CN1985172B - 测量样品中金属标记物质的方法及其试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于测定样品中金属标记物质的存在或含量的方法。在该方法中，使样品中金属标记物质的金属形成可溶性电化学活性复合物，然后用电化学方法测量该可溶性电化学活性复合物以提供金属标记物质的存在或含量的指示。可溶性电化学活性复合物相对于样品中存在的或可能存在的会与所述金属形成不溶性和/或无电化学活性复合物的部分是稳定的。可通过将待测分析物与金属标记结合配对体如抗体或其抗原结合片段结合形成金属标记物质。

Description

测量样品中金属标记物质的方法及其试剂盒
本发明涉及用于测定金属标记物质的存在或含量的方法和装置。特别地，然而并非唯一地，本发明涉及用于检测包括感兴趣的分析物的物质或特异性附着于感兴趣的分析物的物质的方法和装置。
与标记结合的特异性结合物质如抗体在分析物检测中通常用作快速检测用试剂。这种检测法之一在EP-A-0291194中有述。在该检测法中，对横向流动多孔载体装备对感兴趣的分析物是特异性的可移动微粒标记抗体。其另外还装备有对分析物是特异性的但是固定在检测区域内的第二抗体。分析物结合可移动的标记抗体，形成第一复合物，第一复合物随后在检测区域内被固定的第二抗体捕获。检测区域中标记的存在程度提供了样品中分析物的含量的指示。标记可以是微粒物质如金，并且其在检测区域内的存在可通过目测法或光学法检测。
另一种用于检测被标记的特异性结合物质的方法在美国专利申请No 20030186274中公开。在该方法中，金属标记结合物质的存在程度或存在通过在氧化剂如强酸存在下溶解标记以形成金属离子而进行检测。然后，所述离子在适当的负电位的存在下通过电化学还原沉积在电极表面上。然后改变电位以将金属再次氧化，然后使其返回溶液，产生电流响应。该电流响应的强度提供了在电极表面沉积的金属离子量的指示，和由此的最初存在的标记的量。这类电分析技术被称为溶出伏安法(stripping voltammetry)并且可用于测量较低量(例如百万分之一或较低)的金属离子。可使用该方法来检测对标记结合物质具有结合特异性的任何分析物的存在或程度。
US2003018627方法中使用的标记的例子是金。然而，在许多方面，认为银是供电化学检测使用的更好标记，这主要是因为银比金更容易 氧化，从而形成银离子。例如，从银形成银离子所需的氧化剂比从金形成金离子所需的氧化剂较弱，因此更适用于诊断试剂盒。
虽然银在US2003018627中以可被检测到的金属粒子的形式被公开，但是其中所述的方法不能用于生物样品中的银和类似金属的电化学检测。这是因为这些金属的氧化形式将与生物样品如血液、血浆和尿中发现的物质反应，形成不可溶性的无电化学活性的复合物。例如，尿中氯离子的浓度通常为150mM，因此通过氧化形成的任何银离子将立即作为AgCl沉淀，并将因此阻碍银在电极表面被氧化。同样地，溴离子和含硫物质如半胱氨酸还存在于生物样品中，将与银离子形成不溶性的无电化学活性的复合物。
在第一方面，本发明提供了用于测定样品中金属标记物质的存在或含量的方法，所述方法包括：
使所述样品中金属标记物质的金属形成可溶性电化学活性复合物，该可溶性电化学活性复合物相对于所述样品中存在的或可能存在的会与所述金属形成不溶性和/或无电化学活性复合物的部分是稳定的；和用电化学方法测量形成的可溶性电化学活性复合物以提供金属标记物质的存在或含量的指示。
在本发明中，金属的电化学测量通过形成该金属的可溶性电化学活性复合物进行。用这种方法，防止金属与样品中的试剂或部分反应，所述的试剂或部分将导致形成不溶性和/或无电化学活性的复合物。因此，形成的复合物的电化学测量可方便地和容易地进行，而无需除去否则会使金属不能被电化学测量所利用的这些部分。虽然US2003018627公开了以其所公开方法生成的金属离子可以是复合形式，这样作的目的据称是将非电活性金属离子转变成可进行检测的电活性化合物，并从而形成可吸附到电极的更具疏水性的部分。这与本发明是相对立的，在本发明中，电活性金属离子被转变成复合物以防止所述金属离子与样品中存在的部分形成不溶性和/或无电化学活性的 复合物。
在一个方案中，通过氧化所述金属，然后使形成的金属离子与适当的复合剂反应而形成电化学活性复合物。这可通过在适当的复合剂的存在下氧化所述金属而实现。
本发明中使用的金属标记可以是银，尽管也可使用其它金属如铅、镉、铜、铊、汞和锌。与金相比，选择常规的和有利的微粒金属—银—可容易地在铂或碳电极上形成可测量的电化学响应。这使得可使用以方便和廉价方式制备的碳电极。
