CS195568B1 - Preparation for insolubilization of proteins and products from their reaction with other compounds,especially saccharides or lipides - Google Patents

Description

Vynález se týká přípravku, který slouží k ínsolubílisaci rozpustných bílkovin nebo sloučenin bílkovin s jinými látkami, zejména se sacharidy nebo lipidy. Přípravek podle vynálezu je vhodný i k insolubílisaci dalších forem bílkovin, např. jejich ko^pexu s ionty kovů nebo s koenzymy.

Insolubilisované bílkoviny a jejich sloučeniny s jinými ' látkami nacházeií Široké pouuití jako adsorbenty pro biospecifickou chromaaoggrafi. Dosud se využívá existence specifických vazebných míst na bílkovinách jako jsou substráty nebo inhibitory enzymů, antigeny, protilátky nebo lektiny k tomu, aby se látka, která s vazebnými místy interaguje, odddlila ze sm^si jiných látek, jako jsou komplexní maateidly původu rostlinného, Živočišného nebo oikrrobááního. Dooahuje se tak rychlého a účinného čištění látek nejrůznélší chemické povahy> pokud jsou rozpustné ve vodě. Proces bioepecifické adsorpce a desorpce se může provádět jak způsobem sl^^covým^ tak vsádkovým.

Insolubblisace se podle dosud známých postupů řeší buú imobílsa c í, t j. navázáním bílkovin na nerozpustný nosičinebo kopo^me“ rací rozpustných bílkovin s báfunkčníoá níz^ιηο^^uárními látkami. Njj^čattlji se používaáí nosiče na bázi granulovaných gelů zesilovaných polysacharidů nebo polyakrylamidu. Tyto gely však nevykazuúí dostatečnou pevnost při oaankPUaci a jejich pouuití zůstává om^e^eno převážně na laboratorní práce. Podobně nepříznivé meehhnické vlastnosti maáí i nerozpustné kopolymery bílkovin s nízkomolekulárnioi látkami.

V nejnovvěší době byl vynalezen způsob polymerace rozpustných bílkovin s dialdehydy, který se provádí v ^^оопо^. jemně granulovaných polyesterů podle čs. autor, osvědčení č; 190 863. Kopolymer bílkoviny s diaddehydem obalí částice polyesteru tenkou nerozpustnou vrstvou o velk^é^m povrchu. Výhodou tohoto postupu je, že takto připravená nerozpustná bílkovina je ve formě rigidních částic a lze ji ze suspenzí snadno ^děLt filtrací nebo odstředěním. Nevýhodou tohoto postupu však je, že k jeho uskutečnění je třeba poměrně vysoké kvaaifikace pracovníků, kteří jej realizují, nebot jde o reakci v heterogenním systému za přísného dodržení konccntrací látek. Proto byl tento známý postup vyyžíielný pouze na pracovištích spe^a^ov váných na práce s biologc^ými maa г om ole к и lami .

Uvedený nedostatek tohoto jinak velmi výhodného postupu odstraňuje přípravek k jeho provádění podle vynálezu. Poddtata vynálezu spočívá v tom, že přípravek pro insoduuílásaci bílkovin a jejich sloučenin s j^ými látkami, zejména se sacharidy nebo lipidy sestává ze tří samolSa0ných složek, z nichž první složka je tvořena 1 až 40% hmt, jemně granulovaného polyesteru suspen dováného ve vodě nebo ve vodném roztoku látek tlumicích změny pH, druhá složka je tvořena 5 až 40% hmoo, vodným roztokem dialdehydu a třetí složka je tvořena 0,1 až 5% hmt, vodným roztokem dialdehydu vztaženo vždy na hmoonost každé z těchto samoosatných složek. Je výhodné, z hlediska dlouhodobé stability přípravku, jesdiže první složka je tvořena pllynsteeeo aromatických aminokyselin a ethylenglykolu. Jako dialdehydu se ve druhé a třetí složce zpravidla použije glutaraldehydu, ale je možno pouuit i jiných dialdehydů jako např. glyoxalu. Dále je výhodné, jestliže vodný roztok látek tlumicích změny pH je tvořen roztokem primárního a sekundárního fosforečnanu sodného nebo draselného.

