CS201347B1 - Production of monospecific pr ecipitation serums for diagnostical purposes - Google Patents

Description

Vynález sa týká výroby monošpecifických precipitačných sér pre diagnostické účely, v ktorom sa rieši spósob izolácie imunoglobulínových tired špecifickou imunoadsorpčnou metodou na příslušný bakteriálny korpuskulárny antigén a spósob imunizácie pokusných zvierat použitých pre výrobu.

Rozbor doterajšieho stavu techniky ukazuje, že monošpecifické precipitačné séra obsahujú protilátky (precipitíny), ktoré sa Specificky viažu na příslušný druh bielkovín a po ich vaz- . ba sa vyprecipitujú v nerozpustnom komplexe. Precipitačné séra sa vyrábajú proti róznym antigénom, hlavně proti jednotlivým bielkovinám krvného séra. Nakolko uvedené séra precipitujú iba antigén, ktorý dal podnět k ich tvorbě, sú vhodné na kvalitatívny a kvantitativný dókaz příslušného antigénu v róznych tělových tekutinách za použitia imunochemických reakcií. Takýmito reakoiami sú například dvojsmerná imunodifúzna metody podl’a Ouchterlonyho, imunoelektroforéza, jednoduchá, radiálna imunodifúzia a pod. Okrem toho sú tieto precipitačné séra základnou surovinou pri výrobě fluorescenčných sér pre priamu a nepriamu fluorescenciu.

Metody, v ktorých sa používájú monošpecifické precipitačné séra, patria k novším pokrokovým imunodiagnostickým metodám, dnes už nepostrádatelným, či už vo výskume alebo v bežnej veterinárně j imunodiagnostike. Velký teoretický a praktický význam má kvalitatívny a kvantitativný dókaz imunoglobulínov krvného séra. Pre výrobu monošpecifických precipitačných sér je

201 347

201 347 potřebné získat v prvom radě jednotlivé triedy imunoglobulínov (napr. IgG a IgM) v imunochemicky čistom stave. N izoláciu a purifikáciu roznych tried imunoglobulínov boli v poslednom desaťrročí vyvinuté poměrně zložité fyzikálno-chemické metody za použitia chemikálií a prístrojóv povačšine z dovozu z kapitalistických štátov. Nakolko literatura týkajúca sa uvedenej tématiky je velmi rozsiahda a v podstatě sa zakladá na rovnakých princípoch, uvádzam z nich niektoré používané pri izolácii imunoglobulínov IgG a IgM triedy.

S t e f £ e n (Allegemeine und experimentelle Imunologie und Immunopathologie sowie ihre klinische Anwendung, — Georg Thieme Verlag - Stuttgart 1968, strana 564), používá pri izolácii IgM imunoglobulínu následovně metodiku :

Do 10 ml krvného séra sa přidá 0,4 ml 10%-ho roztoku Dextránsulfátu rozpuštěného v destilovanej vodě a 1 ml 1 M roztoku CaC1g. Po zmiešaní sa roztok nechá 15 minút stát pri izbovej teplote. Vyprecipitované lipoproteiny sa centrifuguvaním odstránia (l0 min. pri 6,000 g). Supernatant sa za krátku dobu dialyzuje proti destiloanej vodě a potom sa doplní do 200 ml roztokom 0,75 %-nej kyseliny boritej. Po 30 min. státia pri izbovej teplote sa vzniklý precipitát odcentrifuguje (10 min. pri 2,000 g). Sediment sa ešte dvakrát premyje roztokom kyseliny boritej V uvedenej koncentrácii. Po premytí sa precipitát rozpustí v 3 až 4 ml pufru nasledovného zloženia: Tris-Hydroxymethylaminomethan 7,96 g, NaC1 58,45 g sa rozpustí v destilovanej vodě s obsahom 0,033 M HC1 (pH 8,0).