另外的优点是所述的或各个氧化剂，当使用时，与碳电极(当存在时)一起，用于提供可进行电位参考的稳定参考电位。这避免了构建单独电极的需要，诸如例如目前通常使用的银/氯化银电极。
在一个方案中，金属标记是微粒标记，如银溶胶(silver sol)。提供微粒标记的优点是单一标记可被氧化以提供极大量的金属离子，如106个或更多，根据溶胶尺寸而定，并因此提供更大的灵敏性。金属溶胶是市售的并且可通过如EP291194中所述的已知方法与结合试剂相结合。
使用银比使用金更方便之处在于银离子所需的氧化条件比较贵重金属如金所需的氧化条件的苛刻性更低。例如，金属金到离子金(AuCl4)的氧化要求浓硝酸和浓盐酸的混合物、或次氯酸钠和盐酸的混合物。相比之下，为了将银粒子氧化成银离子，可使用过氧化物、三价铁离子和铁氰化物作为氧化剂。该氧化还可在更有利的pH值如3和7之间进行。
在本发明中，金属标记形成可通过电化学方法进行检测的电化学活性复合物。本文使用的“电化学活性”物质是指可经历一个或多个 电子的获得或缺失的离子、中性化合物或复合物。
电化学活性复合物的作用是防止金属与样品中的将形成不能通过电化学方法检测到的不溶性和/或无电化学活性复合物的物质发生反应。例如，银离子将与卤化物如氯化物反应以形成不溶性盐，或与含硫物质如半胱氨酸、谷胱甘肽、半胱氨酰基甘氨酸和其它氢硫基化合物反应以形成无电化学活性的银离子复合物。因此，电化学活性复合物在这些物质的存在下必须是稳定的。本领域的技术人员可以理解的是，电化学活性复合物与金属(或金属离子)和复合物质将处于动态平衡。金属或金属离子还与样品中存在的能形成无电化学活性和/或不溶性复合物的部分处于平衡状态。因此，原则上，以上全部物质将在某种程度上存在。然而，这些平衡的位置将至少在某种程度上根据能形成可溶性电化学活性复合物的复合物质的含量、样品中能与金属或金属离子形成不溶性和/或无电化学活性复合物的物质的含量和金属或金属离子的含量而定。因此，术语“稳定的”是指其中电化学活性复合物优先形成并且其中无电化学活性和/或不溶性复合物的含量相对于电化学活性复合物的量是微不足道的情况。无电化学活性和/或不溶性复合物的存在水平对测量结果具有无关紧要的作用。复合物质的初始含量越大，则平衡更倾向于向可溶性电化学活性复合物的形成方向移动，并因此将存在较低量的金属或金属离子。为此，提供过量的复合物质以确保优先形成电化学活性复合物，而无论样品中能与所述金属形成不溶性和/或无电化学活性复合物的部分的含量如何。
本发明适用于生物样品，包括所有可得自哺乳动物体的液体，包括例如血液、血浆、尿液、淋巴液、胃液、胆汁、血清、唾液、汗液和脊髓液及脑液。另外，体液可经过处理(如血清)或未经过处理。从主体获得样品的方法是本领域技术人员已知的。生物样品可以得自已经过处理以提供液体样品的固体样品如组织。本发明还适于测量其它液体，包括工业或环境液体，如含有大量能与金属形成不溶性和/或无电化学活性复合物的物质的废水或海水。样品可以是植物来源。当待测 样品含有蛋白质部分时，可添加碘代乙酰胺以与蛋白质中的硫醇反应形成硫酯。这防止了金属离子通过硫醇基团与蛋白质反应从而不能形成可溶性电化学活性复合物。
如上所述，可通过氧化所述金属，然后使形成的金属离子与适当的复合剂反应而形成电化学活性复合物。可使用任何能氧化所述金属的方便的氧化剂，如高锰酸盐、铬酸盐、过氧化物、过硫酸盐、三价铁离子和铁氰化物。在一个具体方案中，氧化剂是三价铁离子，因为其是特别温和的氧化剂。根据本发明，可提供还原形式的氧化剂并且只在需要时才将其氧化成其活性形式。所述的氧化可以是化学氧化或电化学氧化。在某些方案中，氧化可通过将还原形式的氧化剂与待测样品接触而引发。
在一个方案中，根据以下反应图解，使用+III氧化态的铁来氧化银：
Fe3++Ag→Ag++Fe2+。
+III氧化态的铁可以适当的可溶性三价铁盐的形式提供，如硝酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、硫酸铁铵。
作为硝酸铁的替代物，铁氰化钾可根据以下反应图解用作氧化剂，然后与硫氰酸盐或硫代硫酸盐反应：
4K3Fe(CN)6(aq)+4Ag(s)→3K4Fe(CN)6(aq)+Ag4Fe(CN)6(aq)
