CN205907268U - 一种可用于细胞培养或细胞体外实验的器件 - Google Patents

Abstract

本实用新型涉及一种可用于细胞培养或细胞体外实验的器件，该器件具有聚多巴胺层‑羧甲基壳聚糖层‑多肽层的结构，其能够调控人多能干细胞的行为,可用于细胞培养或细胞体外实验。

Description

一种可用于细胞培养或细胞体外实验的器件

本申请要求中国专利申请CN201410850873.1的优先权(申请日：2014年12月31日，发明名称：器件及其在细胞体外实验中的用途)。

技术领域

本实用新型涉及可用于细胞培养的器件。具体涉及一种具有聚多巴胺层-羧甲基壳聚糖层-多肽层结构的器件。

背景技术

人诱导多能干细胞(Hμman pluripotent stem cells,hiPSCs)具有和人胚胎干细胞(Hμman embryonic stem cells,hESCs)几乎同样的形态、扩增能力、表面抗原、基因表达谱和甲基化位点等特征。hiPSCs克服了hESCs存在的伦理道德困惑，增加了干细胞自体移植治疗的可行性，并解决了细胞数量有限的问题。

通常人多能干细胞的体外培养需借助于鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryonicfibroblasts,mEFs)滋养层或Matrigel。mEFs培养体系因其操作过程繁琐，现逐渐被其它培养体系取代。Matrigel是从EHS(Engelbreth-Holm-Swarm)小鼠肉瘤中得到的可溶性基底膜提取物，其能够在培养基底表面形成一层充当细胞外基质的薄膜，使人多能干细胞能够在其构建的体外微环境中获得理想的贴壁和自我更新效果(Xu，C.，et al.、Feeder-freegrowth of undifferentiated hμman embryonicstem cells、Nat Biotechnol、2001、19、10、971-4。)。但是Matrigel培养体系为异种来源且无法保证不同批次产品间的一致性，加之其成分的不明确性，使其不适于人多能干细胞的大规模体外扩增，限制其在临床治疗中的应用。所以许多科学家致力于构建可替代Matrigel的、成分明确的人多能干细胞体外培养体系。

首先，研究者相继发现纤连蛋白，玻连蛋白和层粘连蛋白等蛋白及层粘连蛋白的某些特定部分，均可实现人多能干细胞的体外自我更新。但是，受限于昂贵的费用和物理吸附导致的批次不一致，蛋白等生物制品难以广泛应用于人多能干细胞科研和临床中。因此，近些年研究者成功开发出了，少数几种支持人多能干细胞体外培养和定向分化的人工合成表面，其在成本和批次稳定性等方面具有显著优势。Villa-Diaz等在聚苯乙烯表 面形成PMEDSAH甲基丙烯酸酯类衍生物涂层，外加条件培养基或化学成分明确的“StemPro”培养基可以实现H9hESCs干性维持Villa-Diaz LG et al.Synthetic polymer coatings forlong-term growth of hμman embryonic stem cells.Nature biotechnology.2010；28:581-3。

Melkoμmian等通过在培养板表面形成聚丙烯酸层，并在其表面接枝能够促进hESCs贴壁和增殖的多肽，实验证实hESCs在来源于骨涎蛋白(Bone Sialoprotein,BSP)的Ac-KGGNGEPRGDTYRAY或来源于玻连蛋白(Vitronectin,VN)的Ac-KGGPQVTRGDVFTMP多肽功能化修饰表面均能够实现10代左右的干性维持(Melkoμmian Z et al.Syntheticpeptide-acrylate surfaces for long-term self-renewal and cardiomyocytedifferentiation of hμman embryonic stem cells.Nature biotechnology.2010；28:606-10.)

但是，这些人工合成表面制备过程复杂，含生物惰性成分，不利于人多能干细胞的自我更新和大量扩增。因此，希望利用体内细胞微环境成分来构建一种简单，稳定，有效的成分明确人多能干细胞体外培养体系。

发明内容

本发明人针对上述问题进行了深入研究，结果发现具有聚多巴胺层-羧甲基壳聚糖层-VN多肽层的器件能够调控人多能干细胞的行为，从而完成了本实用新型。

即，本实用新型如下。

1.一种器件，其包括：

基底，

连接于所述基底上的聚多巴胺层，

连接于所述聚多巴胺层上的羧甲基壳聚糖层，以及

连接于所述羧甲基壳聚糖层上的多肽层；

其中，所述多肽层包含玻连蛋白(Vitronectin，简称VN)多肽。

2.根据项1所述的器件，其中，所述多肽层还包含具有促进人多能干细胞定向分化的功能的化合物。

3.根据项2所述的器件，其中，所述具有促进人多能干细胞定向分化的功能的化合物是BFP-1多肽。

实用新型的效果

1.构成所述器件的材料均具有优良的生物相容性，构建了一种化学成分明确、无外源物质、安全的调控人多能干细胞命运的体系。

2.接枝不同的功能多肽可以赋予体系不同的生物学功能。

3.聚多巴胺层-羧甲基壳聚糖层-多肽层的结构可以设置在多种基底材料表面(细胞培养板，种植体等)。这种设置可以在常规条件下进行，步骤相对简单易行，不需要特殊设备和高温高压等条件，更符合GMP的要求。而且，制备过程避免了使用对生物体有毒性的化学物质，工艺过程更为环保。

