CN1978661A - 一种快速从天然产物中筛选具有抗肿瘤活性物质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速从天然产物中筛选具有抗肿瘤活性物质的方法，旨在提供一种适用于抗肿瘤活性物质初期筛选和活性跟踪检测的需要，效率高、费用低的筛选方法。将胞内或胞外的萃取物或水相提取物过滤，收集粒径小于0.22μ的滤液，作为待测样品；将待测样品、酪氨酸激酶、酪氨酸激酶活力试剂盒底物、酪氨酸激酶活力试剂盒的缓冲液混合，按照试剂盒的常规方法进行操作，至酶反应结束，读取其吸光度值；将与待测样品相同的有机溶剂或除盐海水、酪氨酸激酶、酪氨酸激酶活力试剂盒底物、酪氨酸激酶活力试剂盒的缓冲液混合，采用相同的方法处理后读取其吸光度值，将两个吸光度值进行计算比较，判断是否存在抗肿瘤活性的物质。
Description
技术领域
本发明涉及一种快速从天然产物中筛选具有抗肿瘤活性物质的方法。
背景技术
恶性肿瘤是一类病因复杂又对人类危害广泛的疾病，是人类目前最难对付的顽症之一，亦是世界医学的一大难题。在以往20年间，人类为战胜恶性肿瘤付出了艰辛的努力，研制开发出许多抗肿瘤的药物。但是现在药物还远远不能满足人类战胜这一顽疾的需要，随着人们对生活质量的日益重视，开发低毒、更为有效的抗肿瘤药物的要求日益迫切。因此，具有抗肿瘤活性新药的开发与研制已成为近年来的重要课题。
天然产物，包括动植物，微生物，含有丰富的代谢产物，是发现和筛选抗肿瘤活性的来源，特别是近年从海洋生物如藻类中发现这类活性物质报道越来越多，使得从天然物质中研发抗癌药物成为关注的热点。由于藻类具有种类多、可再生性的特点，是一种取之不尽的药源物质，作为一种重要的生物资源越来越受到重视。但这些具有活性功能的物质往往含量微，用常规的筛选技术很难快速、敏捷的检测出来。
药物筛选是基于早期认识到恶性增殖是肿瘤的最大特征，因此细胞毒活性的筛选模型是常规的筛选方法，但由于细胞毒活性的研究较为繁琐，周期长，筛选通量受到一定程度的限制。并且，目前临床上常用的抗肿瘤药物主要是细胞毒类药物，这类抗癌药具有难以避免的选择性差、毒副作用强、易产生耐药性等缺点。近年来，随着生命科学研究的飞速进展，恶性肿瘤细胞内的信号转导、细胞周期的调节、细胞凋亡的诱导、血管生成以及细胞与胞外基质的相互作用等各种基本过程正在被逐步阐明，开始建立基于机理的筛选模型等。
基于机理的筛选模型，是与细胞恶变相关的蛋白分子如受体、酶或者直接以突变的基因为作用靶点进行设计。因而可以进行无细胞离体体系进行筛选，具有简便、灵敏、高通量的特点。酪氨酸蛋白激酶是一类具有酪氨酸激酶活性的蛋白质，它们能催化ATP上的磷酸基转移到许多重要蛋白质的酪氨酸残基上，使其发生磷酸化，调节着细胞体内生长、分化、死亡等一系列生理化过程，其功能的失调则会引发生物体内的一系列疾病，在细胞内的信号转导通路中占据了十分重要的地位。已有的资料表明，超过50％的原癌基因和癌基因产物都具有蛋白酪氨酸激酶活性，它们的异常表达将导致细胞增殖调节发生紊乱，进而导致肿瘤发生。此外，酪氨酸激酶的异常表达还与肿瘤的侵袭和转移，肿瘤新生血管的生成，肿瘤的化疗抗性密切相关，因此酪氨酸激酶是重要的机理筛选模型的靶酶。
目前，本发明采用的酪氨酸激酶试剂盒是一种基于机理筛选模型，无辐射快速灵敏的测定激酶活性的方法，它是无辐射快速灵敏的测定激酶活性的方法，但本试剂盒仅供研究试用，而非诊断使用。根据操作规程需要测试磷酸肽的标准曲线和激酶标准曲线，将实验结果与酪氨酸激酶活力标准曲线进行比较，从而判断酪氨酸激酶的活性。由于需要多次实验，需要使用多个试剂盒才能得到实验结果，实验费用高，不适用于抗肿瘤活性物质初期筛选和活性跟踪检测的需要。
发明内容
