CN217033970U - 一种miRNAs梅毒全周期检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本实用新型属于miRNA检测领域，尤其是涉及一种miRNAs梅毒全周期检测试剂盒，由塑料外壳和试纸条组成，试纸条包括PVC底板，PVC底板上依次设有样品垫、玻璃纤维素膜、硝酸纤维素膜和吸水纸，玻璃纤维素膜上设置有胶体金标记的鼠lgG抗体和被HRP酶/特异性短核酸序列双标记的三种胶体金，硝酸纤维素膜上设有质控线和三条检测线，质控线和三条检测线平行设置，三条检测线上分别包被有探针，质控线上包被有抗鼠lgG多克隆抗体，检测试纸条通过特异性检测每期梅毒患者与正常人相比外周血中表达水平显著上调的差异miRNAs来对梅毒进行分期检测，具有高特异性、高灵敏度、假阴/阳性率低、检测结果更准确、操作简便等优点。
Description
技术领域
本实用新型属于属于miRNAs检测技术领域，具体涉及一种miRNAs梅毒全周期检测试剂盒。
背景技术
梅毒( Syphilis )是由苍白（梅毒）梅毒螺旋体引起的慢性、全身性性传播疾病(Sexually Transmitted Disease ,STD ),是经典的性病之一。可严重影响身体健康，能使几乎全身各种组织器官发生病变，感染早期主要侵犯皮肤黏膜，晚期可侵犯心血管及中枢神经系，导致严重的后遗症。根据卫建委统计，截止到2021年10月，全国梅毒感染者约300万，年发病率为33.0831/10万，我国梅毒发病率呈上升趋势。2009年至今，梅毒在全国甲乙类传染病发病排序不断上升，一直居第3位，仅次于乙型肝炎和肺结核，在一些城市和省份如北京、上海等，已居第1位。梅毒不仅严重威胁着人们的身心健康，同时严重破坏了社会的安宁与和谐。
而目前对梅毒的检测，市面上主要有血清学检测和梅毒特异性抗体检测两种，虽然使梅毒筛查检测的能力得到了提高，但是都存在共性的缺点：无法对梅毒进行分期诊断，且存在灵敏度低、特异性差、漏检、误检、假阴性等问题，造成疾病的错判，给临床治疗带来了极大的困难。
实用新型内容
为了解决目前市面上的梅毒检测试剂盒均无法对梅毒进行分期诊断，且存在灵敏度低、特异性差、漏检、误检、假阴性等问题，本实用新型提供了一种miRNAs梅毒全周期检测试剂盒，能对梅毒进行全周期检测，且特异性强，灵敏度高，具有重要现实意义。
为实现上述目的，本实用新型所采用的技术方案为：一种miRNAs梅毒全周期检测试剂盒，包括底壳和盖板，盖板扣合在底壳上组成外壳，外壳内装有试纸条，通过试纸条对梅毒进行筛查。
试纸条包括PVC基板，PVC基板的一端固定有样品垫，PVC基板的另一端固定有吸水纸，PVC基板上还布置有玻璃纤维素膜和硝酸纤维素膜，玻璃纤维素膜紧贴样品垫布置，硝酸纤维素膜置于玻璃纤维素膜与吸水纸之间。
玻璃纤维素膜上设有胶体金标记的鼠lgG抗体、被HRP酶/特异性短核酸序列（即可与待测梅毒目标miRNA稳定结合的DNA配对序列 ）双标记的三种胶体金；胶体金标记的鼠lgG单克隆抗体的制备方法为：取鼠lgG单克隆抗体和胶体金混合，经温育、封闭，即得胶体金标记的鼠lgG抗体。本试剂盒采用分子杂交技术，胶体金技术和酶联免疫分析技术来进行相关检测。
金纳米颗粒表面的HRP(辣根过氧化物)与TMB/H2O2底物液发生反应，可产生不溶性的蓝色固体，并沉积在金纳米颗粒表面，使检测线颜色加深并易于观察。
硝酸纤维素膜上依次平行布置有质控线、一期梅毒检测线、二期梅毒检测线和三期梅毒检测线，一期梅毒检测线上设有第一探针，二期梅毒检测线上设有第二探针，三期梅毒检测线上设有第三探针，探针具有种属特异性且稳定表达。质控线靠近吸水纸布置，质控线上设有抗鼠lgG多克隆抗体。
当试纸条上只有质控区出现红色条带时，而检测区没有出现红色条带时，则检测结果为阴性，表示检测者不患有梅毒。当试纸条上出现两条条带:一条位于质控区，一条位于S1区时，则表示检测者患一期梅毒；一条位于质控区，一条位于S2区时，则表示检测者患二期梅毒；一条位于质控区，一条位于S3区时，则结果表示检测者患三期梅毒。显示结果只有质控区无条带，则本次检测无效。
其中，盖板上开有与外壳内部相连通的加样口，样品垫抵在加样口的内侧面上，待测样本从加样口滴入。
