CN1976681A - 可磁性靶向丝裂霉素c组合物及其使用方法 - Google Patents

可磁性靶向丝裂霉素c组合物及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及包含丝裂霉素C和优异的可磁性靶向载体颗粒的组合物以及递送所述组合物的方法。由于所述组合物是可磁性靶向的，因此它们的使用可以将丝裂霉素C定位于患者体内的特定部位。这可以增加丝裂霉素C在患者中的有效浓度或减少丝裂霉素C的全身接触。

Description

可磁性靶向丝裂霉素C组合物及其使用方法
发明领域
本发明涉及包含丝裂霉素C的可磁性靶向载体颗粒的优异组合物，包含丝裂霉素C的可磁性靶向载体颗粒的制备方法以及递送方法。
发明背景
迄今为止，已提出和/或利用金属载体组合物治疗各种病症(参见例如1989年7月18日授予Lieberman等的美国专利4,849,209以及1978年8月15日授予Gordon的4,106,488)，且这些金属载体组合物含有对外部施加的磁场反应而在体内被引导或控制的组合物(参见例如美国专利4,501,726(1985年2月26日授予Schroder等)、4,652,257(1987年3月24日授予Chang)以及4,690,130(1987年9月1日授予Mirell))。已证明这些组合物不总是实用和/或完全有效。例如这些组合物可能没有足够的能力将期望的生物活性物质运至治疗部位，磁化率低于期望水平和/或难于制备、储存和/或使用。如所证明的，前述这些尝试没有一个达到商业使用。
一种已知的可通过血管内注射递送的这种组合物包含由被生物相容的聚合物(白蛋白、明胶和多糖)覆盖的铁磁性成分组成的微球，其还含有药物(Driscol C.F.等，Prog.Am.Assoc.Cancer Res.，1980，p.261)。
可能制备粒径达到3.0μm的白蛋白微球，其含有磁性物质(磁铁矿Fe3O4)和抗肿瘤抗生素阿霉素(Widder K.等，J.Pharm.Sci.，68：79-821979)。通过白蛋白在乳剂(油包水)中的热变性和/或化学变性来制备这种微球，其具有含有于药用溶液中的磁铁矿悬浮液的水相。已使用相似的技术制备磁性控制或引导的含有抗生素丝裂霉素C的由乙基纤维素覆盖的微胶囊(Fujimoto S.等，Cancer，56：2404-2410，1985)。
另一种方法用以制备磁性控制的粒径为200nm至800nm的脂质体，其带有能溶解动脉粥样硬化形成物的制剂。该方法基于磷脂在水存在下形成闭合膜结构的能力(Gregoriadis G.，Ryman B.E.，Biochem.J.，124：58，1971)。
对于上述组合物的控制需要极高通量密度磁场，而且在工业规模上一致地制备、杀菌且储存而不改变它们的指定性质有些困难。
为克服这些缺点，已提出一种制备磁控分散体的方法(参见Kholodov L. E.，Volkonsky V.A.，Kolesnik N.F.等的欧洲专利公开0451 299A1)，其使用铁碳颗粒作为铁磁性物质。通过在含氧气氛中将粒径为100μm至500μm的铁粉在800-1200℃温度下加热来制备铁碳颗粒。然后在400-700℃下用一氧化碳处理所述混合物直至10-90％质量的碳颗粒开始在表面上出现。然后将生物活性物质吸附在所述颗粒上。
这一制备铁碳颗粒的方法相当复杂，且需要大量的能量。因为铁磁性成分由于在含氧气氛中在高温下铁碳颗粒的合成而被氧化，所以与金属铁相比，所得分散体的磁化率平均降低一半。生物活性物质吸附在这些颗粒上的上限通常为铁磁性颗粒质量的约2.0％-2.5％。
上述方法制备的磁控颗粒具有球形铁磁性成分和从其上伸出的线状碳链，所述磁控颗粒的粒径通常为2.0μm。认为该结构决定了该复合物的吸附能力较低，并也导致在储存和运输中脆弱的线状碳链从铁磁性成分上断裂下来。
