CN202583197U

CN202583197U - 大鼠凝血酶原片段f1+2酶联免疫吸附测定试剂盒

Info

Publication number: CN202583197U
Application number: CN 201220224438
Authority: CN
Inventors: 杨娟; 李华渊; 童晓玲; 李庆; 从旭霞; 姚雯; 何峰容
Original assignee: Uscn Life Science Inc Wuhan
Current assignee: Uscn Life Science Inc Wuhan
Priority date: 2012-05-13
Filing date: 2012-05-13
Publication date: 2012-12-05
Anticipated expiration: 2022-05-13

Abstract

本实用新型公开了大鼠凝血酶原片段F1+2酶联免疫吸附测定试剂盒，包括酶标板，所述酶标板包括固相载体和包被层，其特征在于：所述固相载体上设置有多个微孔，包被层附着在所述固相载体的微孔表面，封闭层位于包被层上。本实用新型的试剂盒操作简便，特异性、精确度、灵敏度均较高，可以满足普通实验室的要求。

Description

大鼠凝血酶原片段F1+2酶联免疫吸附测定试剂盒

技术领域

本实用新型属于涉及生物技术领域，具体而言，涉及大鼠凝血酶原片段F1+2酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒。

背景技术

在凝血过程中，内源性和外源性凝血途径通过不同的启动和反应方式激活凝血因子X转变为Xa，Xa可使凝血酶原分子中的Arg(280)-Tyr(281)及Arg(316)-Ile(317)间的肽键同时断裂，释放出凝血酶原片段F1+2，即Al a(4)-Arg(323)，同时C端释放出由轻链A和重链B组成的丝氨酸蛋白酶，即凝血酶。该凝血酶能够反馈裂解酶原本身，释放出片段1(F1)和片段2(F2)，序列分别为Ala(1)-PHe(157)，Ser(158)-Arg(180)。因此血液中F1+2的含量可较灵敏的反应出凝血酶原活化的状态，可作为对高凝状态及抗凝和溶栓治疗进行监测的分子标志。临床上在深静脉血栓形成、肺栓塞、弥散性血管内凝血、溶栓治疗、白血病患者体内F1+2明显增高，而在口服抗凝剂治疗患者体内该指标显著降低。

大鼠作为生物医学实验中常用的动物模型，广泛应用于基础医学领域各项生理病理机制、药物以及物理治疗方法的研究中，但是目前没有针对大鼠F1+2检测的ELI SA试剂盒，因此有必要制备高灵敏度、特异性的产品。酶联免疫吸附测定(ELISA)检测技术是利用抗原-抗体之间特异性的免疫反应识别生物液体中的待测物，并利用酶-底物的显色反应定量的反应待测样本中靶分子的含量。由于其特异性强、灵敏度、操作简便及不需大型仪器等优点，现广泛用于生物样本的定量检测实验中。

因此，有必要选用一种快速、简便能够定量且灵敏度、准确度和特异性高的方法来进行大鼠凝血酶原片段F1+2的检测。

实用新型内容

本实用新型目的是提供一种大鼠凝血酶原片段F1+2酶联免疫吸附测定试剂盒，其操作简便，成本低，稳定性好，可以满足普通实验室的要求。为了实现本实用新型的目的，拟采用如下技术方案：

本实用新型一方面涉及大鼠凝血酶原片段F1+2酶联免疫吸附测定试剂盒，包括酶标板，所述酶标板包括固相载体和包被层，其特征在于：所述固相载体上设置有多个微孔，所述包被层附着在所述固相载体的微孔表面，所述封闭层位于包被层上。

在本实用新型的一个优选实施方式中，所述的包被层含有兔抗大鼠F1多克隆抗体，所述的封闭层包含有牛血清白蛋白。

在本实用新型的一个优选实施方式中，所述的多个微孔是指96个微孔。

在本实用新型的一个优选实施方式中，所述的固相载体是聚苯乙烯试剂板。

本实用新型的试剂盒特异性、精确度、灵敏度均较高，可以满足普通实验室的要求。

附图说明

图1为本实用新型一具体实施例酶标板结构示意图。

1固相载体，2包被层，3封闭层。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本实用新型作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本实用新型并能予以实施，但所举实施例不作为对本实用新型的限定。

本试剂盒应用双抗夹心酶联免疫分析法测定大鼠血浆样本中F1+2的水平。制备过程如下：使用96孔聚苯乙烯试剂板(PS)作为固相载体，先将其置于紫外光下辐照2小时，使PS板活化。在试剂板微孔条上预先包被一定浓度的兔抗大鼠F1多克隆抗体，4℃过夜，经洗板及牛血清白蛋白封闭处理后制成包被好的酶标板。由此可见，该酶标板微量孔内主要有2层：2，包被层；3，封闭层。试剂盒的检测抗体，即检测液A，为生物素化的兔抗大鼠F2多克隆抗体，并以亲和素化辣根过氧化物酶(HRP)作为检测液B，与检测抗体特异性结合。其余试剂盒组份包括重组蛋白F1+2制备的标准品、底物TMB和终止液。

