CS200022B1 - Method for the isolation of cephalosporin c from fermentation substrate - Google Patents

Description

POPIS VYNÁLEZU

K AUTORSKÉMU OSVEDČENIU 200 022 (II) (Bl) ČESKOSLOVENSKASOCIALISTICKÁREPUBLIKA( 18 )

(61) (23) Výstavná priorita(22) Přihlášené 07 07 78(21) PV 3690-78 (Sl)lnt.CI. C 07 D 501/1

ÚŘAD PRO VYNÁLEZY

A OBJEVY (40) Zverejnené 30 11 79(45) Vydané 01 02 83 (75)

Autor vynálezu PRIMM RICHARD doc. ing. CSc., BRATISLAVALUCINOVÁ EVA ing., BABSKÁ BYSTRICA aWELWARD LADISLAV ing. CSc.. BABSKÁ BYSTRICA (54) Spoeob izoláoie cefaloeporínu C z fermentačnej pody 1

Vynález sa týká sposobu izolácie cefaloeporínu C z fermentačnej pody prl súčasnomsnížení obsahu nežiadúcich nečistot v izolovaném produkte.

Izolácia a Slstenie cefaloeporínu C navazuje na jeho přípravu fermentačnou cestou. Jeznáme, že keá fermentujeme živná mádlům určitými mikroorganlzmarni například kmeňom Cepha-losporium acremonlum ATCC 14553 obsahuje mádlům biologicky aktívnu látku /Craeford K. akol.t Antibiotio production by a species of Cephaloeporium. J. Cen. Microbiol. 6 /1952/,etr. 47 - 59} Bewton Q. G, F., Abraham E. P.j Cephaloeporium C a new antibiotic contai-nlng sulphur and 0-amlnoadlpic acld. Batuře 175 /1955/, etr. 548; Hewitt W, L.s The cep-halosporlns. The Journal of Infeetions Diseares 128 /1973/, etr. 312. Tieto fermentačnápostupy sú uvedené tiež vo Svajčiarskych patentech 565246, 570459, 570460, v BSR pat. 8. 1 492 053, 2 239 321, USA pat. 8. 3 082 155, v brit. pat. 8. 820 422. Tieto patenty obsa-hujú tiež postupy získavania a čistenia cefaloeporínu C zo surověj fermentačnej pody, za>hrňujúce tieto následné operáclet acldifikácia, flltrácia, dekolorizácia, odstránenieanorganických lontov, adsorpclu antibiotika a elúclu. Bodla iných izolačných postupov na-pr. US pat. 8. 3 739 002, 3 931 161, 3 835 129, BSR pat. 8. 2 157 693, 2 255 973, pat. ZSSR 8. 282 174 sa cefalospoxín C z fermentačnej pody získává vo formě rosných B-halogen- alkanoyl 81 B-benzoyl derivátov, ktoré sa áalej prevedú na soli. Významnou skupinou izola8ných postupov sú postupy založená na principe delenia bázic- kých a aoidických látok pomoeou syntetických ionexov. Tieto izolačně postupy a roznymi 200 022 200 022 úpravami fermentadnej pody, obměnami použitých ionexov a kombinécií ionexov rosného stupňabázicity, resp. acidity popisuje například franc. pat» δ» 1 210 823, US*«*t. δ, 3 467 654,pat, NSR č. 1 125 564 a 1 617 456 a švéd. pat. č. 215 561.

Hydrofilné antibiotiká, medzi ktoré patří tiež cefalosporin C sa možu zo složitýchzmesí napr. zo surověj fermentadnej pody obsahujúoej velké množstvo organických a anorga-nických zlúčenín, zíekaí pomocóu makroporéznych neionogénnych aorbentov typu AmberliteXAD-2, resp. XAD-4, Diaion HP-20, resp. Ostion SP-1, resp. SP-2.

