CN205608008U - 人高迁移率族蛋白b1光激发化学发光检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本实用新型公开了一种人高迁移率族蛋白B1光激发化学发光检测试剂盒，包括白色不透明微孔板、包被有人高迁移率族蛋白B1单抗的发光微粒试剂、一套标准品、生物素化抗人高迁移率族蛋白B1单抗溶液和包被有链霉亲和素的感光微粒试剂。所述试剂盒分为双层，试剂瓶放置在下层，下层环绕试剂瓶放置环形设置冰袋腔，可置入冰袋，运输时可保证冷却效果，防止失效。白色不透明微孔板在试剂瓶上层，使试剂盒体积减小，且试剂瓶置入白色不透明微孔板保护之下，可减少碰撞损伤风险。

Description

人高迁移率族蛋白B1光激发化学发光检测试剂盒

技术领域

本实用新型涉及一种激发化学发光检测试剂盒，属于光激发化学发光免疫分析技术领域。

背景技术

近年许多研究调查显示，高迁移率族蛋白B1（high mobility group box 1，HMGB1）为一种重要的炎症介质和致炎细胞因子，参与多种疾病的发病过程，如脓毒症、关节炎、急性胰腺炎、肺炎、系统性红斑狼疮、脑膜炎、肾脏疾病、心血管疾病等。

目前，HMGB1检测方法主要采用蛋白免疫印迹（Western Blot）、酶联免疫吸附试验（ELISA）等，存在半定量、检测时间过长、操作复杂、酶标记物不稳定、测量精度不够高等不足，同时由于HMGB1在血液、体液、细胞培养液、灌洗液等标本中一般含量较低，采用上述方法有时难以检出或准确定量，因此HMGB1测定方法有待进一步改进，以提高检测的便捷性、灵敏度和准确性。

人高迁移率族蛋白B1光激发化学发光检测试剂在运输中较不稳定，可能因温度过高失效，需要在运输时能置入冰袋的试剂盒，必要时置入冰袋避免运输时失效。

发明内容

本实用新型目的是：提供一种新型的HMGB1光激发化学发光检测试剂盒，运用生物素链霉亲和素（包括亲和素）的放大效应和先进的光激发化学发光检测技术，将双抗夹心法的信号放大，达到高灵敏、特异性好、量程范围宽的目的。

一种人高迁移率族蛋白B1光激发化学发光检测试剂盒，包括试剂盒、白色不透明微孔板及人高迁移率族蛋白B1光激化学发光检测试剂瓶。用于存放人高迁移率族蛋白B1光激发化学发光检测试剂的试剂瓶口设置单向软膜，包括单片膜、双片膜、三片膜及四片膜。所述试剂盒盒体内设置上下两层，上层用于放置白色不透明微孔板，下层用于存放人高迁移率族蛋白B1光激化学发光检测试剂，下层位置环形设置环形凹槽用于容纳冰袋，运输中能置入冰袋，避免失效。所述人高迁移率族蛋白B1光激发化学发光检测试剂瓶内包括人高迁移率族蛋白B1标准品、连有抗人高迁移率族蛋白B1单克隆抗体的发光微粒，生物素化抗人高迁移率族蛋白B1单克隆抗体溶液和包被有链霉亲和素的感光微粒组成。所述人高迁移率族蛋白B1标准品浓度范围0-1000ng/mL。

本实用新型的有益效果：一、剂瓶口设置单向软膜，倾倒时试剂不会流失。二、盒体内设置环形冰袋凹槽，能放入冰袋运输时避免失效。三、试剂瓶在冰袋及上层白色不透明微孔板的保护减少碰撞破碎损失。四、灵敏度高，检测至0.1ng/mL；五、量程宽，血清（浆）样本不需要稀释，样品浓度值介于0.1-1000ng/mL的都能准确检测；六、样品需求量少，一次上样只需25µL。

附图说明

图1为HMGB1光激发化学发光免疫检测分析试剂盒的组成示意图；

图2为HMGB1试剂盒下层设置示意图；

图3为HMGB1试剂盒上层设置示意图；

图4为瓶口内设置单向软膜的侧视示意图；

图5为单向软膜的俯视示意图。

标记说明： 1-试剂盒、11-环形凹槽、2-白色不透明微孔板、3-HMGB1光激化学发光检测试剂瓶、31- HMGB1标准品、32-连有抗HMGB1单克隆抗体的发光微粒、33-生物素化抗HMGB1单克隆抗体溶液、34-包被有链霉亲和素的感光微粒、4-单向软膜、41-单线膜、42-十字膜及43-三叉膜。