丝裂霉素C(MMC)是一种公认的经FDA批准的抗肿瘤药物。其临床活性谱广，安全性和功效特征均十分明确。MMC对快速生长的各种组织特别有效，对多种癌症具有细胞毒性活性。通常单独使用或与其它活性剂组合使用用于治疗非小细胞肺癌(NSCLC)以及乳癌、胃癌、胰腺癌、肝癌和宫颈癌。虽然MMC未被批准用于治疗NSCLC，但文献研究表明一些NSCLC患者对MMC治疗确有客观反应。MMC对整个细胞周期都有效，已有文献表明对肺部癌症具有功效(Wasserman等，Cancer Chemotherapy，3：399-419，1975)，但不幸的是，当经静脉内递送时有严重副作用特征(Spain，Oncology 1993，50Suppl1：35-50，1993)。
MMC静脉内递送因其全身毒性而受到限制。具体而言，观察到的不良反应有骨髓毒性、溶血性尿毒症综合征、肾毒性、肺毒性和心脏毒性。尽管所有这些都可能是严重问题，但是诱发肺毒性的可能性建议本领域技术人员避免将丝裂霉素C引入肺动脉中。
接受全身MMC的患者出现各种不期望的不良反应，包括骨髓抑制、恶心、呕吐、发烧和食欲消退。其它副作用可能包括头痛、视力模糊、精神错乱、困倦、晕厥、疲劳、水肿、血栓性静脉炎、咯血、腹泻、疼痛、不适和虚弱。膀胱内给药有报导发生膀胱纤维化/收缩。
因此，仍然需要有效的生物相容的组合物，所述组合物能通过磁性运输且相对容易地被制备、储存和使用。此外，仍需要找到将MMC递送至靶区域并使该药物的副作用降至最小的方法。以下所示的实施方案满足这些需要而且还提供了其它的优点。
发明内容
以下带有编号的段落描述了本发明的一些方面：
1.一种可磁性靶向载体组合物，其包含活性炭和铁的复合颗粒，其中所述碳随机分布于整个颗粒体积中，其中每个颗粒中含有的铁与活性炭的重量比为约95∶5至约50∶50，且其中每个颗粒中含有的丝裂霉素C与碳和铁总重量的重量比为约1∶100至约20∶100。
2.第1段的可磁性靶向载体组合物，其中丝裂霉素C与碳和铁总重量的重量比为约1∶100至约10∶100。
3.第1段的可磁性靶向载体组合物，其中丝裂霉素C与碳和铁总重量的重量比为约5∶100。
4.第1段的可磁性靶向载体组合物，其中所述颗粒的平均粒径小于5μm。
5.第1段的可磁性靶向载体组合物，其中所述磁性组合物中所述颗粒的平均粒径为约0.1μm至约20μm。
6.第1段的可磁性靶向载体组合物，其中所述颗粒的平均粒径为约0.5μm至约5μm。
7.第1段的可磁性靶向载体组合物，其中约95％颗粒的主要尺寸(major dimension)为约0.5μm至约5μm。
8.第1段的可磁性靶向载体组合物，其中所述活性炭选自NoritA、B、E和K和它们的化学修饰体及组合。
9.第1段的可磁性靶向载体组合物，其中所述活性炭是KB型碳。
10.第8或9段的可磁性靶向载体组合物，其中所述铁与活性炭的重量比为约85∶15至约60∶40。
11.第8或9段的可磁性靶向载体组合物，其中所述铁∶碳比例为86∶14至64∶36。
12.第8或9段的可磁性靶向载体组合物，其中所述铁∶碳比例为65％∶35％。
13.第1、8或9段的可磁性靶向载体组合物，其中所述铁含有约低于5％的氧化铁。
14.第8或9段的可磁性靶向载体组合物，其中所述颗粒的平均粒径为约0.6至约3.5微米。
15.第1段的可磁性靶向载体组合物，其中所述颗粒对其它生物活性物质的吸附能力达到所述颗粒质量的20％。
16.第1段的可磁性靶向载体组合物，其中复合颗粒具有吸附于其上的治疗有效量的其它生物活性物质，所述生物活性物质不同于丝裂霉素C，且所述碳是活性炭。
17.第16段的可磁性靶向载体组合物，其中所述其它生物活性物质选自药物、放射性物质、遗传物质或其组合。
18.第16段的可磁性靶向载体组合物，其中一种或多种其它生物活性物质选自抗生素、抗真菌剂和其它抗肿瘤剂。
19.第1段的可磁性靶向载体组合物，其中所述复合颗粒具有吸附于其上的诊断有效量的其它生物活性物质。
20.一种可磁性靶向载体组合物和丝裂霉素C的制剂，其中所述制剂包含：
第1段的可磁性靶向载体组合物；
递送载体。
21.第20段的制剂，其中丝裂霉素C在吸附于可磁性靶向载体上之前的浓度为约0.5至约1mg/mL。
22.第20段的制剂，其中丝裂霉素C在吸附于可磁性靶向载体上之前的浓度为约0.75mg/mL。
