CN1995063A

CN1995063A - 一种植物硫高效利用蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN1995063A
Application number: CN 200610171543
Authority: CN
Inventors: 向成斌; 吴宇
Original assignee: University of Science and Technology of China USTC
Current assignee: University of Science and Technology of China USTC
Priority date: 2006-12-30
Filing date: 2006-12-30
Publication date: 2007-07-11
Anticipated expiration: 2026-12-30
Also published as: CN1995063B

Abstract

本发明公开了一种植物硫高效利用蛋白及其编码基因与应用。该蛋白，是具有下述氨基酸序列之一的蛋白质：1)序列表中的序列2的氨基酸残基序列；2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物硫高效利用相关的蛋白质。本发明的植物硫高效利用蛋白及其编码基因在培育硫高效利用的植物(特别是油菜、水稻等农作物)中发挥重要的价值。

Description

一种植物硫高效利用蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种植物硫高效利用蛋白及其编码基因与应用，特别涉及一种硫高效利用蛋白及其编码基因与其在培育硫高效利用植物中的应用。

背景技术

拟南芥(Arabidopsis thaliana)是典型的十字花科植物，广泛分布于欧洲、亚洲和北美，它作为模式植物有很多优势：(1)生长周期短。(2)体形小，占地少。(3)后代多。(4)核基因组小。这些优点使得拟南芥成为植物科学研究的优良的模式植物。(5)可用浸花转化法进行遗传转化，转化率高达1.7％，(6)拟南芥基因组已测序完成，其基因组DNA包含25,498个功能基因组及其所对应的11,000个蛋白质家族。上述这些优点使得拟南芥成为植物科学研究优良的模式植物。

另一方面，硫营养代谢不但在植物生长发育中起重要作用，而且在对抗生物和非生物胁迫中起重要作用。但植物硫营养一直没有受到应有的重视，近年来的研究证明因硫营养缺乏而引起的农作物减产与农产品品质下降等问题普遍存在。如何让植物在硫营养缺乏的时候增强其硫吸收能力与如何使植物在硫营养充足时增加其储存和再利用就成为改良农作物高效吸收和利用硫营养的关键问题。培育在低硫环境下高效吸收利用硫素的农作物品种将是解决上述问题的有效途径，要实现这一目标，我们必须首先发现和确定其遗传决定因素，应用突变体来进行高等植物硫营养高效吸收利用的遗传决定因素是一有效途径。但是关于植物体内硫吸收利用相关基因的研究一直没有很系统的报道，除了关于硫转运蛋白，以及硫还原，硫同化途径中一些关键酶的零散研究，没有一个系统性的研究硫代谢的结果，同时也没有通过硫胁迫筛选出硫高效利用突变体，进而确定硫高效利用相关基因的研究。

同时目前，通过质粒介导的T-DNA插入突变已经成为植物中获得突变体的一个简单而普遍的途径，通过带有用于后期筛选MAKER基因以及35S的增强子的质粒，将一段T-DNA随机的插入到植物基因组内，通过有目的的筛选到各种具有耐逆表型的植株，同时通过Tail-PCR的方法，鉴定出所T-DNA在基因组中所插入的位置。而最适合这些工作的植物就是拟南芥，这种全基因组已经被测序成功的优异的遗传模式生物。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物硫高效利用蛋白及其编码基因与应用。

本发明所提供的植物硫高效利用蛋白，名称为SUE4，来源于十字花科植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有硫高效利用功能的由(a)衍生的蛋白质。

其中，序列表中的序列2由199个氨基酸残基组成。

为了使(a)中的SUE4分泌到细胞周质或培养基中或使其功能稳定，可在由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质的N端连接上信号肽序列，为了(a)中的SUE4便于纯化，可在由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质的N端或C端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
标签	残基	序列	Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH	Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH	FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tagII	8	WSHPQFEK	FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tagII	8	WSHPQFEK	c-myc	11	EQKLISEEDL

上述(b)中的SUE4可人工合成，也可先合成其编码基因，再按照下述方法进行生物表达得到。上述(b)中的SUE4的编码基因可通过将序列表中序列1的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端连上信号肽的编码序列，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述植物硫高效利用蛋白的编码基因(SUE4)也属于本发明的保护范围。

