CN1997678B - 用作分离介质的类互穿网络 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种聚合物链的类互穿网络，该聚合物链包括以主要骨架形式存在的线性聚丙烯酰胺(LPA)链和聚二甲基丙烯酰胺(PDMA)链。该LPA链的重均分子量大约是0.05×106到大约25×106g/mol，旋转半径大约是10nm到350nm；PDMA链是在LPA主要骨架存在时通过聚合PDMA制备得到。其中，该LPA和PDMA链彼此缠结、互穿；并且，其中，该类互穿网络基本无化学交联。

Description

用作分离介质的类互穿网络
本发明在国家人类基因组研究学会基金No.5R01HG01386-07-8的政府支持下完成。政府享有本发明的某些权利。
技术领域
本发明总体涉及分离带电分子类物质的技术领域，尤其涉及用于毛细管电泳的分离介质。
背景技术
在生物学相关科学中，凝胶电泳是一种使用最为广泛的分离技术。在外加电场的作用下，通过使带电分子类物质，如蛋白质、肽类、核酸和寡核苷酸，在缓冲介质中发生迁移将它们分离开。通常，将缓冲介质与一种低到中等浓度的适合的凝胶剂一起使用，以促进分离，并且将被分离物质发生混合的机率降低到最小。
直到最近，电泳分离才在凝胶板或者开放式凝胶床上进行，其通常是由琼脂糖或交联的聚丙烯酰胺材料构成。近来，使用聚合物凝胶或溶液作为分离介质的毛细管电泳(CE)已被用于带电分子如DNA的分离。毛细管电泳技术和光度检测方法的联合使用为带电分子的自动化操作以及快速定量分析提供了可能性。而且，相对于传统的平板电泳方法，毛细管电泳能在使用很少量的样品、凝胶(或聚合物溶液)和缓冲剂的情况下提供样品的定量信息。并且，已实现了对带有不同有效电荷的带电大分子的高分辨率分离。
通常，毛细管电泳所用的毛细管柱是由熔融石英管制备得到的，其直径大约在25μm到200μm之间，长度为大约30cm到大约200cm。毛细管柱内充满了凝胶或溶液分离介质和缓冲剂。电泳技术被用于分离带电分子类物质。
在CE中，分离介质是最重要的参数之一，因为它决定带电分子类物质(如DNA片段)的迁移特征，包括分辨率。目前，聚合物溶液被广泛用于这样的分离介质。
已经开发了几种合成的亲水均聚物，同时作为DNA分离介质已进行了验证。这些均聚物包括：线性聚丙烯酰胺(LPA)；和烷基取代的衍生物，如聚-N，N--二甲基丙烯酰胺(PDMA)、聚-N-丙烯酰基氨基-乙氧基乙醇(PAAEE)、聚丙烯酰基氨基丙醇(PAAP)、聚(丙烯酰基氨基乙氧基)乙基吡喃葡糖苷(PAEG)、聚乙二醇(PEG)、和聚环氧乙烷(PEO)。
电泳界非常认同：高度缠结的LPA溶液通常能提供最佳的测序(sequencing)分离，能分离长达1300个碱基的片段中只有一个碱基不同的DNA分子(Zhou et al.，Anal.Chem.72∶1045-52(2000))。认为LPA良好的性能部分是由于它的亲水性。
尽管LPA为长读测序(long read sequencing)能提供良好的DNA分离，但是它有要求使用稳定毛细管壁涂层的缺点。该毛细管壁涂层要求能抑制电渗流(electro-osmotic flow)(EOF)，并防止被分析物的吸收。电渗流的产生是由于分离介质不能直接同毛细管内壁连接。在分离过程中施加电场，这个问题严重的电渗流就会出现。通过将可溶缓冲离子吸附到毛细管壁的带电表面可形成双电层。毛细管壁附近的溶液中，离子局部浓度过大，这将导致在邻近毛细管壁的部位保持电荷中性。最终结果是：在电泳过程中，在带电通道壁会形成液体的整体流动。电渗流导致令人极不满意的分离结果。
旨在防止EOF产生的传统方法包括导入化合物，在将分离介质注入毛细管之前，该化合物能结合到毛细管壁的内表面上。如授予Shieh的美国专利No.5，447，617描述了将聚丁二烯共价结合到毛细管的内表面上，在其中引入丙烯酰胺单体，并将丙烯酰胺和聚丁二烯共聚。这种预涂层技术不仅增加成本，还产生如下问题：如毛细管积垢、涂层不均一、以及被涂布的毛细管的有限贮藏期限。
为避免EOF问题的发生，亲水性较低的聚合物被作为分离介质使用。比如：聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)已作为DNA测序基质使用。由于PVP能动态涂布毛细管壁，避免了对于预涂布毛细管壁的需求。但是，和使用LPA获得的分离效能相比，PVP的分离效能差的多。使用PVP仅能实现略大于300个连续DNA碱基的分离。PVP的限制性特征在于：分离期间所用的筛选基质和荧光染料之间的非特异性(疏水性)相互作用过高。这种相互作用使较大DNA片段的分离不清楚。
高性能分离介质(其筛选能力高、粘度低，并具有动态涂布能力)的开发将有助于CE的自动化，进一步提高其性能。但是，具有这些特性的均聚物迄今为止还没有发现。因此，不同的均聚物的混合物得以研究。
研究发现：分子量不同的同一聚合物(如PEO，六乙基纤维素(HEC)和LPA)的混合物，以及两种改性多糖的混合物，如琼脂糖和HEC，对于DNA小片段和DNA大片段都具有较高的分辨率。但是，由化学结构完全不同的两种聚合物混合得到的混合物，从来没有得到成功应用。Kim等人(Kim，Y.，Yeung，E.S.，J.Chromatogr.A.，1997，781，315-325)曾尝试使用PEO和六丙基纤维素(HPC)的混合物来进行DNA测序，但发现分离效果非常差。失败的原因在于两种聚合物的不相容性。
CE的另外一个挑战在于：将通常非常粘稠的分离基质导入到狭窄的毛细管中。聚丙烯酰胺在毛细管中聚合，避免了迫使聚合物溶液进入毛细管或者微通道的问题。还希望在每次使用后，将“使用过的”聚合物基质从毛细管中除去，并重新在毛细管内填充新鲜基质。但是，一旦聚丙烯酰胺在毛细管中聚合，聚合后的凝胶很难从毛细管中除去。
最近，具有粘度依赖特征的共聚物被应用。这种共聚物允许低粘度状态下介质的加载和去除，以及高粘度状态下的电泳分离。如：基于具有低摩尔量(N-异丙基丙烯酰胺)的短的接枝物的LPA的亲水骨架的基质已被描述(Sudor et al.Electrophoresis22∶720-8(2001))。并且，基于N，N-二甲基丙烯酰胺和N，N-二乙基丙烯酰胺的共聚物(“P(DMA/DEA)”)的基质也被检测(Buchholzet al.Anal Chem 73∶157-64.(2001))。但是，共聚物的合成难以控制和重复，会产生不可靠的结果。
成功的电泳用分离介质将包括如下特征：稳定、中性、合适的网孔大小、动态涂布能力(以有效抑制电渗)、低粘度，介质材料用量最少、同时能提供良好的分离结果和长的读长(read length)。在本发明之前，能够提供一些所需特性(如长的读长)的介质，一般不同时具备其它的所需特性，如动态涂布能力。
发明内容
在一具体实施例中，本发明提供了一种聚合物链的类互穿网络(类-IPN)，该聚合物链包括：以主要骨架形式存在的线性聚丙烯酰胺(LPA)链，以及聚二甲基丙烯酰胺(PDMA)链，LPA链的重均分子量是大约0.05×106到大约25×106g/mol，旋转半径大约是10nm到350nm；而聚二甲基丙烯酰胺(PDMA)链是在主要骨架LPA存在时，通过聚合PDMA制备得到的。其中，LPA链和PDMA链彼此缠结、互穿；并且其中，该类-IPN基本无化学交联。
在另一具体实施例中，本发明提供了缠结的聚合物链的类互穿网络，该聚合物链包括线性聚丙烯酰胺(LPA)链和聚二甲基丙烯酰胺(PDMA)链，该PDMA链缠结在LPA链间，并与LPA链互穿，其中LPA和PDMA的重均分子量大约是0.1×106到大约20×106g/mol，而旋转半径大约是15nm到320nm，其中该类-IPN基本没有化学交联。
在另一具体实施例中，本发明提供了缠结的聚合物链的类互穿网络，其由下述方法制备得到。该方法包括：提供包括线性聚丙烯酰胺(LPA)和缓冲剂的溶液，其中该LPA重均分子量为0.05×106到25×106g/mol；提供包括聚二甲基丙烯酰胺(PDMA)和缓冲剂的溶液，其中该PDMA的重均分子量为100,000到25×106g/mol；以分步方式将LPA/缓冲剂的溶液与PDMA/缓冲剂的溶液进行混合，其中LPA/缓冲剂溶液的浓度是PDMA/缓冲剂溶液浓度的1到15倍，而LPA/缓冲剂溶液的体积大约是PDMA/缓冲剂溶液体积的1到50倍；其中，制备得到缠结、互穿的LPA和PDMA聚合物链的类互穿网络，其中，类-IPN基本无化学交联。
在另一具体实施例中，本发明提供了分离带电分子类物质的方法。该方法包括在外加电场的影响下，使带电分子类物质在分离介质中发生迁移，其中分离介质的改进包括：LPA聚合物体系和PMDA聚合物体系，其中该聚合体体系形成类互穿网络。
在另一具体实施例中，本发明提供了一种聚合物链的类互穿网络，该聚合物链包括以主要骨架形式存在的丙烯酰胺(AM)/二甲基丙烯酰胺(DMA)无规共聚物链，其重均分子量是大约0.05×106到大约2×106g/mol，旋转半径是大约10nm到大约80nm，聚二甲基丙烯酰胺(PDMA)链是通过在该无规共聚物主要骨架存在下，聚合PDMA制备得到；其中，所述链彼此缠结、互穿，并且其中，该类-IPN基本无化学交联。
在另一具体实施例中，本发明提供了一种由缠结的聚合物链构成的类互穿网络，其由如下方法制备得到，该方法包括：提供一种包括AM/DMA无规共聚物和缓冲剂的溶液，其中AM/DMA无规共聚物的重均分子量为0.05×106到2×106g/mol；提供一种包括聚二甲基丙烯酰胺(PDMA)和缓冲剂的溶液，其中PDMA的重均分子量为0.05×106到25×106g/mol；以分步方式将该共聚物/缓冲剂溶液和PDMA/缓冲剂溶液进行混合，其中该共聚物/缓冲剂溶液的浓度是PDMA/缓冲剂溶液浓度的1到50倍，该共聚物/缓冲剂溶液的体积是PDMA/缓冲剂溶液体积的约1到20倍；其中，制备得到缠结的共聚物和PDMA聚合物链的类互穿网络。
