CS202047B2

CS202047B2 - Způsob přípravy makromolekularizováných derivátů adeninu

Info

Publication number: CS202047B2
Application number: CS793667A
Authority: CS
Inventors: Piergiorgio Zappelli; Antonio Rossodivita; Rosario Pappa; Luciano Re
Original assignee: Snam Progetti
Priority date: 1976-05-04
Filing date: 1979-05-28
Publication date: 1980-12-31

Description

Vynález se týká navazování funkcionalizovaných derivátů adeninu pomocí kovaleníní vazby na makromolekulární sloučeniny. Funkcionalizované deriváty adeninu, popsané v čs. patentu č. 202 046 mají v poloze 8 ω-kraboxylový postranní řetězec a jsou odvozeny od sloučenin obahujících adeninové jádro, například nikotinoylamidu, dinukleotidu adeninu (NAD⁺), fosfátu dinukleotidu nikotinoylamidadeninu (NADP⁺), adenosintrifosfátu (ATP), adenosindifosfátu (ADP), adenosinmonofosfátu. (AMP), adenosinu nebo adeninu. Většina těchto sloučenin má velký význam v biochemii.

Předmětem vynálezu je způsob přípravy makromolekularizovaných derivátu adeninu, obsahujících alespoň jednu jednotku obecného vzorce I

je odvozen od sloučeniny vybrané z dinukletidu nikotinoylamidadeninu, fosfátu dinukleotidu nikotinoylamidadeninu, adenosinmonofosfátu, cyklického adenosinmonofosfátu, adenosindifosfátu, adenosintrifosfátu, adenosinu a adeninu, který spočívá v tom, že se funkcionalizované deriváty adeninu obecného vzorce II

SAw^1LS'^(CH.!.'^CC’^0H ¹ til) kde n je celé číslo 2 až 4, nechají reagovat při teplotě 5 až 50 °C v kde n je celé číslo 2 až 4 a zbytek vzorce prostředí vody, popřípadě ve směsi s organickým rozpouštědlem mísitelným s vodou, v přítomnosti vodorozpustného nebo nerozpustného karbodiimidu jako kondenzačního činidla, s polymerem, obsahujícím alespoň jednu primární nebo sekundární aminoskupinu, vybraným z polylysinu, ω-aminoalkylpolyanilamidů, polysacharidových esterů ω-aminoalkylkarbamových kyselin, polyvinylaminu, ω-aminoalkylesterů a ω-aminoalkylamidů polyglutamové kyseliny, aminoalkylsilanizovaných skleněných mikrokuliček a polyethylenimlnu.

Příkladem vodorozpustného karbodiimidu je N-ethyl-N’- (3-dimethylaminopropyl ) karbodiimidhydrochlorid, jako nerozpustného karbodiimidu lze použít N,N’-dicyklohexylkarbodiimidu. Jako rozpouštědel mísitelných s vodou lze použít například pyridinu, tetrahydrofuranu, dioxanu a dalších. Výhodné je pracovat při teplotě místnosti.

Funkcionalizovaných derivátů například NAD, ale i ostatních uvedených sloučenin lze po navázání na vodorozpustné nebo vodorozpustné makromolekulární látky použít jako nedifundovatelných koenzymů nebo v afinitní čhromatografii.

V případě navázání na vodorozpustné makromolekulární látky mohou být vzniklé produkty použity jako nedifundovatelné vodounerozpustné makromolekularizované koenzymy. Tyto látky rozšiřují možnosti použití známých enzymatických systémů, ve kterých je enzym fyzicky zabudován v nerozpustných porézních strukturách, jako jsou vlákna; polyakrylamidový gel, mikrokapsle apod., které jsou neprůchodné pro makromolekuly. Důsledkem fyzického zabudování vodorozpustného makromolekularizovaného koenzymu do enzymu nebo polyenzymatického systému je ve skutečnosti to, že jak enzym, tak koenzym zůstávají v těsném kontaktu a je znemožněno rozptýlení koenzymu ven z uzavřené struktury. Tento jev není u přírodního koenzymu možný vzhledem k jeho nízké molekulové hmotnosti. V případě navázání na vodonerozpustné makromolekulární sloučeniny lze produktů použít v afinitní čhromatografii nebo pro enzymatické reakce v heterogenní fázi, přičemž je možno regenerovat koenzym.

Příklad 1

Příprava dinukleotidu nikotinoylamid-8- (polyethylenlmin-3-karbonylethylthio) adeninu.

