CS202180B1 - způsob odstraňováni nizkomolekulárnich sloučenin z roztoku krevního gama globulinu - Google Patents

Description

Poznáni skutečnosti,že v gama globulinové frakci krevních bílkovin se soustřeďuje Velká část proti látkové aktivity způsobilo zaměřeni pozornosti na přípravu terapeutického preparátu gama globulinu.

Základní podm.inkou pro klinickou efektivnost preparátu je co nejnižši hodnota antikomp lementárni akt ivity,která souvisí s obsahem nizkomolekulárnich anorganických nebo organických sloučenin,které se do roztoku gama globulinu dostávají v souvislosti s jeho technologickou formou separace.

Vynález řeši způsob odstraňováni těchto nizkomolekulárnich sloučenin z roztoku gama g lobu li nu,který může být použit jak pro intramusku lárni,tak i pro intravenózni ap li kaci.

Na precipitaci gama globulinu ze směsi plazmatických nebo sérových krevních bílkovin byl použit siran amonný a hydroxyd hli nitý/Schu Itze H.E,Matheka H.0.:Behringwerke Mitt.

28,9,1 954;Schu Itze H.E.,Sch8nenberger M.,Matheke H.D.:Behringwerke Mitt. 26,21,1952/, rivanol/Hořejši J.,Smetana R.:Acta Med.Scand. 155,65,1956/,siran sodný/Amiraian K., Leikhim E.J.:J.Immuno l. 87,301,1 961 /,ch lorid h li nitý/Lewin J.zTherapie 9,523,1 954/,

DEAE celulóza/Sober H.A.,Peterson E.A.:Fed.Proc.17,1116,1958>Peterson E.A.,Sober H.A.:

J.Am.Chem.Soc. 78,756,1 956;Fahey J.L.,Herbett A.P.:J.Biol.Chem. 234,2645,1959;Stanworth

D.H.zNature 188,1 56,1960/,kyše li na kapry lová/Steinbuch M.,Audran R.zRev.Franc.D*etud.

202 180

202 180 + + 4 + 4- »

Clin.Biol. 14,1054,1969Z,ionty Zn a Al /Rejnek J.,Skvaři l F.:Coli.Czechoslov.Chem. Commun. 23,773,1 958; Rejnek J.,Škvařit F.:Co11.Czechos lov.Chem.Commun.22,1 489,1 957;

Krauze R.,Naimski K.,Zakrewski K.sActa Biochim.Pol. 8,209,1961/,polymetafosfát/Nitschman

H.S.,Rickli R.,Kistler P.:Vox Sang. 5,232,1960/,étér /Pennel R.B.v Putnám F.M./ed/ The Plasma Protéins vol.I Academie Press-New Vork 1960,str.9/ a etanolZCohn E.J.,Gurd F.N.R., Surgenor O.M.,Barnes B.A.,Broun R.K.,Derouaux G.,Gillespie J.M.,Kahnt F.W.,Lever U.F.,

Liu C.H./Hitte Iman D.,Houton R.F.,Schmid K.,Uroma E.: J.Am.Chem.Soc. 72,465,1 950;Deutsch H.F.Gostling G.L.,Alberty R.A.,Ui l liams Biol.Chem. 164,109,1946; Oncley J.L.,

Helin M.,Rickert D.A.,Cameron J.W.,Gross P.M.:J.Amer.Chem.Soc. 71,541,1949;Nitschman H.S., Kistler P.,Lergier U.:He Iv.Chim.Acta 37,866,1954;Kist ler P.,Nitschman H.S.:Vox Sang.

7,414,1962;TayLor H.L.,Bloom F.C.,Hc Call K.B.,Hyndman L.A.,Anderson H.D,:J.Am.Chem.Soc. 78,1356,1956Z.

Současná technologická praxe však na jedná straně sice odděluje gama globulin od směsi jiných krevních bílkovin,ale na druhé straně zanáší do gama globulinového roztoku nízkomolekulární anorganické nebo organické sloučeniny.Technologický postup může taktéž část některých nlzkomolekulérnlch sloučenin s biochemicko-fysio log ickou aktivitou v roztoku gama globulinu končentrovát,tj.obohacovat vzhledem k jejich koncentraci ve výchozí surovině,ze které byl gama globulin izolován.