Týmto spósobom rozpuštěný precipitát sa potom nanesie na kolonu naplněnu gelom Sephadex G-200 o rozmeroch 2,8 x 80 cm ustálenu na uvedený Tris pufor. Frakcie prvého vrcholu obsahujú čistý IgM imunoglobulín. Metoda však nevylučuje znečistenie alfa,, makroglobulínom, ktorá sa nachádza takmer vo všetkých IgM imunoglobulínových preparátoch připravených uvedenou metodou. Alfa^ makroglobulína má totiž velmi blízké fyzikálno-chemické vlastnosti ako IgM imunoglobulín.

F e y (Methods of Purification and Quantitation of bovine Immunoglobulins, Zbl.Vet.Med.

8,23, 1976, 269-300) udává nasledovnú metodu izolácie IgM imunoglobulínu :

Krvné sérum sa dialyzuje proti 0,01 M fosfátovému pufru o pH 5,4. Euglobulínový precipitát, ktorý vznikne pri dialýze sa dvakrát premyje v 0,01 M acetátovom pufre s obsahom 0,15 M NaC1 o pH 5,4.sa rozpustí. Množstvo acetátového pufru má byť 20 jí póvodného množstva séra. Potom za stálého miešania pri kvapkáva 0,1 M ZnSO^, aby výsledná koncentrácia ZnSO^ dosiahla 25 mM, Vzniklý precipitát sa pri izbovej teplote mieša po dobu dvoch hodin a potom sa centrifugovaním odstráni pre 3000 ot/min. Používá sa supernatant, z ktorého sa Zn ionty odstránia pomocou 1#-ho roztoku tetrasódnej EDTA. Po koncentrovaní roztoku sa tento dá na gelovú kolonu naplněná Sephadexom G—200 ustálená na 0,1 M Tris-HC1 pufor s obsahom 0,1 M NaC1 o pH 8,6. Frakcie prvého vrcholu obsahujú IgM imunoglobulín. Pre imunizáciu zvierat sa však používajú len frakcie nachádzajúce sa v ascendentnej časti prvého vrcholu. Ale i takto připravené precipitačné séra ebsahujú precipitiny proti IgG a alfagM bilekovinám, ktoré třeba z precipitačného séra odstrániť. N. odstránenie alfa ^M globulínu připravil izolačnú metodu na získanie uvedeného globulínu v čistom stave. Týmto sa popísáná metoda áalej komplikuje.

201 347

Na izoláciú IgG triedy imunoglobulínu používajú takmer všetci autoři gélovú filtráciu (napríkl. Sephadex G-2OO) a iontomeniče (ako je DEAE celulóza a DEAE Sephadex). Pre tento účel sa používá buď celé krvné sérum alebo kolostrum, alebo z nich izolované imunoglobulíny v nečlstom stave za použitia síranu amonného, síranu sodného alebo rivanolu.

L e v i e u x (immunoglobulines Bovines et Brucellose, Ann.Rech.Vétér., 197^, 5,329—342) udává nasledovný postup izolácie IgG2 imunoglobulínu :

Celé sérum hovádzieho dobytka sa filtruje na Sephadexe G-2OO na koloně o rozmeroch 90x5 cm ustálenéj na 0,1 M Tris—HC1 pufor s obsahom 0,15 M NaC1 a AzidU sodného v celkovej koncentrácii 1:5000 o pH 8,0. Frakcie druhého vrcholu, ktoré obsahujú IgG imunoglobulín a ostatné bielkoviny s obdobnou molekulovou váhou ďalej frakcionuje na DAEA celulóze za použitia nasledovných pufrov : 0 : 0,01 M pH 8,0 - 1 : 0,015 M pH 7,3 - 2 : 0,03 M pH 7,3 - 3:0,06 M pH 7»O - 4i0,1 M pH 6,0. Používá fosfát pufor. Roztok získaný pri gelovej filtrácii dialyzuje proti 0,01 M fosfát pufru a pri tejto molarite získané frakcie znovu dá na uvedený iontomenié a filtruje ich pri tej istej molarite. Takto získá čistý IgG2 imunoglobulín. Ostatní autoři používajú viac alebo menej komplikované metody v podstatě zhodné a líšia sa iba v tom, že nevychádzajú pri frakcionovaní z celého séra, ale najprv izolujú IgG imunoglobulín v nečlstom stave za použitia vyměňovaných chemikálií, či už z krvného séra alebo z kolostra a takto získaný imunoglobulín frakcionujú na geloch, alebo na iontomeničoch.

