CN87100124A - 两性分子与单克隆或多克隆抗体结合用于放射显影和治疗 - Google Patents

Abstract

本发明揭示一种增加抗体，放射性同位素标记的毒素或药物免疫结合物溶解度；通过FC受体调节机制降低结合和或未结合的抗体非特异性地摄入到RES器官中的方法。该方法包括将反应成分与两性分子如，一种阴离子去污剂保温而达到目的。优选的去污剂是十二烷基硫酸钠(SDS)。

Description

总的说本发明是关于两性分子的应用，尤其是涉及用诸如阴离子去污剂等两性分子来增加毒素、放射性同位素和药物的免疫结合物的溶解度和降低结合或未结合的单克隆抗体的非特异性吸收。

近年来应用单克隆抗体作为靶子或给药载体促使各种新的抗癌办法的出现。其中办法之一是应用未结合抗体的血清治疗，也就是抗体与放射性同位素，药物或毒素结合，其结合物称为“免疫结合物”。有各种将这些制剂与抗体偶联的方法，例如：通常用的毒素法。它是把二硫基团引入抗体而把硫氢基团引入毒素，接着，通过一个共价二硫键形成免疫毒素。这种改变通常增加结合物的疏水性和促进它们的凝聚，甚至沉淀。尽管人们努力控制抗体取代的程度，结合物在贮藏期间经常不稳定，并自发地沉淀，结果降低了效价、稳定性和治疗效果。按照惯例，控制免疫结合物溶解度的唯一方法是控制不同的双功能配体的取代程度。可是，这种技术有一个最大缺点，即限制了毒素与抗体结合的数量，同时在抗体与毒素中取代像赖氨酸那样的功能基团方面是互相矛盾的。此外，某些未结合的抗体如：IgG亚族的抗体，每次从腹水或用过的培养基中提纯时都很难溶解。像已分离出的抗体那样，它们在4℃贮藏或在-70℃重建时能自发地沉淀。于是这些抗体亚族产生高度不溶解和不稳定的免疫毒素。尽管有很多不同方法使药物、同位素和毒素连结到抗体上，但大多数方法都有一个类似的溶解度的问题。

在制备免疫毒素结合物时，还存在进一步的问题。例如：最常用的毒素是由两条多肽链，即A链和B链组成，它们通过二硫键相连接。毒素通过B链上的识别部位结合到细胞表面的受体上，而A链则穿透（或是易穿过）细胞膜进入胞浆，它在那里抑制蛋白质的合成。大多数免疫毒素是用A链单独地连接到特异抗体上而形成的，但应用完整毒素有很多潜在的优点。典型的完整毒素结合物比单独用A链制备的结合物制剂具有更高的效价。这里因为B链在免疫毒素的内部化中履行一个重要角色，它是免疫结合物限定效价的因素。实际上，内部化的增加将转变为效价的增加。此外，如果在试图制备结合物之前就必须把A链与B链分开的话，那么免疫毒素的制备就更加困难。这些涉及到的亲合纯化步骤和为把分子内二硫键打开而降低A链与B链结合的步骤。这使制造完整毒素制剂，使其具有抗原性细胞的选择性效价的方法存在着很多限制。Thorpe等人（见Immun.Rev.62：119-159，1982）证实用完整毒素与抗体结合可以生成选择性免疫结合物，它可简单地将完整毒素通过N-琥珀酰亚胺基-3-（2-吡啶基硫代）丙酸酯（SPDP）与抗体结合，一定百分率的免疫毒素分子封锁了不能与糖类结合的B链，从而不能调节对不携带抗原的肿瘤细胞或正常细胞的毒性。亲和层析能够除去与B链结合的分子，该分子仍保留与糖类结合的能力。可是，即使在完全除去之后，某些免疫毒素的制剂仍具有高水平的非特异性和毒性。其原因尚不清楚。

除免疫结合物的溶解度和毒素以外，当用于体内时，单克隆抗体和它们的结合物非特异性摄入到网状内皮系统（RES）各器官如：肺、肝、脾和骨髓中限制了它们的潜在效价，从而降低了治疗指数。RES的成分同样存在于许多其它组织，包括淋巴结、扁桃腺和小肠。FC受体可被考虑是单克隆抗体及其结合物被非特异性摄入RES器官的主要部分。另一些体体系如：Cb或Cd受体，免疫复合受体和糖类或糖蛋白受体同样可参于是抗体的非特异性吸收。已经证实，糖类受体也结合毒素分子上的残基，从而可加强免疫结合物的非特异性摄取。