4.该体系制备过程均为化学反应，相较于Matrigel和蛋白质的物理吸附，具有更优越的批次稳定性。

5.采用不同的定向诱导培养基，即可促使人多能干细胞向不同类型的细胞定向分化。

附图说明

图1是显示本实用新型的器件的制备流程和结构的图。

发明的具体实施方式

本说明书中提及的科技术语具有与本领域技术人员通常理解的含义相同的含义，如有冲突以本说明书中的定义为准。

器件

本实用新型的一个方面提供一种器件(以下也称作本实用新型的器件)，其包括：

基底，

连接于所述基底上的聚多巴胺层，

连接于所述聚多巴胺层上的羧甲基壳聚糖层，以及

连接于所述羧甲基壳聚糖层上的多肽层；

其中，所述多肽层包含下述多肽A；

多肽A：由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的多肽。

本实用新型的器件可用于细胞体外实验或细胞培养。在本说明书中，细胞体外实验是指：(1)诱导人体细胞重编程为人多能干细胞，(2)使人多能干细胞贴壁，和/或(3)使人多能干细胞长期自我更新。

1.基底

对于用作本实用新型的器件的基底的材料没有特殊限制，可以使用通常用作细胞培养表面的基底的那些材料，例如聚苯乙烯、聚二甲基硅氧烷、玻璃等。作为基底，例如可以使用细胞培养板，也可以使用种植体(钛或聚醚醚酮制)。

2.聚多巴胺层

多巴胺(Dopamine,DA)在体内是一种生物神经递质，将基底材料浸没在含多巴胺的缓冲液中，多巴胺会通过氧化聚合沉积到基底材料表面，从而在基底材料表面形成聚多巴胺层。

对于构成所述聚多巴胺层的聚多巴胺(Polydopamine，PDA)的分子量没有特殊限制。聚多巴胺的分子量可以采用常规方法进行控制，例如0.01～100g/L多巴胺溶液5～90℃反应1分钟～72小时。

3.羧甲基壳聚糖层

羧甲基壳聚糖(Carboxymethyl chitosan,CMC)是壳聚糖最重要的衍生物之一，与细胞外基质成分糖胺聚糖(GAG)有相似之处，具有良好的生物相容性。

本发明人通过多肽荧光素标记研究发现，PDA层上能够接枝VN多肽，但所得器件不能促使细胞贴壁。

令人惊奇的是，本发明人发现，在设置CMC层作为PDA层与VN多肽层的桥梁的情况下，所得器件被赋予了调控人多能干细胞行为的功能。本实用新型中使用的羧甲基壳聚糖，通过凝胶渗透色谱仪和参照《中国人民共和国药典》方法，测得的重均分子量可以为1000～20万g/mol，优选1万～10万g/mol，更优选6～8万g/mol。例如实施例中制备的PDA-CMC-VN器件的CMC层中的羧甲基壳聚糖的重均分子量为83550g/mol。

羧甲基壳聚糖含有氨基和羧基，其中的氨基可与聚多巴胺形成化学结合。羧甲基壳聚糖与聚多巴胺的化学结合可利用本技术领域已知的化学反应来实现，例如迈克尔加成和席夫碱反应。例如，可以将一定量的0.1重量％～30重量％的CMC溶液加至聚多巴胺层基底上，5～60℃反应1h～72h，即可得到聚多巴胺-CMC基底层。

4.多肽层

所述多肽层应包含下述多肽A，视需要也可以包含其他成分(多肽、蛋白质、核酸、小分子化合物等)，只要本实用新型的器件能够发挥调控人多能干细胞行为的功能即可。

所述多肽A是由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的多肽，称作玻连蛋白(VN)多肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1:KGGPQVTRGDVFTMP。VN多肽来自于玻连蛋白 (Vitronectin,VN)，有报道称，通过在培养板表面形成聚丙烯酸层，并在其表面接枝来源于骨涎蛋白(BoneSialoprotein,BSP)的Ac-KGGNGEPRGDTYRAY和N端乙酰化的该VN多肽，能够实现hESCs的10代左右的干性维持(Melkoμmian Z et al.Synthetic peptide-acrylate surfaces forlong-term self-renewal and cardiomyocyte differentiation of hμman embryonicstem cells.Nature biotechnology.2010；28:606-10.)。

本实用新型的研究表明，在PDA层直接接枝该VN多肽，所得器件不能促使细胞贴壁，但在设置CMC层作为PDA层与VN多肽层的桥梁的情况下，所得器件被赋予了调控人多能干细胞行为的功能。

对于实现本实用新型的器件的功能而言，所述多肽A的分布密度应为一定值以上，例如为1μg/cm²以上，优选为10μg/cm²以上，更优选为20μg/cm²以上，更优选为30μg/cm²以上，更优选为40μg/cm²以上。此外，对于所述多肽A的分布密度的上限没有特殊限制，从可操作性的角度考虑，可以是例如200μg/cm²以下或150μg/cm²以下或100μg/cm²以下或80μg/cm²以下或60μg/cm²以下。

羧甲基壳聚糖含有氨基和羧基，其中的羧基可与多肽进行接枝。羧甲基壳聚糖与多肽的接枝可利用本技术领域已知的化学反应来实现，例如聚多巴胺-羧甲基壳聚糖表面浸入活化剂溶液(例如，20mg/ml N-羟基琥珀酰亚胺和20mg/ml 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，pH＝5.6吗啉乙磺酸缓冲液)中室温反应10～1000min后，与0.1～100mMVN多肽溶液4℃过夜反应，即可通过迈克尔加成和席夫碱反应得到聚多巴胺-羧甲基壳聚糖-VN多肽修饰的人多能干细胞培养表面。