可在用于氧化金属如银溶胶粒子的电极氧化亚铁氰化物(FeII)生成铁氰化物(FeIII)。该方法具有几个优点。首先，在使用的时间点以及在需要的时间可以以受控方式和受控量产生铁氰化物。这使得金属扩散到测量区域外的可能的损失最小化。可使用相同电极产生氧化剂以及用于测定金属离子水平。其次，干燥形式的亚铁氰化物比干燥形式 的铁氰化物更稳定并因此可储存在本发明的装置和试剂盒中直到添加样品。第三，亚铁氰化物与银形成较弱的复合物，因此，其在当需要时只产生铁氰化物时是有利的。
亚铁氰化物与银的反应活性相对较低并且只在氧化时才有活性的事实在本发明的这些方案中是重要的，本发明的方案包括使用银标记结合配偶体与分析物结合从而形成银标记物质(见下文)。在这些方案中，任何未结合的银标记结合配偶体可接触亚铁氰化物，而没有所述未结合的银标记结合配偶体通过提供可形成可溶性电化学活性复合物的银离子而干扰结果的危险。在任何未结合的银标记结合配偶体已经除去后，亚铁氰化物可被氧化形成铁氰化物，从而只有结合的银标记质中的银形成可溶性电化学活性复合物。
这使得在提供一步测试/试剂盒时更容易，所述一步测试/试剂盒在装置内提供干燥状态的必要试剂并且使用者仅需要施用液体样品就可进行测试。在这种测试/试剂盒中，样品自身将作为洗涤液，从可溶性电化学活性复合物被检测的检测区域/范围内除去任何未结合的银标记结合配偶体。可在检测区域上游或在检测区域提供亚铁氰化物。可使用亚铁氰化钾因为其具有高度的水溶性、与银的反应活性相对较低并且在干燥状态下是稳定的。
在形成银离子后，如下所示，可使用过量的硫氰酸铵形成可用电化学方法检测的可溶性银离子复合物：
Ag++m(NH4)++n(SCN)-→[Ag(NH4+)m(SCN-)n]m-n+1
可使用过量的硫代硫酸铵代替硫氰酸盐以形成可溶性银离子复合物。所述的阴离子复合物先于不溶性银盐形成并因此以可溶性复合物的形式保留，即使在能与银离子形成不溶性盐的物质的存在下也是如此。
用于氧化银(或其它金属)并形成稳定复合物的试剂可以干燥状态存在，这使得它们向免疫测定装置内的引入是方便的。在使用过程中，所述试剂可通过待分析的生物样品溶解。
使用银作为金属标记的另一个优点是从电极脱出的银物质的还原电位在与银离子相比的较低负电位下发生。这减少了来自于可能存在的电化学活性物质如抗坏血酸和其它金属离子如铜、镉和汞的干扰的背景效果。
可通过任何方便的电化学方法进行电化学活性复合物的测量。可使用具有电位扫瞄或重叠正弦电压的阳极溶出伏安法(或极谱法)，所述电位扫瞄可为线性、环状、方形波、标准脉冲或差分脉冲。或者，可使用阳极溶出计时电位分析法。可使用其它技术，如离子交换伏安法，具有可为线性、环状、方形波、标准脉冲或差分脉冲或重叠正弦电压的扫描的吸附性阴极溶出伏安法(或极谱法)，或计时安培分析法，计时库仑分析法，或线性、环状、方形波、标准脉冲或差分脉冲伏安法(或极谱法)，或具有重叠正弦电压的伏安法(或极谱法)。
可通过将待测分析物与金属标记结合配偶体结合形成金属标记物质。因此，金属标记物质和由此由该金属标记物质形成的可溶性电化学活性复合物是生物样品中分析物的存在或含量的指示剂。金属标记结合配偶体可以是任何能与待测分析物结合的物质。因此，根据待测分析物而定，金属标记结合配偶体可以是抗固体或其抗原结合片段、蛋白质受体、T细胞受体、抗原、半抗原、蛋白质、肽、寡核苷酸、硼酸衍生物、高分子酸或碱、碳水化合物、凝集素、互补核苷酸或肽序列、特异性蛋白质结合剂、核酸(例如DNA或RNA)、分析物结合物等等。
在另一个方面，本发明提供测定样品中分析物的存在或含量的方 法，该方法包括：
使被怀疑含有分析物的样品接触金属标记结合配偶体以形成金属标记物质；
将金属标记物质氧化并使得到的金属离子形成可溶性电化学活性复合物，该电化学活性复合物相对于样品中存在的或可能存在的能与所述金属离子形成不溶性和/或无电化学活性的复合物的部分是稳定的；和
用电化学方法测量形成的可溶性电化学活性复合物以提供分析物的存在或含量的指示。
如本文中使用的术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分或片段，即，含有特异性结合抗原的抗原结合部位的分子。可用于本发明的免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)或小类的免疫球蛋白分子。抗体包括但不限于多克隆抗体，单克隆抗体，双特异性抗体，人源化抗体和嵌合抗体，单链抗体，Fab片段和F(ab’)2片段，由Fab表达文库产生的片段，抗独特型(anti-Id)抗体，和上述任一种的表位结合片段。如果抗体优先结合抗原，则抗体或通常的任何分子“特异性结合”抗原(或其它分子)，并且例如具有小于约30％，优选20％、10％、或1％的与其它分子的交叉反应性。抗体的部分包括Fv和Fv’部分。