Přítomnost netěkavých anorganických soli v roztoku gama globulinu,jakož i přítomnost netěkavých nizkomolekulárnich organických molekul v roztoku gama globulinu vytváří předpoklady pro vznik nežádoucích interakci těchto látek s molekulami gama globulinu, a to zejména při lyo-filizaci nebo při skladováni v injekčním roztoku,co může snižovat kvalitu preparátu a popřípadě omezovat rozsah jeho indikace v terapii.

Nedostatkem dosud užívané technologie je skutečnost,že takto připravené lyofi lizované preparáty mají vysokou antikomplementární akt ivitu,které byla zjištěna na základě úbytku aktivity komplementu po přidáni rozpuštěného lyofi lizovaného preparátu metodou podle KabatHayera/Kabat E.A.,Mayer M.H.sExperimentélni imunochemie ČSAV Praha 1965,str.1 807.

U nově navrhované technologie se tyto potíže nevyskytovaly v tak výrazné intenzitě, což lze dokumentovat údajem,že z 10 připravených experimentálních šarži,podle předloženého vynélezu,bylo dosaženo sníženi antikomp lementárni aktivity u lyofi lizovaného preparátu o 70 až 90% ve srovnáni se stejným materiálem,který byl lyofiUzovén bez předcházející separace nizkomolekulárnich sloučenin.

Podstata odstraňováni nizkomolekulárnich anorganických nebo organických sloučenin z roztoku gama globulinu spočívá podle předloženého vynálezu v tom,že bílkovinný materiál, obsahující purifikovaný gama globulin se suspenduje za aseptických podmínek v takovém množství apyrogennl destilovaná vody o teplotě 0 °C až *6 °C,aby hodnota koncentrace bílkovin se nacházela v rozmezí 2% až 15%, s optimem 8 %_+ 2, %,gama globulinový roztok se vyčeři například filtraci a separace nizkomolekulárnich sloučenin z gama globulinového roztoku se provádí elučni chromatografii s vylučovací mezi gelu,vyjádřenou molekulovou hmotnosti nizkomolekulárnich sloučenin do 10 000,pomoci eluce s 0,1Xnim až 3,0%n1m roztokem chloridu sodného v destilovaná apyrogenni vůdě,s optimem 0,45 % až 0,9 % chloridu

202 180 sodného,o teplotě 0 °C až +6 °C s hodnotou pH v rozmezí 4,0 až 7,0 při průtoku 0,01 ml 2 až 3,0 ml,s optimem 0,05 ml až 1,0 ml za minutu na cm výtokové plochy gelové ěásti kolony.

Za optimální průtok je možno považovat objem v rozmezí od 0,05 ml do 1,0 ml za 2 minutu na cm ,kdy vzniká neředěni na čele a konci výtoku bílkoviny z kolony,při čemž cca 80 % naloženého objemu roztoku bílkovin vytéká z kolony prakticky v té koncentraci, v jaké byl roztok bílkovin na kolonu nasazen.Průtoky kolem 5 ml za minutu na cm /Friedli H.,Kistler P.:Chimia 26,25,1972/ způsobuji neředěni roztoku na vice než dvojnásobný objem.

Z gelové chromatografické kolony vyteklý gama globulinový roztok se podrobí sterilizaci například filtraci nebo radiační sterilizaci a potom dalšímu zpracováni,napřik lad lyofilizaci nebo zakoncentrováni pomoci vakuové dešti láce,popřípadě pomoci membrán.

Vynález je dále objasněn na přikladu provedení,ji miž jeho rozsah není ani omezen, ani vyčerpán.

Přiklad 1

Výchozí surovinou je pasta frakce II,izolovaná metodou podle Cohna.BiIkovinný gama globulinový materiál se rozpouští v takovém množství destilované apyrogenni vody o teplotě 0 °C až +6°C,aby hodnota koncentrace bílkovin se nacházela v rozmezí 2 % až 15 X s optimem 8 2 X.Rozpouštění se urychluje mícháním.Po rozpuštěni se gama globulinový roztok vyčeři,napřiklad filtraci.

