CS201363B1 - Příprava imobilizovaných enzýmov - Google Patents

Description

201 363 (Π) (Bl)

POPIS VYNÁLEZU

REPUBLIKA

<1β> K AUTORSKÉMU OSVEDČENIU (¢1) (23) Výstavná priorita(22) Přihlášené 13 11 78(21) PV 7358-78 (51) IntCl.3 C 12 N 11/12

ÚŘAD PRO VYNÁLEZY

A OBJEVY (40) Zverejnené 29 02 80(45) Vydané Q1 03 83

Autor vynálezu ZEMEK JURAJ ing. CSo., LEHNICA, KUNIAK LUDOVÍT ing. CSc. a GEMEINER PETER ing.CSc., BRATISLAVA (54) Příprava imobilizovaných enzýmov 1

Vynález sa týká přípravy imobilizovaných enzýmov viazaných na perlová celulózu obshhu-jácu oxiranové skupiny.

Principy imobilizácie enzýmov na rSznych nosičoch sú dnes dostatočne známe nielenz literárnych záznamov (B. Epton, T. H. Thomas: "An introduction to water insoluble enzy-mes", Koch-Light Laboratories Ltd. England 1971), ale i mnohých praktických aplikácií vovýskume i v priemyslovej praxi.

Chemická imobilizácia enzýmov na vhodnom nosiči patří k najrozšírenejším spdsobom imo-bilizácie, pričom ako nosiče sa používájá rdzne syntetické polyméry ale i přírodně polysa-charidy; škrob, celulóze, dextrany a i. Ak sa použije ako nosič vláknitá alebo prášková ce-lulóza, je nutné před imobilizáciou enzýmu vytvořit na celulóze vhodná funkčná skupinu,ktorá by bola schopná v druhom stupni kovalentne interreagovať s příslušnými skupinami pří-slušného enzýmu. Takouto skupinou je napr. oxiranová skupina, ktorá sa velmi jednoduchozíská pomocou epichlórhydrínu (R. Axén, H. Dřevin a J. Carlson: Acta Chem. Scand. B 29(1975) str. 471-474), ke3 sa reakčné podmienky volia tak, aby epichlórhydrín reagoval lensubstitučně cez chlór pri zachovaní oxiranového kruhu podTa schémy:

Celulóza - OH + CL - 0¾ - CH - CH9 \ / 2o

201 363 2 201 303

Celulóza -O-CHp-CH- CH0 + NaCl

V V druhom stupni aminoskupiny bielkoviny enzýmu reagujú s pxiranovou skupinou modifikova-ného polysacharidu podl’a reakčnej achémy:

Bielkovina - NH, + CH, - CH<oZ CH2 - 0 - Polysacharid · >.

Polysacharid - 0 - CKL,

CH - CH2 - NH - BielkovinaOH čím sa získává imobilizovaný enzým kovalentne viazaný na polysacharidový nosič so všetkýmivýhodami známými pře imobilizované enzýmy.

Je však známe, že polymérny nosič, na ktorom je enzým viazaný má zásadný význam naaplikačně možnosti imobilizovaných enzýmov v priemyelovej praxi. Polymérny nosič musí maťdostatočne velký napúčací objem v reakčnom médiu, aby bole zabezpečená dostatočná rýchlosťdifúzie substrátu k aktívnym centrám imobilizovaného enzýmu a tiež difúzie produktov en-zymatickej reakcie z gélu nosiča. Z uvedených dfivodov sú pre imobilizáciu enzýmov nativně polysacharidy ako celulózaa škrob nevhodné. Třeba ich preto vhodným spfisobom chemicky modifikovat, aby napúčací objempólysacharidového gélu bol dokonale přístupný i pre vSčšie molekuly substrátu.

Ideálnym celulózovým nosičom pre imobilizáciu enzýmov ukázala sa byť perlová celulóza(čs. patent č. 172 640 (1976)), ktorá spíňe náročné požiadavky polymérneho nosiča pře imo-bilizáciu enzýmov.

Podstata vynálezu spočívá v tom, že v prvom stupni sa perlová celulóza v alkalickomprostředí alkyluje s epichlórhydrínom při teplotě 20 až 50 °C po dobu 2 až 18 hodin primolárnom pomere polysacharid : epichlórhydrín 1 : 0,1 až 2 a koncentrácii hydroxidu sodné-ho 2 až 4 %, načo v druhom stupni po premytí produktu do neutrálnej reakcie vodou sa přidároztok enzýmu v množstve 1 až 50 % na váhu suchého celulózového nosiča a nechá sa za mie-šania reagovat po dobu 10 až 24 hodin vo vodnom pufrovacom roztoku pri pH 4 až 8 podl’a pHoptima stability viazaného enzýmu, pri teplote 4 až 40 °C.