本发明是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种适用于抗肿瘤活性物质初期筛选和活性跟踪检测的需要，效率高、费用低的从天然产物中筛选具有抗肿瘤活性物质的方法。
本发明通过下述技术方案实现：
一种快速从天然产物中筛选具有抗肿瘤活性物质的方法，其特征在于，包括下述步骤：
步骤一：将来自天然产物胞内或胞外的有机溶剂萃取物或水相提取物过滤，收集粒径小于0.22μ的滤液，作为待测样品；
步骤二：将待测样品、蛋白浓度为1.3-1.7mg/ml的酪氨酸激酶、酪氨酸激酶活力试剂盒底物、酪氨酸激酶活力试剂盒的缓冲液按照体积比为1∶1∶1∶1的比例混合，制成待检测样品反应试剂混合物，再按照酪氨酸激酶试剂盒的常规方法进行操作，至酶反应结束，用酶标仪迅速读取该反应试剂混合物的吸光度值；同时将与待测样品相同的有机溶剂或除盐海水、与待测样品相同蛋白浓度的酪氨酸激酶、酪氨酸激酶活力试剂盒底物、酪氨酸激酶活力试剂盒的缓冲液按照体积比为1∶1∶1∶1的比例混合，制成溶剂对照混合物，再按照酪氨酸激酶试剂盒的常规方法进行操作，至酶反应结束，再与待检测样品反应试剂混合物相同波长的条件下用酶标仪迅速读取该溶剂对照混合物的吸光度值，将待检测样品反应试剂混合物的吸光度值与溶剂对照混合物的吸光度值进行计算比较，从而判断是否存在抗肿瘤活性的物质。
所述天然产物为藻胞内提取物，所述藻胞内提取物按照下述方法制备：称取藻粉，置研钵中，加入有机溶剂，研磨15min，转入分液漏斗，震荡、摇匀、静置8-12小时，萃取3次；收集合并上清液，并过滤去除藻胞碎片，将上述上清液经旋转蒸发浓缩，得到藻胞内提取物。
所述有机溶剂为乙酸乙酯或正戊醇。
所述天然产物为藻液胞外水相样品，所述藻液胞外水相样品按照下述方法制备：将处于对数期生长后期的藻液离心，取上清液，将其进行透析除盐，再浓缩至原体积的十分之一，得到藻胞外水相提取物。
将待检测样品反应试剂混合物的吸光度值与溶剂对照混合物的吸光度值进行比较，如果判断存在抗肿瘤活性的物质，则将该检测样品进行薄层层析，分离得到各个组分，再将各个组分采用与权利要求1相同的方法进行筛选，筛选后，对于有活性的组分继续用柱层析分离从而得到被分离纯化的活性物质。
所述酪氨酸激酶按照下述方法制备：市售鲜猪肝按照每1g与4ml预冷的溶解缓冲液混匀均质，12000×g，4℃离心10min，取上清液，即为酪氨酸激酶的粗提物。
本发明具有下述技术效果：
本发明的方法以酪氨酸激酶为靶点，利用酪氨酸激酶活力试剂盒和酪氨酸激酶，通过检测对激酶活性抑制程度的大小，来判断是否可能存在抗肿瘤活性的物质，方便快速，时间仅为2小时，灵敏度比细胞毒筛选模型高一个数量级，可直接用于制备薄板层析后的活性跟踪检测。而且，由于只需要对待测样品和溶剂对照，实验次数少，使用的试剂盒量小，实验效率高，实验费用低，适用于抗肿瘤活性物质初期筛选和活性跟踪检测的需要。
附图说明
图1为本发明的实验原理图；
图2为本发明实验的技术路线图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明详细说明。
酪氨酸激酶的试剂盒选用CHEMICON公司生产的产品，其提供的底物为10μg/ml肽，酪氨酸激酶试剂缓冲液的组成为50mmol/L Hepes pH7.2，含10mmol/L MgCl2、2mmol/L MnCl2、0.1mmol/L EDTA、0.4mmol/L EGTA、0.5mmol/L DTT、2.5mmol/L NaF、0.02％BSA小牛血清。测膜性PTK另含0.5％NP-40。
酪氨酸激酶、待检测样品采用常规方法提取。待检测样品可以是从微藻、微生物、动植物原材料等提取的有机溶剂萃取物或水相提取物。
式中OD(溶剂对照)为溶剂对照混合物的吸光度值，OD(样品)为同样波长的待检测样品反应试剂混合物的吸光度值，两次吸光度值进行比较，得到抑制率。
实施例1：