此外，作为使多肽A的分布密度达到1μg/cm²以上的方法，多肽A的反应溶液浓度需在0.25mM以上，优选为1mM以上。

在一个优选的实施方案中，所述多肽层还可包含具有促进人多能干细胞定向分化的功能的化合物B，结合特定的培养基，可在成分明确条件下实现人多能干细胞体外定向诱导分化。所述化合物B可以是多肽、蛋白质、核酸或小分子化合物。对于所述化合物B和特定培养基没有特殊限制，只要其具有促进人多能干细胞定向分化的功能即可。本领域技术人员可以根据定向分化的需要，选择适宜的化合物B和定向诱导培养基。例如：多肽层接枝BFP-1多肽，结合含有β-巯基乙醇，地塞米松和维生素C的αMEM培养基，可定向诱导人多能干细胞成骨向分化。

对于所述化合物B的分布密度没有特殊限制，只要能够发挥促进人多能干细胞定向分化的功能即可，优选至少为1μg/cm²以上，优选为10μg/cm²以上，更优选为20μg/cm²以上，更优选为30μg/cm²以上，更优选为40μg/cm²以上。

作为在羧甲基壳聚糖上接枝化合物B的方法，可以采用与接枝多肽A的方法相同的方法。

所述多肽可以适宜采用(1)化学合成方法、或(2)酶反应合成方法等公知方法来获得，其中化学合成更为简便。在化学合成本实用新型的多肽情况下，通过使用肽合成仪合成或者半合成该多肽来进行。作为化学合成方法，可以列举出例如肽固相合成法等。这样合成的肽可以采用常规手段例如离子交换色谱、反相高效液体色谱、亲和色谱等进行纯化。这样的肽固相合成方法以及其后的肽纯化都是本技术领域公知的。

此外，在通过酶反应生产本实用新型的多肽的情况下，可以采用例如国际公开小册子WO2004/011653号所述的方法。即，可以这样来生产：将一方的氨基酸或二肽的羧基末端被酯化或酰胺化而得到的氨基酸或二肽、与氨基酸处于游离状态的氨基酸(例如羧基保护的氨基酸)在肽合成酶的存在下进行反应，生成的二肽或三肽。作为肽合成酶，可以列举出：具有生成肽的能力的微生物的培养物、由该培养物分离的微生物菌体、或该微生物的菌体处理物、或该微生物来源的肽合成酶。

特别是，多肽的化学合成已经实现了商业化，可以容易地委托专业的多肽合成公司来合成所述多肽。

实施例

以下，通过实施例对本实用新型进行更具体的说明，但本实用新型不受这些实施例的限制。

实施例1PDA-CMC-VN器件的制备及表征

以下制备的PDA-CMC-VN器件依次具备基底(细胞培养板表面)、聚多巴胺层、羧甲基壳聚糖层和VN多肽层。

将24克羧甲基壳聚糖加入含800ml纯水的蓝口瓶中，利用恒温搅拌器在50℃和150转/分钟条件下过夜搅拌，获得质量分数为3％的CMC溶液。在经中速滤纸粗滤后，于超净工作台内先后经0.45μm和0.22μm滤膜过滤后获得无菌CMC溶液。将0.2424克三羟甲基氨基甲烷盐酸盐置入含200ml纯水的烧杯中，用滴管搅拌均匀，然后用1mol/L 盐酸将溶液PH调为8.5。将0.4克多巴胺粉末加入该缓冲液中，用滴管搅拌均匀。在超净工作台内经0.22μm滤膜过滤后，以每孔5ml体积加入康宁6孔细胞培养板中，封口膜封闭后置于37℃恒温摇床(70转/分钟)反应16h。在超净工作台内经无菌纯水冲洗3次后每孔加入5ml纯水，Parafilm封口膜封闭后超声5min，再于超净间内用纯水冲洗一次后每孔加入CMC溶液5ml，封口膜封闭后置于37℃恒温摇床反应70转/分钟)反应24h。然后，超净台内无菌纯水冲洗3次，干燥后紫外照射1h。

在超净工作台将5mg VN多肽溶于3.1ml DPBS缓冲液中，获得1mM VN多肽溶液。将19.52克吗啉乙磺酸溶于1000ml纯水中，用玻璃棒搅拌均匀，然后用饱和氢氧化钠溶液将pH调至5.6.将0.8g N-羟基琥珀酰亚胺和0.8克1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐分别溶于20ml吗啉乙磺酸缓冲液后混匀，在超净工作台内经0.22μm滤膜过滤后，以每孔3ml体积加入康宁6孔细胞培养板中室温反应40min，无菌纯水冲洗3次后每孔加入1ml VN多肽溶液，封口膜封闭后4℃过夜，再用无菌纯水冲洗3次，得到聚多巴胺-羧甲基壳聚糖-VN多肽修饰的细胞培养板。利用X射线光电子能谱(XPS),接触角和原子力显微镜(AFM)研究，细胞培养板表面经PDA-CMC-VN涂层修饰后的化学和形貌变化。

另外，我们利用FITC荧光蛋白标记的VN多肽(FITC-KGGPQVTRGDVFTMP)，对表面接枝的VN多肽进行定量研究。首先，避光条件下用乙腈与纯水的1：1混合液配置0.2mM和2mM浓度的FITC-VN溶液，然后在康宁96孔板中分别加入2ul 0.2mM，5ul0.2mM，1ul 2mM，2ul 2mM，4ul 2mM，8ul 2mM，16ul 2mM(每组4孔)后，在避光条件下自然干燥后，用全波长酶标仪以激发光488nm，吸收光538nm测量荧光值，建立荧光-密度标准曲线。然后，配置1mM FITC-VN溶液,利用上述方法接枝至活化后的PS-PDA-CMC表面，纯水清洗3次后在相同条件下测量荧光值。