/

I, n = 2, —N = zbytek polyethyleniminu \

— zbytek NAD⁺

K 0,76 ml vodného roztoku polyethyleniminu (33 % hm./objem) upraveného na pH 5 konc. kyselinou chlorovodíkovou se přidá 39 mg dinukleotidu nikotionylamid-8- (karboxyethylthio) adeninu

= zbytek NAD+ rozpuštěného v 0,5 ml vody, a 40 miligramů hydrochloridu N-ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl) karbodiimidu rozpuštěného v 0,5 ml vody.

Reakční směs upravená na pH 4,8 přídavkem 2 M HC1 se míchá při teplotě místnosti během 48 hodin za udržování pH 4,8 během prvních tří hodin přídavkem 0,1 M HC1. Reakční směs zředěná vodou na 20 ml se pak přemístí do centrifugační zkumavky a vysráží se 20 ml ÍM fosfátového pufru při pH 6. Odstřeďuje se po 10 minut při 39 000 g a roztok se zbaví polymerní sraženiny dekantováním.

Aby se dále polymer vyčistil, rozpustí se v 4 ml 2 M roztoku chloridu sodného a 0,05 M acetátového pufru při pH 5,5 a takto získaný roztok se doplní 16 ml vody, znovu vysráží 20 ml 1 M fosfátového pufru při pH 6, odstředí během 10 minut při 39 000 g a polymer se oddělí dekantací.

Tento čistící postup se opakuje alespoň čtyřikrát.

Znova rozpuštěný produkt v 2 M roztoku chloridu sodného a 0,5 M acetátového pufru při pH 5,5 se dialyzuje oproti 1 1 dávkám 1.ICH HC1 během čtyř dnů, přičemž se roztok každého dne vyměňuje.

Mrazovým vysušením zbytku po dialýze se získá 223 mg polymerního derivátu NAD o hodnotě A_max 276,5 nm.

Celkové množství NAD vázané na polymer se stanoví měřením absorbance pří 276,5 nm za předpokladu, že extinkční koeficient je stejný jako u NAD derivátu II (ε 18 800 Mícm'¹).

Stanovení koenzymaticky aktivního NAD vázaného na polymer se provede kvantitativní enzymatickou redukcí alkohol—dehydrogenázou z kvasnic v 0,1 M tris pufru při pH 9 v přítomnosti 0,2 methanolu a 0,5 M semikarbazidhydrochloridu.

Ze spektrofotometrického měření při 340 nm u NADH derivátu, který vznikl, vyplývá, že na každý gram polymeru je vázáno 115 μΐηοΐ enzymaticky redukovatelného NAD, což odpovídá tomu, že 90 % celkového NAD je vázáno na polymer.

Takto získaný makromolekulární NAD je koenzymaticky aktivní s mnohými dehydrogenázami. Například s alkohol—dehydrogenázou z kvasnic rychlost enzymatické re202047 dukce makromolekulárního NAD činí 50 % ve srovnání s přirozeným koenzymem, Stanovení se provádí v této inkubační směsi (1,0 ml): tris.HCl 83 μΐηοΐ, ethanol 166 //mol, semikarbazid.HCl 42 μΐηοΐ, koenzym 0,1 μπιοί (vztaženo na vázaný a enzymaticky redukovatelný NAD), enzym 0,2 μ%, pH 9,0, inkubační teplota 25 °C. Rychlost redukce se stanoví přírůstkem absorbance při 340 nm.

Příklad 2

Příprava dinukleotidu nikotinoylamid-8- (polylysin-2-karbonylethylthio) adeninu > / >1, n =2 — N = zbytek póly lysinu

K 50 miligramům hydrobromidu polylysinu přibližně o molekulové hmotnosti 50 000 rozpuštěného; v 0,5 ml vody se přidá 40 miligramů dinukleotidu nikotinoylamid-8-(karboxyethylthio) adeninu

= zbytek NAD⁺ rozpuštěného v 0,5 ml vody, a 40 miligramů N-ethyl-N’- (3-dimethylaminopropyl) karbodiimidhydrochloridu rozpuštěného v 0,5 ml vody.

Reakčni směs se upraví na pH 4,7 0,1 M NaOH, míchá se během 24 hodin při teplotě místnosti za udržování pH při 4,7 během prvních tří hodin přídavkem 0,1 M HC1.

Za týchž podmínek se přidalo dalších 40 mg karbodiimidu v 0,5ml vody a v míchání se pokračovalo dále po 24 hodin.

Reakčni směs zředěná vodou na objem 15 ml se přenesla do centrifugační zkumavky a vysrážela 10 ml 0,15 M fosfátového pufru při pH 6.