盖板上开有与外壳内部相连通的结果显示窗口，硝酸纤维素膜抵在结果显示窗口的内侧面上，检测结果在结果显示窗口显示出来。
结果显示窗口的边缘处设有与质控线相对应的指示标志C，结果显示窗口的边缘处设有与一期梅毒检测线相对应的指示标志S1，结果显示窗口的边缘处设有与二期梅毒检测线相对应的指示标志S2，结果显示窗口的边缘处设有与三期梅毒检测线相对应的指示标志S3。
其中，底壳与盖板均为生物降解塑料中的改性聚乳酸材质。
样品垫的一端固定在PVC基板上，样品垫的端头与PVC基板的端头平齐，样品垫的另一端设有第一压板；
吸水纸的末端固定在PVC基板上，吸水纸的端头与PVC基板的端头平齐，吸水纸的另一端设有第三压板；
玻璃纤维素膜的一端夹持在第一压板与PVC基板之间，玻璃纤维素膜的另一端设有第二压板，硝酸纤维素膜的一端夹持在第二压板与PVC基板之间，硝酸纤维素膜的另一端夹持在第三压板与PVC基板之间。
本实用新型提供的胶体金试纸条具体检测原理如下：
胶体金核酸试纸条是一种对复杂样品中目标物质进行检测的固相免疫分析方法，当样品中含有任意一期的miRNA时，该miRNA先与胶体金上的互补序列结合形成复合物，由于毛细管作用在固相层析膜上涌动，被检测线上的相对应的探针捕获，通过富集作用形成肉眼可见的红色检测线。
本实用新型与现有技术相比，具体有益效果体现在：
一、本实用新型的胶体金制备容易，价格低廉，且被胶体金标记后不影响原来的生物活性。免疫胶体金具有较高的特异性，在电镜下分辨率高，对超微结构遮盖少，并易与其他颗粒性结构区别开来，具有较精确的定位能力。同时胶体金本身有鲜艳的橘红色，应用于快速检测技术具有操作简单快速，特异性、敏感性好，可单份测定，结果直观，且可保存试验结果，无须特殊仪器等优点。
二、本实用新型能做到精准的对梅毒进行分期检测，同时也可用于梅毒患者治疗效果的判定，填补了梅毒检测的空缺。
三、本实用新型特异性强，灵敏度高,稳定性强，检测结果更准确，不易出现漏检、误检、假阴性等情况，使梅毒早检更加准确。
四、本实用新型的塑料外壳采用可生物降解的改性聚乳酸，绿色安全，无污染。
附图说明
图1为本实用新型的结构示意图。
图2为本实用新型的分解状态示意图。
图3为一期梅毒检测结果的指示图。
图4为二期梅毒检测结果的指示图。
图5为三期梅毒检测结果的指示图。
图6为阴性检测结果的指示图。
图7为无效检测结果的指示图。
图中，1为底壳，2为盖板，21为加样口，22为结果显示窗口，3为外壳，4为试纸条，41为PVC基板，42为样品垫，421为第一压板，43为吸水纸，431为第三压板，44为玻璃纤维素膜，441为第二压板，45为硝酸纤维素膜，451为质控线，452为一期梅毒检测线，453为二期梅毒检测线，454为三期梅毒检测线。
具体实施方式
为了使本实用新型所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本实用新型进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本实用新型，并不用于限定本实用新型。
如图1和图2所示，一种miRNAs梅毒全周期检测试剂盒，结合了胶体金技术、分子杂交技术和酶联免疫分析技术，检测血液中的miRNAs，即每期梅毒患者与正常人相比外周血中表达水平显著上调的差异miRNAs。
测试卡一期梅毒检测线452（S1线）包被可与待测一期梅毒目标miRNA稳定结合的第一探针；测试卡二期梅毒检测线453（S2线）包被可与待测二期梅毒目标miRNA稳定结合的第二探针；测试卡三期梅毒检测线454（S3线）包被可与待测三期梅毒目标miRNA稳定结合的第三探针；质控线451（C线）上包被抗鼠lgG多克隆抗体；测试卡上的胶金垫上包被着胶体金标记的鼠lgG、以及被HRP酶和特异性短核酸序列（即可与待测梅毒目标miRNA稳定结合的DNA配对序列 ）双标记的三种胶体金，检测时，在试剂加样口21中滴加约两滴样本，再滴加两滴稀释液，当样本中含有任意一期的生物标志物miRNA时，该miRNA先与胶体金上的互补序列结合形成复合物，由于毛细管作用在固相层析膜上涌动，被检测线上相对应的探针捕获，通过富集作用形成肉眼可见的红色检测线，胶体金颗粒上HRP酶可以和TMB/H2O2底物发生反应产生蓝色的沉淀；质控线451（C线）上会发生鼠IgG和抗鼠IgG的结合反应，即可观察到红色条带的出现，即可检验样品是否转移完全，即此次检测是否有效。