Izolácia týmito sposobmi je uvedené napr. v US pat. d, 3 725 400, švéd. pat, δ. 541 579 a v pat. ZSSR δ, 350 265. Pódia uvedených spoeobov sa antibiotikum získané pomocouneionogénnych sorbentov áalej purifikuje na slabo béziokých anexoch /napr. typu AmberliteIRA-68, IR-4B, IR-45, XB-265 alebo IMAC A 131 a A 17 i?/»« Z takto přečištěného filtrátu samože po jeho prípadnom zahuštění Izolovat cefalosporín‘0 bud vo formě voinej kyseliny, ale-bo vo formě solí s alkalickými kovmi, resp. kovmi alkalických zemin, amonných solí, či so-lí s organickými bázemi, alebo tiež vo formě ťažkorospustných komplestov s tažkými kovmiako sú Cu, Hg, Mn a hlavně Zn, Kvalita Zn komplexu a rýchlosí jeho zrážania sú vo veíkejmiere závislé od obsahu znečistenín, hlavně rozkladných tlobuténových kyselin, vznikajú-cich v priebehu biosynťézy cefalosporínu C z metloníau /N. Bená aj.t Metionine Metabolismand CFS-C Synthesis in Cephalosporium acremonium. Kur» Bleohem. 20 /1971/, etr. 81-88} J, Nuesoh H, J. Treichleťt Genet. Ind, Macroorg., Prague, 1973, etr. 324-325/.

Purifikácia cefalosporínu C si doteraz vyžadovala dvojstupňový postup, pozostávajúolz Sistenia na neionogénnych živiciach a néslednom diatení na anexe. Túto zložitoeí doterajších izoladných postupov odstraňuje předložený vynález, ktoréhopredmetom je sposob izolácie cefalosporínu C z fermentadnej pody upravenej močovinou, spra-cováním filtrátu okyslenej fermentadnej pody neionogénnymi sorbsntami, desorpoiou vodnýmroztokom n-butanolu alebo acetátovým tlmivým roztokom a vyzréžaním cefalosporínu C z eluá-tov do formy voínej kyseliny, nerozpustných solí, alebo zrážsním v podobě íažko rozpustnýchkomplexov, Týmto sa celý postup zjednodušuje na jednostupňovú purifikáciu na živiciach bez dodis-íovánia na anexe.

Cefalosporin C sa sorbuje na živicu z roztoku - obvykle z filtrátu fermentadnej pody- kde je přítomná aj velké množstvo látok podobných tomuto antibiotiku z hlediska fyzikál-ně j a chemickéj povahy, Cefalosporin C sa adsorbuje kvantitativné, neadsorbuje sa všakvadšia dasí nečistot, ktoré přešli ešte do filtrátu zo surověj fermentadnej pody.

Antibiotikum naadsorbované na sorbente sa z něho desorbuje 3 až 6,5% vodným roztokemη-butanolu, alebo 0,05 až 1 M vodnými roztokmi aoetátováho tlmlváho roztoku o pH 4,0 až7,0.

Vhodná pracovná oblasí pH neionogénnych sorbentov je 1 až 8 s výhodou 2 až 3. Na tú-to hodnotu sa surová fermentadná podá, predóm upravená s 5 až 10 mg/ml močoviny, obsahujú-ca cefalosporin C može upravil bud katexami v H* formě, alebo roznymi kyselinami, najdastejšie kyselinou sírovou, chlorovodíkovou, fosforečnou, šíavelovou. Ako neionogenné sorbentypre izoléciu cefalosporínu C dobré použitelné sú syntetické živice o velkosti pórov 4 až20 mm, mernom povrchu 100-1000 m2/g a velkosti častíc 0,3 až 1 mm. Sú to například sorben- 200 022 ty typu Oetion SP-1 a SP-2, .Amberlité XAD-2 a XAD-4, Diaion HP-20, ktoré aú kopolymérmistyrénu s divinylbenzénom. Sorbenty sa regenerujú vodnými alebo vodno-acetonovými alkalic-kými roztokmi napr. 25% vodným roztokom acetonu, obsahujúcim 2 % NaOH. Výhodná je tiež re-generácia vodným roztokom NaOH s následným premývaním živice acetónom. Na regeneráciu samóže tiež použií vodný roztok alkalického chlornanu a zbytok oxidovadla odstránit vhodnýmredukčným činidlom. Z takto získaných eluátov obsahujúcich rozpuštěný cefalosporín C sa vyzráža cefalo-sporín C vo formě nerozpustných solí alebo komplexov z tažkými kovmi,