在另一具体实施例中，本发明提供了一种分离带电分子类物质的方法。该方法包括：在外加电场的影响下，使带电分子类物质在分离介质中发生迁移，其中该分离介质的改进包括：AM/DMA无规共聚物和PMDA聚合物，其中，该聚合物体系形成类互穿网络。
附图说明
图1是样品LPA在1×TTE缓冲溶液中的齐姆图。该图示出了在散射角在150到1390，温度为25℃时，LPA的静态光散射测量。
图2为样品类互穿网络在1×TTE缓冲溶液中的齐姆图。该图示出了在散射角为150到1390，温度为25℃时，包括LPA和PDMA的类互穿网络的静态光散射测量。
图3示出了样品LPA的表观流体动力学半径分布，其在散射角为300，温度为25℃，C＝3.387×10-5g/ml时通过动态光散射测量获得。
图4示出了样品类互穿网络表观流体动力学半径分布，其是在散射角为300，温度为25℃，C＝3.201×10-5g/ml时通过动态光散射测量获得。
图5示出了通过CE分离DNA(pGEM-3Zf(+)从-21M13上游引物)。该分离在IPN/1×TTE+7M尿素缓冲溶液中，C＝2.0％g/ml，60℃条件下进行。毛细管的有效长度是34cm，ID/OD＝75/365(μm)。分离在本实验室自制仪器中进行。
图6示出了通过CE分离DNA(pGEM-3Zf(+)从-21M13上游引物)。该分离在MegaBACE LPA/l×MegaBACE缓冲液中，44℃，150V/cm的条件下进行。毛细管的长度为34cm，ID/OD＝75/365(μm)。分离在本实验室自制仪器中进行。
图7示出了通过CE分离DNA(pGEM-3Zf(+)从-21M13上游引物)。该分离在POP6/1×TTE缓冲液中，50℃，200V/cm的条件下进行。毛细管的长度为34cm，ID/OD＝75/365(μm)。分离在本实验室自制仪器中进行。
图8示出了通过CE电泳分离DNA BigDye Terminator v3.0的末端部分(碱基数目从600到～1000)。该分离在类互穿网络/1×TTE+7M尿素缓冲溶液中，C＝2.0％g/ml，60℃的条件下进行。仪器：ABI Prism 310四色单毛细管遗传分析仪。
图9示出了通过CE电泳分离DNA(BigDye Terminator v3.0)的蓝色-G部分。该分离在POP6/1×ABI缓冲溶液中进行。仪器：ABI Prism 310四色单毛细管遗传分析仪，50℃，Module seqPOP6(1ml)E。毛细管ID/OD＝50/361(μm)。
图10示出了通过使用实验室自制测序分析仪，以2.5％类-IPN/1×ABI缓冲液作为分离介质，在少于～33min内测得的660bp的四色DNA(BigDye Terminator v3.0)序列。(仪器和base calling软件由Stony Brook大学Engineering College提供)
图11示出了通过使用实验室自制测序分析仪，以POP7/1×ABI缓冲液作为分离介质，在～63min内测得的600个碱基的四色DNA序列(BigDye Terminator v3.0)。(仪器和base calling软件由StonyBrook大学Engineering College提供)
图12示出了在LPA/PDMA类互穿网络介质中DNA(BigDyeTerminator v3.0)的分离，其中LPA(重量平均MW＝7.6×106g/mol)和PDMA(重量平均MW～470Kg/mol)的含量分别为83％和17％。工作电压195.5V/cm，DNA注入时间在27V/cm下20s。毛细管有效长度是33cm，ID/OD＝50/361(μm)。仪器：ABI Prism 310四色单毛细管遗传分析仪。
图13示出了在类互穿网络(20805)介质中DNA(BigDyeTerminator v3.0)的分离。类互穿网络中PDMA和LPA的含量分别为～11％和～89％。工作电压195.5V/cm，DNA注入时间在27V/cm下20s。毛细管有效长度是33cm，ID/OD＝50/361(μm)。仪器：ABIPrism 310四色单毛细管遗传分析仪。
图14示出了改变DNA注入电压：(a)25V/cm；(b)75V/cm；(c)100V/cm对DNA分离的分辨率的影响。该分离在实验室自制仪器中进行。注入时间是10秒；毛细管有效长度是35cm；毛细管ID＝75um；工作电场＝150V/cm；缓冲溶液是1×TTE/7M尿素；DNA：pGEM3Zf(+)(C-mix)。
图15示出了在有效柱长为(a)35cm和(b)40cm时DNA分离分辨率的变化。分离在实验室自制仪器中进行，注入电压和时间是75V/cm、10秒。仪器工作条件和DNA样品同图14中所述。
图16示出了工作电场强度为(a)200V/cm和(b)150V/cm时pGEM3Zf(+)第581个碱基后面的电泳图。分离在实验室自制仪器中进行，注入电压和时间是75V/cm、10秒。毛细管有效长度＝40cm。仪器工作条件和DNA样品同图14中所述。
图17示出了通过使用由LPA和PDMA比率为(a)1∶0(未涂布的毛细管)；(b)1.62∶1；(c)3.33∶1；(d)6.33∶1(e)10.9：1的类互穿网络作为分离介质的DNA测序样品的分离。分离在实验室自制仪器中进行，注入电压和时间是75V/cm、10秒。毛细管有效长度＝40cm。仪器工作条件和DNA样品同图14中所述。
图18示出了不同的LPA分子量：(a)Mv＝4.53×106g/mol；(b)Mv＝6.4×106g/mol；(c)Mv＝7.69×106g/mol；(d)Mv＝9.91×106g/mol对DNA分离的影响。分离在实验室自制仪器中进行，注入电压和时间是75V/cm、10秒。毛细管有效长度＝40cm。仪器工作条件和DNA样品同图14中所述。
图19示出了DNA分离结果的比较，其中LPA通过(a)无乳化剂聚合；(b)反相微乳液聚合制备得到。分离在实验室自制仪器中进行，注入电压和时间是75V/cm、10秒。毛细管有效长度＝40cm。仪器工作条件和DNA样品同图14中所述。
图20示出了DNA(BigDye Terminator v3.0)的电泳图的黄色-T部分。仪器和工作条件同图8中相同。
图21示出了DNA(BigDye Terminator v3.0)电泳图黄色-T部分中的单碱基分辨率，如图20所示。
具体实施方式
本发明涉及用于分离带电大分子的毛细管电泳用分离介质，以及制备和使用该分离介质的方法。
本发明中的分离介质包括一种聚合物或共聚链的“类互穿网络”(类-IPN)。这些链彼此互穿、互相缠结。在一个具体实施例中，类-IPN包括线性聚丙烯酰胺(LPA)链和聚二甲基丙烯酰胺(PDMA)链。在另一具体实施例中，类-IPN包括由丙烯酰胺(AM)和二甲基丙烯酰胺(DMA)链构成的无规共聚物，以及聚二甲基丙烯酰胺链。
化学交联不要求出现在类-IPN中。优选地，不出现化学交联。但是，由于实验条件不同，可能出现少量化学交联。基于本说明书的目的，少量化学交联的定义是：低于大约5％、2％、1％、0.5％或0.2％的聚合物链和另外的聚合物链发生化学交联。在类-IPN的制备中不使用交联剂。
一般而言，在本领域中，术语“互穿网络”用于描述一种聚合结构，该结构包含至少两种独立的化学交联聚合物网络，该网络彼此互穿，但是互不发生交联。因此，现有技术所熟知的互穿网络与本发明所涉及的类互穿网络间存在的差异在于：该类互穿网络组成了一种基本无化学交联的单一网络。
该类-IPN中的每种聚合物(或共聚物)提供对于分离介质不同的所需特性。如LPA具有亲水性，并且提供良好的分离效能，如分辨率高、读长长，和工作时间短。但是，由于LPA不能与毛细管内壁直接连接，这导致在电泳过程中产生不希望的电渗流。
PDMA亲水性较差，能动态涂布毛细管内壁，因此可避免电渗流的产生。同时，PDMA能抑制毛细管壁对带电大分子(如DNA片段)的非特异性吸附。
本发明通过将这两种不同的聚合物，LPA和PDMA在类-IPN中结合起来，将每种聚合物理想的特性结合到一种分离介质中。
一般而言，在溶剂中，LPA和PDMA链的相容性从彼此相互混溶到彼此不相互混溶。基于本说明书的目的，若LPA和PDMA链能混合在一起、且能长时期保持溶解状态，则将LPA和PDMA链定义成混溶；若即使在获得LPA和PDMA链的高度缠结的均一溶液时，LPA和PDMA链最终也要发生相分离，则将LPA和PDMA链定义成不混溶。若LPA和PDMA链具有介于混溶和不混溶的聚合物链之间的一定程度的混溶性，则LPA和PDMA链是部分不混溶。
LPA和PDMA链的混溶性受到几个因素的影响，如溶剂中总聚合物浓度、聚合物的分子量、以及每种聚合物的相对含量。随着总聚合物浓度的增加，和/或聚合物分子量增加，和/或LPA作为主要组分的溶液中PDMA相对含量增加，混溶性降低。
要获得用于分离介质的适合网孔大小，要求有一定的最小总聚合物浓度。一般而言，为获得对于绝大部分测序分离适合的网孔大小，要求总聚合物浓度大约是1.5wt％的数量级或更高。在LPA和PDMA链相对含量相当，同时其分子量高时，在总聚合物浓度为1.5wt％时，LPA和PDMA链彼此部分不混溶。但是，通过使部分不混溶的LPA链和PDMA链形成类-IPN，至少一旦在需要进行带电生物分子的分离时，该LPA链和PDMA链应能彼此缠结、互穿。
类互穿网络中的LPA链和PDMA链至少在聚合物链彼此排斥这点上不相同。因此，该链在溶液中变得伸展，超过其正常构象。因此，与不以类互穿网络形式存在的组成型LPA链和PDMA链的重量/体积比之和相比较，溶液中的类互穿网络的重量/体积比更小。更充分伸展的构象能有效提供一种更好的分离介质，同时将形成理想的网孔大小所需的聚合物材料的数量减少到最少程度。
LPA和PDMA链必须混溶到这样的程度，即至少一旦在需要进行带电大分子的分离时，该聚合物链应能保持彼此缠结。如此，当类互穿网络被置于测序缓冲介质中时，该类互穿网络以均一的、凝胶状的溶液形式存在。
LPA链、PDMA链和类互穿网络的某些物理特性能被确定。这些特性包括分子量、多分散指数、旋转半径和流体动力学半径。这些特性能影响由特定的类互穿网络提供的分离效能。基于类互穿网络的具体应用，这些特性可以被改变以最优化分离结果。这些特性将在下文中进行探讨。