Druhým predpokladom pre výrobu kvalitných monošpecif ických precipitačných sér je volba vhodného zvieraťa. Pre tento účel sa najčastejšie používajú králi, koza, osol a ošípaná. Dóležitým limitujúcim faktorom je aj imunizačný postup (miesto aplikácie, interval medzi jednotlivými aplikáciami antigénu, dávky antigénu, použitie alebo nepoužitie roznych adjuvancií a pod.). Imunizačné postupy sú v literatúre uvádzané velmi stručné, nakolko sa jedná o komerčně vyrábané preparáty, ktorých přesný výrobný postup je tajný. Spravidla sú imunizačné postupy zdíhavé a nie vždy zaručujú precipitačné séra žiadanej kvality. Pre ilustráciu uvádzam imunizačný postup pri získávání antiséra proti zvieraciemu gamaglobulínu. Autormi sú Semotán a kolektiv. Závěrečná správa „ Konjugáty, Bioveta, Ivanovice na. Hané 1974.

Prvý deň sa aplikuje 3 ml Freundovho adjuvans podkožně. .Ďalej sa podává intra vénám 1$~ný roztok gamaglobulínu po 1 ml na 9·, 12., 15·, 19·, 21., 26., 307 a 33-deň. Na J6, deň sa podá znova 3 ml Freundovho adjuvans podkožně. Na 44., 47. a 50.deň sa znova podá intra vénám po 1 ml 2%-ho roztoku gamaglobulínu. Na 53.deň sa podává opať adjuvans v uvedenom množstve podkožně. Imunizačný postup sa ukončí intra venóznym podáním 3$-ho gamaglobulínu na 60.,63. a 66.deň.

Z uvedeného vyplývá, že pri izolácii jednotlivých tried imunoglobulínov sa používajú poměrně komplikované metody za použitia drahých chemikálií a prístrojov, pričom nezaručia izoláciú bielkovín dostatočnej čistoty pre imunizáciu zvierat. Ďalej sa používajú zdíhavé imunizačné postupy, ktoré nezaručia vždy výrobu precipitačných sér žiadanej kvality. Z uvedeného vyplývá, že výroba monošpecif ických precipitačných sér si vyžaduje ďalšie zdokonalenie.

201 347

Podstata vynálezu spočívá v praktickom využiti vlastných práč, výsledkov výskumu získaných pri zistovaní dynamiky tvorby protilátok pri bruceloze hospodářských zvierat, pri imunizácii, resp.priebehu infekčného procesu. Pri imunizácii zvierat v začiatočnom Stádiu imunizačnóho procesu sú takmer Všetky protilátky viazaná výhradně na IgM triedu, v neskoršej fáze je protilátková aktivita viazaná na IgG triedu. Tak isto bolo zistené pri vlastných pokusoch, že brucelové protilátky viazaná na IgM triedu sú relativné termorezistentnejšie ako brucelová protilátky viazaná na IgG triedu. Protilátky IgM triedy sa dokonale ničia 10 min. zahriatím na 70 °C, pričom protilátky IgG triedy sú takmer nenarušené. Tieto dva momenty som využil pri výrobě monošpecifických zvieracích anti-IgM a anti-IgG precipitačných sér. To znamená, že izoláciu IgM imunoglobulínov možeme docieliť imunoadsorbčnou metodou za použitia brucelového antigénu, ak použijeme brucelové pozitivně sérum od imunizačných zvierat na 5. až ó.deň od začiatku imunizácie. Na izoláciu imunoglobulínov IgG triedy však třeba použiť krvné sérum od imunižačných zvierat, u ktorýoh uplynulo 14 až 15 dní od imunizácie, pričom sa protilátky viazané na IgM triedu odstránia inaktivovaním vo vodnom kúpeli pri 70 °C po dobu 10 minút. Protilátky viazané na povrch brucelového antigénu, teraz už ako antigén, slúžia na produkciu příslušného antiséra po aplikovaní vhodným pokusným zvieratám. Přitom sa zvolil taký imunizačný postup, aby malé množstvo imunoglobulínov viazané na povrch brucelového antigénu bolo dostatočné na výdatnú tvorbu protilátok. Třeba podotknúť, že brucelové protilátky príslušnej triedy sú tak pevne chemicky viazané na receptoroch brucelového korpuskulárneho antigénu, že ostatné sérové bielkoviny sa pri centrifugovaní (premytí) dokonale odstránia..Uvedené nedostatky za použitia popísaných vlastností brucelových IgG a IgM protilátok sa odstránia tak, že imunoglobulíny IgG a IgM triedy sú imunoohemicky naviazané na povrch brucelového antigénu pri použití vhodných brucelových sér. Takto získané imunoglobulíny spolu s korpuskulárnym brucelovým antigénom sa použijú na imunizácia králikov. Přitom je volený taký imunizačný postup, ktorý i pri nízkom množstve imunoglobulínov IgG a IgM triedy zaručí tvorbu a tým aj výrobu kvalitných monošpecifických precipitačných sér za relativné krátku dobu.