Prednosíou postupu izolácie cefalosporínu C podía předloženého vynálezu je zjednodu-šené získánie antibiotika sposobom zaistujúcim súčasne získánie produktu z dostatoČnoučistotou potřebnou napr, pre chemickú konverziu na 7-aminocefalosporínovú kyselinu. Před-mět vynálezu je áalej podložený príkladmi, ktoré však rozsah vynálezu neobmedzujú. Příklad 1 K surověj fermentačnej pode sa přidá 10 mg/ml močoviny a hodnota pH sa upraví s kyse-linou sírovou zriedenou s vodou v pomere 1»4 na pH 2,6, Biomasa a áalšie zložky sa oddeliaa získá sa číry roztok z obsahom 3000/x4g/ml cefalosporínu C, 5000 ml tohoto filtrátu sapodrobí perkolácii cez 4000 ml Ostionu SP-1 pri meraom zaíažení 1 hodina*"1, Zbytok adsor-bátu sa odstráni dvomi litrami vody. Zo sorbentu sa cefalosporín C eluuje 6,2% vodným roz-tokom n-butanolu. Získá sa 2540 ml hlavných eluátových frakcií obsahujúcich 43θθ,*β cefa-losporínu C v 1 ml eluátu. K takto získanému eluátu sa za chladenia a miešania přidá 5 mgoctanu zinočnatóho v pevnej formě na 1 mg cefalosporínu C přítomného v eluáte. Po 30 minu-tách miešania sa ešte přidá 2500 ml acetonu. Po 5 hodinách miešania pri teplote 3 až 5 °Csa v matečných lúhoch nameralo 200^ag cefalosporínu C v 1 ml. Vylúčený, tažko rozpustnýZn-komplex cefalosporínu C sa oddělí, premyje studenou vodou, acetonem a vysuší. Týmtopostupem sa získá 11,8 g Zn-komplexu CPS-C o čistotě 85,3 %.

Použitý sorbent Ostion SP-1 sa regeneruje 1212% vodného roztoku NaOH. Náplň sa po-tom premýva 2 1 vody, 411% kyseliny sírovej a potom znovu 8 1 vody. Za týmto sa náplňpremyje 151 acetonu a nakoniec sa dokonale premyje vodou. Měrné zataženie vo všetkých Μ — 1 stupnoch sa pohybovalo v rozmédzí 1 až 2 hodiny . Příklad 2

Postupuje sa ako v příklade 1, s tým rozdielom, že na elúciu cefalosporínu C zo sor-bentu sa použije 3,2% vodný roztok n-butanolu a filtrát sa spracuje na sorbente DiaionHP-20, Na 250 ml náplně Diaion HP-20 sa adsorbuje 500 ml kyslého filtrátu obsahujúceho3400/4g/ml cefalosporínu C. Po desorpcii cefalosporínu C zo sorbentu za použitia vyššieuvedeného eluentu sa nameria v eluátoch 73 % z povodně purifikovaného množstva cefalospo-rínu C, K eluátu, ktorý obsahuje 7500/cg cefalosporínu C v 1 ml, Ba přidá 8 mg octanu zi-nočnatého na 1 mg cefalosporínu C a potom 1,25 ml acetonu na 1 ml eluátu. Získá sa 1,3 gZn-komplexu cefalosporínu C o čistotě 80 %.