上述植物硫高效利用蛋白的基因组基因，可具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中序列1的DNA序列；

2)编码序列表中序列2蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

上述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

其中序列表中序列1是由597个脱氧核苷酸组成，自5′端的第1-597位脱氧核苷酸为编码序列(ORF)。

含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增SUE4中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明还提供一种硫高效利用植物的获得方法。

本发明提供的硫高效利用植物的获得方法，是利用植物表达载体，将上述的硫高效利用蛋白的编码基因导入植物细胞或组织，获得低硫耐受力增强的转基因细胞系及转基因植株。

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它的可参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

本发明的SUE4构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、根部特异表达启动子等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

携带有本发明SUE4的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是水稻、小麦等单子叶植物，也可以是拟南芥、大豆、油菜等双子叶植物。

本发明的植物硫高效利用蛋白及其编码基因，可以使植物在低硫的生长条件下相对于野生型的生长能力增强。将本发明的植物硫高效利用蛋白的编码基因转入拟南芥植物后进行的植物生长低硫胁迫生理试验，表明该基因在转入植物后，可显著提高植株的硫高效利用性。本发明的植物硫高效利用蛋白及其编码基因在培育硫高效利用植物(特别是水稻、小麦、油菜等农作物)中发挥作用。

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

图1A为载体pSKI015的物理图谱

图1B为载体pCB2004的物理图谱

图2A为在低硫培养基上萌发12天后，初筛得到可能的硫高效利用突变体

图2B为在含有50mg/L除草剂glufosinate的MS培养基上的纯和硫高效利用突变体和野生型的生长对比

图3A为在低硫培养基上竖直培养的纯和硫高效利用突变体和野生型12天根系延伸试验的对比图

图3B为在低硫培养基上竖直培养的纯和硫高效利用突变体和野生型12天根长差异统计结果

图4A为在MS培养基竖直培养的转pCB2004/SUE4植株和野生型18天根系延伸试验的对比图

图4B为在低硫培养基(B)上竖直培养的转pCB2004/SUE4植株和野生型18天根系延伸试验的对比图

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1：拟南芥硫高效利用蛋白的编码基因SUE4的获得

1、T-DNA插入激活突变体库的构建

将携带有T-DNA片段的pSKI015质粒(质粒购自Invitrogen公司)(质粒图谱如图1A所示)，电转化至农杆菌C58，采用拟南芥花絮浸花转化的方法(floral dipmethod)(Steven J，Clough and Andrew F.Bent：Floral dip：a simplified methodfor Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.The PlantJournal：Volume 16 Issue 6 Page 735-December 1998)大规模转化Columbia拟南芥(购自拟南芥从拟南芥生物资源中心(Arabidopsis Biological ResourceCenter，ABRC))。

在土壤中大规模播种以上步骤获得的T-DNA插入片段的拟南芥转化体的种子，在种子发芽后约5天，表面喷洒浓度为0.2％的除草剂(glufosinate ammonium，商用名为Liberty，法国Aventis作物科学公司)进行筛选，以Columbia野生型拟南芥(购自拟南芥生物资源中心(Arabidopsis Biological Resource Center，ABRC))为对照。约1周后可以观察到转化体植株和野生型植株具有明显差别，野生型植株在0.2％除草剂glufosinate条件下不能存活，而转化体植物不受影响，可以正常生长。以200株转化体植株为一单位进行收种，建立了T-DNA插入激活突变体库。

2、拟南芥硫高效利用突变体转化体的筛选

1)高通量方法初筛硫高效利用植株

低硫培养基的制备：

制备低硫培养基的材料为理论上的无硫，因为配置培养基的去离子水，agarose，以及各种盐试剂里都含有微量的硫，所以配置的培养基里会有微量的硫，因此称为低硫培养基。

配制如下储备液1-4：

储备液1(20×)：Ca(NO₃)₂ 9.45g/L，KNO₃ 10.11g/L；

储备液2(20×)：MgCl₂·6H₂O 8.13g/L，KH₂PO₄ 6.804g/L；

储备液3(200×)：Na.EDTA 0.3722g/L，FeCl3.6H20 0.2703g/L；

储备液4：(200×)：H₃BO₃ 0.866g/L，MnCl₂ 0.252g/L，Zn Cl₂ 0.02726g/L，Cu Cl₂·2H₂O 0.01705g/L，NaMoO₄ 0.0145g/L，CoCl₂ 0.476g/L的CoCl₂·6H₂O 1ml/L。