具体实施方式

下面结合具体附图对本实用新型作进一步说明。

如图1所示，一种人高迁移率族蛋白B1光激发化学发光检测试剂盒，包括试剂盒1、白色不透明微孔板2及人高迁移率族蛋白B1光激化学发光检测试剂瓶3。所述用于存放人高迁移率族蛋白B1光激发化学发光检测试剂瓶3的试剂瓶口设置单向软膜4，包括单线膜41、十字膜42、三叉膜43。所述试剂盒1盒体内设置上下两层，上层用于放置白色不透明微孔板2，下层于存放人高迁移率族蛋白B1光激化学发光检测试剂瓶3位置环形设置环形凹槽11用于容纳冰袋，运输中能置入冰袋，避免失效。所述人高迁移率族蛋白B1光激发化学发光检测试剂瓶3包括人高迁移率族蛋白B1标准品31、连有抗人高迁移率族蛋白B1单克隆抗体的发光微粒32，生物素化抗人高迁移率族蛋白B1单克隆抗体溶液33和包被有链霉亲和素的感光微粒34组成。所述人高迁移率族蛋白B1标准品31浓度范围0-1000ng/mL

如图2所示，所述人高迁移率族蛋白B1光激发化学发光检测试剂瓶3稳定性较差，运输及保存需要在寒冷条件下，通常是使用冷藏车运输。但分装或小量运输条件较难做到，在运输盒体试剂盒1下层存放人高迁移率族蛋白B1光激化学发光检测试剂瓶3位置环形设置环形凹槽11用于容纳冰袋，运输中能置入冰袋，避免失效发生机率。

如图3所示，在上层空间放置白色不透明微孔板2可以避免运输或使用时由于来自上方对试剂盒1的碰撞造成的试剂瓶破裂，从而导致试剂流失。而环形凹槽11容纳冰袋后也能从环形角度从平行的四周方向对试剂盒1进行保护，可以避免运输或使用时由于来自上方对试剂盒1的碰撞造成的试剂瓶破裂，从而导致试剂流失。而下方碰撞机会较少，试剂盒1的底部板材能起到保护作用。

如图4及图5所示，所述用于存放人高迁移率族蛋白B1光激发化学发光检测试剂瓶3的试剂瓶口设置单向软膜4，单向软膜4为形似碗形向试剂瓶瓶底凹陷的软膜。在碗形软膜的凹陷底部设置裂隙，如一字形裂隙为单线膜41、十字型裂隙为十字膜42、三叉形裂隙为三叉膜43。实施时，所述裂隙为裂口，并无空隙，不受力时，裂隙周围的软膜互相接触。当取用试剂时硬质的吸管推开裂隙口边缘的软膜进入瓶内，不受影响。当试剂瓶倾倒时，裂隙周围的软膜在液态压力下向裂隙中央靠近，裂隙被封闭，实际不能流出。

血清人高迁移率族蛋白B1光激发化学发光检测方法，基于光激发化学发光免疫分析法，将链霉亲和素—生物素放大系统引入人高迁移率族蛋白B1双抗夹心体系中，在白色不透明微孔板中加入包被有抗人高迁移率族蛋白B1的一株高效价单抗的发光微粒和连有生物素的抗人高迁移率族蛋白B1的另一株单克隆抗体溶液，及人高迁移率族蛋白B1标准品或样品，避光反应，随后加入包被有链霉亲和素的感光微粒，孵育后检测。

将一株抗HMGB1抗体与发光微粒偶联，另一株抗HMGB1抗体与生物素连接，在均相体系中形成感光微粒抗体抗原抗体生物素的复合物。通过链霉亲和素，感光微粒与双抗夹心复合物免疫夹心，实现感光微粒与发光微粒的特异性接近，从而实现能量传递，发出荧光信号，并被仪器测量出来。