目前，用酶破碎抗体是降低受体调节摄取的标准技术。然而，该方法无论对放射标记的抗体制备及免疫结合物的制备均有一些缺点。

首先，酶破碎抗体FC部分的方法从质和量的控制上都很困难，因为必须要测定抗体制剂中残留的酶。其次，已证实F（ab）₂片段与完整抗体比较增加了降解率。第三，用F（ab）′或Fab（抗体单价片段）有一个附加的缺点，即由于抗体只通过一个结合点结合，对抗原的亲合力大大地降低。此外，配位体取代到抗体片段中比到完整抗体中受到更多的限制，但增加了取代到抗原结合部位的可能性，从而将降低片段的免疫活性。还有一些研究证实了用片段比用完整抗体稳定地增加了摄入肿瘤中的量，而降低了在RES器官中的积累。

在纯化单克隆抗体时经常遇到的另一个问题是内毒素的污染。在某些情况下，内毒素与抗体一起被纯化，好像它被结合到单克隆抗体上了。在这种情况下，用常规方法将内毒素与抗体分离是不成功的，因为除去内毒素时也除去了抗体。由于内毒素乙引起高烧甚至休克，所以这些污染的抗体制剂就不能用于病人。

综如上述，需要一种技术（a）当抗体附加连接物或细胞毒素后，要有一个增加免疫结合物溶解度的有效手段;（b）一个实质上抑制抗体和抗体结合物摄入FC和其它受体的方法，并抑制其摄入RES器官;（c）一个降低完整毒素免疫结合物的毒性的方法;和（d）在不影响抗体回收的情况下，一个降低抗体制剂中内毒素污染水平的方法。本发明满足了这些需要，还进而提供了其它有关的优点。

简言之，本发明关于应用诸如阴离子去污剂等两性离子来增加免疫结合制剂的溶解度，降低抗体通过受体调节机制（结合或未结合的）摄入到RES器官的量。

本发明特别揭示了增加免疫结合物溶解度的方法，包括将免疫结合物制剂与足够量的两性分子温育来增加制剂的热解度。根据最佳实施例，所用的两性分子为诸如十二烷基硫酸钠（SDS）的一种阴离子去污剂。本发明还涉及增加未结合免疫球蛋白溶解度的方法，将免疫球蛋白制剂与足够量的诸如阴离子去污剂等两性分子温育来增加免疫球蛋白制剂的溶解度。在本发明的一个实施例中，所用免疫球蛋白制剂是一种鼠的亚族IgG。

本发明的第三个方面，是揭示了降低抗体与受体结合的方法，包括将抗体与足够量的诸如阴离子去污剂的两性离子温育从而在不改变抗体对靶抗原结合的情况下降低了它与受体的结合。

本发明的另一方面，揭示了降低完整毒素结合物毒性的方法，包括将毒素结合物与足够量诸如阴离子去污剂等中两性分子温育以降低完整毒素结合物的毒性。

本发明再一方面指出了降低单克隆抗体制剂中内毒素水平的方法，包括将单克隆抗体制剂与足够量诸如阴离子去污剂的两性分子温育，从而降低制剂中内毒素的水平。

基于下面的详述及附图，本发明的其它方面是显而易见的。

附图表示处理的、未处理的和单克隆抗体9.2.27的F（ab′）片段与一种人黑色素结合抗原及它们结合到人外周单核细胞上的FC受体的流动细胞计数。

在叙述本发明前，对下面所用术语明确定义一下是需要的。

免疫结合物：单克隆抗体或多克隆抗体与植物、真菌、细菌毒素或它们的A链，核糖体失活蛋白，通过载体分子直接或间接结合到抗体上的药物，放射性同位素的配位体，能直接或间接活化细胞毒素机制的生物反应效应物或其它细胞毒素制剂结合到一起形成的一种共价结合物。