然后按照下述比例配制低硫培养基：储备液1 50ml/L，储备液2 50ml/L，储备液3 5ml/L，储备液4 5ml/L，用去离子水补足到1L，调整PH至5.7，加入agarose7.6g/L，高温蒸汽灭菌15分钟，制得低硫培养基，倒成平板备用。

MS培养基：配置方法如下：

配制如下储备液1-3：

储备液1(10×)：NH₄NO₃ 16.5g/L，KNO₃ 19g/L，KH₂PO₄ 1.7g/L，MgSO₄·7H2O3.7g/L，CaCl₂·2H₂O 4.4g/L

储备液2(100×)：KI 0.883g/L，H₃BO₃ 0.62g/L，MnSO₄·4H₂O2.23g/L，ZnSO₄.7H₂O 0.86g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.025g/L，CuSO₄·5H₂O 0.0025g/L，CoCl₂·6H₂O 0.0025g/L

储备液3(100×)：Na.EDTA 3.723g/L，FeSO₄·7H₂O 2.78g/L

然后按照下述比例配制低硫培养基：储备液1 100ml/L，储备液2 10ml/L，储备液3 10mi/L，蔗糖20g/L，用水补足到11，调整PH至5.8，加入琼脂粉9.0g/L，高温蒸汽灭菌15分钟，制得MS培养基，倒成平板备用。

初筛硫高效利用植株：下述各实验中所用的种子均用如下方法进行表面灭菌处理：用50％(体积比)消毒液(漂渍液(广州蓝月亮公司，标准编号Q/(GK)LYL8∶纯净水＝1∶1)在室温下灭菌15分钟，再用经灭菌的纯净水冲洗4-5遍。

将经表面灭菌处理的步骤1收获的种子在4℃下放置3天，以使种子发芽一致。然后将种子播种于上述制备得低硫培养基平板上使其发芽，种子发芽生长条件为：22℃，光照培养。待植株萌发生长12天后，将在低硫培养基上可以打开真叶(图2A，箭头示)，持续健康生长的绿苗移栽到土中，并单株收种。

2)硫高效利用植株的复筛及性状确认

对初筛得到的硫高效利用植株单株收到的种子中，选取其大约60粒种子用步骤1所述表面灭菌处理的方法进行表面灭菌后，播种于低硫培养基上，种子生长一周后进行观察并记录存活植株数量，观察10天后，统计存活的植株数量(以能否打开真叶作为统计标准)，检查存活植株数量和死亡植株数量之间比例，取存活和死亡比例约为3∶1的样本，将此样本存活植株移入含有50mg/L除草剂(Glufosinate百草枯)的MS培养基上，10天后观察小苗存活情况。如果小苗全部存活，表明上述株系的硫高效利用性状和抗除草剂基因连锁，符合筛选要求。最后，移栽以上硫高效利用株系到土壤中，单株收种，将种子保存备用。

将上述所收复筛得到硫高效利用植株单株的种子，在含有50mg/L除草剂(glufosinate)的MS培养基上重新萌发，以野生型作为生长对照，光照培养10天之后，全部存活的单株即是纯和体(图2B，图2B中，SEU4表示50mg/L除草剂筛选的硫高效利用植株纯和体，WT为对照)。取抗除草剂硫高效利用纯和体植株的种子，进行硫高效利用的根系延伸试验，具体方法为：将硫高效利用纯和体植株和野生型的种子分别播种于低硫培养基上，同时设置MS培养基培养作为对照试验，在常规条件下竖直培养12天，分别在培养第3天、6天、9天、12天、测量根系延伸长度，结果如图3B所示，结果表明，表现为纯和硫高效利用植株突变体(SEU4)对于野生型(WT)来说，在低硫培养基上有着极为显著的根系延伸优势(培养12天后的照片如图3A所示)。