23.第20段的制剂，其中所述制剂中含有赋形剂。
24.第23段的制剂，其中所述赋形剂是甘露糖醇。
25.第23段的制剂，其中所述赋形剂的浓度为终制剂重量的约5％至约10％。
26.第25段的制剂，其中所述赋形剂的浓度为约6.7％。
27.第20段的制剂，其中所述递送载体包含：
盐；
聚合物；和
溶剂。
28.第27段的制剂，其中所述糖是甘露糖醇。
29.第27段的制剂，其中甘露糖醇的浓度为100mg/mL。
30.第27段的制剂，其中所述聚合物是羧甲基纤维素。
31第27段的制剂，其中所述羧甲基纤维素的浓度为3mg/mL。
32.第27段的制剂，其中所述递送载体包含甘露糖醇、羧甲基纤维素和水。
33.第27段的制剂，其中所述递送载体包含约100mg甘露糖醇、约3mg羧甲基纤维素和约897mg水。
34.第27段的制剂，其中所述递送载体包含溶液，所述溶液当经布鲁克菲尔德粘度计在40℃和60rpm下测定时粘度为约14±2cP。
本发明涉及包含丝裂霉素C(MMC)和优异的可磁性靶向载体的组合物及递送所述组合物的方法。由于该组合物是可磁性靶向的，它们的使用可以将丝裂霉素C定位于患者体内的特定部位。这可以增加丝裂霉素C在患者中的有效浓度或减少丝裂霉素C的全身接触。
在一个实施方案中，涉及包含活性炭和铁的复合颗粒的可磁性靶向载体组合物。在该实施方案中，所述颗粒的特征是其中所述碳随机分布于整个颗粒体积中，铁与活性炭的重量比为约95∶5至约50∶50，且丝裂霉素C与碳和铁总重量的重量比为约1∶100至约20∶100。
在另一个实施方案中，涉及可磁性靶向载体和丝裂霉素C的制剂。所述制剂包含可磁性靶向载体、一定量的丝裂霉素C和递送载体，其中所述丝裂霉素C主要与可磁性靶向载体结合。
另一个实施方案包括用于将生物活性物质给予患者体内位点的试剂盒，所述试剂盒包括：第一容器，其包含单元剂量的主要尺寸为0.1-5μm的干燥铁碳颗粒，每个颗粒中铁与活性炭的比例为约95∶5至约50∶50，所述碳与铁形成复合物；一种或多种干燥赋形剂，其量为当在溶液中时促进所述生物活性物质吸附于所述颗粒；和一定量的丝裂霉素C，其吸附于所述颗粒上。
另外的实施方案包括用于将抗肿瘤药递送至患者组织的方法，所述方法包括：将包含活性炭和铁复合颗粒的组合物给予患者，其中所述碳随机分布于整个颗粒体积中，其中每个颗粒中含有的铁与活性炭的重量比为95∶5至约50∶50，其中每个颗粒中含有的丝裂霉素C与碳和铁总重量的重量比为约1∶100至约20∶100；和通过使用长度为足以将药物递送至需要治疗的组织的一段时间的磁场来定位所述组合物在患者体内的分布；上述方法，其中要治疗的组织选自肺、肝和胰腺；上述方法，其中通过选自以下的方法引入所述组合物：注射、输注、植入和摄入；上述方法，其中将所述可磁性靶向载体和MMC的组合物通过动脉，优选肺动脉、支气管动脉、肝动脉或股动脉给予组织；上述方法，其中由于丝裂霉素C附着在可磁性靶向载体上，因此MMC在循环中的浓度降低；和上述方法，其中可磁性靶向载体经动脉内给药。
其它实施方案包括上述方法，其中给予患者的所述组合物还包含递送载体；上述方法，其中丝裂霉素C与碳和铁总重量的重量比为约5∶100；上述方法，其还包括引入栓塞剂；上述方法，其中所述组合物以单元剂型形式给药；上述方法，其中所述活性炭选自A、B、E、K型，特别是KB型和它们的化学修饰体及组合；上述方法，其中所述组合物中丝裂霉素C与铁和碳总重量的重量比为约5∶100。
其它实施方案包括抑制癌症的方法，所述方法包括：将包含活性炭、丝裂霉素C和金属铁的可磁性靶向颗粒的组合物给予需要抑制癌症的组织；和通过使用磁场将所述组合物定位于癌症；和上述方法，其中所述癌症是非小细胞肺癌、胰腺癌、肝癌、肉瘤、胃癌、乳癌或子宫癌。
其它实施方案包括抑制癌症的方法，所述方法包括：将包含活性炭、丝裂霉素C和金属铁的可磁性靶向颗粒的组合物给予需要抑制癌症的组织；和通过使用磁场将所述组合物定位于患者中的癌症；其中如果所述组合物中的丝裂霉素C的量分布在整个血液循环中则该量不足以充分治疗癌症，但是如果被磁场浓缩至癌症部位则该量足以充分治疗癌症。