阴离子去污剂：带有一个溶于油，脂或其它有机溶剂的非极性烃端和一个溶于水中的极性端带负电荷的去污剂，或一个相似的两性分子。

通过肿瘤抗体对特异性靶细胞溶胞进行被动免疫治疗的设想，本世纪以来引起人们很大的兴趣。然而抗体摧毁动物或人肿瘤的能力总是有限的。结果有一系列增加抗体效能的设想被提出来。首先是Mathe等人（C.R.Acad.Sci.<Paris>246：1626，1958）提出将抗癌药附在这些抗体上;Moolten和Cooperband（science169：68，1970）提出用毒素加在抗体上;Ghose和Blair提出（Ann.NY.Acad.Sci.277：671，1976;J.Nat1.Cancer    Inst，61：657，1978）用放射性同位素或酶结合在抗体上。然而，如果这种免疫结合物只是对靶组织特异的，那么高效能只有利于肿瘤治疗，因为当结合抗体的毒素结合物运送到体内时仍是隋性的，仅仅当抗体结合到靶细胞后才变得有活性。

通过应用共价连接在特异性抗体上的细胞毒素制剂杀伤肿瘤细胞取得了有意义的进展，（Jansen等人，Immun.Rev.62：186，1982;Thorpe和Ross，Immun.Rev，62：119，1982），然而将免疫结合物用于治疗还一直是个问题。例如：应用完整毒素需要较少的操作毒素分子和增加抗靶细胞效能，然而通过估计是疏水部分毒素B链的非特异性结合迄今为止使得体内用完整的毒素结合物不是对所有抗体都是可行的。后一问题可能是结合用抗体的功能问题。一些研究者报道了有毒的毒素结合物，而另一些人报导了无毒的。本发明人所用的一个抗体9，2，27（r2a族）与完整abrin形成无毒的结合物，用抗L10肝细胞性癌的DMAb（rl族）与完整abrin结合形成对正常组织高度毒性的结合物。这种毒性可用SDS除去。B链可被除去，而A链单独与单克隆抗体偶联。没有B链通常导致降低免疫毒素的效能。

如上所述，在体内应用免疫结合物还有另一些问题，包括抗体通过诸如Fc受体等其它结合方式非特异性摄入RES器官及在贮存期间免疫结合物溶解度降低而自发沉淀，从而导致效价和治疗效果降低。通过应用诸如阴离子去污剂等两性分子则有效地改善了上述问题。

本发明中，诸如阴离子去污剂等两性分子被用来（a）增加免疫结合物制剂的溶解度;（b）增加未结合的免疫球蛋白制剂的溶解度;（c）降低抗体对FC受体的结合;（d）降低完整毒素结合物的毒素性;和（e）降低单克隆抗体制剂中内毒素水平。

本发明内可用不同的阴离子去污剂，包括十二烷基硫酸钠，十六烷基硫酸铵，牛磺胆酸。优选的阴离子去污剂是十二烷基硫酸钠（SDS）。可用于本发明的其它阴离子去污剂可在“Mc    Cutcheon氏乳化剂和去污剂”（MC    Publishing，Glen    Rock，New    Jersey）中查到。阴离子去污剂的特征是通常具有一个大的非极性烃基端和一个极性端，如：SDS，其通式为：

一般认为阴离子去污剂如：SDS即结合一个带正电荷的基团（即，赖氨酸的r氨基）也结合蛋白质的疏水区。人们想像这些疏水区是负责B链非特异性结合到非抗原细胞或抗体结合到FC受体的区域。

进而，由于结合增加的疏水性使生成的免疫结合物易于凝集和沉淀。然而，SDS通过它与疏水区相互作用降低分子间自身结合，从而减少了沉淀凝集。

上述的每个方法中，都必须将抗体制剂与诸如阴离子去污剂的两性分子温育，从而达到预期效果。优选的去污剂浓度为0.01%到1%（W/V）。此外，优选的温育条件约在室温（25℃）或37℃下，30-60分钟。最佳的时间与温度组合为37℃下约30分钟和25℃下约1小时。优选的除去未与抗体结合的阴离子去污剂的方法是4℃下结晶，凝胶过滤或过清蛋白-Sepharose柱。后一方法是将游离SDS与结合在抗体上SDS分开的最有效方法，能回收90%以上的抗体。