1.重组蛋白的获得：重组F1和F2将作为免疫原免疫动物获得抗体，凝血酶原将用作F1和F2抗体的反向筛选，而重组F1+2将用作ELI SA试剂盒的标准品。

1)引物设计与PCR扩增

参照GenBank公布的大鼠凝血酶原(Prothrombin)基因序列(NM_022924.2)，分别设计扩增F1(氨基酸序列1A-157R)、F2(氨基酸序列158S-323R)、F1+2(氨基酸序列1A-323R)及凝血酶原的特异性引物，并用特异性条件扩增。

A.F1上游引物：5’-GCGCGAATTCGCCAACAGCGGCTTCCTG-3’(EcoR I)

下游引物：5’-CCCAAGCTTCTAGCGAGGAGTCATTTTCACAGTGG-3’(Hi nd III)

扩增条件：95℃预热5分钟；95℃变性30秒；56℃退火30秒；72℃延伸30秒；72℃终末延伸10分钟；30个循环，冷却至4℃保存。

B.F2上游引物：5’-CGCGAATTCTCAAGAGGTTCCAAGGAGAATC-3’(EcoRI)

下游引物：5’-CCCAAGCTTCTACCTCTCATCGAAGAAGGTGTG-3’(Hi nd III)

扩增条件：95℃预热5分钟；95℃变性30秒；58℃退火30秒；72℃延伸30秒；72℃终末延伸10分钟；30个循环，冷却至4℃保存。

C.F1+2上游引物：5’-GCGCGAATTCGCCAACAGCGGCTTCCTG-3’(EcoR I)

下游引物：5’-CCCAAGCTTCTACCTCTCATCGAAGAAGGTGTG-3’(Hind III)

扩增条件：95℃预热5分钟；95℃变性50秒；58℃退火50秒；72℃延伸50秒；72℃终末延伸10分钟；30个循环，冷却至4℃保存。

D.凝血酶原上游引物：5’-GACGAATTCCAGCATGTGTTCCTGGCCCCTC-3’(EcoR I)

下游引物：5’-GCCGAAGCTTCTATCTATGCTGATCAATGACTTTCTGCATCC-3’(HindIII)

扩增条件：95℃预热5分钟；95℃变性1分钟；57℃退火1分钟；72℃延伸1分10秒；72℃终末延伸10分钟；30个循环，冷却至4℃保存。

分别取上述PCR扩增产物10μl，进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶成像系统进行观察、拍摄及分析结果，并用凝胶回收试剂盒进行PCR产物的回收。

2)上述基因的克隆与鉴定

A.F1：取F1的PCR产物和原核表达载体pET28a适量，用EcoR I/Hi ndIII进行双酶切，并将酶切产物按2∶1(摩尔比)比例进行连接反应，将连接后的质粒转化至BL21感受态细胞，涂于含卡那霉素(25μg/ml)的LB平板上，培养过夜并于次日挑选阳性克隆，进行PCR、限制性内切酶酶切以及DNA序列测序鉴定。

B.F2：克隆与鉴定方法参照F1片段。

C.F1+2：克隆与鉴定方法参照F1片段。

D.凝血酶原：克隆与鉴定方法参照F1片段。

3)蛋白表达及纯化

将鉴定正确的阳性克隆菌活化后，1％接种，37℃，250r/mi n摇菌2-3小时，使培养液的OD₆₀₀达到0.4-0.6，加入I PTG终浓度1mmol/L，20℃诱导过夜，离心收集细菌，加入原菌液体积的1/5-1/10体积的超声裂解液【配方：50mMTr i s-HCl(PH8.0)，2mMEDTA，100mMNaCl，0.5％TritonX-100，1mg/ml溶菌酶】。进行冰浴超声，超声5秒，间歇10秒，一般总超声时间为10分钟；然后将超声后的裂解液12,000r/mi n离心15分钟，取上清液按His Trap纯化柱进行纯化。

4)重组蛋白的SDS-PAGE分析

取20μl纯化后的抗原蛋白加入等体积的2×SDS Sample Buffer，100℃加热10分钟，在质量分数为12％的SDS-PAGE胶上电泳，考马斯亮蓝R250染色检测，并通过Bradford标准蛋白曲线测定法测定蛋白浓度。

2.针对F1和F2的多克隆抗体制备

1)免疫动物

用重组抗原F1加等剂量弗式完全佐剂乳化后，背部多点免疫兔子，首次免疫剂量为200μg/只，3周后改用弗式不完全佐剂乳化后加强免疫，免疫次数为3-4次，ELISA法检测抗体效价达标后，颈动脉取血，收获抗血清。F2抗原的免疫方法同F1。