选用正戊醇萃取的球等鞭金藻(Isochrysis galbana 3011)胞内提取物为待测样品，从其中筛选抗肿瘤活性物质的方法如下：
1.提取酪氨酸激酶：市售鲜猪肝按照每1g与4ml预冷的溶解缓冲液混匀均质，12000×g，4℃离心10min，取上清液，即为酪氨酸激酶的粗提物，使用时用试剂盒的样品稀释液稀释至蛋白浓度为1.35mg/ml。
2.藻胞内提取物的制备：
称取1g球等鞭金藻3011干粉，置研钵中，加入20ml正戊醇研磨15min，转入分液漏斗，震荡、摇匀、静置8-12小时，萃取三次。收集合并上清液，并滤纸过滤去除藻胞碎片，置于烧杯中。上清液经旋转蒸发浓缩至1ml，之后过滤收集粒径小于0.22μ的滤液得到藻胞内提取物，作为球等鞭金藻3011胞内提取物待测样品。
3.用酪氨酸激酶试剂盒检测藻胞内提取物样品的抑制激酶的活性：
将球等鞭金藻3011胞内提取物待测样品10μl、蛋白浓度为1.35mg/ml的酪氨酸激酶10μl、酪氨酸激酶活力试剂盒底物10μl、酪氨酸激酶活力试剂盒的缓冲液10μl混合，制成待检测样品反应试剂混合物，再按照酪氨酸激酶试剂盒的常规方法进行操作，至酶反应结束，用酶标仪迅速读取该待检测样品反应试剂混合物的吸光度值。具体操作如下：
①.将上述待检测样品反应试剂混合物中加入10μl的5倍ATP/MgCl2溶液开始反应。
②.反应混合物的30℃培养期，40min。
③.加入10μl的激酶抑制剂120mM EDTA终止酶反应。
④.转移反应混合物至链蛋白酶抗生素包被的96孔板上，每孔50μl，且在37℃下培养30min。
⑤.用1倍冲洗缓冲液冲洗4遍。彻底地清洗板对消除背景来说很重要。从孔中移除液体最好的方法是将板迅速倒置使液体从孔中流出，然后将板印迹在干净的纸上。
⑥.在每个孔中加入200μl的阻断缓冲液，且在37℃下培养30min。
⑦.丢弃阻断缓冲液且在每个反应孔中加入100μl稀释的鼠源抗-PY20-HRP。在摇床室温培养1h。
⑧.根据上面第五步用1倍冲洗缓冲液冲洗4遍。
⑨.将TMB底物放置室温。在每孔中加入100μl的TMB底物，在室温下培养15min。
⑩.在每个孔中都加入终止反应液来停止酶反应。在波长为450nm的光照条件下用酶标仪迅速读取结果，其吸光度为0.743。
4.同时将正戊醇10μl、蛋白浓度为1.35mg/ml酪氨酸激酶10μl、酪氨酸激酶活力试剂盒底物10μl、酪氨酸激酶活力试剂盒的缓冲液10μl混合，制成溶剂对照混合物，再按照酪氨酸激酶试剂盒的常规方法进行操作，至酶反应结束，其实验方法与步骤①-⑩相同，在波长为450nm的光照条件下用酶标仪迅速读取结果，其吸光度为1.217。
根据抑制率的计算公式计算抑制率为38.9％。由此可以得出在正戊醇萃取的球等鞭金藻的提取物中，存在着抑制激酶抑制剂的活性物质，这种物质可能具有抑制肿瘤细胞生长的作用，将正戊醇提取物浓缩十倍，用常规的MTT方法检测HeLa细胞系得到的肿瘤细胞抑制率为51.21％，从而证明本实验筛选出具有抑制酶活性的组分确实具有抑制肿瘤细胞的潜力。使用细胞毒活性法筛选一般检测一个样品需要4～5天，本实验只需2h。而且添加样品浓度为细胞毒活性的筛选模型的十分之一，从而显示本实验方法具有简便易行，灵敏度高的优势。
由于球等鞭金藻3011胞内提取物中存在抗肿瘤活性的物质，则将该藻胞内提取物进行薄层层析，采用展开系统丙酮-石油醚(1∶60，v/v)，可展开得到4个组分，Rf值从上到下依次为0.9068、0.6610、0.6186和0.5169。采用本发明的上述筛选方法活性跟踪发现正戊醇萃取粗提物的4个组分之一(Rf 0.5169)有明显的抑制激酶活性。将该组分用硅胶柱层析，以丙酮-石油醚为洗脱剂进行再次分离，得到5个组分。再采用本发明的上述筛选方法检测，其中第4个组分其抑制激酶活性作用明显，抑制率为86.13％，因此很快地的锁定了目标活性物质。