试剂盒由试纸条4和改性聚乳酸塑料外壳3组成，试纸条4由样品垫42、PVC基板41、玻璃纤维素膜44、硝酸纤维素膜45和吸水纸43构成。
在样品垫42中，将洗涤剂、粘性增强剂、阻滞剂及盐渗入样本垫然后加以干燥，可减缓样品渗透速度，有利样品在结合垫上均匀分布、去除样品中杂质颗粒、调节样品液pH值或粘度等，减少样本差异，提高试验的灵敏度。
PVC基板41用于将各种层析材料组装到一起，本品将采用高质量的粘胶，以最小化对NC膜的影响。
胶金垫采用玻璃纤维素膜44为材质，内含胶体金标记的鼠lgG、HRP酶和由对应分期梅毒的特异性短核酸序列双标记的3种胶体金，可吸附一定量的金标结合物颗粒和样品，并持续不断的将样品转移到NC膜上，保持金标结合物颗粒的稳定性，保证金标结合物颗粒定量完全释放。
NC膜即硝酸纤维素膜45，可在检测线和对照线条带区域传送样品和固定试剂；并作为显色反应发生的载体，即可读出检测结果。
质控线451（C线）内含抗鼠lgG多克隆抗体，在质控区上，胶体金标记的鼠lgG与质控区内的抗鼠lgG结合，出现红色条带，即可判定层析过程是否正常，此次检测是否有效；若为有效检测，即可在产品中看到C区出现红色条带，若无效，则反之。
检测线包括一期梅毒检测线452（S1）、二期梅毒检测线453（S2）和三期梅毒检测线454（S3），并且本实用新型每条检测线等长等距，长1.50cm，距离1.15cm。
如图3所示，一期梅毒患者检测时，会在质控线451（C线）和一期梅毒检测线452（S1线）上发生反应。双标记的胶体金颗粒上配对序列1与一期梅毒标志物miRNA上部分序列稳定结合，形成的复合体中的miRNA下部分序列可以与其互补配对的探针1稳定结合；即在一期梅毒检测区可发生以上三者的稳定配对结合，通过富集作用形成红色条带。胶体金颗粒上携带的HRP酶与TMB/H2O2底物液发生反应，产生蓝色不溶性颗粒沉积在金纳米颗粒表面，使检测线颜色加深；若质控线451（C线）也出现红色条带，则表示此次检测有效，即可说明此次检测者为一期梅毒患者。
如图4所示，二期梅毒患者检测时，会在质控线451（C线）和二期梅毒检测线453（S2线）上发生反应。双标记的胶体金颗粒上配对序列2与二期梅毒标志物miRNA上部分序列稳定结合，形成的复合体中的miRNA下部分序列可以与其互补配对的探针2稳定结合；即在二期梅毒检测区可发生以上三者的稳定配对结合，通过富集作用形成红色条带。胶体金颗粒上携带的HRP酶与TMB/H2O2底物液发生反应，产生蓝色不溶性颗粒沉积在金纳米颗粒表面，使检测线颜色加深；若质控线451（C线）也出现红色条带，则表示此次检测有效，即可说明此次检测者为二期梅毒患者。
如图5所示，三期梅毒患者检测时，会在质控线451（C线）和三期梅毒检测线454（S3线）上发生反应。双标记的胶体金颗粒上配对序列3与三期梅毒标志物miRNA上部分序列稳定结合，形成的复合体中的miRNA下部分序列可以与其互补配对的探针3稳定结合；即在三期梅毒检测区可发生以上三者的稳定配对结合，通过富集作用形成红色条带。胶体金颗粒上携带的HRP酶与TMB/H2O2底物液发生反应，产生蓝色不溶性颗粒沉积在金纳米颗粒表面，使检测线颜色加深；若质控线451（C线）也出现红色条带，则表示此次检测有效，即可说明此次检测者为三期梅毒患者。
吸水垫选取高吸收率、高容量以及相对稳定吸收率的吸收纸，以更好地控制样品的流速，促进虹吸作用，使试剂可跨过膜发生有效反应。
改性聚乳酸塑料外壳3采用生物降解塑料中的改性聚乳酸，它的耐热温度超过80℃，符合欧盟WN13432和美国ASTM D6400降解标准。
稀释液采用pH=7.4的Tris-盐酸缓冲液（TBS）中加入高效RNase灭活剂和TMB/H2O2底物液制得，TMB即3,3',5,5'-四甲基联苯胺，可以在上述纳米金颗粒携带的辣根过氧化物酶HRP催化下被过氧化氢氧化生成不溶性蓝色沉淀，实现标线的直观显示。