Perlová celulóza připravená podlá čs. patentu č. 172 640 má napúčací objem vo vodě6 až 10 ml/g, a tede je dostatočne přístupná pre difúziu molekúl substrátu pře enzýmovéreakcie. Mfiže byť připravená v rfiznej velkosti častíc podle Specifickéj požiadavky od0,05 do 1 mm. Zásadné sa skladuje v mokrom stave e prídavkom azidu sodného v množstve0,01 %.

Zavedenie oxiranovej skupiny sa mfiže prevádzať s epichlórhydrínom pri izbovej teplotepo dobu 10 až 24 hodin alebo při zvýšenej teplote 40 až 60 °C. Výsledný produkt obsahuje300 až 400 μ mol oxiranových skupin ne 1 gram suchého preparátu. 3

Viazanie enzýmu prevádza sa při teplote 4 °C, resp. při izbovej teplote podlá tepel-nej stability aplikovaného enzýmu. Po imobilizácii sa preparát premyje dokonale 10 %-nýmroztokom NaCl. Stabilita zmobilizovaného enzýmu na perlovej oxiranovej celulóze bola za-chovaná po dobu 1 roka. Výhodou predmetnej imobilizácie enzýmov na perlovej celulóze je predovšetkým to, žeperlová celulóza v ddsledku presnej gulovej geometrie častíc má dostatečné vysoký napúčacíobjem vo vodných roztokoch, čím sú podmienené dobré difúzne rýchlosti substrátu k aktivnymcentrám imobilizovaného enzýmu, So je limitujúcim faktorom rýchlosti enzýmových reakcií ka-talyzovaných pomocou zmobilizovaných enzýmov. Příklad 1 K 30 gramom mokrej perlovej celulózy (sušina 10,5 %) sa přidá 24 ml 1 lí NaOH, dobrésa rozmieša a nechá sa pri izbovej teplote za miešania penetrovať 30 minút, potom sa přidá5 ml epichlórhydrínu dobré sa zamieša a nechá sa reagovat 2 hodiny pri 50 °C. Produkt sapremyje destilovanou vodou a obsahuje 310 μ mól oxiranových skupín/g suchej vzorky. K pre-raytej vzorke sa přidá 120 ml 0,05 N borátového pufru o pH = 8,6. K uvedenej suspenzii sapotom přidá roztok pseudocholínesterázy (acylcholín acylhydroláza, EC 3.1.1.8) (lg o akti-vitě 120 u/mg) v 100 ml 0,05 N borátového pufru o pIí =8,6 za stálého miešania na elektro-magnetické j miešačke při nízkých obrátkách, aby sa guličky perlovej celulózy nerozbili. Re-akcia imobilizácie prebieha po dobu 24 hodin při 4 °G. Po ukončení reakcie sa celulózas zmobilizovaným enzýmom odfiltruje a na filtri premyje 10 %-ným roztokom NaCl, aby sa vy-myl podiel enzýmu viazaného fyzikálně. Premytý zmobilizovaný enzým mel aktivitu 21C0 U/gmokrej celulózy a zachoval si túto aktivitu pri skladovaní za leboratórnej teploty po dobu1 roka. Příklad 2

Postup podlá příkladu 1 s tým rozdielom, že tvorbu oxiranu a epichlórhydrínom prevá-dzame při laboratorněj teplote po dobu 18 hodin. Calší postup ako v příklade 1. Příklad 3

Postup podl’a příkladu 1 s tým rozdielom, Že na imobilizáciu použijeme enzým oi-awylázu(oL-1,4-glukán glukánohydroláza, EC 3.2.1.1) (Bacillus substilus) vo fosfátovom pufrio pH = 7,0. Příklad 4

Postup podlá příkladu 1 s tým rozdielom', že na imobilizáciu použijeme enzým gluko-amylázu (<*.-1,4-glukán glukánohydroláza EC 3.2.1.3) (Endomycopsys bispora) vo fosfátovompufri o pH = 6,0.

Vynález sa mdže uplatnit všade, kde sa používajú zmobilizované enzýmy vo vý3kume alebov priemyslovej aplikácii, resp. humánnej medicíně.

Claims (1)

1. 4 201 383 PUDÍM VYNALEZU SpBaob přípravy imobilizovanýeh enzýmov vyznažujúei sa tým, že v prvom stupni sa per-lová celulóza v alkalickom prostředí alkyluje s epichlorhydrínom při teplote 20 až 50 °Cpo dobu 2 až 18 hodin pri molárnom pomere polysacharid : epichlorhydrín = 1 : 0,1 až 2a koncentrácii hadroxidu sodného 2 až 4 %, načo v druhom stupni po premytí produktu desti-lovanou vodou do neutrálnej reakcie sa přidá roztok enzýmu v množstve 10 až 50 % na váhusuchého celulózového gélu a nechá sa za mieSania reagovat po dobu 10 až 24 hodin vo vodnompufrovanom roztoku pri pH = 4 až 8, podlá pH optima a stability viazaného enzýmu, pri tep-lote 4 až 40 °C. Vytiskly Moravské tiskařské .závody,provoz 12, Leninova 21, Olomouc Cena: 2,40 Kčs