另一实施方案包括用于将抗瘢痕药递送至患者组织中的方法，所述方法包括：将包含活性炭和铁的复合颗粒的组合物给予患者，其中所述碳随机分布于整个颗粒体积中，其中每个颗粒中含有的铁与活性炭的重量比为约95∶5至约50∶50，且其中每个颗粒中含有的丝裂霉素C与碳和铁总重量的重量比为约1∶100至约20∶100；和通过使用长度为足以将药物递送至需要治疗的组织的一段时间的磁场来定位所述组合物在患者体内的分布。
其它实施方案包括将丝裂霉素C递送至患者体内期望部位的方法，所述方法包括：将包含活性炭和铁的复合颗粒的组合物给予患者，其中所述碳随机分布于整个颗粒体积中，其中每个颗粒中含有的铁与活性炭的重量比为约95∶5至约50∶50，且其中每个颗粒中含有的丝裂霉素C与碳和铁总重量的重量比为约1∶99至约20∶80；和通过患者体内期望的部位使用磁场定位所述组合物在患者中的分布；上述方法，其中所述活性炭选自A、B、E、K和KB型和它们的化学修饰体及组合。
另一个实施方案包括减少丝裂霉素C在患者中全身接触的方法，所述方法包括：将包含活性炭和铁的复合颗粒的组合物给予患者，其中所述碳随机分布于整个颗粒体积中，其中每个颗粒中含有的铁与活性炭的重量比为约95∶5至约50∶50，且其中每个颗粒中含有的丝裂霉素C与碳和铁总重量的重量比为约1∶100至约20∶100；和通过将磁场用于患者的某一部位以定位所述组合物在患者中的分布来减少患者中相对健康组织对丝裂霉素C的全身接触；在一个实施方案中，所述患者需要用丝裂霉素C治疗；在另一个实施方案中，所述患者需要治疗癌症。
其它实施方案包括制备包含丝裂霉素C的可磁性靶向载体的方法，所述方法包括：制备能够吸附丝裂霉素C的可磁性靶向载体；制备一定量的丝裂霉素C；将丝裂霉素C与可磁性靶向载体混合；将丝裂霉素C与可磁性靶向载体一起温育约5至约60分钟；上述方法，其中当丝裂霉素C与可磁性靶向载体混合时丝裂霉素C在溶液中；上述方法，其中所述温育时间为约30分钟；上述方法，其还包括从丝裂霉素C与可磁性靶向载体的组合中除去多余的、未结合的丝裂霉素C的步骤；上述方法，其还包括向悬浮液中加入其它赋形剂；上述方法，其还包括将所得制剂冻干；上述方法，其还包括将冻干的制剂置于容器中，并充入气体以除去容器中其余部分的其它气体；和任选将容器密封；和上述方法，其中所述可磁性靶向载体包含活性炭和铁的复合颗粒，其中所述碳随机分布于整个颗粒体积中，其中所述碳选自A、B、E、K和KB型，其中每个颗粒中含有的铁与活性炭的重量比为约95∶5至约50∶50，且其中每个颗粒中含有的丝裂霉素C与碳和铁总重量的重量比为约1∶100至约20∶100。
附图简述
图1是可磁性靶向载体颗粒的横截面图示。
图2是表示一个制备可磁性靶向载体颗粒的实施方案的流程图。
图3是表示一个制备可磁性靶向载体颗粒的实施方案的流程图。
图4是表示可磁性靶向载体颗粒的粒径分布图。
图5表示一个批次的可磁性靶向载体颗粒的磁化率和磁滞图。
图6是可磁性靶向载体颗粒的1000倍放大电子显微照片。
图7是可磁性靶向载体颗粒的2500倍放大电子显微照片。
图8是可磁性靶向载体颗粒的4000倍放大电子显微照片。
图9是可磁性靶向载体颗粒的10000倍放大扫描电子显微照片。
图10是可磁性靶向载体颗粒的16000倍放大扫描电子显微照片。
图11是可磁性靶向载体颗粒的100000倍放大扫描电子显微照片。
图12是表示水蒸气吸附等温线图。
图13是表示可磁性靶向载体-MMC颗粒注射制剂的实施方案的流程图。
图14表示结合上清液和丝裂霉素储备液中剩余的丝裂霉素C浓度对时间的图(N＝3，平均值±SD)。
图15表示不同的可磁性靶向载体颗粒浓度下人血浆中丝裂霉素C的解吸。
图16表示MMC的细胞存活率图。
图17是显示肺血管直径的预处理选择性血管造影照片。
图18是其中左肺动脉插管并选择分支进行输注的预处理选择性血管造影照片。
图19是其中左肺动脉插管并选择分支进行高剂量可磁性靶向载体-MMC颗粒输注的预处理选择性血管造影照片。