3、硫高效利用蛋白及其编码基因的获得

利用已经成熟的TAIL-(Thermal asymmetric interlaced)PCR的技术(Liu andWhittier，1995)扩增硫高效利用基因。提取步骤2筛选得到的硫高效利用纯和体植株的基因组DNA，并以此为模板，进行下述TAIL-PCR的扩增：

第一轮PCR：以硫高效利用纯和体植株的基因组DNA作为模板，以LB1：5′-ATACGACGGATCGTAATTTGTC-3′和AD3：5′-(A/T)GTGNAG(A/T)ANCANAGA-3′为引物进行PCR扩增。

反应体系为：共20ul，其中，DNA模板1ul(0.1ug)，10X buffer 2ul，浓度为2.5umol/L的dNTPs 0.2ul，10pmol/ul的LB1 4pmol，AD3(50pmol/ul)80pmol，ExTaq polymerase 0.1ul，加水至20ul。

反应程序：先93℃ 1min，95℃ 1min，1个循环；再94℃ 30sec，58℃ 3min，72℃ 2.5min，5个循环；再94℃ 30sec，24℃ 3min，慢慢升至72℃ 3min，72℃ 2.5min 1个循环；再94℃ 10sec，58℃ 1min，72℃ 2.5min，94℃ 10sec，58℃ 1min，72℃ 2.5min，94℃ 10sec，44℃ 1min，72℃ 2.5min，15个循环；最后72℃ 5min，1个循环。

第二轮PCR：将第一轮PCR反应后的反应液用ddH₂O稀释50倍，以稀释后的溶液作为模板，以LB2：5′-TAATAATAACGCTGCGGACATCAT-3′和AD3：5′-(A/T)GTGNAG(A/T)ANCANAGA-3′为引物进行PCR扩增。

反应体系为：模板1ul，10X buffer2ul，dNTPs 0.2ul LB2(10pmol/ul)4pmol，AD3(50pmol/ul)40pmoles，ExTaq polymerase 0.1ul，加水至20ul。

反应程序：先94℃ 10sec，58℃ 1min，72℃ 2.5min，94℃ 10sec，58℃ 1min，72℃ 2.5min，94℃ 10sec，44℃ 1min，72℃ 2.5min，13个循环；然后72℃ 5min，1个循环。

第三轮PCR：将第二轮PCR反应后的反应液用ddH₂O稀释10倍，以稀释后的溶液作为模板，以LB3：5′-TTGACCATCATACTCATTGCTG-3′和AD3：5′-(A/T)GTGNAG(A/T)ANCANAGA-3′为引物进行PCR扩增。

反应体系为：模板1ul，10X buffer 2ul，dNTPs 0.2ul LB3(10pmol/ul)4pmol，AD3(50pmol/ul)40pmol，ExTaq polymerase 0.1ul，加水至20ul。

反应程序：先94℃/15sec，44℃/1min，72℃/2.5min，30个循环；再72℃/5min 1个循环。

反应结束后，以LB3作为测序引物对PCR产物进行测序，测序结果表明该基因具有序列表中的序列1的核苷酸序列，由597个碱基组成，将其命名为SUE4，SUE4编码具有序列表中序列2的氨基酸残基序列的蛋白质，即硫高效利用蛋白SUE4。

上述SUE4基因可直接根据其序列(序列表中的序列1)设计引物，以Columbia拟南芥(购自从拟南芥生物资源中心Arabidopsis Biological ResourceCenter(ABRC)购得)的基因组DNA为模板直接扩增得到。

实施例2、转SUE4基因的拟南芥在培养基上的硫高效利用功能检测

1、转SUE4基因的拟南芥的获得

1)转化用重组载体(pCB2004/SUE4)的构建

pCB2004是含有35S启动子的植物过量表达双元载体，其构建方法为：

将pCAMBIA3301(CAMBIA)用BstXI和SmaI消化，在pCAMBIA3301的BstXI和SmaI识别位点间插入由依次串联的BstXI，SstI，DraIII(a)，AscI，AvrII，SwaI，DraIII(b)，和SmaI识别序列组成的多克隆位点片段，得到重组载体pCB2002。其中SmaI识别位点是下述两个合成的多聚核苷酸：5’AGCTCACGGGGTGGCGCGCCTAGGATTTAAATCACAAAGTGCCC3’和5’GGGCACTTTGTGATTTAAATCCTAGGCGCGCCACCCCGTGAGCTCATG3’在66℃退火60秒得到的。