V praktik^ém provedeni je každá z těchto samosatných složek umiítěna v samostatné nádobce a teprve při uskutečnění postupu dojde k jejich smísení tak, že se nejdříve smísí první a druhá složka a když proběhne aktivace polymeru v první složce, sraní se kapalná fáze a aktivovaný polymer se smísí s roztokem bílkoviny a s třetí složkou. Reakce se nechá proběhnout a insolubiLlisovaná bílkovina se oddělí, např. filtrací a promytim se zbaví rozpustných reakčních produktů. Tím je pouzžií přípravku podle vynálezu ukončeno.

Jak je zřejmé z uvedeného popisu pouHtí přípravku podle vynálezu, je jeho výhodou především to, že umooňujl provést podle shora posledně uvedeného, jinak velmi výhodného, postupu insolubilisaci i pracovníkům relativně velmi málo kva^ík^vaným, což je důležité zejména ve zdravotnických zařízeních a . podnácich.

Vyyález je blíže vysvětlen pomoc-i dále uvedených příkladů jeho provedení.

Příklad 1

Přípravek pro iaeolubilieaci podle vynálezu sestával ze 100 mg práškového polyethyуennereftalátu suspendovaného v 1 ml vody. Tato první složka byla umístěna ve skleněné uzavřené nádobce. Druhá složka přípravku byla tvořena 1 ml 20% vodného ’ roztoku glutaraldehydu umístěného ve skleněné ammull. Třetí složka tyla tvořena 0,5 ml 1% vodného roztoku glltaraleehslu umístěného v oddělené skleněné ampU·. Všechny tři složky'byly uskladněny v chladnici při +4 °C.

Při vlastním přípravku podle vynálezu byla k první složce přidána druhá složka z ampule a obsah skleněné nádobky byl protřepán. Směs první a druhé složky byla ponechána 40 hodin při laboratorní teplotě. Pak byl polymer (dfíltrován, na filtru promyt 10 ml fksfákového pufru pH 7,0 a suspendován v 5 ml 1% roztoku lidského imunaklobulinu G ve fosfáoovém pufru pH 7,0. Suspenze byla intenzivně míchána eleУtrCykým míchačem. Za míchání byla přidána třetí složka. Míchání suspenze pokračovalo dvě hodiny. Polymer s iaekl1bil.So^^^ι^r^ku bílkovinou byl pak od^lt^ván, Ve filtrátu bylo měřením optické absorpce při 280 nm stanoveno mnnkžSví nenavázané bílkoviny a z rozdílu vypočteno/ že na částicích polymeru bylo taeklubilteováno 96 % přidaného lidského tmunaogo0b1inu G.

Příklad 2

Přípravek pro iaekl1bílisaci podle vynálezu sestával z 200 mg práškového pklyprkppSleatleetalátu suspendovaného v 1,5 ml fosfátkvého pufru pH 8,0. Tatk· první složka byla umístěna ve skleněné amppul. Druhá složka přípravku byla tvořena' 2 ml 0,2% vodného roztoku glyoxalu umístěného v oddělené skleněné ampuUi. Všechny tři složky byly uskladněny v chladnnc při +4 C.

Při uou1ití byl obsah an^le s první složkou a ampule s druhou složkou smíchán ve skleněné nádobce. Uzavřená nádobka byla umiítěna do termootatu s teplotou 40 °C na dobu 16 hodin. Pak' byl polymer odf til. roován a ihned suspendován v 5 ml 0,8% lidského slrumalb1lmiau v octanovém pufru pH 4,0. Suspenze byla intenzívně míchána kým michaHem. Za míchání byla po kapkách přidávána třetí složka. Míchání suspenze pokračovalo při laboratorní teplotě tři hodiny. Polymer s inso lub i 1isovanou bílkovinou byl od diltrován. Ve filtrátu bylo mířlaím optické absorpce při 280 nm stanoveno množství nenavázané bílkoviny a z rozdílu vypočteno., že na částicích polymeru bylo inekl1biisoováno 76 % přidaného lidského seirunalbuminu.