Odstřeďovalo se po dobu 10 minut při 19 000 g a roztok se od polymerní sraženiny dekantoval.

K dalšímu vyčištění se polymer rozpustí v 1 ml 2 M roztoku NaCl a 0,05 M acetátového pufru při pH 5,5, takto získaný roztok se doplní 15 ml vody a znovu vysráží 10 ml 0,15 M pyrofosfátového pufru o pH 6, pak se během 10 minut odstředí při 39 000 g a polymer se izoluje dekantací.

Tento čisticí postup se opakuje alespoň ještě čtyřikrát. Produkt rozpuštěný v 2 M roztoku chloridu sodného a 0,05 M acetátového pufru o pH 5,5 se dialyzuje během 48 hodin oproti 500 ml 3 M roztoku chloridu sodného. '

Dialyzuje se pak oproti 2 mol podílům

1. ΙΟ^-4 M HC1 po dobu čtyř dnů, přičemž se roztok denně mění.

Mrazovým vysušením dialyzačního zbytku se získá 34 mg polymerního derivátu NAD o hodnotě A_max 276,5.

Celkové množství NAD vázaného na polymer se stanoví měřením absorbance při

276,5 nm za předpokladu, že extinkční koeficient je stejný jako u derivátu II NAD (ε 18 800 M⁴cm⁴), Koenzymaticky aktivní NAD vázaný na polymer se stanoví kvantitativní enzymatickou redukcí alkohol-dehydrogenázou z kvasnic v 0,1 M tris-pufru při pH 9 v přítomnosti 0,2 M ethanolu a 0,05 M hydroehloridu semikarbazidu.

Ze spektofotometrického stanovení při 340 nm se jeví, že takto vytvořený derivát NADH obsahuje 157 ^mol enzymaticky redukovatelného NAD vázaného na gram polymeru, což odpovídá, že 90 % NAD je vázáno na polymer.

Takto získaný NAD převedený na makromolekulami látku je koenzymaticky účinný s řadou dehydrogenáz.

P ř í k 1 a d 3

Příprava dinukleotidu nikotinoylamid-8- (aminohexylsepharoso-2-karbonylethylthio j adeninu /

I, n = 2 —N zbytek aminohexyl-

500 mg aminohexylsepharózy 4B se ponechá botnat v 0,5 M NaCl, pak se promyje 200 ml 0,5 M NaCl a potom vodou. Získaný gel se rozmíchá v 2 ml vody, pak se přidá 40 mg dinukleotidu nikotlnoylamid-8-( karta cxyethylthio j adeninu

rozpuštěného v 0,5 ml vody a upraví se na pH 4,7 1 M NaOH. K suspenzi míchané mechanickým míchadlem za teploty místnosti se přidá 40 mg hydroehloridu N-ethyl-N’- (3-dimethylaminopropyl j karbodiimidu rozpuštěného v 0,2 ml vody a v míchání se po20 2047 kračuje dalších 24 hodin, přičemž pH se během prvních tří hodin udržuje na 4,7 přidáváním 0,1 M HC1.

Za týchž podmínek se přidají ve 24 hodinových intervalech tři další podíly roztoku karbodiimidu (40 mg v 0,2 ml vody) při celkové reakční době 96 hodin. Gel se pak odfiltruje a promývá 1 M roztokem chloridu sodného a 1. ΙΟ ⁴ M HG1, až se zjistí úplné zmizení UF absorpce (NAD, který není vázán). Tímto způsobem se získá 1,8 ml polymerního derivátu NAD ve formě vlhkého gelu, A_max 276,5 nm.

UF spektrum se získalo suspendováním gelů ve vodném 50% roztoku sacharózy (hm.j, který zamezuje usazení gelu. Celkové množství vázaného NAD na polymer se stanoví měřením absorbance při 276,5 nm za předpokladu, že extinkční koeficient je stejný jako u NAD derivátu II (ε 18 800 M¹cm¹). Koenzymaticky účinný NAD vázaný na polymer se stanoví kvantitativní enzymatickou redukcí alkohol-dehydrogenázou z kvasnic suspendováním gelu v 50% vodném roztoku sacharózy (hm.) obsahujícím 0,1 M tris.HCl pufr, 0,2 M ethanol a 0,5 M semikarhazidhydrochlorid upraveném na pH 9.

Z fotometrického měření při 340 nm je zřejmé, že 21 μπιοί enzymaticky redukovatelného NAD je vázáno na každý gram suchého NADH derivátu, což odpovídá 80 % celkem vázaného NAD na polymer.