Po nasazení celého objemu gama globu li nového roztoku se chromatografická kolona promývá 0,1 Xnim až 3,0 Xnim roztokem chloridu sodného v destilované apyrogenni vodě, s optimem 0,45 X až 0,9 X chloridu sodného,o teplotě 0°C až +6 °C při zachováni stejné průtokové rychlosti.Po výtoku gama globu li nového roztoku,zbaveného nízkomolekulárních sloučenin se gelově chromatografická kolona promývá rychlosti cca 0,3 ml až 0,6 ml za minutu na cm minimálně 10ti násobkem objemu své gelové části s 1M roztokem chloridu sodného v apyrogenni vodě před tim předestilovené.Potom se chromatografická kolona promyje minimálně 15ti násobkem objemu své gelové části s apyrogenni destilovanou vodou o teplotě 0 °C až +6 °C,přičemž lze oddělováni nízkomolekulárních sloučenin z gama globulinového roztoku na gelově chromatografické koloně po ekvi librizaci s 10ti násobkem objemu gelové části s 0,1Xnim až 3,0 Xnim roztokem chloridu sodného v destilované apyrogenrii vodě,s optimem 0,45 X až 0,9 X chloridu sodného,opakovat.

Sama globulinový roztok po eluci z gelově chromatografické kolony se podrobí sterilizaci ,napřiklad filtraci nebo radiační sterilizaci a potom dalšímu zpracováni,napřiklad lyofilizaci nebo zakoncentrováni pomoci vakuové dešti láce,popřípadě pomoci membrán.

Numerické hodnoty,uváděné jako optima,jsou vhodné pro technologické provedeni,které bylo úspěšně odzkoušeno.

Přiklad 2

Výchozí surovinou může býti bílkovinná pasta gama g lobu linu,izolovaná i pomoci síranu amonného a hydroxydu h linitého,ri vano lu,siránu sodného,ch loridu h li nitého,DEAE

202 180 . ψ + +ψ+ ee lulozy,kyseliny kapry lové,iontu Zn a AI ,po lymetafosfátu nebo étéru.Bi Ikovinná pasta se zpracovává v dalšim postupu jako v příkladě 1.

Claims (3)

1. Způsob odstraňováni nizkomolekulárnich sloučenin z roztoku krevního gama globul i nu,vyznačuj ici se tim,že bílkovinný materiá l,obsahuji cl puriti kovaný gama globulin se suspenduje za aseptických podmínek v takovém množství apyrogenni destilované vody o teplotě 0 °C až +6 °C,aby hodnota koncentrace bílkovin se nacházela v rozmezí 2 X až 15 X,gama globulinový roztok se vyčeř1,napřiklad filtraci a separace nízkomolekulárních sloučenin z gama g lobu li nového roztoku se provádí eluční gelovou čhromatografii s vylučovací mezí gelu,vyjádřenou molekulovou hmotnosti nízkomolekulárních sloučenin do 10 000, pomoci eluce S 0,1 %n1m až 3,0 /ínim roztokem chloridu sodného v destilované apyrogenni vodě o teplotě 0 °C až +6 °C s hodnotou pH v rozmezí 4,0 až 7,0 při průtoku 0,01 ml až 3,0 ml za minutu na cm²výtokové plochy gelové části kolony,při čemž z gelové chromatografické kolony vyteklý gama globulinový roztok se podrobí steri lizaci,například filtraci nebo radiační sterilizaci a potom dalšímu zpracováni.napřiklad lyofilizaci nebo zakoncentrovánl s výhodou pomoci vakuové destilace nebo pomoci membrán.

2. Způsob podle bodu 1,vyznačuj 1c1 se tim,že výchzl bilkovinný materiál se suspenduje na hodnotu koncentrace bílkovin v rozsahu 6 až 10 %.

3. Způsob podle bodů 1 a 2,vyznačuj ici se t1m,že eluce gelové chromatografieké kolony se provádí s 0,45 až 0,9 Zním roztokem chloridu sodného v destilované apyrogenni vodě při průtoku 0,05 až 1,0 ml za minutu na cnr výtokové plochy gelové části kolony.