可使用免疫测定法测量待测分析物。这种测定法可以是竞争性或非竞争性(三明治)免疫测定法。均相和非均相的这种测定法都是本领域公知的。
在一个实施方案中，免疫测定法如下进行：将得自待测主体的样品与适当的金属标记抗体接触，形成金属标记物质，然后处理所述金属标记物质以形成电化学活性复合物(其可以是金属的氧化和所得金属离子的复合)，然后电化学测量该电化学活性复合物以测定该电化学活性复合物的含量或存在，该含量或存在相当于分析物的含量或存在。
可通过两步三明治测定法检测生物样品中的分析物。在第一步中，使用捕获剂(如抗-分析物抗体)捕获分析物。捕获剂可任选固定在固相上。在第二步，使用金属标记检测剂检测被捕获分析物。或者，捕获剂可用金属进行标记，并且检测剂可被固定。这允许检测其中固定有检测剂的特定区域中的分析物。
在一个实施方案中，可使用“三明治”形式的横向流动免疫测定装置，在该装置中，样品中足够的分析物标识物的存在将在横向流动测定的捕获区域中引起“三明治”相互作用的形成。如本文中使用的捕获区域可含有捕获剂，如适于捕获待测分析物的抗体分子、抗原、核酸、凝集素和酶。在本发明的方法中可使用的其它测定法包括但不限于流通装置(flow-through devices)。
本发明还提供试剂盒，该试剂盒包括：
能够与样品中被怀疑存在的分析物结合以形成金属标记物质的金属标记结合配偶体；
用于使金属标记物质的金属形成可溶性电化学活性复合物的一种或多种试剂，该电化学活性复合物相对于样品中存在的或可能存在的会与所述金属形成不溶性和/或无电化学活性复合物的部分是稳定的；
其中金属标记结合配偶体可以与分析物结合的容积；和
用于固定金属标记物质使得一种或多种试剂可以引起可溶性电化学活性复合物形成的捕获区域。
试剂盒可与读出器组合提供，其用于可溶性电化学活性复合物的电化学测量。在一个实施方案中，试剂盒是一次性的而读出器是可再用的，各自的部件在用前已接合或以其它方式结合在一起。或者，它们作为单一体系被提供。
试剂盒或读出器可装备有至少两个电化学测量用电极。当装备在 试剂盒中时，电极可通过端子与读出器内部或外表面上存在的电极端子连接。当装备在读出器中时，试剂盒经过配置使得当试剂盒和读出器接合在一起时电极位于试剂盒内的适当位置处。
读出器可包括信号转导和信号处理机构，其用于为电极提供信号以及转导和处理得自电极的特殊信号。读出器可包括显示信息的显示器机构；容纳试剂盒的机构；接受外动力的能量源或结构；记忆机构，校准结构和任选的数据输入/输出机构。
在一个实施方案中，试剂盒的容积由多孔板等形成。将样品置于孔中并添加金属标记结合配偶体。然后任何存在的分析物将形成金属标记物质。该金属标记物质可以固定在捕获区域(如过滤器或固定抗体)中，从而可向其中添加用于使金属标记物质的金属形成可溶性电化学活性复合物的一种或多种试剂。或者，可通过多孔载体形成或提供容积，所述多孔载体可以是侧向流动多孔载体或微流体装置。
当本发明涉及形成可随后复合的金属离子时，为了提供精确的结果，应当使电化学测量仅限于那些已经复合的金属离子。也就是说，未复合的金属标记结合配偶体将不会被氧化，或者，如果氧化，其将不会影响测量结果。这可以通过首先使样品接触结合配偶体以形成固定的金属标记结合配偶体-分析物复合物、然后通过洗涤从捕获区域的附近除去任何未结合的金属标记结合配偶体得以实现。然后，用于使金属标记物质的金属形成可溶性电化学活性复合物的一种或多种试剂可接触固定区域从而形成电化学稳定的金属离子复合物。
电极可通过多种方法制备，包括各种印刷法，如筛网印刷、喷墨印刷、平版胶印、旋转印刷等。或者，可通过真空沉积或溅射沉积电极。电极可在衬底的内表面上提供。在双电极构造中，一个电极是工作电极，另一个电极作为反电极/参考电极。可提供可能作为参考电极的第三电极。可提供相同的或另外的电极以指示室中样品的存在和/或 确保室被正确填充。电极可以是平面筛网印刷的3-碳电极构造的一部分。该构造可通过在衬底上印刷上低温碳图形，然后将这些图形用低温电介质图形进行套印以限定电极并掩盖其它的碳区域防止与水接触。衬底可以是聚合物，虽然可使用氧化铝。电极材料和电介质的沉积可通过包括网目印刷的多种技术实现。
在一个实施方案中，金属标记物质(结合配偶体-分析物复合物)的固定或捕获通过使用过滤器结构实现。在不存在分析物时，金属标记结合配偶体将通过过滤器，在存在分析物时，所得复合物的形成将使金属标记结合配偶体被固定或截留在过滤器中。