2)抗体的纯化

采用亲和层析法纯化抗血清中的特异性抗体。将上述重组蛋白(包括F1、F2、凝血酶原)分别偶联到不同的亲和层析柱上，制备成能分离F1、F2和凝血酶原抗体的层析柱。

此处以F1抗体的纯化为例，F2抗体的纯化与之相同。将20-30ml血清样本直接从F1抗原偶联的层析柱进样口上样，流速为1ml/mi n。用0.1mo l/LPH8.0磷酸缓冲液(30-40ml)洗脱杂蛋白后，再用0.01mo l/L PH8.0磷酸缓冲液(20-30ml)洗脱，流速为2ml/min。最后用0.1mol/L Gly-HCl洗脱缓冲液洗脱，流速为1.5ml/min，收集样本洗脱液，透析浓缩后进行凝血酶原层析柱的反向筛选，主要为去除能与凝血酶原结合的抗体，此次主要收集磷酸盐缓冲液洗脱的未与层析柱结合的蛋白，并将其浓缩后备用。

3.大鼠凝血酶原片段F1+2酶联免疫吸附测定试剂盒的研制：

4.检测大鼠血浆中的F1+2

检测样本时，加入待测标本及标准品，温育使之充分反应，再加入检测液A，即生物素化的F2多克隆抗体，因此，能同时被包被抗体和检测液A识别的抗原只有F1+2，而血浆中存在的F1、F2、凝血酶原均无法同时被这两个抗体识别，未结合的蛋白可以通过洗涤除去，酶标板上的生物素标记的F2抗体可与后续加入亲和素标记的辣根过氧化物酶(HRP)结合，催化底物3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)产生蓝色可溶性物质，最后加入硫酸终止后呈黄色，于450nm检测标准品孔及样本孔O.D.值。在试剂盒的检测范围内，待测物浓度越高，样本O.D.值则越高。

技术效果

大鼠凝血酶原片段F1+2酶联免疫吸附测定试剂盒采用了分别针对F1和F2片段的抗体，有效的避免了与F1和F2片段的交叉反应。且检测系统采用了生物素-亲和素放大系统，使得其检测范围为31.2-2000pg/ml，最低检测限为12.5pg/ml，可以达到样本的检测要求。为验证试剂盒的各项性能，分别检测了试剂盒的标准曲线、特异性、精密度、回收率及样本稀释的线性，具体实验方法和结果如下：

1)标准曲线：

表1：大鼠凝血酶原片段F1+2酶联免疫吸附测定试剂盒标准曲线值

2.特异性检测：

检测该试剂盒能否与F1+2的结构类似物反应，所测值用交叉反应率来表示，即类似物的测定浓度与实际添加值的比值。具体测定方法如下，在阴性血浆中添加下述物质，使其终浓度为200ng/ml，使用该试剂盒检测并计算交叉反应率。

类似物	交叉反应率
		大鼠F1片段	0.5％
大鼠F2片段	0.3％
		大鼠凝血酶原	1.1％
大鼠凝血因子VII	0.1％
		大鼠凝血因子IX	0.1％
大鼠凝血因子X	0.1％

表2：大鼠凝血酶原片段F1+2酶联免疫吸附测定试剂盒交叉反应率测试

2.精密度实验：

用该试剂盒对高、中、低值质控品分别进行精密度实验，每个样本重复测定20次，表3中结果可见该试剂盒精密度较好。

	批内差CV(％)	批间差CV(％)
			高值	6.3	8.4
中值	5.9	7.9
			低值	7.1	7.8

表3：大鼠凝血酶原片段F1+2酶联免疫吸附测定试剂盒精密度测试

3.回收实验：

在定值血清(2.3pg/ml)中分别加入高、中、低浓度的标准品使F1+2终浓度为52.3pg/ml、202.3pg/ml、802.3pg/ml，用该试剂盒检测，并比较测定值和预期值得到回收率(见表4)。

浓度	ELISA法
		52.3pg/ml	91％
202.3pg/ml	86％
		802.3pg/ml	93％

表4：大鼠凝血酶原片段F1+2酶联免疫吸附测定试剂盒回收率测试

当理解的是，上述具体实施方式仅仅是举例性说明，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本实用新型所附权利要求的保护范围。

Claims

1.大鼠凝血酶原片段F1+2酶联免疫吸附测定试剂盒，包括酶标板，所述酶标板包括固相载体和包被层，其特征在于：所述固相载体上设置有多个微孔，包被层附着在所述固相载体的微孔表面，封闭层位于包被层上。

2.根据权利要求1所述的大鼠凝血酶原片段F1+2酶联免疫吸附测定试剂盒，所述的包被层含有兔抗大鼠F1多克隆抗体。

3.根据权利要求1所述的大鼠凝血酶原片段F1+2酶联免疫吸附测定试剂盒，所述的封闭层包含有牛血清白蛋白。

4.根据权利要求1或2所述的大鼠凝血酶原片段F1+2酶联免疫吸附测定试剂盒，所述的多个微孔是指96个微孔。

5.根据权利要求1或2所述的大鼠凝血酶原片段F1+2酶联免疫吸附测定试剂盒，所述的固相载体是聚苯乙烯试剂板。