CS201786B1 - Způsob imobilizovaní (2-galaktosidasy - Google Patents
Způsob imobilizovaní (2-galaktosidasy Download PDFInfo
- Publication number
- CS201786B1 CS201786B1 CS594578A CS594578A CS201786B1 CS 201786 B1 CS201786 B1 CS 201786B1 CS 594578 A CS594578 A CS 594578A CS 594578 A CS594578 A CS 594578A CS 201786 B1 CS201786 B1 CS 201786B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- galactosidase
- cells
- gel
- imobilized
- beta
- Prior art date
Links
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 title claims description 8
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 title claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title 1
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- VILCJCGEZXAXTO-UHFFFAOYSA-N 2,2,2-tetramine Chemical compound NCCNCCNCCN VILCJCGEZXAXTO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 5
- -1 hydroxylalkyl methacrylate Chemical compound 0.000 claims description 3
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000007863 gel particle Substances 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 22
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 4
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 3
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 3
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- VKYKSIONXSXAKP-UHFFFAOYSA-N hexamethylenetetramine Chemical compound C1N(C2)CN3CN1CN2C3 VKYKSIONXSXAKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FFRVQTGCNAGNJO-UHFFFAOYSA-N 2-(4-fluorophenyl)-2-pyrrolidin-1-ylethanamine Chemical compound C=1C=C(F)C=CC=1C(CN)N1CCCC1 FFRVQTGCNAGNJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N Epichlorohydrin Chemical compound ClCC1CO1 BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000007444 cell Immobilization Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 235000010299 hexamethylene tetramine Nutrition 0.000 description 1
- 239000004312 hexamethylene tetramine Substances 0.000 description 1
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Description
Vynález se týká způsobu imobilizace kvasinkové jS-galaktosidasy, který spočívá v zakotvení celé buňky jejího producenta kovalentní vazbou na pevný nosič.
Průmyslová aplikace vázané /3-galaktosidasy nalézá značně uplatnění v procesu úpravy mléka i při degradaci odpadních produktů obsahujících laktózu. V. této souvislosti je použití kvasinkové /3-galaktosidasy výhodnější jednak tím, že optimální pH enzymu je bližší pM mléka, jednak tím, že aktivita kvasinkové /2-galaktosidasy je v prostředí mléka stabilnější.
Ve vývoji způsobů přípravy vázaných enzymů představuje imobilizace celých buněk jejich producentů nový směr, kterému je v současné době věnována pozornost především pro značné operační výhody.
Dosud známé způsoby přípravy vázaných mikrobiálních buněk obecně vycházejí z metod imobilizace čistých enzymů a lze je rozdělit do následujících kategorií:
a) vazba buňky fyzikálním zachycením v gelu, membráně nebo mikropouzdru;
b) vazba buňky adsorpcí na ionex nebo biospecifický adsorbent biologické povahy;
c) vazba buňky kovalentní vazbou na pevný nosič.
Výhody a nevýhody těchto známých způsobů hodnotí z hlediska aplikace vázaných buněk poměrně málo prací. Je však zřejmé, že imobilizací celých buněk kovalentní vazbou je možno získat zakotvený enzymatický systém, jehož aktivita nebude negativně ovlivněna difuzní bariérou nebo dalšími negativními vlivy, které se projevují při použití způsobů, kdy se vazba buňky provádí fyzikálním zachycením nebo adsorpcí na ionexu. Z těchto důvodů je imobilizace buňky kovalentní vazbou na pevný nosič velmi perspektivní.
Podle vynálezu spočívá způsob imobilizace kvasinkové /3-galaktosidasy v zakotvení permeabilizované kvasinkové buňky na hydroxyalkyl metakrylátový gel prostřednictvím triethylentetraminu, který byl aktivován glutaraldehydem nebo karbodiimidem. Synthesa (S-galaktosidasy byla v těchto buňkách indukována před imobilizací.