增加免疫结合物溶解度和降低其非特异性摄入RES器官优选的方法是在将抗体和细胞毒素偶联后开始的。如上所述，这些方法包括将免疫结合物与浓度为0.01%到1%（W/V）的SDS一起温育。虽然高或低的浓度均可用，但典型的免疫结合物制剂剂量为1mg/ml。更确切地说，免疫结合物制剂是以一个小的体积相对高的浓度被处理的，从而以后可作适当的稀释。如果免疫结合物制剂为1mg/ml的溶液，那么就用10%的SDS溶液处理它。混合后，将其放置37℃30分钟或室温下1小时。25℃下成功地处理时，所用免疫细胞毒素的最高浓度为10mg/ml。用上述浓度，在25℃用SDS处理时一般溶解度很低，而37℃下处理溶解度较高。这样处理的重要特色是只需将其与去污剂短时间温育。典型的温育条件是37℃下或25℃下30分钟-60分钟。

处理后，未与抗体结合的SDS用下述方法除去。首先是结晶，在4℃下冷却导致过量的SDS结晶出来。取出上清液，过G-25柱进一步将低分子量的SDS从免疫结合物中除去。还可将其过清蛋白-Sepharose柱，将未被吸附的抗体回收。愿意的话，还可用与吖啶橙结合方法和在甲苯中溶解的方法测定结合在蛋白上的残存SDS或游离的SDS。

由于过清蛋白-Sepharose柱仅除去了游离SDS即未与抗体结合的SDS，SDS似乎稳定地与抗体结合了，又因为抑制了体内RES对抗体的摄取，即使在血清中循环后由于血清中各种其它蛋白对SDS的在竞争而抑制RES对抗体的摄取。

既可用SDS处理未结合的单克隆抗体制剂，也可处理结合的制剂，对后者既可用可溶性制剂即超过离心（100，000×g，60分钟）步骤后的上清液，也可用已发生自发沉淀的免疫结合物制剂。在与SPDP或其它异双功能连接剂结合时经常发生自发沉淀，这是由于过多结合，即温育时间太长或制剂浓度过高引起的。用SDS处理这些不溶的沉淀可使其再溶。更重要的是，SDS可使免疫结合物制剂可溶性稳定，即在4℃下贮存时免疫结合物制剂仍可溶，并不随时间加长而增加沉淀;而未处理的免疫结合物则有这些缺点。

进而，已证实用SDS还可使药物结合物，衍生物的抗体或与如：聚-L-赖氨酸的载体结合的抗体恢复可溶性。特别是对如：亚德里亚霉素等对抗体-药物结合物具高度疏水性的药物更为有效。对毒素结合物和药物结合物，用SDS处理后进行效价试验发现，似乎都没失去活性，也没失去杀伤抗原细胞的抗原特异性或抗原选择性。

此外，还证实SDS可用来稳定未结合抗体。例如：从腹水或用过的培养液分离出的IgG亚族抗体溶解度很低。它在4℃或-70℃时自发沉淀，然而如上述用SDS处理后，加强了这个特别不稳定的亚族的溶解度。另外，短时间将其暴露于SDS似乎对这种未结合的抗体亚族的免疫活性几乎没有什么影响。

总结下述的例子，例1说明适用的阴离子去污剂对免疫活性的影响。例2说明用阴离子去污剂抑制FC受体调节的结合和降低RES非特异性的摄取。例3说明应用阴离子去污剂在体内降低完整毒素结合物的毒性。例4说明应用阴离子去污剂降低单克隆抗体制剂中内毒素的水平。

下面的例子只是说明本发明，但不限制本发明。

例1：阴离子去污剂对免疫反应活性的影响。

这个例子说明将阴离子去污剂与免疫结合物或免疫球蛋白温育以改善其溶解度，本质上没有影响抗体与抗原结合的能力。如表Ⅰ所示，将SDS以特定时间，量，加入未结合的抗体（1毫克/毫升），然后在一个0.5毫升体积的小型G-25柱上离心除去游离的SDS。再测定0.1μg抗体结合10⁵个黑色素瘤细胞。加入荧光标记的免疫球蛋白，再用流动细胞计数仪检验细胞。测定SDS处理和未用SDS处理的抗体制剂结合黑色素瘤细胞的平均荧光强度。比较平均荧光强度，以未经SDS处理的抗体与黑色素瘤细胞结合数的百分数计算。在25℃温育时结合数低于0.2%，37℃时低于0.1%，均无抑制意义。

表Ⅰ

暴露时间

百分数    5分钟    15分钟    30分钟    60分钟

1    72＊    70    50    36

0.5    56    67    83    74    25℃

0.2    79    78    84    89

0.1    88    88    84    86

0.05    95    98    94    N.T.