Sposob výroby monošpecifických precipitačných sér pre diagnostické účely vyznačuje sa tým, že na imunizáciu zvierat s výhodou králikov sa použije korpuskulárny bakteriálny antigén,s výhodou brucelový, pre pomalú aglutináciu Specificky imunoadsorpčne obsadený protilátkami róznych tried imunoglobulínov, ktorý sa aplikuje dokonale premytý (aspoň 3 x) s výhodou vo fyziologickom roztoku chloridu sodného o koncentrácii 0,85 Při imunizačnom procese s výhodou s kompletným Freundovým adjuvansom subkutánne (medzi prsty predných a žádných končatín) a intramuskulárne, připadne do žily bez adjuvansu.

POPIS VYNÁLEZU

1. Příprava brucelového pozitívneho séra s obsadením IgG a IgM protilátok :

Velkým zvieratám (hov&dzí dobytok, kóň) sa na prvý a druhý deň intra vénám aplikuje ml brucelového antigénu pre pomalú aglutináciu. Obdobný je imunizačný postup aj u menších zvierat (ošípaná, ovca, koza) s tým rozdielom, že aplikujeme iba 2 ml antigénu, Krv sa odoberá najprv na 5· a 6,deň pre výrobu monošpecifických anti-IgM precipitačných sér a drhýkrát na l4.až 15.deň na výrobu anti-IgM precipitačných sér. Odobratú krv necháme zrazit a centrifugáciou pri 2000 g po dobu 30 minút získáme číře sérum. V případe, že sa sérum ihned nespracuje, konzervuje sa lyofilizovaním alebo zmrazením pri -20 °C. Takto konzervované sérum je použitelné pre uvedené účely po dobu 2irokov.

2. Příprava brucelového antigénu senzibilizovaného protilátkami IgM a IgG triedy :

Výroba anti-IgM precipitačného séra :

Pre výrobu monošpecifického anti-IgM precipitačného séra sa použije pozitivně sérum od příslušného druhu, ktoré sme odobrali na 5>až ó.deň po prvej aplikácii antigénu. Sérum sa inaktivuje pri 60 °C po dobu 30 min. vo vodnom kúpeli. Sérum sa vyšetří na hladinu brucelových protilátok pomocou skúmavkovej aglutinácie podlá platných vyšetřovacích metod.

Aby sa docielilo čo najdokonalejšie obsadenie všetkých receptorov brucelového antigénu, použije sa 8 až 16 násobné množstvo brucelových protilátok, ktoré sú v pomalej aglutinácii schopné aglutinovať všetky bručely (aglutinácia na ++++). N příklad, ak má sérum titer 1ÓO znamená to, že jedna jednotka brucelového antigénu (0,05 ml) je aglutinovaná sérom v zriedení Í:16O. V tomto případe použijeme na jednu jednotku antigénu polovičné alebo rovnaké množstvo pozitívneho brucelového séra. Sérum sa v požadovanou! pomere zmieša s brucelovým antigénom a inkubuje v termostate pri 37 °C po dobu 4 až 8 h a potom cez noc v chladničke . , . o , , pri + 4 az + 6 C, Antigen je plné obsadeny protilátkami vtedy, ak supernatant antigénu po odcentrifugovaní ešte obsahuje brucelové protilátky, t.j. v rýchlej aglutinácii na sklíčku aglutinuje brucelový antigén. Ak to nie je tak, přidá sa ešte k brucelovému antigénu sérum a inkubácia sa prevedie rovnakým spósobom ako predtým.