本发明各个方面的优选特征可以是对其它每个方面加以必要的变更。本文提及的现有技术文献以法律所允许的最大程度被并入本文。
现在将在以下实施例中描述本发明。所提及的附图是：
图1是电流-电位曲线，说明当硫氰酸铵和硝酸铁在水溶液中混合时形成银离子复合物的最适pH值。
图2是进行根据实施例的电化学测量的电极的示意图；
图3是表示根据实施例1的方法获得的液体样品中存在的不同量的银粒子的电流响应曲线。
图4是图3的特定范围的银粒子量的放大图；
图5是根据本发明的免疫测定法的示意图；
图6是根据实施例2的方法获得的电流响应-分析物人绒毛膜促性腺激素(hCG)的存在水平的函数；
图7是表示测量的电荷-NTproBNP浓度的曲线；误差线表示在基于2次或3次测量的测量信号中的一个标准偏差；
图8是测量的电荷量-NT-proBNP添加浓度的曲线；
图9是实施例5中使用的微流体装置的图示；和
图10是说明在有或无5mM碘乙酰胺的条件下血浆样品中银离子的测量图。
实施例
实施例1—血清中银溶胶的电化学测量
添加硫氰酸铵(0.4g)到1ml血清样品中，使用含硝酸铁(0.01g)(作为氧化剂)的1％EDTA(100μl)和pH4的缓冲液(枸橼酸/枸橼酸钠)。先前发现该pH给出在生物样品和纯缓冲液二者中银离子的最佳分析信号(参见图1)。从图1能够看出，pH4是最佳的，因为其提供最大的电流读数即敏感性。还能够看出，银离子复合物的氧化反应是pH依赖性的。然而，当在全血中进行测量时，可选择较高的pH如pH7以避免血样凝固。添加10μl的已知浓度的银粒子到血清样品中。这些粒子迅速溶解，得到光学上透明的溶液。
生成的银离子的测量可在平面筛网印刷3-碳电极构造(参见图2)上进行。通过在25μm氧化铝衬底上印刷低温碳图形(D2，GwentElectronic Materials)制造电极。然后将这些低温碳图形用低温电介质图形(Gwent Electronic Materials)进行套印以限定电极并掩盖其它的碳区域以防止与水接触(参见图2)。
在每种情况下施加到电极表面的样品量是10μl。使用碳/硫氰酸铵/三价铁离子作为参考电极。其具有的相对于Ag/AgCl/3.5M KCl半电池为约-450mV的电位差。使用的电分析技术是快速方波阳极溶出伏安法(FQWASV)。当然还可使用其它的标准电分析技术。
使用以溶出方波伏安测量方式工作的EzescanTM(WhistonbrookTechnologies)进行测量。在-900mV的累积电位(无搅拌)下进行预浓缩120秒。在该时间(任选的5秒静止期)后引发在-900mv到-100mv之间的溶出，使用以下的仪器工作参数：电位阶跃1mV；峰宽5ms；半周期振幅25mV；频率100Hz。由扫描引起的峰高表示样品中银离子的浓度。或者，可测量由峰限定的面积以表示电荷。
图3和4示出所得结果。能够看出，电流响应随着最初存在的银粒子的量的增加而增加。
实施例2—血清中hCG分析物水平的测定使用标准ELISA型过程，采用实施例1的电化学方法测定血清中的分析物人绒毛膜促性腺激素(hCG)的水平。简而言之，含有不同水平的hCG分析物的样品与银微粒标记抗体(抗-αhCG)混合以形成第一抗体-分析物复合物。然后将该复合物添加到包括固定抗体试剂(抗-βhCG)的ELISA板中以形成固定的抗体-分析物-抗体的第二“三明治”复合物。最后，过量的未结合的银微粒标记抗体(第一抗体)通过洗涤从板上被除去，这在图5中示意性示出。
随后，通过添加含有实施例1所述试剂的含水样品进行银-抗体复合物的氧化以形成可溶性银离子复合物，然后电化学测量银离子以提供hCG分析物含量的测量。
银标记抗体试剂和ELISA板固定试剂可根据以下标准方法制备。
使S-乙酰基巯基琥珀酸(SAMSA)(Sigma)与抗-αhCG单克隆抗体(Mabs)反应。用25ml的pH6.0的磷酸盐缓冲液平衡PD-10大小的排阻色谱柱(Pharmacia)，添加2.5ml的MAb储液到该柱上并用3.5ml的pH6.0的磷酸盐缓冲液洗脱。向900μl的磷酸盐缓冲液中添加100μl的洗脱的MAb液，并在280纳米测量吸光度。计算浓度(Abs＝εcl)，ε＝1.4。计算溶液中蛋白质的总量(3.4ml剩余)。计算MAb的摩尔数(MAb的MW＝150,000)。计算需要35当量过量的SAMSA的摩尔数(SAMSA的MW＝174.2)。计算SAMSA溶液中需要给出SAMSA在每毫升二甲基甲酰胺(DMF)中为50毫克浓度的SAMSA的量(μl)。