测定结果表明，修饰之前，PS呈现典型的水接触角值(86.36±1.67°),经PDA/CMC/VN修饰后表面接触角分别降低至61.54±1.70°，41.48±7.16°和30.88±3.52°。我们利用原子力显微镜测量了PS表面分别经PDA/CMC/VN多肽修饰后的表面形貌变化。我们选择了1μm×1μm和5μm×5μm两个扫面范围进行AFM测量。1μm×1μm结果显示，PS未修饰前的表面比较平滑(Ra＝4.83nm),聚多巴胺修饰后，我们能够在这些基体的表面见到典型的聚多巴胺颗粒,Ra值也分别增加至5.01nm,进一步修饰CMC和VN多肽，我们发现表面的Ra值均呈下降趋势，并最终获得非常平滑的表面(Ra＝2.20nm)。当AFM扫面范围扩大至5μm×5μm时，也发现了类似的AFM测量结果。该修饰过程 进一步利用XPS进行表征,新出现的N元素峰证实PDA层的形成，Na元素峰和“C-N”键的出现说明CMC成功与PDA层共价结合。最后，接枝VN多肽后，其所含肽键使得“C-N”含量增高。上述表征结果说明我们开发的PDA-CMC-VN表面能够共价结合至PS培养板表面。

另外，我们测得PS-PDA-CMC-FITCVN修饰12孔板表面的荧光强度为399.695±73.65291，根据96孔板标准曲线结果可知，表面VN多肽的接枝密度51.75±9.53ug/cm²。

实施例2PDA-CMC-VN器件使人多能干细胞贴壁

细胞培养

H1和H9人胚胎干细胞由中科院广州生物医药与健康研究院购买自WiCell研究所后赠送。人诱导多能干细胞系(人皮肤细胞来源的hNF-C1，以及人间充质干细胞来源的UMC-C1)均由中科院广州生物医药与健康研究院以慢病毒重编程方法获得后赠送。这些人多能干细胞系培养在铺有Matrigel(BD Biosciences,Canada)的培养板中，培养基使用的是成分明确的mTeSR^TM1(StemCell Technologies,Canada)。细胞培养在条件为37℃,100％湿度and 5％CO₂的培养箱中。Matrigel用DMEM/F12在冰上以1：80稀释后，以1ml每孔体积加入6孔板37℃孵育1h以上。细胞每天换液，并每隔3-4天经0.5mMEDTA37℃消化4-5min以1:3比例传代。

PDA-CMC-VN修饰支持人多能干细胞在不同基体表面生长

如上所述，制备接枝1mM VN多肽的PDA/VN和PDA-CMC/VN修饰6孔培养板，同时利用FITC标记的荧光多肽进行定量研究。用0.25％胰酶/EDTA(Stem Cell Technologies,Canada)将hNF-C1hiPSCs消化为单细胞，然后以23500细胞/cm^-2密度接种至PDA/VN和PDA-CMC-VN修饰6孔板中，并以预铺有Matrigel的培养板作为对照。每天更换新鲜培养基至第四天，利用CCK8细胞计数试剂盒(Dojindo,Japan)测量每孔细胞数。每组含三个平行孔，每孔吸光度值测量三次。具体实验方法如下：

1.实验在避光条件下进行。将CCK8试剂以1:10比例加入至mTeSR1培养基中，均匀混合后每孔加入1ml。

2.置于培养箱中反应2小时后，每孔吸取200ul转至96孔板中,然后用全波长酶标仪(Model 680,Bio-Rad,Hercules,CA)测量吸光度值。

另外，Matrigel上培养的hNF-C1人诱导多能干细胞经EDTA消化后，以1:3比例传至PDA-CMC-VN修饰的不同基体(PS,玻璃,PDMS和Ti)表面。培养4天后，用倒置显 微镜(OlympusCKX31SF,Japan)和正置金相显微镜(OlympusBX51M,Japan)观察材料表面细胞形貌。同时，收集细胞后，用流式细胞术测量Oct-4表达情况。

细胞贴壁研究

选择H1人胚胎干细胞和hNF-C1hiPSC，研究多肽浓度，消化方法和ROCK抑制剂Y-27632对人多能干细胞贴壁的影响。首先，PDA/CMC修饰6孔板经NHS/EDC活化后，每孔加入1ml不同浓度的VN多肽(0.25mM,0.5mM,0.75mM and 1mM)后4℃过夜反应。第二天，接枝多肽后的培养板用DMEM/F12培养基清洗三次，然后Matrigel上培养的H1hESC和hNF-C1人诱导多功能细胞经0.25％Trypsin/EDTA消化为单细胞，再以23500个细胞每平方厘米密度接种。同时，以相同密度传至Matrigel上作为对照。每天更换新鲜的培养基至第四天，然后用CCK8试剂盒测量各孔细胞数。

如前所述，以每孔1ml体积将1mM VN加入活化后的PDA/CMC修饰培养板，制备PDA-CMC-VN表面用于后续人多能干细胞相关实验。H1人胚胎干细胞和hNF-C1人诱导多功能细胞分别以单细胞或者克隆的形式(23500个细胞每平方厘米)接种至PDA-CMC-VN和Matrigel表面，研究传代方式对人多能干细胞贴壁和增殖的影响。同时，ROCK抑制剂Y-27632的作用也进行了研究，即一组添加5mM Y-27632，另一组不添加。每天更换新鲜的培养基至第四天，然后用CCK8试剂盒测量各孔细胞数。