Brucelovými látkami obsadený antigén potom odcentrifugujeme po dobu 10 min, pri 2000-g a sediment 4x premyjeme vo fyziologickom roztoku NaC1 v póvodnom objeme. Po poslednom centrifugovaní sediment resuspendujeme v takom množstve fenol-fyziologickom roztku (obsah fenolu 0,5% ), aké množstvo antigénu sme povodně použili na senzibilizáciu. Antigén pomocou sterilných buličiek roztrepeme. Takto senzibilizovaný antigén uchovávaný pri teplote +4 až +8 °C je použitelný na imunizáciu králikov aspoň jeden rok.

Výroba anti-IgG precipitačného séra :

Ne, výrobu monošpecifického anti-IgG precipitačného séra sa použije krvné sérum odobraté na l4.až 15.den po imunizácii příslušného druhu zvierat. Sérum sa zriedi rovnakým dielom s 0,85 % roztokom NaC1 a inaktivuje sa v ultratermostate po dobu 10 min. pri teplote 70 °C. Pri takejto inaktivácii séra spravidla stratia aglutinačnú schopnost alebo aglutináciu vyvolávajú zonove, t.j., že aglutinácia nevznká tam, kde sa nachádza najvačšie množstvo protilátok, ale vo vyšších zariadeniach. Pri tejto inaktivácii sa IgM protilátky dokonale odstránili a zostali iba protilátky viazané na IgG triedu imunoglobulínov. Titer protilátok však meritorne móžeme dokázat iba antiglobulínovou technikou podlá Coombsa vo vlastnej modif ikácii .

201 347

Na senzibilizáciu antigénu použijeme 8 až 16 násobné množstvo protilátok na jednu jednotku ántigénu (0,05 ml), ktoré je schopné vyvolat aglutináciu na ++++ v modifikovanom antiglobulinovom teste. Například, ak má sérum titer 640, tak na 1 ml brucelového antigénu použijeme 2 alebo 4 ml brucelového séra inaktivovaného uvedeným spósobom. Pri určení titra brucelóvých brucelových protilátok v modifikovanom antiglobulínovom teste nesmieme zabudnut na to, že sa pracuje so zreideným sérom. Premytie antigénu sa robí obdobným spósobom ako pri přípravě senzibilizovaného antigénu IgM protilátkami s tým rozdielom, že ho centrifugujeme po dobu 3θ minút pri 6000 g. Po poslednom premytí antigén resuspendujeme vo fenofyzi&ogickom roztoku ako pri přípravě IgM antigénu. Použitelnost tohto antigénu je zhodná s predchádzajúcim.

3. Imunizácia králikov pre výrobu monošpecifických anti-IgG a an±i*lgM precipitačnýčh sér pre jedneitlivé druhy zvierat :

Imunizačný postup je tobžný pre obe triedy bez ohl’adu na triedu imunoglobulínov. Na imunizáciu použijeme králíky vo váhe 4 až 6 kg. Prvá imunizácia králikov sa robí do kože medzi jednotlivými prstami predných a žádných noh tak, že na dvoch miestach každej nohy aplikujeme po 0,25 ^ml antigénu. Antigén pre prvá a druhá imunizáciu sa připraví s kompletným Freundovým adjuvansom tak, že na 1 ml brucelového senzibilizovaného antigénu (antigén sa musí dokonale premiešať, nakolko státím sedimentuje), přidáme 1 mi Freundovho adjuvansu a brucelovú suspenziu s adjuvansom zhomogenizujeme pomocou injekčnej striekačky. Asi desetkrát sa obsah natiahne a energicky vystriekne zo striekačky. Pri prvej imunizácii připadá na jedného králika objem dva ml (1 ml brucelového antigénu a 1 ml adjuvansu). Druhá imunizácia králikov sa robí na l4.deň intra-muskulárne do stehenného svalu rovnako připraveným antigénom ako pri prvej imunizácii v dávke 1 ml. Tretíkrát sa aplikuje antigén bez adjuvansu na 21.deň do ušnej marginálnej žily v dávke 1 ml na králika a na 22.deň. sa rovnako aplikuje ten istý antigén (bez adjuvansu) v dávke 1 ml na králika.