图20是第二次输注高剂量可磁性靶向载体-MMC颗粒(总剂量为80mg可磁性靶向载体颗粒和4mg MMC)后的后处理选择性血管造影照片。在血管造影照片右侧可见磁铁及其在皮肤表面上的位置。可见侧面实质增强的块状缺失，并有相邻外周轻度削减。
图21是显示递送含有80mg可磁性靶向载体颗粒和4mg MMC的高剂量可磁性靶向载体-MMC颗粒后28日，在猪的靶肺叶中损伤内部具有可磁性靶向载体颗粒的肺部肉芽肿的照片。
图22是显示磁性靶向递送可磁性靶向载体颗粒后28日，猪的靶肺叶中血管周围可磁性靶向载体颗粒的照片。
图23是显示磁性靶向递送可磁性靶向载体颗粒后28日，猪的靶肺叶的肺泡毛细血管中可磁性靶向载体颗粒的照片。
具体实施方式
通过靶向药物递送进行的局部治疗可能通过增加肿瘤内的药物浓度并同时限制产生全身毒性的全身药物浓度而具有改善功效的可能。用于药物递送的磁性靶向载体(MTC)颗粒(或简称为同义词磁性靶向载体)的使用旨在通过选择性插管和向期望的位点直接施加磁场使药物靶向于特定的位点，从而通过可磁性靶向载体颗粒在感兴趣区域的保留而实现高浓度定位药物的延长释放。
在一个实施方案中，在外部施加的磁场存在下可磁性靶向载体颗粒经动脉内递送至期望的位点，所述磁场通过可磁性靶向载体颗粒外渗至该周围组织中以帮助可磁性靶向载体颗粒定位并保留于靶点(Goodwin等，J Magnetism and Magnetic Materials，194：132-139，1999)。迄今为止，用另一种磁性靶向研究药物-可磁性靶向载体-MMC颗粒进行的临床研究表明磁性靶向载体颗粒与阿霉素联合可以给予患有肝细胞癌的患者(the American Society of Clinical Oncology，2001报告)。这些研究还表明磁铁能够持久地将药物定位于肝脏肿瘤，结果阿霉素在全身血液中的水平没有检测到。本发明的公开内容进一步发现丝裂霉素C也可以与可磁性靶向载体颗粒以有益的方式结合并用于将相对高剂量的丝裂霉素递送至需要治疗的患者的相对定位区域。
所述可磁性靶向载体颗粒是可磁性控制或引导的，该实施方案的载体组合物包含复合的、体积混合的平均主要尺寸为约0.1μm至约5.0μm，优选约0.5μm至约5.0μm的铁碳颗粒，其含有约1.0％至约95.0％质量的碳，例如约10-60％质量的碳。约15％至约40％是碳的优选范围，已发现该范围在许多应用中都表现有用的特征。
在不施加外部热量的情况下将铁粉和碳粉的混合物机械碾磨来制备可磁性靶向载体颗粒。然后可以将如此获得的复合铁碳可磁性靶向载体颗粒置于生物活性物质的溶液中使该生物活性物质吸附至可磁性靶向载体颗粒上。将可磁性靶向载体颗粒按期望的粒径和磁化率特征分离。可磁性靶向载体颗粒的分离可以在接触所述生物活性物质之前或之后进行。
通过一个实施方案的方法制备的铁碳可磁性靶向载体颗粒大致为球形，精细形态不规则，碳沉积物内含物分布在每个可磁性靶向载体颗粒的整个体积(在每个可磁性靶向载体颗粒的表面和内部)中，如下面图1和6-10所更详细描述。因此，所述碳基本随机分布在整个可磁性靶向载体颗粒体积中。在该磁控组合物的长期储存、运输、保存、包装和直接使用中组分间的强连接不会破坏。铁与碳之间可能发生化学键合，例如在碾磨过程中形成微量的渗碳体(Fe3C)夹层或其它碳化铁。
在外部磁场的控制下铁碳可磁性靶向载体颗粒可作为载体用于将MMC和任选一种或多种被吸附的生物活性物质递送至机体的特定位点。本文使用的术语“生物活性物质”包括可用于体内医学诊断和/或治疗的物质。在另一个实施方案中，丝裂霉素C用于防治其中可磁性靶向载体颗粒定位的组织或相关组织的任何瘢痕形成，且第二生物活性成分可以与癌症治疗无关。(参见例如Wilkins M，Indar A，Wormald R.，Intra-operative Mitomycin C for glaucoma surgery(Cochrane Review)，在The Cochrane Library，Issue 1，2004.Chichester，UK：John Wiley & Sons，Ltd.a discussion of mitomycin C in preventingscarring中)。