稀释液用于稀释血液，增加血液的流动性，有助于跑板，防止血液过快凝固，并维持反应内环境稳定，屏蔽非特异性结合，保证检测过程顺利进行。高效RNase灭活剂可增强miRNA稳定性，TMB/H2O2底物液使反应现象更明显。
如图3所示，质控线451（C线）和一期梅毒检测线452（S1线）变红，即检测结果为一期梅毒；如图4所示，质控线451（C线）和二期梅毒检测线453（S2线）变红，即检测结果为二期梅毒；如图5所示，质控线451（C线）和三期梅毒检测线454（S3线）变红，即检测结果为三期梅毒。如图6所示，当试纸条4上只有质控区出现红色条带时，而检测区没有出现红色条带时，则检测结果为阴性，表示检测者不患有梅毒；如图7所示，不管哪条线变红，只要质控线451（C线）未变红，则本次的检测结果无效。
本实用新型提供的胶体金试纸条4结构简单，采用检测血液中miRNA的原理，通过对探针、胶体金的调整，使其能够产生特异条带。同时，在对一份样品进行检测时，能同时检测出该样品是否正常、是否是一期、二期或三期梅毒，其具有特异性好、灵敏度高、检测速度快等优点，且不需要使用仪器设备，操作简单，能广泛地用于各种年龄段人群对于梅毒的检测。
以上所述仅为本实用新型的较佳实施例而已，并不用以限制本实用新型，凡在本实用新型的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包在本实用新型范围内。
Claims (5)
1.一种miRNAs梅毒全周期检测试剂盒，其特征在于，包括底壳（1）和盖板（2），所述盖板（2）扣合在底壳（1）上组成外壳（3），所述外壳（3）内装有试纸条（4）；
所述试纸条（4）包括PVC基板（41），所述PVC基板（41）的一端固定有样品垫（42），所述PVC基板（41）的另一端固定有吸水纸（43），所述PVC基板（41）上还布置有玻璃纤维素膜（44）和硝酸纤维素膜（45），所述玻璃纤维素膜（44）紧贴样品垫（42）布置，所述硝酸纤维素膜（45）置于玻璃纤维素膜（44）与吸水纸（43）之间；
所述硝酸纤维素膜（45）上依次平行布置有质控线（451）、一期梅毒检测线（452）、二期梅毒检测线（453）和三期梅毒检测线（454），所述一期梅毒检测线（452）上设有第一探针，所述二期梅毒检测线（453）上设有第二探针，所述三期梅毒检测线（454）上设有第三探针，所述质控线（451）靠近吸水纸（43）布置；
所述盖板（2）上开有与外壳（3）内部相连通的加样口（21），样品垫（42）抵在加样口（21）的内侧面上；
所述盖板（2）上开有与外壳（3）内部相连通的结果显示窗口（22），所述硝酸纤维素膜（45）抵在结果显示窗口（22）的内侧面上。
2.根据权利要求1所述的一种miRNAs梅毒全周期检测试剂盒，其特征在于，所述玻璃纤维素膜（44）上设有胶体金标记的鼠lgG抗体、被HRP酶/特异性短核酸序列双标记的三种胶体金；
所述质控线（451）上设有抗鼠lgG多克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的一种miRNAs梅毒全周期检测试剂盒，其特征在于，所述结果显示窗口（22）的边缘处设有与质控线（451）、一期梅毒检测线（452）、二期梅毒检测线（453）和三期梅毒检测线（454）相对应的指示标志。
4.根据权利要求1所述的一种miRNAs梅毒全周期检测试剂盒，其特征在于，所述底壳（1）与盖板（2）均为改性聚乳酸材质。
5.根据权利要求1所述的一种miRNAs梅毒全周期检测试剂盒，其特征在于，所述样品垫（42）的一端固定在PVC基板（41）上，所述样品垫（42）的另一端设有第一压板（421）；
所述吸水纸（43）的一端固定在PVC基板（41）上，所述吸水纸（43）的另一端设有第三压板（431）；
所述玻璃纤维素膜（44）的一端夹持在第一压板（421）与PVC基板（41）之间，所述玻璃纤维素膜（44）的另一端设有第二压板（441），所述硝酸纤维素膜（45）的一端夹持在第二压板（441）与PVC基板（41）之间，所述硝酸纤维素膜（45）的另一端夹持在第三压板（431）与PVC基板（41）之间。
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