Příklad 4

Příprava fosfátu dinukleotidu nikotinoylamid-8- (polyethylenimin-2-kar bonylethylthiojadeninu

II, n = 2

= zbytek NADP /

I, n = 2 —N = zbytek polyethyleniminu

= zbytek NADP

K 0,38 ml 38% vodného roztoku polyethyleniminu (hm./objem) upraveného na pH koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou se přidá 20 mg fosfátu dinukleotidu nikotinoylamid-8- (karboxyethylthio) adeninu rozpuštěného v 0,5 ml vody, a 20 mg N-ethyl-N’- (3-dlmethylaminopr opyl j karbodiimidhydrochloridu rozpuštěného v 0,2 ml vody. Reakční směsí upravenou na pH 4,8 přídavkem 2 M HC1 se míchá při teplotě místnosti během 24 hodin a během prvních tří hodin se pH udržuje přídavkem 0,1 M HC1. Za týchž podmínek se přidá dalších 20 mg karbodiimidu v 0,2 ml vody a v míchání se pokračuje 24 hodin. Reakční směs zředěná vodou na objem 10 ml se potom přenese do centrifugační zkumavky a vysráží se 10 ml 1M fosfátového pufru při pH

6. Odstředí se během 10 minut při 39 000 g a roztok se oddělí od polymerního koagulátu dekantováním. Za účelem dalšího přečištění se polymer rozpustí v 2 ml 2 M roztoku NaCl a 0,05 acetátového pufru při pH 5,5, takto získaný roztok se doplní 8 ml vody a znovu vysráži 10 ml 1 M fosfátového pufru při pH 6, odstředí během 10 minut při 39 000 g a polymer se oddělí dekantací. Tento čisticí postup se opakuje nejméně čtyřikrát. Produkt se znovu rozpustí v 2 M roztoku NaCl a 0,05 M acetátového pufru při pH 5,5, dialyzuje se oproti 1-litrovým podílům 1. 10'⁴ M HC1 po dobu čtyř dnů, přičemž se roztok denně obnovuje. Mrazovým vysušením zbytku po dyalýze se získá 83 mg polymerního derivátu NADP, A_max 276,5 nm. Celkové množství NADP vázaného na polymer se stanoví obsorbancí při 276,5 nm za předpokladu, že extinkční koeficient je stejný jako u derivátu NAD II (ε 18 800 M-icm-i).

Koenzymaticky aktivní NADP vázaný na polymer se stanoví kvantitativní enzymatickou redukcí dehydrogenázou glukózo-6-fosfátu z kvasnic v 86,3 mM triethanolaminovém pufru pH 7,6 obsahujícím 6,7 mM MgCb a 1,2 mM glukózo-6-fosfátu. Ze spektrofotometrického stanovení vytvořeného NADP při 340 nm je zřejmé, že na každý jeden gram polymeru se nevázalo 23 //mol enzymaticky redukovatelného NADP derivátu.

Takto získaný NADP přeměněný na makromolekulami látky je koenzymaticky účinný s četnými dehydrogenázami například s dehydrogenázou 6-fosfoglukonanu a dehydrogenázou L-glutamátu.

Claims

PREDMET vynalezu

Způsob přípravy makromolekularizovaných derivátů adeninu, obsahujících alespoň jednu jednotku obecného vzorce I tu, adenosinu a adeninu, vyznačující se tím, že se funkcionalizované deriváty adeninu obecného vzorce II kde kde n je celé číslo 2 až 4 a zbytek vzorce je odvozen od sloučeniny vybrané z dinukleotidu nikotinoylamidadeninu, fosfátu dinukleotidu nikotinoylamidadeninu, adenosinmonofosfátu, cyklického adenosinmonofosfátu, adenosindifosfátu, adenosintrifosfáS_J/k_N ^y-^s'^lcK’í^c00H lil) n je celé číslo 2 až 4, nechají reagovat při teplotě 5 až 50 °C v prostředí vody, popřípadě ve směsi s organickým rozpouštědlem mísitelným s vodou, v přítomnosti vodorozpustného nebo nerozpustného karbodiimidu jako kondenzačního činidla, s polymerem, obsahujícím alespoň jednu primární nebo sekundární aminoskupinu, vybraným z polylysinu, ω-aminoalkylpolyanilamidů, polysacharidových esterů ω-aminoalkylkarbamových kyselin, polyvinylaminu, ω-aminoalkylesterů a ω-aminoalkylamidů polyglutamové kyseliny, aminoalkylsilanizovaných skleněných mikrokuliček a polyethyleniminu.