Účinek tohoto způsobu imbolizace jS-galaktosidasy spočívá ve vyloučení izolace a purifikace enzymu a v jeho zachování v intracelulárním prostředí buňky, což přispívá ke stabilitě jeho aktivity, zaručuje optimální podmínky pro vlastní enzymatickou reakci a izoluje enzym od negativních vlivů extracelulárního prostředí.
Způsob podle vynálezu je dále blíže vysvětlen na několika příkladech provedení,
Příklad 1
Hydroxyalkyl metakrylátový gel (8 až 13 <um), zpracovaný epichlorhydrinem, byl modifikován vazbou triethylentetraminu podle následujícího postupu: 1 g gelu byl suspendován v 10 ml 1 M triethylentetramin dihydrochloridu, jehož pH bylo upraveno 1 M NaOH na hodnotu pH 9,0. Po 24 hod míchání za laboratorní teploty byla suspenze převedena do kolonky a gel byl promýván vodou až do vyrovnání vodivosti. Potom byl gel .promyt desetinásobným objemem ethanolu, butanolu a opět ethanolu a vysušen. Obsah triethylentetraminu byl vypočten na základě stanovení dusíku Kjeldahlovou metodou na 256 pmol/g suchého gelu. Modifikovaný gel (1 g) byl po 3 hod bobtnání ve vodě promyt několikanásobným objemem vody. Odsátý gel byl suspendován ve dvojnásobném objemu vody a k vzniklé suspensi byl přidán glutaraldehyd (25 %) do konečné koncentrace 5 %. Po 1 hod míchání byl gel převeden do kolonky a promýván vodou až do negativní reakce, kterou byla sledována přítomnost glutaraldehydu v jednotlivých promývkách. Po vymytí volného glutaraldehydu byl gel promyt 300 ml 0,05 M fosfátového pufru (pH 7,0). Takto připravený gel (0,5) byl přidán do 5 ml buněčné suspenze, obsahující v 1 ml téhož pufru 109 permeabilizovaných buněk kmene Kluyveromyces lactis. Z hlediska přechodu (3-galaktosidasóvé aktivity na nosič a její stability bylo konstatováno, že imobilizace buněk pevnou kovalentní vazbou byla v podmínkách míchané suspenze dokončena v teplotě 20 °C přibližně po 100 hodinách. Lokalizace buněk na povrchu zmíněného nosiče je dokumentována mikrofotograficky.
Využití intracelulární enzymatické aktivity imobilizovaných buněk je podmíněno jejich permeabilizací, která byla v tomto případě provedena následujícím způsobem: buněčná suspenze byla po 0,1 ml objemech nanášena na střed membránového filtru, přičemž každé následující nanešení bylo provedeno vždy po úplném odsátí média, Po nanesení 1 ml objemů byly filtry přeneseny na skleněnou desku a zachycené buňky byly vystaveny proudu teplého vzduchu o konstantní teplotě 60 °C po dobu 70 sek. Permeabilizované buňky byly z povrchu filtrů smyty 0,05 M fosfátovým pufrem (pH 7,0).
Příklad 2
Příprava zakotvených permeabilizovaných buněk byla provedena způsobem popsaným v příkladu 1 s tím rozdílem, že k vazbě místo triethylentetramin byl použit hexamethylentetramin.
Příklad 3
Příprava zakotvených permeabilizovaných buněk byla provedena způsobem popsaným v příkladu 1 a 2 s tím rozdílem, že bylo použito buněk permeabilizovaných dimethylsulfoxidem. Suspenze buněk v 0,05 M fosfátovém pufru (pH 7,0) byla vystavena účinku dimethylsulfoxidu (40 %) při Teplotě 20 °C. Po 30 min byly buňky promyty, resuspendovány v uvedeném pufru a imobilizovány. Příklad 4
Postupem uvedeným v příkladu 1 a 2 byly zakotveny nepermeabilizované buňky. Takto zakotvené buňky byly dodatečně permeabilizovány postupem uvedeným v příkladu 1 s tím rozdílem, že bylo použito suspenze nosiče s navázanými buňkami.