一般而言，除丝裂霉素C以外，任何其它有用的诊断性和/或治疗性生物活性物质也都可以附着于所述可磁性靶向载体颗粒，被引导递送至靶点。术语“生物活性的”也包括用于诊断目的和没有明显生理、治疗作用的活性剂。也包括既有诊断性质又有治疗性质的双功能活性剂。能够沉淀、吸附或标记在可磁性靶向载体颗粒上的生物活性物质包括例如但不限于毒蕈碱性受体激动剂和拮抗剂；抗胆碱酯酶药；儿茶酚胺、拟交感神经药和肾上腺素能受体拮抗剂；5-羟色胺受体激动剂和拮抗剂；局部和全身麻醉药；抗偏头痛药如麦角胺、咖啡因、舒马普坦等；抗癫痫药物；治疗中枢神经系统退行性病症的药物；阿片类镇痛药和拮抗剂；抗炎药，包括平喘药；组胺和缓激肽拮抗剂；脂质衍生的自泌物(autocoid)；非甾体抗炎药和抗痛风药；抗利尿药如加压素肽；肾素-血管紧张素系统抑制剂如血管紧张素转化酶抑制剂；用于治疗心肌缺血的药物如有机硝酸酯、Ca2+通道拮抗剂、β肾上腺受体拮抗剂和抗血小板剂/抗凝血药；抗高血压药如利尿剂、血管扩张剂、Ca2+通道拮抗剂及β肾上腺受体拮抗剂；强心苷类如地高辛及磷酸二酯酶抑制剂、抗心律失常药；抗高脂蛋白血症药；控制胃酸和治疗胃溃疡的药物；影响胃肠道水通量和运动性的药物；引起子宫收缩或舒张的药物；抗原生动物剂；驱肠虫药；抗微生物剂如磺胺类、喹啉类、甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲基异噁唑；β内酰胺类抗生素；氨基糖甙类；四环素类；红霉素及其衍生物；氯霉素、用于结核、鸟分枝杆菌复合型疾病和麻风病化疗的药物；抗真菌药；抗病毒药；抗肿瘤药如烷化剂和抗代谢药；天然产物如长春花碱、抗生素(如阿霉素、博来霉素等)；酶(如L-天门冬酰胺酶)、生物反应调节剂(如干扰素α)；铂配位化合物、蒽二酮和其它多种药物；以及激素及拈抗剂(如雌激素、孕激素和肾上腺皮质类固醇)和抗体；免疫调节剂，包括免疫抑制剂和免疫刺激剂；造血生长因子、抗凝血剂、溶栓剂和抗血小板剂；甲状腺激素、抗甲状腺药、雄激素受体拮抗剂；肾上腺皮质类固醇、胰岛素、口服降血糖药、影响钙化和骨转化的药物以及其它治疗和诊断激素、维生素、矿物质血液制品生物反应调节剂、诊断成像剂以及顺磁性和放射性分子或颗粒。其它生物活性物质还可以包括但不限于单克隆抗体或其它抗体、天然或合成遗传物质以及前药。
本文使用的术语“遗传物质”一般是指核苷酸和多核苷酸，包括来源于天然或合成的核酸、RNA和DNA，包括重组的正义和反义RNA和DNA。遗传物质的类型可以包括例如表达载体如质粒、噬菌粒、粘粒、酵母人工染色体和缺陷病毒(辅助病毒)、反义核酸、单链和双链RNA和DNA及其类似物上携带的基因。还包括蛋白质、肽和遗传物质表达形成的其它分子。
除递送治疗量的MMC之外，本发明的可磁性靶向载体颗粒还可用于体内诊断成像，可获得的检测仪器的类型是选择给定放射性同位素的主要影响因素。所选择的放射性同位素的衰变类型应该用给定类型的仪器检测到。一般而言需要γ射线。选择放射性同位素的另一个重要因素是其半衰期应足够长，使得在靶最大摄取时间时其仍然可以检测到，但是其半衰期也应足够短，使得对受者的放射性伤害降至最低。选择适当的放射性同位素对于本领域技术人员而言将是十分清楚的。可以使用的放射性同位素包括但不限于99mTc、142Pr、161Tb、186Re和188Re。此外，其它可诊断性使用的化合物的典型实例是金属离子，包括但不限于111In、97Ru、67Ga、68Ga、72As、89Zr和201TI。此外，在磁共振成像技术和电子自旋共振技术中特别有用的顺磁性元素包括但不限于157Gd、55Mn、162Dy、52Cr和56Fe。