将SAMSA溶于无水DMF溶液中达到50mg/ml的浓度并且添加适当量的溶液到MAb溶液中并同时搅拌。得到的溶液在搅拌下在室温 下培养过夜。
根据以下步骤进行银胶体与得到的结合SAMSA的抗-αhCG单克隆抗体(MAb)的结合。
将已知量的银胶体与非离子型表面活性剂(Pluronic F108-PMPI)培养以减少特异性结合。添加含5mg F108-PMPI的去离子水到微量离心管中并添加约2mg的银溶胶。将其在室温下在旋转式搅拌机上培养约1小时。将溶液在5℃以17000rpm离心15分钟。除去上清液，并将小粒再悬浮在1ml的50mM HEPES(pH7.5)中。
对SAMSA-MAb进行脱保护以给出单克隆抗体硫醇(MAb-SH)用于有效结合银胶体。向1ml小份的SAMSA-MAb溶液中添加40μl的0.1M三羟甲基氨基乙烷(Tris)溶液并混合5分钟。添加20μl的0.1M乙二胺四乙酸(EDTA)溶液并混合5分钟。添加40μl的1M羟胺溶液并混合5分钟。用20ml的pH7.5的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)平衡NAP-10柱填充物(Pharmacia)，装载1ml脱保护的MAb溶液并用1.5ml的HEPES洗脱。
然后使银胶体与脱保护的SAMSA-Mab反应。将银胶体悬浮液分成两个等份，并向各个等份中添加500μl的脱保护的SAMSAAb(MAb-SH)溶液并同时混合。将样品在50℃以17000rpm离心30分钟培养过夜，除去上清液，并将各个样品再悬浮在500μl的硼酸盐缓冲液(pH8.6)中。将样品重新合并在一个微量离心管中并在5℃以17000rpm离心30分钟。弃去上清液并将固体再悬浮在1ml硼酸盐缓冲液中。得到的银微粒标记抗体在4℃储存。
如下将单克隆抗-βhCG抗体试剂固定到ELISA板(Greiner高结合性板)上。
添加含200μl的抗-βhCG的50mM硼酸盐缓冲液(pH8.6)到每个孔中。将板覆盖并在37℃振摇培养1小时，然后洗涤。添加DBS/BSA缓冲液(Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水，每100ml R.O.水1片，1％BSA)到孔中并放置过夜。然后弃去缓冲液，将200μl的在DBS/BSA缓冲液中的所需浓度的hCG(分别为0、0.2、1、5、10、20和50mIU)一式两份增加到孔中，并在37℃培养1小时，然后洗涤。添加100μl的在硼酸盐缓冲液(pH8.6)中的过量的与银胶体结合的SAMSA-MAb到每个孔中并在37℃培养1小时，然后洗涤。
通过添加100μl的5M硫氰酸铵、0.05M的柠檬酸盐缓冲液(pH4)、1M硝酸铁、1％EDTA溶液到各个孔中并在37℃培养30秒进行固定银抗体复合物的氧化。通过移液管除去溶液，将其置于实施例1中所述的3电极构造上，然后如实施例1所示电化学测量银离子的量，除了使用常规的Ag/AgCl参考电极之外。因此，累积电位为-300mV并且溶出电位在-300mV到+400mV之间变化。结果如图6所示，从该图能够看出分析物水平的增加获得电流响应的增加。
实施例3—基于磁性捕获粒子和银溶胶信号粒子的应用的NTproBNP免疫测定法在本实施例中，将用Ag标记的抗NT-proBNP抗体和用乳胶覆层磁性粒子标记的抗NT-proBNP抗体与NT-proBNP混合，形成三明治复合物。得到的样品在磁场下浓缩，该磁场具有将未结合的Ag标记抗体与复合物(以及任何未结合的磁性粒子标记抗体)分离的作用。除去上清液，将样品再悬浮在PBS中并提供在电极表面上。添加亚铁氰化物到电极表面并进行氧化以提供活性试剂—铁氰化物。通过在电极表面上还原然后进行电溶出和测量的电荷测量Ag离子的量。该实验使用不同水平的NT-proBNP重复进行，得到的结果如图7所示，图7表示电荷-浓度(pg/ml)曲线，pg/ml浓度为最终浓度，不是添加溶液的浓度。
在本实施例和以下实施例中，工作电极面积是0.8mm×4mm＝3.2 mm2，通过在峰下积分并除去背景(由于充电电流、任何干扰物等)后获得的电荷为约-0.4到0.0V。电位(V)可相对于(碳/K4Fe(CN)6、K3Fe(CN)6、NH4SCN)进行引用。
更详细地，通过British Biocell international使用抗-NT-proBNP抗体和80nM直径的银粒子(OD10)制备银溶胶结合物。通过使用在表面上吸附有Hytest15F11抗-NT-proBNP抗体并用BSA封闭以产生10％的固相溶液的乳胶覆层顺磁性粒子(1.5μm直径)制备磁性粒子结合物。