Králíky sa vykrvia na 5»áeň po posledněj aplikácii antigénu a sérum sa získává tak, že krv sa nechá koagulovat. Po oddělení krvného koláča od steny centrifugačného pohára vloží sa do termostatu na 1 h. Potom sa krv centrifuguje po dobu 30 min pri 3000 g a číře s_rum sa stiahne injekčnou striekačkou.

Precipitačné séra sa vyšetria imunoelektroforeticky proti celému krvnému séru, alebo východiskovej telnej tekutině příslušného druhu zdravého zvieraťa. Obdržíme iba jednu výrazná precipitaěnú liniu charakteristická pre daná triedu imunoglobulínu. Markantnějšie sú však rozdiely, kecl sa precipitačné séra vyšetria na precipitačnú aktivitu. Táto sa dokazuje jednoduchou radiálnou imunodifúznou metodou tak, že sa do gelu (agar alebo agaróza) inkorporuje příslušný antigén (imunoglobulin) a do dierok sa přidává rovnaké množstvo vyrobených precipitačných sér, Precipitačné sérum je tým kvalitnějšie, čím vznikne váčší a výraznější ostro ohraničený precipitačný kruh za ten istý čas. Touto metodou kontrolované pre cipitačné séra vyrobené podía vynálezu, vykazujú až dva až páťkrát váčšiu precipitačnú aktivitu v porovnaní s inými metodami na výrobu precipitačných sér. Okrem toho nie je zanedba

201 347 telná přednost navrhovanéj výroby aj to, že sa precipitačné séra vyrobia za kratáiu dobu a netřeba použit komplikované izolačně métody ňa izoláciu a purifikáciu imunoglobulínov různých tried, aby sme ich dostali v imunochemicky čistom stave. Vyššia účinnost (precipitačné aktivita) sa vysvětluje tým, že pokusné zvipratá dost zle tvoria protilátky (precipitíny) proti čistým imunoglubulínom, ale relativné dobré tvoria protilátky proti nečistotám (iný druh bielkovín), ktoré móžu obsahovat, i ked v nepatrných množstvách Po adsorbcii na bakteriálny „nosič však imunoglobulíny sa stanů pre pokusné zvieratá ovela potentnejšlm antigénom, ktoré potom proti nim výhodnejšie tvoria precipitíny. Nedá sa však zanedbat ani potencujúci účinok samotného bakteriálneho nosiča, najmá obsahu polysacharidov na imunitný systém pokusného zvierata. Tým sa dosiahne tvorba vačŠieho množstva precipitínov za krat• šiu dobu u imunizovaných zvierat, čo je podstatou vynálezu.

Claims (1)

1. PREDMET VYNÁLEZU

   Sposob výroby monošpecifických precipitačných sér pre diagnostické účely, vyznačujúci sa tým, že sa zvieratá, s výhodou králíky, imunizujú korpuskulárnym bakteriálnym antigénom, s výhodou brucelovým, pre pomalú aglutináciu, ktorý je specificky imunoadsorbčne obsadený protilátkami róznych tried imunoglobulínov, pričom uvedený antigén sa minimálně trikrát premyje fyzilogickým roztokom chloridu sodného a pre prvu a druhu imunizaciu zvierat sa antigen zmieša kompletným Preundovým adjuvansom a aplikuje sa subkutánne medzi prsty predných a žádných končatin a intramuskulárne a pre tretiu imunizáciu sa aplilqjje antigén bez adjuvans intrávenozne a následné sa zvieratá vykrvia a sérum sa získá po koagulácii odstránenim krvného koláča.