Příklad 3

Přípravek pro íos! lub Visací sestával z 1 g práškového polyesteru kyseliny tereftalové a kyseliny eU.ioieoit al o vé s ethyl^g^k-olem suspendovaného ve 20 ml vody, jejíž pH bylo nastaveno primárním fosforečnanem d^senným na 5,2. Tato první složka byla umíítěaa ve skleněné lahvi ťuzávěrem z polyethylenu. Druhá složka byla tvořena 10 ml 40% vodného roztoku glutaraldehydu 'umiítěného ve skleněné ' amppH. Třetí složka byla tvořena 1 mí 3% glutaraldehydu umístěného v oddělené skleněné ampuUi· Všechny tři složky byly uchovávány v chladaici při +4 °C. .

Při pou1ití byl obsah ammule s druhou složkou přidán do láhve obsahnuicí 'první složku, směs byla promíchána a ponechána 20 hodin při laboratorní teplotě. Pak byl polymer odfiltoován a po phívSí vodou suspendován v 25 ml 1% vodného roztoku lidského imunoolkb uHnu A ve fosfákvvím pufru pH 6,0. Suspenze byla iatlazívaě míchána mmgnntickým míchadlem. Za míchání byla přidána třetí složka.. Mícháni suspenze pokračovalo při laboratorní teplotě 4 hodiny. Polymer s iasol1bilSovvano1 bílkovinou byl kdliltkováa· Ve filtrátu bylo mířloím optické absorpce při 280 nm stanoveno množství nenavázané bílkoviny a z rozdílu vypočteno, že na částicích polymeru bylo iasklubilsoováno 89 % lidského tmunao;lobultou A.

Příklad 4

Přípravek pro iaeol1bilieaci sestával ze 100 mg práškového polylthy1enaerlftalát1 eueuendkvaoého ve 2 ml fosfátového pufru pH 7,2. Tato první složka byla umiítěna v uzavřené skleněné lahvičce. Druhá složka byla tvořena 0,5 ml 25% vodného roztoku glutaraldehydu umístěného ve skleněné ampu1i· Třetí složka byla tvořena 0,5 ml 1% vodného roztoku glutaraddehydu umístěného v oddě- ' lené skleněné amρu1i, Všechny tři složky byly uchovávány v chladnici při +4 °C.

Při p^i^uítí byl obsah ammule s druhou složkou přidán do lahvičky obsahnuicí první složku, obsah byl promíchán a v uzavřené lahvičce umiítěn na 10 hodin do ter^mas^^atu s teplotou 37 °C. Pak byl polymer kdlfltrován a po prom^yí vodou suspendován v 2,5 ml 1% roztoku alfa-1 kyselého glykopnu v octanovém pufru pH 4,6.

Suspenze byla míchána magnntickým michadlem. Po 25 minutách míchání byla po·kapkách přidána třetí složka. Mícháni suspenze pokračovalo ještě dvě hodiny při laboratorní teplotě. Polymer s tnskluiiteloaaýým glykouroteanem byl odliltkováa· Ve filtkátu bylo měřením optické absorpce pří 280 nm stanoveno maože^ví nenavázaného glykkpkkteia1 a z rozdílu vypočteno, že na částicích polymeru bylo iaekl1iilSokváak 88 % alfa-1 kyselého nlskkpr^,o0liau· \

Přípravku podle vynálezu je možno použít zejména v oblasti zdravotnictví, farmacie a biologického výzkumu к selektivní biospecí-

Claims (3)

1. PŘEDMĚT

   1. Přípravek pro insolubi 1 isaci bílkovin a jejich sloučenin s jinými látkami, zejména se sacharidy nebo lipidy, vyznačující se tím, že sestává ze tří samostatných složek, z nichž první složka je tvořena 1 až 40 % hmot, jemně granulovaného póly’ esteru suspendovaného ve vodě nebo vodném roztoku látek tlumících změny pH, druhá složka je tvořena 5 až 40% hmot, vodným roztokem dialdehydu a třetí složka je tvořena 0,1 až 5% hmot, vodným roztokem di fické izolaci látek, jako např. protilátek z imunních sér.

   VYNÁLEZU aldehydu, vztaženo na hmotnost každé z těch to složek.
2. 2. Přípravek podle bodu 1, vyznačující se tím, že první složka je tvořena polyeste ry aromatických kyselin a ethylenglykolu.
3. 3. Přípravek podle bodu 1 a 2, vyznačující se tím, že vodný roztok látek tlumících změny pH je tvořen roztokem primárního a sekundárního fosforečnanu sodného nebo draselného.