通过培养银溶胶结合物(10μl)、磁性粒子结合物(5μl)和NTpro-BNP(5μl)的加料样品5分钟进行测定。然后将样品在磁场下浓缩并除去上清液。将样品再悬浮在PBS(10μl)中，通过磁棒浓缩，然后除去上清液。再一次重复该过程，然后将粒子再悬浮并置于电极表面上，然后将所有的磁性粒子移到工作电极上。添加0.106g的K4Fe(CN)6溶解在1ml的4M SCN中的溶液(5μl)到电极。在autolab恒电位器上进行基本上如实施例1所述的电化学测定，三个筛网印刷碳电极分别用作工作电极、反电极和参考电极。使用的碳墨是得自Gwent ElectronicMaterials的D2碳墨。
通过银的阳极溶出伏安法的电化学分析的参数如下：在0.35V停留10秒，以将Fe2+转化为Fe3+，
2.在-1.6V停留5秒，
3.在-1.2V停留55秒，
4.从-1.2V扫描到0.1V，扫描速率为1Vs-1。
在步骤1中，通过在工作电极氧化亚铁氰化物产生铁氰化物。铁氰化物将银氧化使其溶解。在步骤2和3中，将银镀到电极上，在步骤4中，银从电极溶出。通过从约-0.4到0.0V的溶出峰下的面积进行级分并除去背景(由于充电电流、任何干涉等)后得到溶出电荷Q。
图7表示溶出电荷对增加的分析物浓度的响应。
实施例4—基于使用通道式过滤器使用银溶胶信号粒子截留20um直径乳胶捕获粒子的NTproBNP免疫测定法在本实施例中，将乳胶标记NT-proBNP抗体和Ag-标记NT-proBNP抗体与NT-proBNP混合。将得到的混合物置于通道中并通过毛细管作用流到孔径<＝20um的过滤器区域。过滤器用于捕获乳胶标记抗体-分析物-Ag-标记抗体的复合物(以及任何未结合的乳胶抗体)。任何未结合的Ag标记抗体通过过滤器。然后洗涤捕获的物质以除去任何未结合的Ag标记抗体并添加亚铁氰化物溶液。试剂的氧化和银离子的检测通过在过滤器区域附近和上游提供的电极进行。因此，使用抗-NT pro-BNP20μm乳胶捕获粒子结合物截留其上捕获有NT pro-BNP的银溶胶抗-NT pro-BNP结合物。胶乳粒子对着紧接于通道内电极的过滤器被捕获，未结合的银结合物材料由穿过被捕获粒子填充层的旁路溶液冲走。通过在电极处的溶解和随后的溶出伏安法测量结合的银粒子。重复该实验数次，并测量电荷量(相当于通过电极检测的Ag离子的量)。图8表示测量的电荷量-添加的NT-proBNP的浓度曲线。
更详细地，装置(参见图9)包括工作电极、反电极和得自GwentElectronic Materials的被丝网印刷到聚酯薄膜上的D2碳墨的参考电极。使用U形双面胶带片将它们连接到聚苯乙烯成型件上，所述聚苯乙烯成型件经过处理具有亲水性，并且特征在于直通道为50um深和过滤器。工作电极(WE)是紧接于过滤器的最左边的电极。添加样品到通道的右手部分以进行试验。使用的通道宽度是4mm。过滤器的尺寸如下：5mm长，4mm宽，通道宽度30um，壁宽50um。过滤器内的通道(开口)数是49。
如下制备溶液。将NTproBNP标准品(1.953×106pgml-1)在PBSA(磷酸盐缓冲盐水，含0.05％叠氮化物)中稀释到40mgml-1BSA以生成其它标准品。
在1.5ml eppendorf中添加含40mgml-1BSA和30μl标准品的176μl PBSA。将其混合并向其中添加40μl Ag溶胶(溶胶通过BritishBiocell international，使用抗-NTproBNP抗体和80nM银粒子并用β-酪蛋白封闭并悬浮在0.5mgml-1β-酪蛋白在10mM硼酸盐(pH8.5)中制备)并进一步混合60秒。以标称5％固体(20μm直径，用PBSA中的15F11敏化)向其中添加33μl乳胶并混合该溶液3分钟。
通过添加0.5％的吐温20溶液填充装置，然后用乳胶、NTproBNP标准品、银溶胶溶液包装小珠层。使用15μl PBSA洗涤以除去未结合的银，添加另外5μl的PBSA以保持毛细管被充满。视觉检查填充层以评价覆盖的电极面积。吸干毛细管的凝胶污点，尽管液体保留在包装的小珠层中。在临到电化学量时，添加在PBSA中的2.5μl的0.8M SCN和50mM亚铁氰化物到小珠层中。
对于电化学测量：
1.在0V预调整5秒，
2.在0.5V偏压40秒，
3.在-1.0V保持60秒，
4.以0.5Vs-1的扫描速率从-1.0V电位扫描到0.5V的最终电位。