Claims (3)

1. 200 022 Použitý sorbent Diaion HP-20 sa regeneruje postupom uvedeným v příklade 1, Příklad 3 Postupuje sa ako v příklade 1, s tým rozdielom, že na desorpciu cefalosporínu C zosorbentu SP-1 sa použije 0,2 M vodný roztok octanu amonného o pH 5,5. 5000 ml filtrátu zís-kaného postupom v příklade 1 a obsahujúcom 2850 z«g/ml cefalosporínu C sa purifikuje na sor-bente Ostion SP-1. Po desorpeii cefalosporínu C za použitia hoře uvedeného roztoku octanuamonného sa získá 3100 ml hlavných eluátových frakcií, ktoré obsahovaly δΟδΟ^β/ιηΙ cefalo-sporínu C. V sekundárných eluátových frakciách sa namerla 5,2 % z povodně purifikovaného.množstva cefalosporínu C. Hlavné eluátové frakcie sa rozdelia na dve časti a připraví sa A Zn-komplex cefalosporínu C nižáie uvedenými sposobmi. Jedna část eluátov sa zráža 8 mg octanu zinočnatého na 1 ml cefalosporínu C a 1 mlacetonu na 1 ml eluátu. Získá sa 6,6 g Zn-komplexu cefalosporínu C o čistotě 81,5 %· V druhéj časti eluátov sa hodnota pH z povodněj 4,7 upraví s hydroxidom amonným nahodnotu 5,3 a potom sa zráža ako v prvej časti. Získá sa 8,1 g Zn-komplexu cefalosporínuC o čistotě 77 %. Příklad 4 500 ml filtrátu sa purifikuje na 250 ml náplně sorbentu Diaion HP-20 sposobom uvede-ným v příklade 3, s tým rozdielom, že na elúciu sa použije 0,05 M octan amonný o pH 4,2.Získá sa eluát obsahujúci 7800/4řg/ml cefalosporínu 0, v ktorom je přítomné 75 % z purifi-kovaného množstva cefalosporínu C, Z takto získaného eluátu sa postupom uvedeným v příkla-de 1 připraví Zn-komplex cefalosporínu C o čistotě 87 %. Příklad 5 Postupuje sa ako v příklade 3, s tým rozdielom, že cefalosporín C sa zo sorbentu SP-1desorbuje 1 M vodným roztokem octanu amonného o pH 6,9 a na vyzrážanie Zn-komplexu cefa-losporínu C z eluátu sa použije 10 mg octanu zinočnatého na 1 mg cefalosporínu C a 1,5 mlacetonu na 1 ml eluátu. Získá sa jemná sraženina Zn-komplexu cefalosporínu C o čistoto80 % a množštve 68 % z purifikovaného množstva cefalosporínu C. PREDMET VYNÁLEZU 1· Spoeob izolácie cefalosporínu C z fermentačnej pody, spracováním získaného filtrátu okyslenej fermentačnej pody neionogennými sorbentami vyznačujúci sa tým, že desorpcia na živici adsorbovaných zložiek sa robí elúciou vodným roztokom n-butanolu, alebo ace- tátovým tlmivým roztokom, pričom z takto získaných bohatých eluátov Ba získajú vyzráža- 200 022 ním íažko rozpustné soli, alebo komplexy cefalosporínu C, ktoré sa odseparujú a vysušia,
2. 2. Sposob pódia bodu 1, vyznačujúci sa tým, že ako elučné činidlo sa použije 3 až 6,5%vodný roztok n-butanolu.
3. 3. Sposob podía bodu 1, vyznačujúci sa tým, že ako elučné činidlo sa použije 0,05 až 1,00M acetátový tlmivý vodný roztok zložený z kyseliny octovej a hydroxidu amonného, majúcipH 4,0 až 7,0.