单一聚合物链的分子量通过将单体的分子量和聚合物链中单体数量简单相乘得到。聚合物溶液中包括多种具有不同分子量的聚合物链。溶液中聚合物的分子量即是溶液中聚合物链的分子量的平均值。有几种方式来描述溶液中聚合物的平均分子量。
一种描述溶液中聚合物分子量的方式是通过确定溶液中聚合物的“数均分子量”(Mn)。数均分子量被定义为溶液中聚合物链的总分子量除以溶液中聚合物链的总数量。也就是说，Mn＝∑niMi/∑ni，其中ni是溶液中分子量为Mi的聚合物链的数目。
另一种描述聚合物分子量的方式是通过确定“重均分子量”(Mw)。重均分子量被定义成niMi 2的总和除以niMi的总和，其中nj是分子量为Mi的聚合物链的数目。也就是说，Mw∑niMi 2/∑niMi。重均分子量可以通过静态激光散射实验测定。
比值Mw/Mn被定义成聚合物的多分散指数。该指数是聚合物链的尺寸分布量度。多分散材料的重均分子量一般比数均分子量大。若多分散指数的值接近1，则聚合物链尺寸大小更接近。正如本领域技术人员所熟知的那样，多分散指数能使用数值计算法，即CONTIN法(Provencher，Comput.Phys.Commun.27∶229(1982))并结合动态光散射测定法估算得到。
旋转半径(Rg)是聚合物链的尺寸量度。它是根据聚合物链中分子量为mi的每个单体距聚合物链重心的距离分布来定义的，即：Rg 2＝∑miri 2。溶液中聚合物的旋转半径可以通过静态激光散射实验来实验确定。旋转半径在交叠浓度之后测定。
另外，若已知溶液中特定的聚合物的旋转半径Rg和相应的重均分子量(Mw)两值，那么在相同溶液中，具有不同已知Mw的聚合物，其旋转半径能估算得到。这个估算方法使用下面公式：Rg＝KgMw α，其中，Kg是常数。在一种为本领域技术人员承认的良好的溶剂中，指数α大约是0.58。
旋转半径相关的一个特性是流体动力学半径(Rh)。通过使用动态光散射实验测定聚合物分子的迁移率(根据稀溶液中的平移扩散系数)，可确定溶液中聚合物分子的流体动力学半径。正如本领域的技术人员所熟知的那样，Rg：Rh比值取决于聚合物分子的构象。
本发明中的类互穿网络不能通过简单地将LPA和PDMA混合制备，而是使用特定的合成方法，以影响这些聚合物链的缠结和互穿。
一种优选的用于制备类互穿网络的合成方法包括：由LPA，或AM/DMA共聚物形成聚合物网络，或“主要骨架”。基于本发明中的目的，主要骨架包括溶剂中的LPA聚合物分子、或AM/DMA共聚物分子，其中，如下文所述，对于特定的溶剂，溶液的浓度远远高于LPA，或AM/DMA共聚物的交叠浓度(C*)。
溶液中聚合物的交叠浓度是指：聚合物分子第一次相互交织、并变得彼此缠结时的最低浓度。因此，聚合物溶液的特征在交叠浓度时通常显著改变。与更稀浓度时的单个聚合物分子相比，交叠浓度时的单个聚合物分子，对毗邻分子的运动影响更大。比如，聚合物分子的运动更受限于毗邻分子。同样地，一般而言，溶液粘度急剧增加。
交叠浓度可根据聚合物溶液的各种可测定的特性来决定。比如，一般而言，聚合物溶液的交叠浓度被估算为溶液固有粘度([η])的倒数。
并且，交叠浓度可根据溶液中聚合物的分子量M和旋转半径(Rg)，利用公式：C*～M/Rg 3估算得到。分子量和旋转半径能通过本领域所熟知的光散射实验来实验测定。B.Chu，“Laser Light
Scattering：Basic Principles and Practice，”2naEdition，Academic Press，Boston(1991)pp.343。
LPA主要骨架通过使用任何合适的聚合方法聚合丙烯酰胺单体形成。一旦溶液达到交叠浓度，LPA主要骨架就能形成。聚合方法的实例包括：反相微乳液聚合、无乳化剂聚合、常规的和种子乳液聚合(conventional and seeded emulsion polymerization)、以及分散和悬浮聚合。
优选产生高分子量的LPA的聚合方法，如，反相微乳液聚合。反相微乳液聚合方法为本领域所熟知。反相微乳液包含被油性分子包裹的纳米尺寸级水滴。在引发剂，如UV辐射或者热引发剂的触发下，在水滴内发生聚合。无乳化剂聚合也可合成高分子量LPA分子。
优选的是具有分子量分布范围相当窄，也就是多分散指数小的LPA。反相微乳液聚合提供了多分散指数小的LPA。
在整个说明书中，有由上限和下限所定义的范围。每个下限可以与每个上限结合定义一个范围。上下限均可作为独立要素。
优选地，主要骨架LPA的物理性质在缓冲溶液中存在LPA时测定。恰当的缓冲剂的实例包括：Tris-TAPS-EDTA(TTE)，Tris-硼酸(Borate)-EDTA(TBE)和Tris-冰醋酸-EDTA(TAE)。LPA如下的物理性质在1×TTE缓冲溶液中测定。1×TTE缓冲溶液含50mM Tris；50mM TAPS；和2.0mM EDTA。
交叠浓度取决于LPA的分子量和溶剂。1×TTE中LPA的交叠浓度范围的下限大约是5.0×10-4g/ml。其它下限的实例包括：5.0×10-3g/ml和9.0×10-3g/ml。1×TTE中LPA的交叠浓度范围的上限大约是4.0×10-2g/ml。其它下限(上限)的实例包括：1.0×10-2g/ml和2.0×10-2g/ml。一个交叠浓度的具体的实例大约是：1.2×10-3g/ml。
优选地，LPA链的重均分子量范围的下限大约是0.05×106g/mol。其它下限的实例包括大约0.1×106、0.3×106、1×106、4×106、6×106、和7×106g/mol。
优选地，LPA链的重均分子量范围的上限大约是25×106g/mol。其它上限的实例包括大约8×106、10×106和15×106g/mol。LPA重均分子量的一实例是7.6×106g/mol。
优选地，LPA链的多分散指数的范围是窄的。比如，优选地，多分散指数范围的下限大约是1.01。其它下限的实例包括大约1.02、1.05和1.1。
优选地，多分散指数范围的上限大约是1.8。其它上限的实例包括约1.3、1.5和1.6。一个LPA多分散指数的实例是1.3。
优选地，缓冲溶液中的LPA的旋转半径范围的下限大约是10nm。其它下限的实例包括大约15nm、28nm、55nm、125nm、150nm、和165nm。
优选地，缓冲溶液中LPA的旋转半径范围的上限大约是350nm。其它上限的实例包括大约180nm、210nm和250nm。一个LPA旋转半径的实例是大约180nm。
溶液中LPA的流体动力学半径的范围与良好溶剂中LPA的Rg范围相吻合，这将被本领域中的技术人员所熟知。溶液中LPA的流体动力学半径的实例是大约81nm。
将二甲基丙烯酰胺单体和LPA主要骨架聚合。通过采用任何适合的方法聚合二甲基丙烯酰胺单体，如，比如，使用同上文所述的制备LPA的相同的方法。优选自由基聚合。
优选地，由LPA和PDMA链形成的类互穿网络的重均分子量范围的下限是大约几十万。其它下限的实例包括大约0.1×106、0.5×106、2×106、和6×106g/mol。
优选地，由LPA和PDMA链形成的类互穿网络的重均分子量范围的上限是大约20×106g/mol。其它上限的实例包括大约7×106、10×106和16×106g/mol。一个LPA/PDMA类互穿网络的重均分子量的具体实例是大约6.4×106g/mol。
优选地，类互穿网络具有组成型聚合物，其中，每种组成型聚合物的多分散指数范围的下限是大约1。其它下限的实例包括大约1.05和1.1。
优选地，类互穿网络具有组成型聚合物，其中，每种组成型聚合物的多分散指数范围的上限是大约1.8。其它上限的实例包括大约1.3和1.5。
在优选的具体实施例中，类互穿网络中的LPA和PDMA的旋转半径范围的下限大约低于10nm。其它下限的实例包括大约15nm、40nm、80nm和150nm。
优选地，类互穿网络中的LPA和PDMA的旋转半径范围的上限大约是320nm。其它上限的实例包括大约165nm、210nm和280nm。类互穿网络中的旋转半径的一实例是大约153nm。
由LPA和PDMA链构成的类互穿网络在1×TTE中的交叠浓度大约是5×10-4到3.0×10-2g/m1。一个交叠浓度的具体的实例是大约5.5×10-3g/ml。
LPA的重量分子量的范围在大约6×106到7×106g/mol之间时，LPA含量和PDMA含量比率的范围在大约10∶1到15∶1之间。
通过首先提供LPA主要骨架，允许LPA和PDMA在高的聚合物浓度下混合，由此能够制备均一的、凝胶状的溶液，从而形成类互穿网络。即使在较高浓度条件下LPA和PDMA变得不混溶，且在相当的时间出现肉眼可见的相分离，这种方法也可得以实施。
在LPA浓度较高时，如：大于大约4.0×10-2g/ml，PDMA和LPA变得基本上不混溶。但是，在本发明中的一个具体实施例中，类互穿网络由AM和DMA的无规共聚物，和均聚合物PDMA形成。(AM/DMA的)无规共聚物为在高的总聚合物浓度、且没有出现相分离的条件下(与PDMA)形成类互穿网络提供可能。
在所述的具体实施例中，通过使用任何适当的聚合方法，在缓冲液中将丙烯酰胺和二甲基丙烯酰胺单体聚合。自由基聚合是优选的聚合方法。一旦缓冲溶液中达到交叠浓度，则由AM和DMA无规共聚物链形成无规共聚物的主要骨架。缓冲溶液中无规共聚物的交叠浓度大约是3×10-3到4.0×10-2g/ml。缓冲溶液中所述范围的另一下限是5.0×10-3g/ml。缓冲液中所述范围的另一上限是3.0×10-2g/ml。缓冲溶液(如1×TTE)中的交叠浓度的一具体实例是大约1.0×10-2g/ml。
优选地，构成主要骨架的AM/DMA无规共聚物链的重均分子量范围的下限是大约0.05×106g/mol。其它下限的实例包括大约0.1×106和0.3×106g/mol。
优选地，构成主要骨架的AM/DMA无规共聚物链的重均分子量范围的上限是大约2×106g/mol。其它上限的实例包括0.5×106和1×106g/mol。