Příklad 5
Příprava zakotvených buněk byla provedena způsobem popsaným v příkladu 1 s tím rozdílem, že modifikovaný gel byl během imobilizace aktivován přítomností 100 mg N-ethylN'-/3-dimethylaminopropyl/karbodiimidu na 100 mg nosiče.
Claims (1)
- PŘEDMĚT VYNÁLEZUZpůsob přípravy imobilizovaný jž-galaktosidasy kovalentní vazbou intatní kvasinkové buňky na pevný nosič, vyznačený tím, že permeabilizovaná nebo nepermeabilizované kvasinková buňka se při teplotě 20 °C zakotví pomocí triethylentetraminu na povrch partikulí hydroxylalkyl metakrylátového gelu.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS594578A CS201786B1 (cs) | 1978-09-14 | 1978-09-14 | Způsob imobilizovaní (2-galaktosidasy |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS594578A CS201786B1 (cs) | 1978-09-14 | 1978-09-14 | Způsob imobilizovaní (2-galaktosidasy |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS201786B1 true CS201786B1 (cs) | 1980-11-28 |
Family
ID=5405395
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS594578A CS201786B1 (cs) | 1978-09-14 | 1978-09-14 | Způsob imobilizovaní (2-galaktosidasy |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS201786B1 (cs) |
-
1978
- 1978-09-14 CS CS594578A patent/CS201786B1/cs unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Husain | β Galactosidases and their potential applications: a review | |
| JPS5912275B2 (ja) | 生物学的に活性な物質の固定化に関する改良法 | |
| JPH0338B2 (cs) | ||
| JPS5978687A (ja) | 固定化酵素配合体 | |
| Chen et al. | Preparation and characterization of urease immobilized onto porous chitosan beads for urea hydrolysis | |
| US3824150A (en) | Enzyme bound to polymeric sheet with a triazine bridging group | |
| US5419902A (en) | Method for inactivating pathogens | |
| Hussain et al. | Urease-Based Biocatalytic Platforms―A Modern View of a Classic Enzyme with Applied Perspectives | |
| Kennedy et al. | Application of cellulosic fast‐flow column filters to protein immobilisation and recovery | |
| Iyengar et al. | Urease bound to chitin with glutaraldehyde | |
| Stults et al. | Immobilization of proteins on partially hydrolyzed agarose beads | |
| JPS6190672A (ja) | 生理活性物質を固定した多孔性中空繊維を使用した液の処理方法 | |
| CS201786B1 (cs) | Způsob imobilizovaní (2-galaktosidasy | |
| CA1179283A (en) | SUCROSE MUTASE, IMMOBILISED SUCROSE MUTASE AND THE USE OF THIS IMMOBILISED SUCROSE MUTASE FOR THE PREPARATION OF ISOMALTULOSE (6-0-.alpha.-D- GLUCOPYRANOSIDO-D-FRUCTOSE) | |
| Smiley et al. | Immobilized enzymes | |
| Jirků et al. | Modified hydroxyalkyl methacrylate gel as a support for immobilization of yeast cells | |
| Chetty et al. | Characterization of pneumococcal purpura-producing principle | |
| CA1229808A (en) | Preparation of hydrophobic cotton cloth | |
| JPS6187700A (ja) | ペプチド含有物質固定化物 | |
| WO1989008705A1 (en) | Supports for proteins and amino acids | |
| Rocha et al. | Spent-grains and zeolites as potential carriers for trypsin immobilisation | |
| Linhardt et al. | Patents and literature | |
| Ortega-Lopez et al. | Lactose hydrolysis by immobilized β-galactosidase on nylon-6: a novel spin-basket reactor | |
| KR20000011105A (ko) | 고정된 미생물에 의한 이소말툴로즈의 제조방법 및 제조용 담체 | |
| CHIOU et al. | Immobilization of papain on an anion exchange resin by physical adsorption followed by cross linking with glutaraldehyde |