0.01    104    104    99    102

暴露时间

百分数    5分钟    15分钟    30分钟    60分钟

1    62    44及    39    23

0.5    72    79    38    28    37℃

0.2    70    77    78    62

0.1    98    89    91    N.T.

0.05    100    96    101    97

0.01    101    102    101    102

＊对照百分数

例2：SDS调节抑制FC受体的结合和RES的摄取。

如图1所示，将抗体与阴离子去污剂温育，将抑制Fc受体与细胞的结合。如上所述，在非特异性的RES摄取中，Fc受体的结合可能起重要的作用。如表2所示，用去污剂处理的抗体制剂降低了非特异性抗体摄入RES组织，如肝和脾中的量。

A.调节Fc受体结合减少：

将去污剂处理的抗体，未处理的抗体和F（ab′）₂片段与人单核白细胞温育，再用流动细胞仪计数分析。培养的人单核白细胞表达出被证实为鼠单克隆抗体的Fc受体。用0.1%低浓度的SDS处理一种Ig G_2a抗体的单克隆抗体9，2，27，有效地降低了它与Fc受体的结合能力，降低的水平与F（ab′）₂制剂的对照比较，是可观察到的（见图1）。

将单克隆抗体9，2，27（小鼠抗-人黑色素瘤）与0.1%或1%（W/V）SDS在25℃温育30分钟。将该SDS处理过的抗体（0.1μg）与5×10个冲洗过的人单核白细胞（＞95%纯度），在4℃温育30分钟。未处理的9，2，27和F（ab′）₂片段作为对照。将单核白细胞洗两次，与FITC-标记的山羊抗小鼠F（ab′）₂混匀，用流动细胞仪计数分析。图1表明单克隆抗体9，2，27与0.1%或1%SDS温育后得到的抗体结合曲线与9，2，27F（ab′）₂片段的结合曲线非常相似。这些资料说明用SDS处理的抗体会对FC受体与人单核白细胞的结合产生实质性地抑制。

B.降低RES非特异性的摄取：

检验上面（A）所述结合活性的降低，从而进一步测定体外结合的结果是否说明在经人黑色素瘤异种移植的裸鼠中降低了非特异性摄取。如表Ⅱ所示，活体中的1%SDS处理过的抗体与未处理过的抗体比较，其非特异性摄取减少了。对肿瘤部位探测，两种抗体摄取量是相等的，也许这是因为用SDS处理后失去了一些免疫反应活性（见表Ⅰ）。用浓度降低的SDS（0.1%）进一步试验，表明加强了肿瘤部分的摄取。试验表明，SDS降到0.01%足以抑制RES的摄取。

表2

SDS对未结合抗体在活体中生物分布的影响

抑制百分数%

组织    （用SDS）

脾    52.5

肝    50.0

肺    -14.3

肾    33.3

肌肉    33.3

甲状腺    -48.1

试验程序如下：将250μg的¹²⁵I标记的（氯胺-T）抗体与1%（W/V）SDS在25℃温育30分钟。将SDS处理的放射性碘标记的抗体以50μg/每只动物的剂量给鼠静脉注射。对照动物用未处理的I标记的抗体静脉注射。去污剂处理与未处理的抗体制剂在血清中半衰期没有区别（T＝24小时）。免疫后48小时杀死小鼠，分析不同组织的放射性标记量。重获放射剂量的百分数以每克所选组织重获的CPM总数的百分数计。用SDS处理的抑制百分数根据下式计算：