HMGB1的测定原理： 在受到红色激光（680 nm）照射后，感光微粒能使周围环境中的氧转化为单线态氧，单线态氧的生存时间仅为4微秒。短暂的生存时间决定了单线态氧的传播直径很小（约为200 nm）。如果发光微粒在200nm范围之内就能接受单线态氧，并发出高能级的光（520 nm - 620nm）。相反，如果在200nm直径范围内没有发光微粒，单线态氧就会回落到基态氧而没有信号产生。这种依赖于两种微粒相互接近的化学能量传递是LICA均相反应的基础。通常在该反应体系中，微粒的浓度是很低的。两种微粒相互随机碰撞的几率很低，因此，反应体系的本底非常微弱。如果样本中存在HMGB1，则HMGB1单抗包被的发光微粒与HMGB1结合后再与生物素标记的配对HMGB1单抗结合，再加入包被链霉亲和素的感光微粒，形成免疫夹心复合物，这样就能产生能量的有效传递并发出光信号，信号的强弱与样本中HMGB1含量成正比。

具体实施如下：

抗体包被： 取lmg发光微粒、0.05mg的HMGB1单抗、12. µL的1％Tween-20、10µL氰基硼氢化钠溶液加入离心管，然后用0.01M MES溶液(pH6.0)补充到200µL体积，令上述溶液充分混合后37℃反应过夜。次日，加入10µL 0.3M CMO溶液(pH 5.0)终止连接反应，37℃孵育1小时。之后，连有HMGB1单抗的发光微球离心浓缩，再超声混匀以提纯，重复上述步骤两次。最后，将微球溶于含有0.1% Proclin-300的PBS (pH7.4)，2～8 ℃保存。

生物素与抗体连接：取1mgN-羟基琥珀酰亚胺生物素(BNHS)加入0.2mg的HMGB1单抗的pH 7.2 0.05M PBS溶液中，37℃反应1小时，PBS透析24小时后，中间换液3次，分装，-20℃保存。

HMGB1标准品的配制：稀释HMGB1抗原至浓度分别为0.1ng/mL、1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、1000 ng/mL /L，标准品稀释液为含0．05mol /L PBS、0．1mol/L NaC1、0．01％Tween-20、0．1 ％Proclin 300、0．1％ BSA、pH 7．4的反应缓冲液，0 ng/mL标准液为标准品稀释液。

HMGB1的测定步骤：将HMGB1单抗包被的发光微粒和生物素化HMGB1单抗各取25µL，加入不透明微孔板微孔 中，再加入25µL标准品(或样品)，充分混匀，37℃振荡孵育60min。加包被链霉亲和素的感光微粒200µL，室温振荡孵育15min后，在光激发化学发光检测仪上检测光信号，最后从标准曲线计算样品中的HMGB1的含量。

如下所示，为HMGB1光激发化学发光检测结果

HMGB1（ng/mL）——荧光值（cps）

0 253

0.1 1251

1 4162

10 18160

100 100175

1000 610523

本实用新型所述实施例是指导性的，非限定性的，只是帮助理解本实用新型，因此本实用新型并不限于具体实施方式中所述的实施例，凡是由本领域技术员根据本实用新型的技术方案得出的其他具体实施方式，同样属于本实用新型的保护范围。

Claims (1)

1.一种人高迁移率族蛋白B1光激发化学发光检测试剂盒，包括试剂盒（1）、白色不透明微孔板（2）及人高迁移率族蛋白B1光激化学发光检测试剂瓶（3），其特征在于：所述用于存放人高迁移率族蛋白B1光激发化学发光检测试剂瓶（3）的瓶口设置单向软膜（4），包括单线膜（41）、十字膜（42）、三叉膜（43）；所述试剂盒（1）盒体内设置上下两层，上层用于放置白色不透明微孔板（2），下层用于存放人高迁移率族蛋白B1光激化学发光检测试剂瓶（3），下层位置环形设置环形凹槽（11）用于容纳冰袋，所述人高迁移率族蛋白B1光激发化学发光检测试剂瓶（3）内的试剂包括人高迁移率族蛋白B1标准品（31）、连有抗人高迁移率族蛋白B1单克隆抗体的发光微粒（32），生物素化抗人高迁移率族蛋白B1单克隆抗体溶液（33）和包被有链霉亲和素的感光微粒（34）；所述人高迁移率族蛋白B1标准品（31）浓度范围0-1000ng/mL。