优选地，在类互穿网络中AM含量和DMA含量的比率范围的下限大约是5∶1。其它的下限实例包括10∶1和20∶1。优选地，在类互穿网络中AM含量和DMA含量的比率范围的上限大约是50∶1。其它上限的实例包括30∶1和40∶1。
优选地，缓冲溶液中AM/DMA无规共聚物的旋转半径大约介于10nm到80nm之间。该范围的下限的实例是大约10nm、15nm和30nm。该范围的上限的实例是大约40nm、55nm和80nm。优选地，该无规共聚物的多分散指数介于大约1.1到2之间。
通过使用任何合适的聚合方法，在无规共聚物主要骨架存在时，通过聚合DMA可制备得到PDMA链。自由基聚合是优选的聚合方法。
优选地，类互穿网络的组成型聚合物和共聚物的重均分子量范围的下限大约是0.1×106g/mol，其中该类互穿网络由AM/DMA共聚物和PDMA聚合物形成。下限的其它实例包括大约0.5×106g/mol和0.8×106g/mol。
优选地，类互穿网络的组成型聚合物和共聚物的重均分子量范围的上限大于2×106g/mol，其中该类互穿网络由AM/DMA共聚物和PDMA聚合物构成。上限的其它实例包括大约1×106g/mol到2×106g/mol。
优选地，该聚合物和共聚物的旋转半径范围的下限大约是15nm。下限的其它实例包括大约40nm和50nm。
优选地，该聚合物和共聚物的回转半径范围的上限大约是80nm。上限的其它实例包括大约55nm和65nm。
优选地，无规共聚物和PDMA聚合物的多分散指数介于大约1.1到2之间。多分散指数的一具体实例是大约1.6。应注意到的是：存在两种类型的聚合物，其中每种都有自己的多分散指数，这加宽了类互穿网络的多分散指数，尤其是在两种聚合物的分子量大大不同时。
在本发明中的可选具体实施例中，制备类互穿网络的方法可通过混合溶液法实现。在该方法中，形成类互穿网络的聚合物和/或共聚物要求在聚合物的混合物的均一、单相区域中能彼此相容。
在该方法中，提供了LPA和PDMA的单独的溶液。这些溶液中的溶液之一，优选PDMA溶液，较LPA溶液更稀。用于这些溶液的溶剂的实例包括水和缓冲溶液。合适的缓冲溶液的实例包括Tris-TAPS-EDTA(TTE)、Tris-硼酸-EDTA(TBE)、和Tris-冰醋酸-EDTA(TAE)。将两种聚合物彻底混合，为聚合物链互穿提供可能。将两种聚合物溶液与两种远远高于交叠浓度的溶液混合没有效用。
LPA溶液的浓度大约是PDMA溶液浓度的1到15倍。在LPA和PDMA浓度相同的具体实施例中，PDMA的体积相应地降低。LPA溶液的体积大约是PDMA溶液体积的1到50倍。在LPA和PDMA体积相同的具体实施例中，PDMA的浓度相应地降低。
以分步方式将PDMA溶液加入LPA溶液中。每次加入后，将得到的溶液充分混合。基于本说明书中的目的，分步方式意味着PDMA溶液总量的部分被加入到LPA溶液中，并且在每部分加入之后，将得到的溶液充分混合。被加入部分的实例包括三分之一的PDMA溶液、四分之一的PDMA溶液、五分之一的PDMA溶液、十分之一的PDMA溶液、和二十分之一的PDMA溶液。
在该具体实施例中，优选地，LPA的重均分子量范围的下限大约是0.05×106g/mol。其它下限的实例包括大约0.1×106、0.3×106、和1×106g/mol。
优选地，LPA的重均分子量范围的上限大约是25×106g/mol(或尽可能高)。其它上限的实例包括大约4×106、6×106、7×106、8×106、10×106、15×106和20×106g/mol。LPA重均分子量的一实例是6.4×106g/mol。
LPA溶解在含水溶液中，如水，或缓冲溶液。合适的缓冲剂的实例包括TTE、TBE和TAE。优选的缓冲溶液的一实例是1×TTE+7M尿素缓冲液。LPA/缓冲剂溶液，如LPA/TTE溶液，其浓度范围的下限优选是大约1.0％g/ml。下限的其它实例包括4.0％和6.0％g/ml。LPA/缓冲剂溶液，如LPA/TTE溶液，其浓度范围的上限优选是大约12.0％g/ml。上限的其它实例包括8.0％和10.0％g/ml。随着浓度的增加，类互穿网络的网孔大小降低。LPA/TTE溶液浓度的一实例是大约2.6％g/ml。
优选地，PDMA的重均分子量范围的下限大约是100,000g/mol。其它下限的实例包括大约300,000和500,000g/mol。优选地，PDMA的重均分子量范围的上限大约是25×106g/mol。其它上限的实例包括大约1×106、3×106和10×106g/mol。PDMA重均分子量的一个实例是470,000g/mol。
PDMA溶于含水溶液中，如水或缓冲溶液。适当的缓冲剂的实例包括TTE、TBE和TAE。优选的缓冲溶液的实例是1×TTE+7M尿素缓冲液。PDMA/缓冲剂溶液，如PDMA/TTE溶液，其浓度范围优选介于大约0.1％g/ml到3.0％g/ml之间。PDMA/TTE溶液的浓度的一个实例是大约1.6％g/ml。
在通过该方法制备得到的类互穿网络中，LPA大约是PDMA的3.0到15.0倍。比如，类互穿网络可以包括大约85wt％LPA和15wt％PDMA。
溶液混合法也可用于制备AM/DMA无规共聚物和PDMA的类互穿网络。制备AM/DMA无规共聚物和PDMA的独立的缓冲溶液。合适的缓冲溶液的实例包括TTE、TBE和TAE。，这些溶液中的一种溶液，优选PDMA溶液，较无规共聚物溶液更稀。该聚合物和共聚链充分混合，为该链互穿提供可能。
AM/DMA的无规共聚物溶液的浓度大约是PDMA溶液浓度的1到50倍。在该共聚物和PDMA浓度相同的具体实施例中，PDMA的体积相应地减少。该无规共聚物溶液的体积大约是PDMA溶液体积的1到20倍。在该共聚物和PDMA体积相同的具体实施例中，PDMA的浓度相应地降低。该共聚物/缓冲剂溶液的浓度大约是5.0到20.0％g/ml，优选大约7％到12％g/ml。PDMA/缓冲剂溶液的浓度大约是0.1到1.0％g/ml。
如前文关于LPA和PDMA的描述那样，以分步方式将PDMA溶液加入到无规共聚物溶液中。
在该具体实施例中，优选地，该无规共聚物的重均分子量范围的下限大约是0.05×106g/mol。其它下限的实例包括大约0.1×106，和0.3×106g/mol。优选地，该无规共聚物的重均分子量范围的上限大约是2×106g/mol(或尽可能高，但在可接受的粘度范围内)。其它上限的实例包括大约0.5×106、1×106和1.5×106g/mol。
优选地，PDMA的重均分子量范围的下限大约是50,000g/mol。其它下限的实例包括100,000和200,000g/mol。PDMA的重均分子量范围的上限大约是25×106g/mol。其它上限的实例包括500,000、1×106、3×106、5×106和10×106g/mol。
通过该方法制备得到的类互穿网络，其无规共聚物较PDMA大约高达50倍。
本发明中所有具体实施例中制备得到的类互穿网络可作为带电分子类物质的分离介质，如毛细管电泳或芯片上的DNA/蛋白分析。生物分子的实例包括核酸分子和蛋白质。
在不考虑仪器变量的情况下，就给定的聚合物，用于DNA序列分析的毛细管电泳的分离条件的最优化取决于三个主要因素：聚合物浓度、样品注入量和电场强度。分离介质中聚合物的浓度影响到分辨率、工作时间和读长。浓度越高，分辨率越高，但是浓度越低，粘度越低，分离更快，读长更长。最佳浓度应该在尽可能低的浓度条件下，分辨率足够高。样品注入量影响到分辨率和信号噪声比。为实现最佳效果，注入量应该保持最少，以提供高分辨率和足够高的信号噪声比。电场强度应该适当高，比如大约150V/cm。就较小片段而言，电场强度越高，分离更快捷，分辨率更高。但是，如果电场强度过高，较大片段的分辨率就会降低，同时读长缩短。
作为DNA分离介质，类互穿网络成功地结合了PDMA的动态涂布能力和LPA的亲水性。同时，由于这两种聚合物体系的部分不相容性，LPA和PDMA链均得到超过其自然构象的伸展。这种伸展提高了类互穿网络作为分离介质的效率，同时将用于获得理想网孔大小所使用的聚合物材料量降低到最小。通过使用裸露毛细管而不增加另外的聚合物涂布步骤就能获得高效的分离分辨率。
包括LPA和PDMA的类互穿网络作为分离介质，其性能受到几个变量的影响。比如，如前文所述，LPA的分子量及其分子量分布，在DNA测序分析中起着重要的作用。LPA分子量越高，同时分子量分布范围越窄，其分辨率越高，同时分离能力越稳定。
另外，相对于LPA的分子量，LPA与PDMA的比率影响到分离效果。就LPA的每个重量分子量范围而言，LPA：PDMA比率可优化分离效果。比如，就重均分子量大约是6×106到7×106的LPA而言，LPA：PDMA比率的范围介于大约10∶1到15∶1时最佳。即使总聚合物浓度相当低，若PDMA含量进一步增加，可能导致该聚合物体系的微相分离，不利于分离效果。
如图20和21所示，在最佳的工作条件下，通过使用2.0w/v％LPA和PDMA，LPA：PDMA比为10∶1作为分离介质，在60℃，大约35分钟内，对于858个碱基的单个碱基分辨率可达到0.50以上，对于1000个碱基的单碱基分辨率为～0.3以上。值得注意的是：LPA和PDMA总分子量越高，性能会得到进一步提高。
由于该聚合物不通过交联剂进行化学连接，因此该类互穿网络可以容易地从毛细管中去除。因此，如果必要，在每次电泳工作后，这些聚合物溶液可以被替换。这样的特征使本发明中的分离介质非常适用于自动毛细管电泳。