将Gateway Conversion A试剂盒(Invitrogen，Gateway vector Conversion systemCat.No.11828-019)中的Conversion A通过平末端连接插入到pCB2002的SmaI和PmlI识别位点之间就得到基础载体pCB2003。

以pCAMBIA3301(CAMBIA)为模板，以5’-GGGCACGGGGTGGATTAGCCTTTTCAATTTCAGAAA-3’和5’-GGGCACTTTGTGATTGTAAATAGTAATTGT-3’扩增35S启动子的PCR引物，扩增烟草花叶病毒(CaMV)35S启动子，将PCR扩增出的烟草花叶病毒(CaMV)35S启动子片段，用DraIII消化后，插入到pCB2003的DraIII酶切位点处，测序验证，将经测序验证含有烟草花叶病毒(CaMV)35S启动子的重组载体命名为pCB2004。

从野生型扩增该硫高效利用基因的方法为，取野生型Columbia拟南芥种子(购自拟南芥生物资源中心(Arabidopsis Biological Resource Center，ABRC))，进行表面消毒后，在MS培养基上重新萌发，光照培养10天之后，抽提DNA作为模板，以P1： GGGG ACA AGT TTG TAC AAA AAA GCA GGC TGC ATGGGTTTGATTAGCAAAGA( attb 接头)，P2： GGGG AC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTC TCAAAGTGAACTTACGGATT( attb 接头)为引物，进行PCR扩增，PCR扩增程序为先95℃/3min，94℃/30sec，56℃/39sec，72℃/1min，40个循环；再72℃/7min 1个循环，PCR产物跑琼脂糖凝胶电泳回收，用于后面的构建试验。

将上述PCR扩增得到的SUE4基因，利用Gateway^R BP Clonase^TM II Enzyme Mix试剂盒(Invitrogen，Cat.No.11789-020)通过Gateway^TM Cloning Technology重组克隆到含有35S启动子的过量表达双元载体pCB2004(如图1B所示)的attR1和attR2位点之间，经测序检测，将检测表明含有SUE4基因的pCB2004重组表达载体命名为pCB2004/SUE4。

将pCB2004/SUE4用电转化法转入农杆菌，再用花序转化方法(floral dip method)转化野生型Columbia拟南芥植株(购自拟南芥生物资源中心(ArabidopsisBiological Resource Center，ABRC))。

对转化后植株所收集种子，进行表面消毒后，在含有50mg/L除草剂(glufosinate)的MS培养基上重新萌发，光照培养10天之后，存活的单株即是阳性苗，移栽到土里，单株收种，得到转pCB2004/SUE4植株的阳性苗种子。

得到的转pCB2004/SUE4植株阳性苗的种子，进行表面消毒后，在MS培养基上重新萌发，光照培养10天之后，抽提RNA，RT(reverse transcription)-RCR检测SUE4基因是否过量表达，获得过量表达SUE4的单株，作为后期生理试验的材料。

2、转SUE4基因的拟南芥的获得

然后对转基因植株进行硫高效利用实验，方法为：将过量表达SUE4的转pCB2004/SUE4植株和野生型拟南芥的种子分别播种低硫培养基上，以MS培养基上培养的转pCB2004/SUE4植株和野生型拟南芥，作为对照，在22摄氏度，每天16小时光照的培养条件下竖直培养，8天后，观察并记录根系延伸的情况，结果表明，MS培养基上培养的转pCB2004/SUE4植株(图4A中的pCB2004/SUE4)和野生型拟南芥(图4A中的WT)根分别伸长2.75cm、2.39cm，低硫培养基上转pCB2004/SUE4植株(图4B中的pCB2004/SUE4)和野生型拟南芥(图中的WT)根分别伸长1.50cm、0.98cm，培养8天的图片如图4所示，表明，在普通MS培养基上培养8天，转pCB2004/SUE4植株(图4A中的pCB2004/SUE4)生长状况与野生型(WT)基本一致(如图4A所示)；在低硫培养基上培养8天，野生型(WT)根系生长受到抑制，转pCB2004/SUE4植株(图4B中的pCB2004/SUE4)则几乎不受影响(如图4B所示)。