生物活性物质如放射性同位素是发射用于诊断和/或治疗目的的α、β或γ射线的化学剂或元素。在选择合适的放射性同位素时考虑的一个因素是其半衰期应足够长，使得在靶最大摄取时间时其仍然可以检测到，但是其半衰期也应足够短，使得对患者的放射性伤害降至最低。选择适当的放射性同位素对于本领域技术人员而言将是十分清楚的。一般而言，认为α、β射线对局部治疗有用。有用的活性剂的实例包括但不限于32P、55Co、56Co、57Ni、186Re、188Re、123I、125I、131I、90Y、166HO、153Sm、143Pr、149Tb、161Tb、111In、77Br、214Bi、213Bi、224Ra、210Po、195mPt、165Dy、109Pd、117mSn、123mTe、103Pd、177Lu和211At。放射性同位素通常以于盐中的基团的形式存在，但碘是值得注意的例外。有用的诊断和治疗性放射性同位素可以单独使用或组合使用。
作为一般的原则，可以通过将在可磁性靶向载体颗粒中的碳的比例提高至最高达到该可磁性靶向载体颗粒质量的约40％来增加任何水溶性生物活性物质或吸附的生物活性物质的量，而不失去可磁性靶向载体颗粒在本申请中描述的治疗方案中的利用。在很多情况下观察到吸附的生物活性物质的量的增加与碳含量的增加大约成线性关系。但是，随着碳含量的增加，可磁性靶向载体颗粒对磁场的磁化率或响应性下降，因此(虽然吸附能力增强)但是对在体内控制它们的条件变差。因此，有必要达到铁∶碳比例的平衡以获得改善的治疗或诊断效果。在治疗方案中为增加给定活性剂的量，可以将较大剂量的可磁性靶向载体颗粒给予患者，但这些颗粒不由于剂量增加而有增大的磁性。本领域技术人员在本发明公开内容的启发下可以确定适当的比例。
作为一般的原则，已确定的用于如本申请所述的体内治疗的可磁性靶向载体颗粒的铁∶碳比例的有用范围为约95∶5至约50∶50，例如约85∶15至约60∶40。可吸附于具有任何给定浓度的碳的复合铁碳可磁性靶向载体颗粒的生物活性物质的最大量也将是不同的，其取决于生物活性物质的化学性质并且在有些情况下取决于组合物中使用的碳的类型(例如活性炭(AC)。
生物活性物质的吸附受其溶于其中的溶液的性质，即该物质本身的浓度、pH、离子强度、张力、疏水指数和温度的影响。可以加入赋形剂以改变这些溶液性质中的一些，以有助于生物活性物质的溶解或促使其吸附于颗粒上。使用表面活性剂和溶剂、调节酸碱pH以及升高温度或加入能量如用超声可以增加溶解。通过增加亲水性、加入糖、盐或聚合物、升高或降低温度、中性pH以及与所涉及的特定化学相关的其它因素可能有利于对可磁性靶向载体颗粒的吸附。由于提高溶解度和增强颗粒吸附这两个目的常常互相对抗，因此同时实现两者的方法对于制剂的设计是重要的，其将取决于产品的特定化学和药物递送目标的具体情况。
可磁性靶向载体悬液在给予患者之前必须保持耐聚集。不期望颗粒发生不可逆的聚集，因为聚集物可阻断流向疾病位点的血流，迅速从悬液中析出或导致生物活性物质在制备中或在疾病位点处分布不均匀。聚合物、糖和表面活性剂可用于抑制可磁性靶向载体颗粒的聚集，但必须选择合适的类型和正确的浓度以避免干扰前述的溶解和吸附的目的。
此外，特别感兴趣的是，实施例1例示用于将丝裂霉素C吸附至可磁性靶向载体颗粒上的所述可磁性靶向载体颗粒的制备。通过这些实施方案的方法，丝裂霉素C被吸附至含有铁∶碳比例分别为64-86重量％比36-14重量％的可磁性靶向载体颗粒上。在一个实施方案中，使用的碳类型是KB型。在本发明公开内容的教导下使用对本领域技术人员而言将是显而易见的相似技术也可以吸附或额外吸附其它生物活性物质。铁与碳的每一比例以及生物活性物质与铁碳总量的比例都可以自成一项发明。没有本发明的公开，可能很难或无法预先确定碳与铁的正确平衡。每种组分的相对量、各组分如何组合、各组分的形状、各组分的大小都可能影响生物活性物质的结合能力。在一个实施方案中，这些可磁性靶向载体颗粒具有在患者中优选人患者中发挥作用所需要的最小吸附阈。不仅生物活性物质的结合重要，而且解吸特征也是重要的。在一个实施方案中，生物活性物质必须足够强地附着于可磁性靶向载体颗粒，以使生物活性物质被递送至特定部位。但是，在一个实施方案中，它们也应该能够在患者中将生物活性物质释放出来以使治疗程度更高。此外，没有本发明的公开，则可能很难确定丝裂霉素C(或其它生物活性物质)与可磁性靶向载体颗粒之间的正确平衡。本文报告测定吸附和解吸性质的具体试验以及丝裂霉素C的具体结果。