上述实验每组包含3个平行孔，每孔CCK8试剂吸光度值测量3次。

实验结果

虽然荧光多肽实验证实有大量的VN多肽成功接枝到聚多巴胺表面，但是没有发现贴壁的H1人胚胎干细胞和hNF-C1hiPSC，说明这种直接接枝的方式不可行。于是，我们引入同时含有氨基和羧基的羧甲基壳聚糖，先共价接枝至聚多巴胺表面，然后通过经典的NHS/EDC反应活化表面暴露的羧基，从而接枝VN多肽。有趣的是，虽然CMC的参入减少了VN多肽的接枝量，但实验证实H1人胚胎干细胞和hNF-C1hiPSC均能够很好地贴壁和生长在PDA-CMC-VN修饰的培养板表面。

选择H1hESCs和hNF-C1hiPSCs，研究多肽浓度、消化方式和ROCK抑制剂Y-27632对PDA-CMC-VN修饰培养板表面人多能干细胞贴壁和增殖的影响。随着VN多肽浓度的增加，PDA-CMC-VN表面含有更多的VN多肽，hNF-C1hiPSCs的细胞数也随着逐渐增加，但H1hESCs的细胞数没有显著变化，且两者均显著低于Matrigel对照组(p<0.01)。该结果说明，要想实现hPSCs在PDA-CMC-VN表面的长期培养和扩增，多肽的分布密度应为一定以上。我们进一步研究了EDTA消化方式和ROCK抑制剂Y-27632 对hPSCs贴壁和生长的促进作用。无论是以单细胞或者克隆方式消化，Y-27632的加入均能够显著增加在PDA-CMC-VN表面培养4天的H1hESCs和hNF-C1hiPSCs的细胞数量(p<0.05)。然而，在Matrigel表面,单细胞或者克隆，Y-27632的促进作用对于H1hESCs比较显著，而对于hNF-C1hiPSCs则不明显。此外，无论是否增加Y-27632，在PDA-CMC-VN表面生长四天后，我们发现以克隆形式接种的H1hESCs和hNF-C1hiPSCs的细胞数，明显多于以单细胞接种者(p<0.05)。我们惊喜的发现，结合EDTA消化方式和Y-27632，hNF-C1hiPSCs在PDA-CMC-VN表面生长四天后的细胞数与Matrigel相近。

实施例3PDA-CMC-VN器件诱导人体细胞重编程为人多能干细胞

人尿液细胞重编程为人诱导多能干细胞实验在中科院广州生物医药与健康研究院进行。首先，我们成功从一名男性帕金森患者尿液中，纯化获得尿液细胞。然后利用电穿孔仪(AmaxaNucleofector II,Lonza,Switzerland)按照操作手册，将同时编码Oct-4(POU5F1),Sox-2,SV40LT,Klf-4的非整合型附着体载体和MicroRNA MIR302–367转进150万尿液上皮细胞。将转染后的细胞转至3孔PDA-CMC-VN修饰6孔板中，用添加有丁酸钠的E7培养基(Stem Cell)培养，隔天换液。在转染后的第14天，将培养基换成mTeSR1(Stem Cell)，继续培养至第18天后挑取克隆。在PDA-CMC-VN表面培养至第16代后，利用核型、流式细胞术、免疫荧光、体外拟胚体和畸胎瘤实验对所获得的PDUE0304hiPSCs的多能性进行鉴定。

实验结果：重编程至第8天即有少量胚胎干细胞样人诱导多能干细胞克隆，出现在PDA-CMC-VN表面。继续诱导至第18天，表面有许多典型的胚胎干细胞样人诱导多能干细胞克隆，我们挑取一个克隆至Matrigel表面。在PDA-CMC-VN表面培养至P16的PDUE0304hiPSCs呈现典型的未分化克隆形貌，且核型完整。定量RT-PCR证实细胞表达干性基因Oct-4,Nanog和Sox-2，而不表达分化基因Rex-1。流式和免疫荧光结果显示细胞高表达Oct-4,SSEA-3andTra-1 60等全能型标志物。此外，体外拟胚体和畸胎瘤实验实验证实PDUE0304hiPSCs具备三胚层分化能力。这些结果证实，我们开发的PDA-CMC-VN器件能够支持人体细胞重编程。据我们所知，该实验是首次报道多肽修饰表面能够在成分明确条件下，将人体细胞重编程为人诱导多能干细胞，势必将促进人工合成表面在人多能干细胞中的应用。

实施例4PDA-CMC-VN器件使人多能干细胞长期自我更新

人多能干细胞系长期自我更新

培养在Matrigel上的人胚胎干细胞(H1，H9)和人诱导多能干细胞系(hNF-C1,GZC2F6和UMC-C1)，经0.5mM EDTA 37℃条件下消化4分钟后，用含有5μm Y-27632的mTeSR^TM1培养基将克隆吹打下来，并以1:3传至PDA-CMC-VN修饰的6孔板中。第二天，更换为不含Y-27632的培养基并每天换液。同时，每天用倒置显微镜(OlympusCKX41,Japan)观察细胞的形态，如发现有分化或异常的克隆，标记后在生物安全柜内用负压吸引器(YX932D，China)吸除。根据克隆的大小和密度，细胞每隔3-5天经EDTA消化后传代至新的PDA-CMC-VN修饰6孔板中。

定量RT-PCR检测

细胞用TRiZol提取RNA，继而进行逆转录PCR合成cDNA，最后定量检测Oct-4,Nanog,Sox-2和Rex-1的表达量，以ACTB作为对照基因，各基因引物见序列见表1。