序列表

<160>2

<210>1

<211>597

<212>DNA

<213>十字花科植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>1

atgggtttga ttagcaaaga agagataagc aaaacaagaa gatattcatc ttctctttgg 60

agaggtatca aaacgatctt tgttctcttc actatgtttc tctctttcat catcttttct 120

gctccgatct tcctcgccgt cgccgacgcc gtcctcccct ccgcaatcct ctcatcctcc 180

tcaccctccc tcaaccgcct atctccttct agttttccgg cgacgattta ttcttacctc 240

agtaactacg atttccgtta ctctctcatc gacatacctc tcatctccat aattagatct 300

gccattatac tatgcgttta cgggctttgt gacggaccaa agttatcaag gggaccatat 360

ctgacaataa cgatgatatg ctcgatatct tcactgatat acgtatcgtt caaggcagca 420

attgtattcg gagagccagt gatcggagga tatttccgaa cagaggaaat ggctctcttt 480

ctatgttctt ggatcttagc catcggtcac atcgttgtgg cgtaccgtac aagttgtaga 540

gagagacgaa agctcctagt cttcaaaatc gacatcgaat ccgtaagttc actttga 597

<210>2

<211>199

<212>PRT

<213>十字花科植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>2

Met Gly Leu Ile Ser Lys Glu Glu Ile Ser Lys Thr Arg Arg Tyr Ser

1 5 10 15

Ser Ser Leu Trp Arg Gly Ile Lys Thr Ile Phe Val Leu Phe Thr Met

20 25 30

Phe Leu Ser Phe Ile Ile Phe Ser Ala Pro Ile Phe Leu Ala Val Ala

35 40 45

Asp Ala Val Leu Pro Ser Ala Ile Leu Ser Ser Ser Ser Pro Ser Leu

50 55 60

Asn Arg Leu Ser Pro Ser Ser Phe Pro Ala Thr Ile Tyr Ser Tyr Leu

65 70 75 80

Ser Asn Tyr Asp Phe Arg Tyr Ser Leu Ile Asp Ile Pro Leu Ile Ser

85 90 95

Ile Ile Arg Ser Ala Ile Ile Leu Cys Val Tyr Gly Leu Cys Asp Gly

100 105 110

Pro Lys Leu Ser Arg Gly Pro Tyr Leu Thr Ile Thr Met Ile Cys Ser

115 120 125

Ile Ser Ser Leu Ile Tyr Val Ser Phe Lys Ala Ala Ile Val Phe Gly

130 135 140

Glu Pro Val Ile Gly Gly Tyr Phe Arg Thr Glu Glu Met Ala Leu Phe

145 150 155 160

Leu Cys Ser Trp Ile Leu Ala Ile Gly His Ile Val Val Ala Tyr Arg

165 170 175

Thr Ser Cys Arg Glu Arg Arg Lys Leu Leu Val Phe Lys Ile Asp Ile

180 185 190

Glu Ser Val Ser Ser Leu

195

Claims

1、一种植物硫高效利用蛋白，是具有下述氨基酸序列之一的蛋白质：

1)序列表中的序列2的氨基酸残基序列；

2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物硫高效利用相关的蛋白质。

2、根据权利要求1所述的耐逆相关蛋白，其特征在于：所述硫高效利用蛋白，其氨基酸残基序列是序列表中序列2。

3、权利要求1或2所述植物硫高效利用蛋白的编码基因。

4、根据权利要求3所述的的编码基因，其特征在于：所述植物硫高效利用蛋白的基因组基因，具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中序列1的DNA序列；

2)编码序列表中序列2蛋白质序列的多核苷酸；

5、含有权利要求3或4所述植物硫高效利用蛋白的编码基因的表达载体。

6、含有权利要求3或4所述植物硫高效利用蛋白的编码基因的转基因细胞系。

7、含有权利要求3或4所述植物硫高效利用蛋白的编码基因的宿主菌。

8、一种培育硫高效利用植物的方法，是利用植物表达载体将权利要求3或4所述的基因导入植物细胞或组织，获得硫高效利用的转基因细胞系及转基因植株。

9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述植物为拟南芥、小麦、水稻、油菜或大豆。