制备类互穿网络的关键点在于：1)选择最有效的分离聚合物；2)将该分离聚合物和另外的聚合物混合均匀，该另外的聚合物能动态涂布毛细管的内壁或分离芯片；以及3)每种聚合物均高于自身的交叠浓度。因此，主要骨架聚合物应该具有在总聚合物浓度(即由所需网孔大小决定的浓度)中的体系所允许的最高聚合物比率。该涂布聚合物应尽量少，但需高于自身的交叠浓度。就用于测序分析的分离介质而言，由于总聚合物浓度相对较低，很容易满足该要求。就芯片上进行的DNA分析而言，即对于使用较短的通道长度(信道长度)和较小的带电分子大小进行快速分析，网孔大小更小，所需总聚合物浓度变得更高。在这种浓度条件下，即便对于在低聚合物浓度时能混溶的LPA和PDMA而言，也会出现相分离。基于此，在总聚合物浓度较高时，类互穿网络中的聚合物的相容性可通过利用AM/DMA无规共聚物调节，其中，调节该共聚物中DMA的含量，使PDMA同AM/DMA的无规共聚物在所需浓度范围内变得混溶。类互穿网络分离介质应该使用本发明中的方法彻底混合，即通过一种聚合物在另外的主要骨架聚合物中进行原位聚合，或通过分步法。为获得可重复性的结果，混合溶液在分子水平上应该保持均一，但这并不取决于视觉观察。
实施例
实施例1
材料和方法
过硫酸铵(APS)、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、N-三-(羟甲基)甲基-3-氨基丙烷磺酸(TAPS)、乙二胺四乙酸(EDTA)和丙烯酰胺购自Sigma公司(St.Louis，MO，USA)。丙烯酰胺由氯仿两次重结晶。将磺基丁二酸二(2-乙基己基)酯(AOT，Fluka)溶于甲醇中以去除盐分，然后过滤。然后将滤液和石油醚一起振荡，以便抽提有机杂质。随后除去溶剂，在五氧化二磷的存在下，于50℃真空干燥沉淀物。偶氮二异丁腈(AIBN)由乙醇两次重结晶。N，N，N＇，N＇-四亚甲基二胺(TEMED)购自Fisher Scientific(Pittsburgh，PA)。DMA购自Polysciences(Warrington，PA，USA)，使用前在80℃/20mmHg下蒸馏。阳极和阴极工作缓冲液均是1×TTE(50mMTris/50mM TAPS/2.0mM EDTA)。同分离基质一样，阴极工作缓冲液也包括-7M尿素。所有反应和溶液中使用的水均经Milli-Q水净化系统(Millipore，Bedford，MA，USA)去离子化至18.2MΩ。
通过反相微乳液聚合制备LPA
表1列出了典型的LPA制备方法。聚合反应在氮气中，45℃，搅拌速度为350rpm的条件下进行。除AIBN溶液外，所有成分均放置在150ml四颈圆底烧瓶中。该圆底烧瓶配备有机械搅拌器、回流冷凝器、温度计、氮气进气管，和加料漏斗。在AIBN溶液加入前，反应系统用氮气吹扫一个小时。聚合结束后，在过量丙酮中沉淀，连续洗涤、过滤和50℃真空干燥，从而回收聚丙烯酰胺。
表1聚丙烯酰胺聚合a方法
Figure S04827066420060404D000261
a)：聚合时间：2h
b)：聚合温度：60℃
制备类互穿网络
将LPA溶解入100ml四颈圆底烧瓶中的水中，该圆底烧瓶配备有机械搅拌器、回流冷凝器、温度计、氮气进气管，和加料漏斗。加入DMA后，反应系统用氮气吹扫一个小时，然后加入APS和TEMED。聚合结束后，在过量丙酮中沉淀，随后连续洗涤、过滤和50℃真空干燥，从而回收类互穿网络。表2列出了典型的制备基于LPA和PDMA的类互穿网络的方法。
表2基于丙烯酰胺和二甲基丙烯酰胺的类互穿网络的制备方法
聚合温度：0℃
聚合时间：24h
聚合物的特征
利用Ubbelohde粘度计测定1M NaNO3水溶液中LPA的固有粘度[η]，通过外推法计算30℃、零浓度时该LPA的固有粘度。使用下面的公式计算合成的LPA的粘度-平均分子量(Mv)(表1)：[η]＝3.73×10-2Mv0.66cm3/g。
通过AC250-1H-NMR测定类互穿网络的组合物，其以D2O作为溶剂。类互穿网络中LPA与PDMA的比率(表2)以位于2.1和2.6ppm的峰的积分峰面积比估算。
测序化学
使用具有
Figure S04827066420060404D000271
DNA聚合酶的ABI PRISMTMDye Primer(-21M 13forward)Cycle Sequencing Ready Reaction Kit，pGEM3Zf(+)双链模板上的F S(PE Biosystems/Perkin-Elmer，Foster City，CA，USA)进行测序反应。使用FAM标记的引物和C端混合物进行单染料标记的测序反应。DNA测序利用GeneAmp PCR System2400(PE Biosystems/Perkin-Elmer)进行，循环条件如下：95℃10秒、50℃5秒和70℃1分钟的15个循环，随后95℃10秒和70℃1分钟的15个循环。反应产物经乙醇沉淀纯化、随后用95％和75％v/v乙醇洗涤两次、20μl去离子甲酰胺中重新悬浮。
激光诱导的荧光检测
氩离子激光器被用于形成λ＝488nm的激发光束和大约5mW的入射功率。该激光束经焦距为25cm的透镜聚焦、通过分色镜(550DRLP；Omega Optical，Brattleboro，VT)反射，然后使用10×物镜再次聚焦在分离通道内的点上。经分色镜的荧光在进入光电倍增管(Hamamatsu R928，Hamamatsu Corporation，NJ)前，由带通滤波器(530DF30，Omega Optical，Brattleboro，VT)进行过滤。为获得毛细管图像，该装置还连有电荷耦合装置(CCD)摄像机(SONY SSC-M350，SONY Corporation，New York，NY)。显微镜上的发光装置发出的白色光束照亮毛细管。然后，它通过物镜聚焦、通过滑入/滑出镜(slide in-and-out mirror)反射，通过Zoom 6000系统放大(D.0Industries，Rochester，NY)，随后通过CCD摄像机检测。显微镜(KarlZeiss，Melville，NY)和CCD摄像机提供了获得优良光学质量和快速对准的方法。
CE步骤
1.针对实验室自制的CE仪器
使用具有75/365μm的ID/OD的熔融石英毛细管(PolymicroTechnologies.Phoenix AZ)。通过用刀片剥开聚酰亚胺涂层在距阳极端8cm处开放检测窗。毛细管用1M HC1简单洗涤10min。使用气密注射器将分离介质注入毛细管。每次电泳工作前，将毛细管柱在300V/cm电场强度下进行调试，直至电流稳定(一般约10min)。以电动方式将DNA样品注入毛细管。附图说明中列出了具体注入条件、具体长度和电泳条件。
2.针对ABI-310步骤同(1)，但遵循ABI过程的常规操作。
实施例2：变量
工作条件的影响
工作条件，如DNA注入宽度、有效柱长和工作电场强度，对类互穿网络在DNA分离中的性能影响非常大。为了比较，根据下面的公式计算所选DNA  片段的分辨率(R)：R＝2(t2-t1)/[1.699(w2+w1)]，其中t和w分别表示迁移时间和1/2最大高度的全峰宽度。
在CE中，DNA样品一般是通过电动注射方式注入毛细管柱。初始DNA带宽或被注入的DNA的量通过调节注入电压和注入时间间隔进行调控。
图14示出了使用实施例1中的类互穿网络在不同DNA注入电压下的分辨率的变化。保持注入时间间隔(10s)不变，利用公式(2)计算注入电压为：25V/cm、75V/cm、和100V/cm时碱基片段分离的分辨率，同时相对于片段长度对分辨率作图(图14)，其中被检测碱基片段长度为：103/104、158/159、186/187、216/217、280/281、310/311、357/358、411/413、716/720和833/836。(其中411/413碱基对的分辨率除以2，716/720碱基对的分辨率除以4，和833/836碱基对的分辨率除以3)。与注入电压100V/cm和25V/cm相比，注入电压为75V/cm时分辨率最高。更高的注入电压(高于75V/cm)不仅增加初始DNA带宽，且导致峰前拖尾。这种现象的产生是由于：DNA片段在样品缓冲液和分离介质交界处过量堆积。注入电压过高，注入时间过长，将导致在施加工作电压前一些DNA片段被导入分离介质。带宽增加，峰型畸变，会降低分离效果。注入电压较低，能缩短初始带宽，从而提高分辨率。但是，若电压过低，信号噪声比将会降低。注入时间间隔对DNA分离的影响方式同注入电压。
在75V/cm下，注入时间10s，分离效果最好(未给出数据)。注入电压和注入时间间隔与初始DNA带宽紧密相关。当其它工作条件，如柱长、温度、和工作电场强度保持不变时，存在一个最佳组合。
另一个对DNA分离具有很大影响的参数是柱长。图15示出有效柱长为40cm和35cm时分辨率的变化。40cm的柱长比35cm的柱长分辨率更高。在用CE进行DNA序列测定分析中，13cm到60cm的柱长已与不同分离介质一起被使用。一般说来，存在一个最小柱长；柱长比最小柱长更小，则不能获得令人满意的分离；柱长较长通常会导致DNA读长更长，但是工作时间短；通过降低柱长可实现快速分离，但同时降低了DNA的读长和分辨率。
工作电场强度影响到DNA测序的速度、读长和分辨率。图16是在工作电场强度为200V/cm和150V/cm时，在581个碱基后pGEM3Zf(+)(C-mix)的电泳图。和较高的工作电场强度(200V/cm)相比，较低的工作电场强度(150V/cm)使得DNA读长更长、分辨率更高和迁移时间更长。
温度影响DNA分离。一般地，柱温适当增加(低于50℃)，会提高分离效果和分离速度，这也有助于DNA大片段的分离。当使用LPA和PDMA构成的类互穿网络作为DNA分离介质时，能观察到非常相近的结果(数据未给出)。
LPA与PDMA比率的影响
图17示出了DNA测序样品的分离，该分离是使用LPA与PDMA比率为1.62∶1，3.33∶1，6.33∶1，和10.9∶1的类互穿网络作为分离介质。在无涂层的毛细管中，将分子量为6.4×106g/mol的LPA作为DNA分离介质，分离效能非常差，如图17a所示。通过添加非常少量的PDMA形成类互穿网络可以显著提高分离效果，如图17e所示，其中，LPA与PDMA比率为10.89∶1。但是，PDMA量的进一步增加会削弱分离效果。如图17b-d所示，当LPA与PDMA比率从6.33∶1降到1.62∶1时，分离分辨率相应降低。