表1.干性检测基因引物序列

免疫荧光检测

人胚胎干细胞(H1，H9)和人诱导多能干细胞系(hNF-C1和UMC-C1)在PDA-CMC-VN表面连续传至P20时，利用免疫荧光检测多能性标记物Oct-4和SSEA-3表达情况。免疫荧光实验在12孔板中进行，具体检测步骤介绍如下：

1)吸尽人多能干细胞的培养基，用DPBS洗一次,加入1ml 4％多聚甲酵室温

固定30分钟。

2)吸去固定液,DPBS洗3次，每次在摇床上轻摇2min；

3)加入1ml 0.2％Triton-X100(Sigma,Missouri,USA)室温通透30min，然后DPBS洗三次，每次在摇床上轻摇2min；

4)再利用1ml 3％BSA(Aladdin,Shanghai,China)溶液室温封闭2小时；

5)用3％BSA与0.2％Triton-X100的等比例混合液，以1:50配制一抗(Mouse Anti-Oct-3/4IgG to Hμman(sc-5279)；Mouse Anti-SSEA-3IgM to Hμman(ab16286))，每孔 加200ul，然后再覆盖上比孔略小的封口膜，把培养板放到有水的针盒(湿盒)里4℃过夜；

6)第二天用弯的针尖挑走封口膜，吸走一抗，PBS洗三次，每次在摇床上轻摇5min；

7)以下避光操作。用DPBS以1:500比例稀释二抗(Goat Anti-Mouse Alexa Fluor488IgG(Molecular Probes,Invitrogen,USA和Goat Anti-mouse Alexa Fluor 488IgM(Molecular Probes,Invitrogen,USA))，然后每孔加入400ul反应1h；

8)DPBS洗三次，每次在摇床上轻摇5min。用DPBS以1:5000比例稀释DAPI后，每孔加入500ul室温染色5min；

9)DPBS洗一次后加入新DPBS,利用尼康Eclipse E800显微镜或者蔡司Axiovert200M倒置共聚焦显微镜观察和拍照。DAPI和绿色荧光标记抗体的激发波长分别是405nm和488nm。

流式细胞术分析

2个人胚胎干细胞系(H1，H9)和2个人诱导多能干细胞系(hNF-C1和UMC-C1))在PDA-CMC-VN表面连续传至P20时，利用流式细胞技术检测其多能性标记物Oct-4，SSEA-3和Tra-1 60阳性表达率。具体实验过程如下：

1)待处理细胞通过0.25％胰酶/EDTA(Stem Cell Technologies,Canada)培养箱内消化4分钟，加入含血清培养基终止并吹打成单细胞；2)200g离心5分钟，用1ml流式缓冲液(含2％FBS的DPBS)重悬细胞并转移到1.5mlEP管中，加入200ul1％多聚甲醛37℃固定5分钟后200g离心5分钟。

3)用流式缓冲液重悬细胞,200g离心后加入200ul冰上预冷的90％甲醇,置冰上通透30分钟。200g离心5分钟后,流式缓冲液洗2次。

4)用流式缓冲液按1:100比例稀释Oct-3/4一抗(01550,StemCell Technologies,Canada)。以100ul一抗溶液重悬细胞，并在培养箱中孵育30min。200g离心5分钟,用流式缓冲液洗1次。步骤3-4适于细胞内标记物Oct-4检测,细胞表面标记物SSEA-3和Tra-1 60无需此操作；

5)以下避光操作。用流式缓冲液按1:500比例稀释Oct-4二抗，以200ul体积重悬并在培养箱中孵育30min。同时，用流式缓冲液按1:100比例稀释SSEA-3(60061PE,StemCellTechnologies,Canada)和Tra-1 60(60064PE,StemCell Technologies,Canada)直标抗体，以100ul溶液重悬细胞，并在培养箱中孵育30min。孵育结束后,200g离心5分钟。

6)流式缓冲液洗1次后,用600ul流式缓冲液洗重悬细胞。过滤后，用BD FACSCalibur System(LSRFortessa,USA)检测并通过Flowjo软件分析干性因子表达情况。

4.4核型

5个人多能干细胞系在PDA-CMC-VN修饰6孔板上传过20代后，回传至预铺有Matrigel的10cm培养皿进行核型检测。待细胞生长到75％-85％密度,按50μg·ml^-1浓度加入秋水仙素(Dahui Biotech,China)并在培养箱内处理1h。DPBS润洗2遍后,用0.25％Trypsin/EDTA消化为单细胞。200g离心5分钟后弃上清,用8ml 37℃预热的0.075mol/LKC1溶液重悬细胞,然后置于37℃水浴中反应20分钟。然后，加入2ml新鲜配制的卡诺固定液(甲醇:冰醋酸3:1)并继续处理10分钟。细胞固定完成后,200g离心5分钟，用冰浴过的固定液重悬细胞并制片。最后用BX51显微镜(Olympus,Japan)观察染色体的排列。

拟胚体形成实验

在PDA-CMC-VN上传过20代的H1hESCs和hNF-C1hiPSCs，当生长至培养板约70％面积时，用1mg·mL^-1Dispase消化7分钟。DMEM/F12培养基清洗3次后，加入EB培养基(DMEM/F12基础培养基含20％牛血清白蛋白,2mM L-glutaMax,1％(wt/vol)NEAA,0.1mMβ-巯基乙醇)并将细胞克隆机械刮脱，然后转至低黏附6孔培养板中悬浮培养8天。根据细胞情况添加培养基或2-3天换液。然后将拟胚体转至PDA-CMC-VN贴壁培养8天，并隔天换液。最后用Trizol裂解细胞,提取总RNA后,荧光定量PCR检测三胚层标志性基因的表达情况(引物见表2),与未分化的人多能干细胞进行比较。