(组织中未处理抗体重获放射剂量百分数)/(组织中用SDS处理抗体重获放射剂量百分数) -1.00×100

如表2所示，用SDS处理的抗体明显地抑制抗体非特异性摄入到RES组织中。在肺和甲状腺中脱碘的两个部位没观察到抑制现象。这些组织中的CPM（每分钟放射计数）可能是游离的标记引起的，而不是结合在抗体上的。（表3表明处理的免疫毒素在活体中生物分布的结果），说明它是一个完整的abrin-9，2，27结合物，用9，2，27的美洲商陆（一种植物）抗病毒蛋白结合物所作试验得到相似结果。这两种情况下，在RES器官中免疫毒素制剂的摄入量比较未处理的免疫毒素制剂摄入量降低了。

被动治疗前用SDS与结合物温育（该结合物不能通过特异B-链受体与糖类结合）可以有效地降低完整的毒素结合物的非特异性摄取。简言之，用SPDP将¹³¹I-标记的单克隆抗体9，2，27结合到¹²⁵I-标记的完整abrin上。通过半乳糖/Sepharose（葡聚糖）上吸附除去完整的毒素结合物，该完整毒素结合物保留了通过糖类结合的B-链。将得到的完整毒素结合物与0.5%（W/V）SDS在25℃温育30分钟。将未经处理和用SDS处理的完整毒素免疫结合物以50μg/动物的剂量给裸鼠静脉注射。对照组与去污剂处理的完整毒素结合物的血清半衰期没有区别（T＝3.5小时）。免疫24小时后杀死小鼠，取出不同组织，测其结合上的放射标记，如表3所示，在活体给药前，用SDS与完整毒素结合物温育，将明显降低其RES组织非特异性摄入。

表3

活体中SDS对免疫毒素生物分布的影响

抑制百分数%

组织    （用SDS）

脾    37

肝    52

肺    27

肾    54

肌肉    0

甲状腺    -25

例3：完整毒素结合物在活体中毒性的降低。

如上述，通过SPDP将D₃（豚鼠L10肝细胞癌的单克隆抗体）与完整的abrin结合。过半乳糖-葡聚糖柱后，将结合物在体外进行抗抗原性细胞和阴性细胞的试验发现杀死抗原性细胞为阴性细胞的10000倍，（抗抗原性细胞的ID₅₀＝10^-14M，而对阴性细胞的ID₅₀＝10^-10M，）。D₃的典型A-链结合物对抗原性（阳性）和阴性细胞的ID₅₀分别为10^-7和10^-10M。用D₃-完整毒素abrin结合物，以1μg和10μg/每只豚鼠的剂量，给体重350克的豚鼠注射。二种剂量均使动物在24小时内死亡。用0.5%SDS处理以后，并清除游离的去污剂，结合物的给药剂量为每次150μg，每天3次，间隔3天（七天内累积给量为450μg）。观察200天，全部豚鼠无明显中毒表现。

假单胞杆菌外毒素A（PE）与单克隆抗体结合后，具有很高的效价[抗抗原（阳性）细胞的LD₅₀为10^-11到10^-13m]，并具有很好的选择性（抗抗原阴性细胞的LD₅₀为10^-10到10^-9m）。然而，在活体内，该结合物像其它完整毒素结合物一样，具有明显的肝脏致毒作用。这点可用各种肝细胞酶水平，如SGOT，SGPT，LDH的水平的检测（见表中猴的资料）或死亡（小鼠）很容易的判定。对于小鼠，PE结合物的常规致死量为1μg/每只。假若先把结合物用SDS处理一下，给药剂量可提高到50μg/每只小鼠，而无明显的中毒（更高剂量的给药没有试验）。对于猴，有相似的情况，给以未经处理的结合物，在出现死亡或严重的症状之前，先有肝细胞各种酶水平的升高，给以用SDS处理过的结合物，则肝细胞酶水平将大大减低。更为重要的是：如同体外试验一样，经SDS处理以后，结合物的效价和选择性实质上不受影响。

因此，可总结如下：SDS同样可有效地减低完整毒素结合物的毒性。此完整毒素结合物由细菌外毒素，如假单胞杆菌外毒素A所制成。用Diptheria毒素也会得到同样的结果。