在图17中，LPA的分子量非常高(6.4×106g/mol)。含少量PDMA(LPA：PDMA为10.9∶1)的类互穿网络的形成在没有相分离的情况下优化了该网络。另外，PDMA提供了足够强的动态涂布能力，能抑制电渗流。PDMA含量增加(LPA：PDMA为6.33∶1)会导致分离效能更差。并且，PDMA含量进一步增加会引起微相分离，这会破坏类互穿网络的性能，如图17b和17c所示。
LPA分子量的影响
为了开发适用于DNA测序分析的类互穿网络，使用分子量尽可能高的LPA来形成主要骨架，然后将少量PDMA单体聚合，以优化类互穿网络的形成并提供动态涂布能力。图18示出了LPA分子量对DNA分离的影响。当保持LPA：PDMA比率几乎不变并且较低(小于10∶1以保持LPA和PDMA的相容性)时，LPA的分子量越高，分辨率越好并且读长越长。由大尺寸的LPA形成的类互穿网络的主要骨架提供了几乎所有的筛选能力。互穿PDMA链的存在扩展了LPA链，并且，使得分离介质更有效。
LPA分子量分布的影响
如图18所示，类互穿网络中更高的LPA分子量会产生更好的分辨率和更长的DNA读长。为了增加LPA的分子量，可以采用不同的合成方法。在一种方法中，采用无乳化剂的方案来聚合LPA(样品AO，表1)。在另一种方法中，采用反相微乳液聚合的方案来聚合LPA(样品A4，表1)。用两种方法都成功合成了片段大于9×106的高分子量LPA。这样的LPA用于形成具有类似量的PDMA的类互穿网络，其在DNA分离中的性能如图19所示。用反相微乳液聚合法合成的LPA在同PDMA(图19b)形成类互穿网络后，分离能效更佳。所有的其它条件，如LPA分子量、LPA：PDMA比率和形成类互穿网络的方法，几乎相同。
优化条件下的DNA测序
为了提高DNA分离的处理量，读长较长的快速分离是一个很实用的方法。采用下面的工作条件：有效柱长为34m，工作电压为225V/cm，在75V/cm进行DNA注入，时间是8s，温度为45℃。类互穿网络具有如下参数：2.5w/v％(LPA的Mv是4.53×106g/mol)，LPA/PDMA比率为10.81∶1。使用Fam标记的-21M13引物在pGEM-3Zf(+)模板上形成C端单染料标记的DNA序列测定片段的电泳谱图，如图15所示。在室温下，能实现高达617个碱基时，单个碱基分辨率为0.63，高达～1000个碱基时单碱基分辨率为0.3。值得注意的是，操作温度越高(>50℃)，具有相当的分辨率所需的工作时间越短。
实施例3
在LPA中聚合PDMA以生成类互穿网络
(a)样品制备：
采用反相微乳液聚合法将已纯化的丙烯酰胺单体聚合成LPA。在LPA主要骨架中将二甲基丙烯酰胺单体进行自由基聚合，形成类互穿网络。
(b)激光散射用溶液的制备：
配制两种溶于1×TTE缓冲溶液中，浓度分别为7.77×10-2g/ml和1.20×10-2g/ml的LPA和类互穿网络的储备溶液。将该储备溶液保存在50ml的容量瓶中，在慢速摇动混合器上振荡至少7到10天，以制备均一的溶液。通过稀释储备溶液制备用于光散射检测的，指定浓度的六种LPA溶液和五种类互穿网络溶液。将每种稀释液通过离心(7700g(-8000rpm)，6h)净化。上层无尘溶液用来检测该溶液光散射的特征。
(c)光散射检测：
在散射角为150到1390、温度25℃下，使用实验室自制激光散射分光计进行静态和动态光散射检测。在532nm波长处激光输出功率为～500mW。利用Brookhaven Instruments B 19000数字相关仪测定在散射角为300、350、400、500、600、700和900时的强度-强度自相关函数。
图1和图2分别示出了LPA和类互穿网络的静态光散射结果。图3和图4分别示出了LPA和类互穿网络的动态光散射结果。图3出现两个峰，其中一个是在Rh～15nm处的微小峰，而另一个是在Rh～80nm处的主峰。对类互穿网络而言，该微小尺寸的成分可在澄清过程中去除。但是，该微小峰的存在可能是LPA的聚合过程的指示，其中可能涉及分子链增长的两个独立步骤。开始步骤中形成较小尺寸的分子链，后续步骤中形成较大尺寸的分子链。
(d)毛细管电泳
类互穿网络分离介质的制备：
在一个5ml小瓶中，将干燥的类互穿网络溶解在1×TTE+7M尿素缓冲溶液中。总溶液体积一般少于2ml，并且聚合物浓度约为2-2.5％g/ml。通过静置过夜，使干燥样品溶胀成凝胶状溶液后，在旋涡混合器上将该凝胶状溶液彻底混合20s，每天两次，直到聚合物全部溶解。至少要花3-4天时间来制备其均一溶液。在使用之前，(聚合物溶液)分离介质要进行离心，以除去气泡。
(e)CE电泳：
三种用于CE检测的不同仪器：
(i)实验室自制的具有水冷却的氩离子激光器的激光诱导荧光检测器，λ＝488nm，其用于单染料[FAM]标记的引物和C端混合DNA(pGEM-3Zf(+)从-21M13上游引物)的DNA测序分析。
在图5中，测序分析数据表明：具有单个碱基分辨率(仅用肉眼)的1000个碱基的分离可在30min内完成。
用于DNA分离的类互穿网络与各种聚合物介质的商业产品的比较
图6示出了DNA(pGEM-3Zf(+)从-21M13上游引物)测序分析数据。根据Amersham Biosciences公司推荐，在44℃和150V/cm下，MegaBACE LPA凝胶/1×MegaBACE缓冲液中进行毛细管电泳。图7示出了相同DNA的测序分析数据，但是是在50℃和200V/cm下，在介质POP-6(Applied Biosystems)/1×TTE缓冲液中进行CE，这是POP6的CE常规工作条件。
作为对比，可将800b的DNA样品的迁移时间作为分离的速度标准，利用类互穿网络作为分离介质的分离可在26.3min(t800，IPN)内完成(图5)，而利用MegaBACE LPA凝胶作为分离介质的分离在89min(t800，LPA)内才能完成(图6)。
在类互穿网络介质中DNA的分离速度比在MegaBACE LPA凝胶中DNA的分离速度快约3倍。在POP6介质中的DNA分离不能达到800b(图7)。如果590b的迁移时间可用作DNA分离的速度标准，那么使用类互穿网络、MegaBACE LPA和POP6作为分离介质的迁移时间分别是t590，IPN＝～22min，t590，LPA＝～70.5min和t590，POP6＝～89min。在类互穿网络中590bpDNA的分离所需的时间仅是在MegaBACE LPA中所需时间的三分之一，在POP6中所需时间的四分之一。
ABI310遗传分析仪是一种自动化的单毛细管遗传分析仪，其被设计并被优化，以支持宽范围的测序和片段分析应用。用BigDyeTerminator v3.0标准DNA来表明测序分析性能。
图8示出了BigDye v3.0的电泳分离的末端部分(碱基数从600到～1000)。在ABI310上，使用经表征的类互穿网络介质，能在36min内完成四色BigDye v3.0DNA的1000个碱基的分离。
图9示出了利用POP6介质和Module seq POP6(1mL)E对BigDye v3.0进行电泳分离的蓝色-G部分。860b(t860，POP6)的迁移时间是～61.5min，是利用类互穿网络分离介质的860b(t860，IPN)的迁移时间～32min的1.9倍(图8)。ABI310不能使用MagBACE LPA凝胶，因为该凝胶粘滞度高，而ABI310的泵压不足以进行检测。
当类互穿网络用作分离介质时，肉眼能从电泳分离数据中读取长的碱基识别(1ong base-call)(1007b)(图8)，而当POP6用作分离介质时，肉眼只能读取860b(图9)。
实验室自制的具有硅雪崩光电二极管的激光诱导的荧光(四色)检测器(Perkin E1mer Model SPCM-AQR-12-FC)可用以对BigDye Terminator v3.0进行序列分析。该检测器由Stony Brook的SUNY工程学院(Engineering College)制备。作为对比，CE在类互穿网络和Applied Biosystems公司的新产品POP7的不同的介质中进行。
在图10中，DNA(BigDye Terminator v3.0)的碱基识别数据表明：在60℃和304V/cm下，当CE在类互穿网络/1×ABI缓冲液中进行时，具有单碱基分辨率的600碱基的分离能在～30.4min(t600，IPN)内完成。毛细管有效长度为50cm，毛细管ID/OD＝50/361(μm)。但是，当POP7/1×ABI缓冲液作为分离介质时，在60℃和196V/cm下，对相同DNA的600个碱基的分离获得的最好分离结果是在～63.3min(t600，POP7)内。毛细管有效长度和ID/OD的比率分别是相同的，在50cm和50/361(μm)。图11是碱基识别数据。在类互穿网络介质中，分离具有单碱基分辨率的600b的DNA分离所需的时间比在POP7中所需时间少一半。(仪器和碱基识别软件由StonyBrook的SUNY工程学院提供。)
实施例4
形成类互穿网络的溶液混合方法
分别配制两种不同聚合物的稀释溶液。这两种聚合物溶液逐渐混合到一起，以形成具有指定浓度和聚合物组分的组成的均一溶液混合物。
LPA和PDMA是部分相容的聚合物对。为制备CE检测用分离介质，通过使用溶液混合方法制成均一的LPA和PDMA溶液混合物。分别配制LPA/缓冲剂溶液和PDMA/缓冲剂溶液。将LPA(Mw＝7.62×106g/mol)溶解在1×TTE+7M尿素缓冲液中，以配制成2.57％g/ml的溶液。将PDMA(Mw＝470Kg/mol)溶解在1×TTE+7M尿素缓冲液中，以配制成1.61％g/mL的溶液。在每种聚合物在其自身的缓冲剂中完全溶解后，以100μl等分量将300μlPDMA溶液逐步加入0.9ml LPA溶液中。在每次添加PDMA溶液后，将溶液混合物在旋涡混合器上混合20s。溶液混合物中LPA和PDMA的含量分别是83％和17％。值得注意的：在PDMA分子量为470K时，浓度1.61％g/mL已高于其C*值。