表2.拟胚体三胚层鉴定引物序列

畸胎瘤生成检测

在PDA-CMC-VN上传过20代的H1hESC和hNF-C1hiPSC回传至Matrigel上培养，以用于畸胎瘤生成实验。将待注射细胞经Dispase消化后,用1:80稀释的Matrigel重悬，然后以一百万细胞量立即对NOD-SCID小鼠进行皮下注射,并做好标记。当有畸胎瘤形成并成长至直径1cm时，处死小鼠，约6-8周后,一般即会有畸胎瘤长出。取出畸胎瘤,切片进行苏木精-伊红染色。显微镜观察寻找三个胚层典型的细胞。

实验结果：

选择2个人胚胎干细胞系H1和H9，以及2个人诱导多能干细胞系hNF-C1和UMC-C1，在PDA-CMC-VN表面连续传代超过20代，以判断该表面是否能够支持人多能干细胞的长期自我更新。在PDA-CMC-VN表面培养的4个人多能干细胞系，在传至P20时均保持完整的核型。流式结果显示，对于这4个人多能干细胞系，细胞多能性标志物Oct-4,SSEA-3和Tra-160的阳性表达率均分别超过99.4％,82.6％和96.4％。免疫荧光实验进一步证实这些细胞克隆均高表达多能性标志物Oct-4和SSEA-3。

我们通过拟胚体形成和畸胎瘤形成实验，进一步验证H1hESCs和hNF-C1hiPSCs在PDA-CMC-VN表面培养超过20代后仍保持多能性。PDA-CMC-VN表面培养的H1hESCs和hNF-C1hiPSCs，经悬浮和贴壁培养各8天后提取细胞总RNA，q-PCR结果证实H1hESCs和hNF-C1hiPSCs在PDA-CMC-VN表面形成的拟胚体均表达三胚层基因。此外，这些细胞在注射入裸鼠皮下6-8周后形成了畸胎瘤，且包含来源与三胚层的组织。这些结果证实长期培养在PDA-CMC-VN表面的H1hESCs和hNF-C1hiPSCs仍保持多向分化能力。

实施例5PDA-CMC-VN器件支持人多能干细胞向神经样细胞和心肌样细胞定向分化

H9hESCs在PDA-CMC-VN表面连续传代至第15时，利用STEMdiff neural system(Stem Cell Technologies,Canada)，并按照说明书步骤进行神经向诱导分化；另外，我们参照文献报道的方法(Yang,L.etal.Human cardiovascular progenitor cells developfrom a KDR+embryonic-stem-cell-derived population.Nature、2008、453、524-528.)进行了H9hESCs向心肌细胞分化的实验，除第0，1和4天所用培养基如下所示之外，所有实验方法与文献报道相同:第0天培养基：Stempro-34SFM10640medium,Glutamin(100X),transferrin(0.15mg/ml),1-thioglycerol(6.5ul/ml in 500ml medium,3ul/ml ofbackbone),ascorbic acid(50ug/ml),BMP4(0.05ng/ml),Y27632(10ug/ml)。第1天培养基：Stempro-34SFM 10640medium,Glutamin(100X),bFGF(6ng/ml),Activin A(2.5ng/ml),ascorbic acid(50ug/ml),BMP4(10ng/ml)。第4天培养基：Stempro-34SFM 10640medium,Glutamin(100X),transferrin(0.15mg/ml),1-thioglycerol(6.5ul/ml in 500mlmedium,3ul/ml of backbone),ascorbic acid(50ug/ml),Y27632(10ug/ml),SB431542(10nM)。

定向分化形成的神经细胞和心肌细胞用4％多聚甲醛固定后，通过免疫荧光染色检测是否表达相关标记物进行鉴定。所选用的神经特异性抗体为SOX-1(R&D AF3369,USA),Nestin(R&D MAB1259,USA),MAP-2(Millpore AB5622,USA)和Anti-β-Tubulin III(TUJ-1,Sigma-Aldrich T3952,USA)；心肌细胞特异性抗体为α-actinin(Abcam AB9465,UnitedKingdom)和β-myosin(R&D MAB4470,USA)。

实验结果

在PDA-CMC-VN表面培养的第15代H9hESCs,利用AggreWell^TM800板形成均一的拟胚体，并在成分明确条件下分别分化为神经细胞和心肌细胞。H9hESCs在神经诱导培养基中诱导至第14天后形成神经玫瑰花环结构,且阳性表达神经标记物Sox-1和Nestin,说明成功诱导成为神经前体细胞。与此同时，我们挑取神经玫瑰花环结构在神经玫瑰花环选择培养基中培养7天出现典型的神经元形貌，免疫荧光染色实验证实阳性表达神经元标记物MAP-2和TUJ-1，说明成功分化为神经元细胞。此外，H9hESCs形成的拟胚体在PDA-CMC-VN表面诱导16后形成跳动的心肌细胞,且这些细胞表达心肌标记物α-actinin和β-myosin。这些实验结果说明PDA-CMC-VN表面支持hESCs在成分明确条件下定向诱导分化为神经细胞和心肌细胞。