实施例2
球等鞭金藻3011胞外水相为待测样品进行筛选的方法如下：
藻液胞外水相样品的制备：将处于对数生长后期的藻液离心，取上清，将其进行透析除盐，再浓缩至原体积的十分之一。之后过滤收集粒径小于0.22μ的滤液作为藻液胞外水相待测样品。
将藻胞外水相待测样品10μl、蛋白浓度为1.68mg/ml酪氨酸激酶10μl、酪氨酸激酶活力试剂盒底物10μl、酪氨酸激酶活力试剂盒的缓冲液10μl混合，制成待检测样品反应试剂混合物，再按照酪氨酸激酶试剂盒的常规方法进行操作，即实施例1中①-⑩的步骤，至酶反应结束，在波长450nm光照的条件下用酶标仪迅速读取该待检测样品反应试剂混合物的吸光度值为1.852。
同时将经除盐处理用于培养金藻3011的培养基即除盐海水10μl、蛋白浓度为1.68mg/ml酪氨酸激酶10μl、酪氨酸激酶活力试剂盒底物10μl、酪氨酸激酶活力试剂盒的缓冲液10μl混合，制成溶剂对照混合物，再按照酪氨酸激酶试剂盒的常规方法进行操作，至酶反应结束，其实验方法与实施例1步骤①-⑩相同，在波长为450nm的光照条件下用酶标仪迅速读取结果，其吸光度为1.822。
将该藻胞外水相待测样品吸光度与除盐海水的吸光度值对照，按照抑制率公式得出抑制率几乎为0，可以得出该藻胞外水相中没有抑制激酶活性的物质。
实施例3
选用乙酸乙酯萃取的球等鞭金藻H29(Isochrysis galbana H29)胞内提取物为待测样品，从其中筛选抗肿瘤活性物质的方法如下：
球等鞭金藻H29(Isochrysis galbana H29)胞内提取物使用乙酸乙酯有机溶剂萃取、浓缩至1ml，之后过滤收集粒径小于0.22μ的滤液作为藻胞内提取物待测样品。
将上述待测样品10μl、蛋白浓度为1.52mg/ml酪氨酸激酶10μl、酪氨酸激酶活力试剂盒底物10μl、酪氨酸激酶活力试剂盒的缓冲液10μl混合，制成待检测样品反应试剂混合物，再按照酪氨酸激酶试剂盒的常规方法进行操作，至酶反应结束，在波长450nm光照的条件下用酶标仪迅速读取该待检测样品反应试剂混合物的吸光度值为0.075。其它与实施例1相同，其对应的乙酸乙酯溶剂对照的吸光度值为0.877，按照抑制率的公式计算，抑制率为91.45％，因此在该藻粉的乙酸乙酯有机相中存在很强的激酶抑制活性的物质。对其萃取物的石油醚∶乙醚(1∶1，v/v)薄层层析所得到的5个分离组分(Rf值分别为0.4820、0.1325、0.5060、0.9398和0.9759)采用本发明的实施例1的筛选方法检测，其中Rf值为0.4820的分离组分对酪蛋白激酶的酶促反应有明显的抑制作用，其ΔOD值为0.670，抑制率为76.05％，说明此组分中含有酪蛋白激酶抑制剂的有效组分，所以对该分离组分再进行硅胶柱层析分离，分别采用5种洗脱剂(石油醚∶乙醚(1∶1，v/v)、石油醚∶乙醚(1∶3，v/v)、石油醚∶乙醚(1∶6，v/v)、乙醇和甲醇)洗脱并收集得到的5个组分，用此方法进行检测，其中用甲醇洗脱收集得到的组分相对而言对酪蛋白激酶的酶促反应有较强的抑制作用，其ΔOD值为0.672，抑制率为76.80％，对该组分进一步分离纯化，可以筛选出具有抗肿瘤作用的生物活性物质。
本发明的方法利用激酶(从猪肝中提取的粗酶制剂)将磷酸基团偶联在预先制备的个短肽上，磷酸化的短肽与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的抗磷酸酪氨酸单抗偶联，发生显色反应。藻类中的有机溶剂萃取物中含有激酶抑制剂，就不发生显色反应/抑制显色反应，建立了一套藻类抗肿瘤活性物质的筛选方法，本发明快速便捷，只需要2个小时。
Claims (6)
1、一种快速从天然产物中筛选具有抗肿瘤活性物质的方法，其特征在于，包括下述步骤：
步骤一：将来自天然产物胞内或胞外的有机溶剂萃取物或水相提取物过滤，收集粒径小于0.22μ的滤液，作为待测样品；