图12示出了利用根据实施例3制备的LPA/PDMA类互穿网络作为分离介质的CE结果。作为对比，图13示出了利用根据实施例2制备的类互穿网络作为分离介质的CE结果。在同样工作条件下，两种分离介质的DNA分离结果非常相近。电泳在工作电场为195.5V/cm下进行，并且DNA注入时间为在27V/cm时20s。
实施例5
一种生成类互穿网络的溶液混合方法
原材料包括分子量约7M的LPA；和分子量约0.5M的PDMA。采用如下所示的几种不同方法配制最终总浓度为2～2.5-wt％(0.02～0.025g/mL)的混合溶液。
A)配制LPA/PDMA的浓度比(wt％)为1.6/1的溶液。LPA溶液的浓度为0.0257g/mL，PDMA溶液的浓度为0.016g/mL。采用下述各方式混合最终总浓度为2～2.5wt％的混合溶液。
Figure S04827066420060404D000371
*假设体积和体积单位不变。
B)配制LPA/PDMA的浓度比(wt％)为2/1的溶液，其中LPA溶液的浓度为0.028g/ml，PDMA溶液的浓度为0.014g/ml。采用下列各方式混合最终总浓度为2～2.5wt％的混合溶液。
Figure S04827066420060404D000381
*假设体积和体积单位不变。

Claims (120)

1.一种聚合物链的类互穿网络，所述聚合物链包括：
(a)以主要骨架形式存在的线性聚丙烯酰胺链，所述聚丙烯酰胺链的重均分子量为0.05×106到25×106g/mol，旋转半径为10nm到350nm；以及
(b)聚二甲基丙烯酰胺链，所述聚二甲基丙烯酰胺链是在线性聚丙烯酰胺主要骨架存在下，通过聚合二甲基丙烯酰胺制备，
其中，所述线性聚丙烯酰胺链和聚二甲基丙烯酰胺链彼此缠结、互穿，并且其中，所述类互穿网络无化学交联。
2.根据权利要求1所述的网络，其中，线性聚丙烯酰胺主要骨架是通过反相微乳液聚合形成。
3.根据权利要求1所述的网络，其中，所述聚二甲基丙烯酰胺是在线性聚丙烯酰胺主要骨架中通过自由基聚合而聚合形成。
4.根据权利要求1所述的网络，其中，所述线性聚丙烯酰胺主要骨架包括缓冲溶液中的线性聚丙烯酰胺，其中，所述线性聚丙烯酰胺具有的交叠浓度为5×10-4到4.0×10-2g/ml。
5.根据权利要求1所述的网络，其中，所述线性聚丙烯酰胺主要骨架在缓冲溶液中的交叠浓度为1.2×10-3g/ml。
6.根据权利要求1所述的网络，其中，所述线性聚丙烯酰胺的重均分子量的下限为0.05×106g/mol。
7.根据权利要求1所述的网络，其中，所述线性聚丙烯酰胺的重均分子量的下限为0.1×106g/mol。
8.根据权利要求1所述的网络，其中，所述线性聚丙烯酰胺的重均分子量的下限为0.3×106g/mol。
9.根据权利要求1所述的网络，其中，所述线性聚丙烯酰胺的重均分子量的下限为1×106g/mol。
10.根据权利要求1所述的网络，其中，所述线性聚丙烯酰胺的重均分子量的下限为4×106g/mol。
11.根据权利要求1所述的网络，其中，所述线性聚丙烯酰胺的重均分子量的下限为6×106g/mol。
12.根据权利要求1所述的网络，其中，所述线性聚丙烯酰胺的重均分子量的下限为7×106g/mol。
13.根据权利要求1所述的网络，其中，所述线性聚丙烯酰胺的重均分子量范围的上限为8×106g/mol。
14.根据权利要求1所述的网络，其中，所述线性聚丙烯酰胺的重均分子量范围的上限为10×106g/mol。
15.根据权利要求1所述的网络，其中，所述线性聚丙烯酰胺的重均分子量范围的上限为15×106g/mol。
16.根据权利要求1所述的网络，其中，所述线性聚丙烯酰胺的重均分子量范围的上限为25×106g/mol。
17.根据权利要求1所述的网络，其中，所述线性聚丙烯酰胺的旋转半径范围的下限为10nm。
18.根据权利要求1所述的网络，其中，所述线性聚丙烯酰胺的旋转半径范围的下限为15nm。
19.根据权利要求1所述的网络，其中，所述线性聚丙烯酰胺的旋转半径范围的下限为28nm。
20.根据权利要求1所述的网络，其中，所述线性聚丙烯酰胺的旋转半径范围的下限为55nm。
21.根据权利要求1所述的网络，其中，所述线性聚丙烯酰胺的旋转半径范围的下限为125nm。
22.根据权利要求1所述的网络，其中，所述线性聚丙烯酰胺的旋转半径范围的下限为150nm。
23.根据权利要求1所述的网络，其中，所述线性聚丙烯酰胺的旋转半径范围的下限为165nm。
24.根据权利要求1所述的网络，其中，所述线性聚丙烯酰胺的旋转半径范围的上限为180nm。
25.根据权利要求1所述的网络，其中，所述线性聚丙烯酰胺的旋转半径范围的上限为210nm。
26.根据权利要求1所述的网络，其中，所述线性聚丙烯酰胺的旋转半径范围的上限为250nm。
27.根据权利要求1所述的网络，其中，所述线性聚丙烯酰胺的旋转半径范围的上限为350nm。
28.根据权利要求1所述的网络，其中，所述线性聚丙烯酰胺的多分散指数为1.01到1.8。
29.根据权利要求28所述的网络，其中，所述线性聚丙烯酰胺的多分散指数范围的下限为1.01、。
30.根据权利要求28所述的网络，其中，所述线性聚丙烯酰胺的多分散指数范围的下限为1.02。
31.根据权利要求28所述的网络，其中，所述线性聚丙烯酰胺的多分散指数范围的下限为1.05。
32.根据权利要求28所述的网络，其中，所述线性聚丙烯酰胺的多分散指数范围的下限为1.1。
33.根据权利要求28所述的网络，其中，所述线性聚丙烯酰胺的多分散指数范围的上限为1.3。
34.根据权利要求28所述的网络，其中，所述线性聚丙烯酰胺的多分散指数范围的上限为1.5。
35.根据权利要求28所述的网络，其中，所述线性聚丙烯酰胺的多分散指数范围的上限为1.6。
36.根据权利要求28所述的网络，其中，所述线性聚丙烯酰胺的多分散指数范围的上限为1.8。
37.一种缠结的聚合物链的类互穿网络，其中所述聚合物链包括：
(a)线性聚丙烯酰胺链；和
(b)缠结在所述线性聚丙烯酰胺链内并互穿在线性聚丙烯酰胺链中的聚二甲基丙烯酰胺链，
其中，所述线性聚丙烯酰胺和聚二甲基丙烯酰胺的重均分子量为0.1×106g/mol到20×106g/mol，旋转半径为15nm到320nm，其中所述类互穿网络无化学交联。
38.根据权利要求37所述的网络，其中，所述重均分子量范围的下限为0.1×106g/mol。
39.根据权利要求37所述的网络，其中，所述重均分子量范围的下限为0.5×106g/mol。
40.根据权利要求37所述的网络，其中，所述重均分子量范围的下限为2×106g/mol。
41.根据权利要求37所述的网络，其中，所述重均分子量范围的下限为6×106g/mol。
42.根据权利要求37所述的网络，其中，所述重均分子量范围的上限为7×106g/mol。
43.根据权利要求37所述的网络，其中，所述重均分子量范围的上限为10×106g/mol。
44.根据权利要求37所述的网络，其中，所述重均分子量范围的上限为16×106g/mol。
45.根据权利要求37所述的网络，其中，所述重均分子量范围的上限为20×106g/mol。
46.根据权利要求37所述的网络，其中，所述旋转半径范围的下限为15nm。
47.根据权利要求37所述的网络，其中，所述旋转半径范围的下限为40nm。
48.根据权利要求37所述的网络，其中，所述旋转半径范围的下限为80nm。
49.根据权利要求37所述的网络，其中，所述旋转半径范围的下限为150nm。
50.根据权利要求37所述的网络，其中，所述旋转半径范围的上限为165nm。
51.根据权利要求37所述的网络，其中，所述旋转半径范围的上限为210nm。
52.根据权利要求37所述的网络，其中，所述旋转半径范围的上限为280nm。
53.根据权利要求37所述的网络，其中，所述旋转半径范围的上限为320nm。
54.根据权利要求37所述的网络，其中，所述线性聚丙烯酰胺和聚二甲基丙烯酰胺的多分散指数均为1.0到1.8。
55.根据权利要求37所述的网络，其中，所述线性聚丙烯酰胺和聚二甲基丙烯酰胺的多分散指数均为1.6。
56.根据权利要求37所述的网络，其中，所述网络在缓冲溶液中的交叠浓度为5.0×10-4到3.0×10-2g/ml。
57.一种缠结的聚合物链的类互穿网络，由下述方法制备得到，所述方法包括：
(a)提供一种包括线性聚丙烯酰胺和缓冲剂的溶液，其中，所述线性聚丙烯酰胺的重均分子量为0.05×106到25×106g/mol；
(b)提供一种包括聚二甲基丙烯酰胺和缓冲剂的溶液，其中，所述聚二甲基丙烯酰胺的重均分子量为100000到25×106g/mol；
(c)以分步方式将线性聚丙烯酰胺/缓冲剂溶液和聚二甲基丙烯酰胺/缓冲剂溶液混合，其中，所述线性聚丙烯酰胺/缓冲剂溶液的浓度是聚二甲基丙烯酰胺/缓冲剂溶液浓度的1到15倍，所述线性聚丙烯酰胺/缓冲剂溶液的体积是聚二甲基丙烯酰胺溶液体积的1到50倍；其中，制备得到由缠结、互穿的线性聚丙烯酰胺和聚二甲基丙烯酰胺聚合物链构成的类互穿网络，其中，所述互穿网络无化学交联。
58.根据权利要求57所述的类互穿网络，其中，所述线性聚丙烯酰胺的重均分子量范围的下限为0.05×106g/mol。
59.根据权利要求57所述的类互穿网络，其中，所述线性聚丙烯酰胺的重均分子量范围的下限为0.1×106g/mol。
60.根据权利要求57所述的类互穿网络，其中，所述线性聚丙烯酰胺的重均分子量范围的下限为0.3×106g/mol。
61.根据权利要求57所述的类互穿网络，其中，所述线性聚丙烯酰胺的重均分子量范围的下限为1×106g/mol。
62.根据权利要求57所述的类互穿网络，其中，所述线性聚丙烯酰胺的重均分子量范围的上限为4×106g/mol。
63.根据权利要求57所述的类互穿网络，其中，所述线性聚丙烯酰胺的重均分子量范围的上限为6×106g/mol。
64.根据权利要求57所述的类互穿网络，其中，所述线性聚丙烯酰胺的重均分子量范围的上限为7×106g/mol。
65.根据权利要求57所述的类互穿网络，其中，所述线性聚丙烯酰胺的重均分子量范围的上限为8×106g/mol。