实施例6实施例6PDA-CMC-VN·BFP-1器件促进人多能干细胞向成骨细胞定向分化

PDA-CMC-VN·BFP-1器件的制备和表征

PDA-CMC修饰细胞培养板的制备如前所述，在超净工作台将5mg VN多肽溶于3.1mlPBS缓冲液中，获得1mM。将5mg BFP-1多肽溶于3.0ml PBS缓冲液中，获得1mM BFP-1多肽溶液。将已制备的VN和BFP-1多肽溶液按照体积比10:0，7:3和5:5混合，得到VN₁₀/BFP-1₀(简称VN)、VN₇/BFP-1₃(简称7:3)和VN₅/BFP-1₅(简称5:5)三组多肽混合液。然后利用如前所述NHS/EDC活化方法得到PDA-CMC-VN/BFP-1多肽混合修饰的细胞培养板。

我们利用FITC荧光蛋白标记的VN多肽以及用罗丹明标记的BFP-1多肽(Rho-KGGQGFSYPYKAVFSTQ)对表面接枝的VN和BFP-1多肽进行多肽接枝情况的定量研究。首先，避光条件下用无菌的PBS溶液分别配置0.2mM，0.4mM，0.6mM，0.8mM，1.0mM以及1.2mM浓度梯度的FITC-VN和Rho-BFP-1多肽溶液，然后在康宁24孔板中分别加入200ul的多肽梯度液(每组3个副孔)。用全波长酶标仪以激发光488nm，吸收光525nm测量VN多肽荧光值，以激发光532nm，吸收光582nm测定BFP-1多肽荧光值，建立荧光-密度标准曲线。然后，配置VN₁₀/BFP-1₀(简称VN)、VN₇/BFP-1₃(简称7:3)和VN₅/BFP-1₅(简称5:5)三组荧光多肽混合液。利用上述方法接枝至活化后的PS-PDA-CMC表面，纯水清洗3次后在相同条件下测量荧光值。

人多能干细胞向成骨细胞定向分化

在Matrigel表面培养的H9hESCs(代数为30-50代)及UMC-C1hiPSCs(代数为30-45代)，用Acutase酶消化成单细胞，然后接种至材料表面(VN组，7:3组及5:5组)。在mTESR1中加入ROCK抑制剂(Y-27632)促进单细胞贴壁。12h后大部分的细胞已完全贴壁，此时更换为不含ROCK抑制剂(Y-27632)的mTESR1培养基。继续培养1天后，更换mTESR1培养基为成骨诱导培养基(α-MEM培养基含10％的FBS，5μg/ml的维生素C(AA)，10mM的β-甘油磷酸钠(β-GP)及10^-8M的地塞米松)，每2天更换培养基至28天。在培养到第28天的细胞培养板中，冰PBS冲洗三遍后加入4％的多聚甲醛固定30min。每孔加入1ml 2％质量分数茜素红水溶液(pH＝4.2)反应20min，蒸馏水多次冲洗后通过倒置光相差显微镜下拍摄钙结节的染色情况。然后，在每孔中加入500ul的1％质量分数十六烷基吡啶溶液，反应完全后每孔吸取100ul的上清液转移至新的96孔板中，每组做3个副孔，在全波长酶标仪中用490nm的波长测定吸光度，从而定量钙结节的形成量。

实验结果

不同多肽混合接枝的表面，荧光强度都较为均匀，证实我们构建了一个相对较为均一的材料表面。定量测量结果显示，从VN组，到7:3组及5:5组，绿色荧光强度逐渐降低(代表VN多肽的接枝量逐渐降低)，红色荧光强度逐渐增强(代表BFP-1多肽的接枝量逐渐增加)，说明多肽按照预设的比例接枝在材料表面，荧光定量的实验进一步证实多肽的混合接枝比例。

成骨诱导28天后，各组的茜素红定性染色和定量测定结果。通过28天的成骨诱导，VN组，7:3组和5:5组表面培养的H9hESCs及UMC-C1hiPSCs均有钙结节形成，且随着BFP-1成骨多肽的含量增加，钙结节的形成量逐渐增加。定量结果进一步证实，成骨多肽的确对干细胞的成骨起到促进的作用，但是不同的细胞系表现有一定的差异，H9hESCs较UMC-C1hiPSCs成骨效果更好。

还需要说明的是，在可实施且不明显违背本实用新型的主旨的前提下，在本说明书中作为某一技术方案的构成部分所描述的任一技术特征或技术特征的组合同样也可以适用于其它技术方案；并且，在可实施且不明显违背本实用新型的主旨的前提下，作为不同技术方案的构成部分所描述的技术特征之间也可以以任意方式进行组合，来构成其它技术方案。本实用新型也包含在上述情况下通过组合而得到的技术方案，并且这些技术方案相当于记载在本说明书中。

以上通过具体实施方式和实施例对本实用新型进行了说明，但本领域技术人员应该理解的是，这些并非意图对本实用新型的范围进行限定，本实用新型的范围应由权利要求书确定。

工业实用性

根据本实用新型，能够提供一种可用于细胞培养或细胞体外实验的器件。

Claims (3)

1.一种可用于细胞培养或细胞体外实验的器件，其包括：

基底，

连接于所述基底上的聚多巴胺层，

连接于所述聚多巴胺层上的羧甲基壳聚糖层，以及

连接于所述羧甲基壳聚糖层上的多肽层；

其中，所述多肽层包含玻连蛋白多肽。

2.根据权利要求1所述的可用于细胞培养或细胞体外实验的器件，其中，所述多肽层还包含具有促进人多能干细胞定向分化的功能的化合物。

3.根据权利要求2所述的可用于细胞培养或细胞体外实验的器件，其中，所述具有促进人多能干细胞定向分化的功能的化合物是BFP-1多肽。