表4

给Cynomologous猴用假单胞杆菌外毒素免疫毒素结合物的解毒作用

血中酶水平

测定天数

用量    监测的肝酶    1    2    3    4    5    正常值

2mg    SGOT    35    62    56    41    ND    60

（SDS处理的）    SGPT    137    147    137    108    ND    60

LDH    ND    865    572    597    ND    350

症状    没有

2mg    SGOT    1297＞5000    ND    ND    死亡

（未处理的）    SGPT    750    2500    ND    ND    死亡

LDH    1725＞6000    ND    ND    死亡

症状    恶心    腹泻    不思饮食    第五天死亡

1mg    SGOT    58    386    1310    ND    76

（未处理的）    SGPT    36    525    1955    ND    500

LDH    526    2090    4259    ND    715

症状    恶心    腹泻    不思饮食

例4：单克隆抗体制剂中内毒素水平的降低。

为表5所示，将单克隆抗体与阴离子去污剂温育降低了抗体制剂中内毒素的污染。用QCL

属溶胞产物试验（whittake/MA生物产品）测定从蛋白A葡聚糖层析的组织培养上清液纯化的单克隆抗体（有两种蛋白）。用凝集试验（Pyrotel Woods Hole.MA）得到同样的结果，都表明含有内毒素污染。然后将抗体制剂与0.1%SDS在37℃温育30分钟。通过在4℃冷却2小时使过量SDS结晶出来，再以2000g离心10分钟除去SDS结晶。用吖啶橙结合试验测得每毫克抗体结合494微克SDS。用去污剂处理的抗体内毒素水平降低95%以上。用从不含内毒素的腹水提纯的抗体制剂，将其用去污剂处理作为对照试验。结果表明SDS处理不影响对内毒素阳性对照的估计

表5

SDS对单克隆抗体9，2，27内毒素水平的影响

500μg处理的编号407033    处理前    处理后    百分数的降低

500μg处理的编号411272    76    1.4    98.0

240    11.0    95.4

如上所述，本发明的实施例是为了说明本发明，不偏离本发明的构思还可作很多修饰，因此，本发明不受实施例的限制，保护范围根据权利要求。

Claims (17)

1、增加免疫结合物制剂或未结合的免疫球蛋白溶解度的方法，包括：

将免疫结合物制剂或一种免疫球蛋白制剂与足够量的两性分子温育以增加免疫结合物制剂或免疫球蛋白制剂的溶解度。

2、根据权利要求1的方法，其中所述的两性分子包括一种阴离子去污剂。

3、根据权利要求2的方法，其中所述阴离子去污剂是十二烷基硫酸钠（SDS）

4、根据权利要求2或3的方法，其中所述的去污剂存在的浓度为0.01%到1%（W/V）

5、根据权利要求1到4任一项所述的方法，其中所述的免疫结合物制剂以约1毫克/毫升的浓度存在。

6、根据权利要求1到5中任何一项所述的方法，其中所述的免疫结合物制剂或免疫球蛋白制剂温育30-60分钟。

7、根据权利要求1到6中任何一项所述的方法，其中温育的步骤是在25℃或37℃进行的。

8、根据权利要求3的方法，温育，然后通过结晶、凝胶过滤、或过清蛋白-葡聚糖柱，除去未与抗体结合的SDS。

9、根据权利要求2的方法，其中所述免疫球蛋白制剂是一种亚族IgG3

10、降低抗体与受体非特异结合的方法，包括：

将单克隆抗体与足够量的两性分子温育，从而降低抗体与受体的结合。

11、根据权利要求10的方法，其中的两性分子包括一种阴离子去污剂。

12、根据权利要求10的方法，其中的受体选自下列一组：FC受体，C3b受体，C3d受体，免疫复合物受体，糖类受体和糖蛋白受体。

13、降低完整毒素结合物毒性的方法，包括将毒素结合物与足够量两性分子温育，从而降低完整毒素结合物的毒性。

14、根据权利要求13的方法，其中所述的两性分子包括一种阴离子去污剂。

15、降低生物制剂中内毒素水平的方法，包括：

将生物制剂与足够量的两性分子温育，从而降低制剂中内毒素的水平。

16、根据权利要求15的方法，其中所述的两性分子包括一种阴离子去污剂。

17、根据权利要求15的方法，其中所述的生物制剂是从BALB/C小鼠腹水中提纯的一种单克隆抗体制剂或是从生长在大规模组织培养物中的单克隆抗体提纯得到的。

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