66.根据权利要求57所述的类互穿网络，其中，所述线性聚丙烯酰胺的重均分子量范围的上限为10×106g/mol。
67.根据权利要求57所述的类互穿网络，其中，所述线性聚丙烯酰胺的重均分子量范围的上限为15×106g/mol。
68.根据权利要求57所述的类互穿网络，其中，所述线性聚丙烯酰胺的重均分子量范围的上限为20×106g/mol。
69.根据权利要求57所述的类互穿网络，其中，所述聚二甲基丙烯酰胺的重均分子量范围的下限为100000g/mol。
70.根据权利要求57所述的类互穿网络，其中，所述聚二甲基丙烯酰胺的重均分子量范围的下限为300000g/mol。
71.根据权利要求57所述的类互穿网络，其中，所述聚二甲基丙烯酰胺的重均分子量范围的下限为500000g/mol。
72.根据权利要求57所述的类互穿网络，其中，所述聚二甲基丙烯酰胺的重均分子量范围的上限为1×106g/mol。
73.根据权利要求57所述的类互穿网络，其中，所述聚二甲基丙烯酰胺的重均分子量范围的上限为3×106g/mol。
74.根据权利要求57所述的类互穿网络，其中，所述聚二甲基丙烯酰胺的重均分子量范围的上限为10×106g/mol。
75.根据权利要求57所述的类互穿网络，其中，所述聚二甲基丙烯酰胺的重均分子量范围的上限为25×106g/mol。
76.根据权利要求57所述的类互穿网络，其中，所述线性聚丙烯酰胺/缓冲剂溶液的浓度为1.0到12.0％g/ml。
77.根据权利要求57所述的类互穿网络，其中，所述聚二甲基丙烯酰胺/缓冲剂溶液的浓度为0.1到3.0％g/ml。
78.一种分离带电分子类物质的方法，所述方法包括：在外加电场的作用下，使带电分子类物质在分离介质中发生迁移，其中，对所述分离介质的改进包括：线性聚丙烯酰胺聚合物体系和聚二甲基丙烯酰胺聚合物体系，其中所述的聚合物体系形成根据权利要求1至56中任一项所述的类互穿网络。
79.根据权利要求78所述的方法，其中，所述互穿网络是通过合成线性聚丙烯酰胺主要骨架、以及在所述主要骨架内聚合二甲基丙烯酰胺制备得到。
80.根据权利要求78所述的方法，其中，制备所述互穿网络是通过：
(a)提供一种包括线性聚丙烯酰胺和缓冲剂的溶液，其中，所述线性聚丙烯酰胺的重均分子量为0.05×106到25×106g/mol；
(b)提供一种包括聚二甲基丙烯酰胺和缓冲剂的溶液，其中，所述聚二甲基丙烯酰胺的重均分子量为100000到25×106g/mol；以及
(c)以分步方式将线性聚丙烯酰胺/缓冲剂溶液和聚二甲基丙烯酰胺/缓冲剂溶液进行混合，其中，所述线性聚丙烯酰胺/缓冲剂溶液的浓度是聚二甲基丙烯酰胺/缓冲剂溶液浓度的1到15倍，所述线性聚丙烯酰胺/缓冲剂溶液的体积是聚二甲基丙烯酰胺溶液体积的1到50倍。
81.一种聚合物链的类互穿网络，所述聚合物链包括：
(a)以主要骨架形式存在的丙烯酰胺/二甲基丙烯酰胺无规共聚物链，其中所述无规共聚物链的重均分子量为0.05×106到2×106g/mol，旋转半径为10nm到80nm；以及
(b)聚二甲基丙烯酰胺链，其中所述聚二甲基丙烯酰胺链是在无规共聚物主要骨架存在下，通过聚合二甲基丙烯酰胺制备得到的；
其中，所述丙烯酰胺/二甲基丙烯酰胺链和聚二甲基丙烯酰胺链彼此缠结，彼此互穿，并且其中所述类互穿网络无化学交联。
82.根据权利要求81所述的网络，其中，无规共聚物主要骨架是通过自由基聚合形成的。
83.根据权利要求81所述的网络，其中，所述聚二甲基丙烯酰胺是在无规共聚物主要骨架内，通过自由基聚合而聚合得到。
84.根据权利要求81所述的网络，其中，所述无规共聚物主要骨架包括缓冲溶液中的共聚物，其中所述无规共聚物的交叠浓度为3×10-3到4.0×10-2g/ml。
85.根据权利要求81所述的网络，其中，所述共聚物主要骨架在缓冲溶液中的交叠浓度为1×10-2g/ml。
86.根据权利要求81所述的网络，其中，所述无规共聚物的重均分子量范围的下限为0.05×106g/mol。
87.根据权利要求81所述的网络，其中，所述无规共聚物的重均分子量范围的下限为0.1×106g/mol。
88.根据权利要求81所述的网络，其中，所述无规共聚物的重均分子量范围的下限为0.3×106g/mol。
89.根据权利要求81所述的网络，其中，所述的无规共聚物的重均分子量范围的上限为0.5×106g/mol。
90.根据权利要求81所述的网络，其中，所述的无规共聚物的重均分子量范围的上限为1×106g/mol。
91.根据权利要求81所述的网络，其中，所述的无规共聚物的重均分子量范围的上限为2×106g/mol。
92.根据权利要求81所述的网络，其中，所述共聚物的旋转半径范围的下限为10nm。
93.根据权利要求81所述的网络，其中，所述共聚物的旋转半径范围的下限为15nm。
94.根据权利要求81所述的网络，其中，所述共聚物的旋转半径范围的下限为30nm。
95.根据权利要求81所述的网络，其中，所述共聚物的旋转半径范围的上限为40nm。
96.根据权利要求81所述的网络，其中，所述共聚物的旋转半径范围的上限为55nm。
97.根据权利要求81所述的网络，其中，所述共聚物的旋转半径范围的上限为80nm。
98.根据权利要求81所述的网络，其中，所述无规共聚物的多分散指数为1.1到2.0。
99.一种缠结的聚合物链的类互穿网络，所述类互穿网络由下述方法制备得到，所述方法包括：
(a)提供一种包括丙烯酰胺/二甲基丙烯酰胺无规共聚物和缓冲剂的溶液，其中，所述丙烯酰胺/二甲基丙烯酰胺无规共聚物的重均分子量为0.05×106到2×106g/mol；
(b)提供一种包括聚二甲基丙烯酰胺和缓冲剂的溶液，其中，所述聚二甲基丙烯酰胺的重均分子量为0.05×106到25×106g/mol；
(c)以分步方式将共聚物/缓冲剂溶液和聚二甲基丙烯酰胺/缓冲剂溶液进行混合，其中，所述共聚物/缓冲剂溶液的浓度是聚二甲基丙烯酰胺/缓冲剂溶液浓度的1到50倍，所述共聚物/缓冲剂溶液的体积是聚二甲基丙烯酰胺/缓冲剂溶液体积的1到20倍；
其中，制备得到缠结的共聚物链和聚二甲基丙烯酰胺聚合物链的类互穿网络，其中，所述类互穿网络无化学交联。
100.根据权利要求99所述的类互穿网络，其中，所述共聚物的重均分子量范围的下限为0.05×106g/mol。
101.根据权利要求99所述的类互穿网络，其中，所述共聚物的重均分子量范围的下限为0.1×106g/mol。
102.根据权利要求99所述的类互穿网络，其中，所述共聚物的重均分子量范围的下限为0.3×106g/mol。
103.根据权利要求99所述的类互穿网络，其中，所述共聚物的重均分子量范围的上限为0.5×106g/mol。
104.根据权利要求99所述的类互穿网络，其中，所述共聚物的重均分子量范围的上限为1×106g/mol。
105.根据权利要求99所述的类互穿网络，其中，所述共聚物的重均分子量范围的上限为1.5×106g/mol。
106.根据权利要求99所述的类互穿网络，其中，所述共聚物的重均分子量范围的上限为2×106g/mol。
107.根据权利要求99所述的类互穿网络，其中，所述聚二甲基丙烯酰胺的重均分子量范围的下限为50000g/mol。
108.根据权利要求99所述的类互穿网络，其中，所述聚二甲基丙烯酰胺的重均分子量范围的下限为100000g/mol。
109.根据权利要求99所述的类互穿网络，其中，所述聚二甲基丙烯酰胺的重均分子量范围的下限为200000g/mol。
110.根据权利要求99所述的类互穿网络，其中，所述聚二甲基丙烯酰胺的重均分子量范围的上限为500000g/mol。
111.根据权利要求99所述的类互穿网络，其中，所述聚二甲基丙烯酰胺的重均分子量范围的上限为1×106g/mol。
112.根据权利要求99所述的类互穿网络，其中，所述聚二甲基丙烯酰胺的重均分子量范围的上限为3×106g/mol。
113.根据权利要求99所述的类互穿网络，其中，所述聚二甲基丙烯酰胺的重均分子量范围的上限为5×106g/mol。
114.根据权利要求99所述的类互穿网络，其中，所述聚二甲基丙烯酰胺的重均分子量范围的上限为10×106g/mol。
115.根据权利要求99所述的类互穿网络，其中，所述聚二甲基丙烯酰胺的重均分子量范围的上限为25×106g/mol。
116.根据权利要求99所述的类互穿网络，其中，所述共聚物/缓冲剂溶液的浓度为5.0到20.0％g/ml。
117.根据权利要求99所述的类互穿网络，其中，所述聚二甲基丙烯酰胺/缓冲剂溶液的浓度为0.1到1.0％g/ml。
118.一种分离带电分子类物质的方法，所述的方法包括：在外加电场的影响下，使带电分子类物质在分离介质中发生迁移，其中对所述分离介质的改进包括：丙烯酰胺/二甲基丙烯酰胺无规共聚物和聚二甲基丙烯酰胺聚合物，其中，所述聚合物体系形成根据权利要求81至98中任一项所述的类互穿网络。
119.根据权利要求118所述的方法，其中，所述的互穿网络是通过合成丙烯酰胺/二甲基丙烯酰胺无规共聚物主要骨架，和在所述主要骨架内聚合二甲基丙烯酰胺制备得到。
120.根据权利要求118所述的方法，其中，制备所述的互穿网络是通过：
(a)提供一种包括丙烯酰胺/二甲基丙烯酰胺无规共聚物和缓冲剂的溶液，其中，丙烯酰胺/二甲基丙烯酰胺无规共聚物的重均分子量为0.05×106到2×106g/mol；
(b)提供一种包括聚二甲基丙烯酰胺和缓冲剂的溶液，其中，聚二甲基丙烯酰胺的重均分子量为50,000到25×106g/mol；以及
(c)以分步形式将共聚物/缓冲剂溶液和聚二甲基丙烯酰胺/缓冲剂溶液进行混合，其中所述共聚物/缓冲剂溶液的浓度是聚二甲基丙烯酰胺/缓冲剂溶液浓度的1到50倍，所述共聚物/缓冲剂溶液的体积是聚二甲基丙烯酰胺溶液体积的1到20倍；
其中，制备得到缠结的共聚物和聚二甲基丙烯酰胺聚合物链的类互穿网络，其中，所述类互穿网络无化学交联。
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