在步骤2中，通过在工作电极处氧化亚铁氰化物产生铁氰化物，引起银溶胶被氧化并溶解。在步骤3中，将银镀于电极上，并且在步骤4中，银从电极溶出。通过对溶出峰下面积进行级分并减去背景后得到溶出电荷Q。
结果可见于图8，图8是测量的电荷-NTproBNP的对数浓度的曲线。误差线表示在基于3次或4次测量的测量信号中的一个标准偏差，图8是溶出电荷对增加的分析物浓度的响应。
实施例5—在测量血浆中的银时使用碘乙酰胺本实施例表示添加碘乙酰胺的作用。在含有蛋白质的溶液例如血液或血浆的存在下使用Ag的潜在问题是Ag通过硫醇基强烈结合于蛋白质并变得无电化学活性或其活性被电化学还原。因此，添加也强烈结合于蛋白质的碘乙酰胺作为蛋白质多价螯合剂，由此除去蛋白质与Ag结合的能力。该试剂可以干燥状态提供于装置内。
使用碘乙酰胺的基本原理是其与蛋白质终的硫醇反应以形成硫酯。碘乙酰胺具有以下所示的结构和与硫醇的反应：
Figure S05818662020061211D000191
卤代烷或卤代乙酰胺硫醚
(X＝I，Br，Cl)
以得自500mM的甲醇储备溶液的80％的浓度添加碘乙酰胺到血浆样品中形成5mM的浓度。将20μl的血浆(有或者没有碘乙酰胺)与5μl的4M NH4SCN、250mM铁氰化钾和25mM亚铁氰化钾以及不同浓度的AgNO3混合。得到的含有4mM碘乙酰胺、0.8M NH4SCN、50mM铁氰化钾和5mM亚铁氰化钾以及不同浓度的AgNO3的溶液被施用于电极。以1V/s扫描电位到-1.6V，在-1.6保持5秒，然后跃进到-1.2V并在-1.2V保持115秒。随后，以1V/s扫描电位到0.1V。通过将溶出峰下面积进行级分并减去背景后得到溶出电荷Q。
结果如图10所示。能够看出，在不存在碘乙酰胺时，低含量的银的信号是极小的。添加碘乙酰胺恢复一些银信号，使得可检测含量低得多的银。

Claims (15)

1.测定样品中金属标记物质的存在或含量的方法，该方法包括：
使样品中金属标记物质的金属形成可溶性电化学活性复合物，该电化学活性复合物相对于样品中存在的或可能存在的会与所述金属形成不溶性和/或无电化学活性复合物的部分是稳定的；和
用电化学方法测量形成的复合物以提供金属标记物质的存在或含量的指示；
其中，电化学活性复合物通过将金属氧化形成金属离子并使所述金属离子与复合剂反应形成；其中所述的复合剂是硫氰酸盐和/或硫代硫酸盐。
2.如权利要求1的方法，其中金属的氧化使用选自高锰酸盐、铬酸盐、过氧化物、过硫酸盐、三价铁离子和铁氰化物中的一种或多种。
3.如权利要求中1或2中的方法，其中金属标记是银。
4.如权利要求3的方法，其中所述的可溶性电化学活性复合物根据以下反应形成：
Ag++m(NH4)++n(SCN)-→[Ag(NH4+)m(SCN-)n]m-n+1。
5.如权利要求1的方法，其中金属标记是微粒。
6.如权利要求1的方法，其中电化学活性复合物的测量通过阳极溶出伏安法进行。
7.如利要求中1的方法，其中金属标记物质通过将待测分析物与金属标记结合配偶体结合形成。
8.如权利要求1的方法，其中金属标记结合配偶体是抗体或其抗原结合片段。
9.如权利要求1的方法，其中样品是生物样品。
10.试剂盒，包括：
能够与样品中被怀疑存在的分析物结合形成金属标记物质的金属标记结合配偶体；
用于使金属标记物质的金属形成可溶性电化学活性复合物的一种或多种试剂，该可溶性电化学活性复合物相对于样品中存在的或可能存在的会与所述金属形成不溶性和/或无电化学活性复合物的部分是稳定的；
金属标记结合配偶体可以与分析物结合；和
用于固定金属标记物质使得一种或多种试剂可以引起可溶性电化学活性复合物形成的捕获区域；
其中用于使金属标记物质的金属形成可溶性电化学活性复合物的一种或多种试剂包括用于将金属氧化形成金属离子的试剂和用于与金属离子反应形成电化学活性复合物的复合剂，其中的复合剂为硫氰酸盐和/或硫代硫酸盐。
11.如权利要求10的试剂盒，其中金属标记结合配偶体是抗体或其抗原结合片段。
12.如权利要求10的试剂盒，其中用于将金属氧化的试剂是选自高锰酸盐、铬酸盐、过氧化物、过硫酸盐、三价铁离子和铁氰化物中的一种或多种的氧化剂。
13.如权利要求10到12中任一项的试剂盒，其中金属标记是银。
14.如权利要求10到12中任一项的试剂盒，其中金属标记是微粒。
15.如权利要求10到12中任一项的试剂盒，其与读出器组合提供，用于可溶性电化学活性复合物的电化学测量。
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