步骤二：将待测样品、蛋白浓度为1.3-1.7mg/ml的酪氨酸激酶、酪氨酸激酶活力试剂盒底物、酪氨酸激酶活力试剂盒的缓冲液按照体积比为1∶1∶1∶1的比例混合，制成待检测样品反应试剂混合物，再按照酪氨酸激酶试剂盒的常规方法进行操作，至酶反应结束，用酶标仪迅速读取该反应试剂混合物的吸光度值；同时将与待测样品相同的有机溶剂或除盐海水、与待测样品相同蛋白浓度的酪氨酸激酶、酪氨酸激酶活力试剂盒底物、酪氨酸激酶活力试剂盒的缓冲液按照体积比为1∶1∶1∶1的比例混合，制成溶剂对照混合物，再按照酪氨酸激酶试剂盒的常规方法进行操作，至酶反应结束，再与待检测样品反应试剂混合物相同波长的条件下用酶标仪迅速读取该溶剂对照混合物的吸光度值，将待检测样品反应试剂混合物的吸光度值与溶剂对照混合物的吸光度值进行计算比较，从而判断是否存在抗肿瘤活性的物质。
2、根据权利要求1所述的快速从天然产物中筛选具有抗肿瘤活性物质的方法，其特征在于，所述天然产物为藻胞内提取物，所述藻胞内提取物按照下述方法制备：称取藻粉，置研钵中，加入有机溶剂，研磨15min，转入分液漏斗，震荡、摇匀、静置8-12小时，萃取3次；收集合并上清液，并过滤去除藻胞碎片，将上述上清液经旋转蒸发浓缩，得到藻胞内提取物。
3、根据权利要求2所述的快速从天然产物中筛选具有抗肿瘤活性物质的方法，其特征在于，所述有机溶剂为乙酸乙酯或正戊醇。
4、根据权利要求1所述的快速从天然产物中筛选具有抗肿瘤活性物质的方法，其特征在于，所述天然产物为藻液胞外水相样品，所述藻液胞外水相样品按照下述方法制备：将处于对数期生长后期的藻液离心，取上清液，将其进行透析除盐，再浓缩至原体积的十分之一，得到藻胞外水相提取物。
5、根据权利要求1所述的快速从天然产物中筛选具有抗肿瘤活性物质的方法，其特征在于，将待检测样品反应试剂混合物的吸光度值与溶剂对照混合物的吸光度值进行比较，如果判断存在抗肿瘤活性的物质，则将该检测样品进行薄层层析，分离得到各个组分，再将各个组分采用与权利要求1相同的方法进行筛选，筛选后，对于有活性的组分继续用柱层析分离从而得到被分离纯化的活性物质。
6、根据权利要求1所述的快速从天然产物中筛选具有抗肿瘤活性物质的方法，其特征在于，所述酪氨酸激酶按照下述方法制备：市售鲜猪肝按照每1g与4ml预冷的溶解缓冲液混匀均质，12000×g，4℃离心10min，取上清液，即为酪氨酸激酶的粗提物。
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| GR01 | Patent grant | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Assignee: Tianjin Xuanzhen Biomedical Technology Development Co., Ltd. Assignor: Tianjin University Of Commerce Contract record no.: 2012120000022 Denomination of invention: Method for quickly screening anti-tumour active substance from natural product Granted publication date: 20090729 License type: Exclusive License Open date: 20070613 Record date: 20120406 |
|
| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20090729 Termination date: 20111219 |