因为制备和销售干燥形式的可磁性靶向载体颗粒是方便的，因此可以将赋形剂制备为干燥形式，并将一种或多种干燥赋形剂与单元剂量的可磁性靶向载体颗粒包装在一起。例如如果存在，则可以使用各种赋形剂，以增强生物活性物质的沉淀或释放。本领域技术人员能够容易地确定适当干燥赋形剂的类型和量。例如，赋形剂可以选自粘度剂或张力剂(tonicifier)，或同时使用两者。粘度剂是例如可生物降解的聚合物如羧甲基纤维素、PVP、聚乙二醇(PEG)等。张力剂包括氯化钠、甘露糖醇、葡萄糖、乳糖以及用于赋予复制溶液相同重量克分子渗透浓度的其它试剂。最优选配制含有干燥赋形剂和干燥磁性颗粒例如铁的包装或试剂盒以与含有单元剂量生物活性物质的小瓶中的液体内容物混合。在使用可磁性靶向载体颗粒之前即刻可以使用液体活性剂作为赋形剂。这些液体活性剂可以是豆油、油菜籽油或含有以上列出的聚合物的水基聚合物溶液。液体溶液也可以是张力剂如林格液、5％葡萄糖溶液、生理盐水。如前述，液体赋形剂和张力剂可以联合使用。(参见例如Kibbe，AH，Handbook of PharmaceuticalExcipients，American Pharmaceutical Association，Washington，DC，2000))。根据对每种化合物研究的实验方案，含有生物活性化合物的液体与含有干燥成分(如干燥铁颗粒和干燥赋形剂)的试剂盒中的内容物混合时，所述生物活性化合物附着于可磁性靶向载体颗粒上，从而形成可磁性控制的组合物，其含有诊断和/或治疗量的附着于所述可磁性靶向载体颗粒的生物活性化合物，并且适用于离体或体内治疗和/或诊断以及离体诊断用途。
使用液体试剂盒时，可以将可磁性靶向载体颗粒作为一个单元包含在例如小瓶中，而上述赋形剂以水溶液的形式包含在另一个单元中。给药时，将铁碳颗粒(即可磁性靶向载体颗粒)与含有单元剂量的药物和足量的药物制造商推荐的生物相容的水溶液如盐水的小瓶中的内容物混合，将药物制成药学期望的浓度。然后，将得到的其上吸附有生物活性物质的可磁性靶向载体颗粒与另一含有于水溶液中的赋形剂的单元混合。制备这两种制剂时，可以使用任何合适的灭菌技术。例如铁碳颗粒可以用γ辐射灭菌，而赋形剂水溶液可以用高压灭菌器灭菌。
吸附于可磁性靶向载体颗粒的生物活性物质的诊断或治疗量将由本领域技术人员确定，所述量为对具体疾病或病症进行诊断或治疗所必须的量，考虑诸如患者体重、年龄、一般健康状况、药物的诊断和治疗性质以及疾病的性质和严重程度等各种因素。
确定用于任何特定治疗情况的可磁性靶向载体颗粒的粒径需要考虑很多因素。粒径的选择部分地由制备粒径低于0.2μm颗粒的固有的技术限制所决定。此外，对于粒径小于约1.0μm的可磁性靶向载体颗粒而言，在血流中的磁控性和携带能力可能会下降。相对大的颗粒在注射中或者机械地或者因生理机制促使凝块形成而容易引起不期望的血管栓塞形成。该分散体可能凝结，这使得注射更困难，并且生物活性物质在靶病理区从可磁性靶向载体颗粒上解吸的速率可能降低。将铁粉和碳粉的混合物一起碾磨的方法(如下所述)制备的可磁性靶向载体颗粒的形状大致为球形，表面呈颗粒状，得到平均主要尺寸为约0.1μm至约5.0μm的颗粒数。
由于这些实施方案中描述的可磁性靶向载体颗粒中的铁不是某些以前公开的磁控分散体中所述的氧化铁的形式，所以铁碳颗粒的磁化率或响应性都保持在较高水平。
铁碳颗粒的特征在于形成良好的亚结构(见图1)，具有铁12连接网络，其与其中捕获的碳沉积物10形成布满孔隙的网络。可磁性靶向载体颗粒的特征性亚结构在铁粉与碳粉机械混合的联合变形过程中形成，与具有其它亚结构类型的铁颗粒相比，这也增加了铁碳颗粒8中铁内含物的磁化率。例如，根据本文所述方法制备的复合铁碳颗粒的磁化率优于欧洲专利公布0 451 299A1中公开的颗粒，尽管两种类型的可磁性靶向载体颗粒中的铁磁含量大约相同。铁磁颗粒8的高磁体响应性使得在一些情况下使用低于约250高斯的磁场将颗粒定位于期望的解剖位点成为可能。
由于可磁性靶向载体颗粒8中碳沉积物10的表面积大，吸附的生物活性物质占颗粒8质量的高达约20.0％，或换言之，每克颗粒8吸附的生物活性物质高达约200mg。因此，使用时，与一些以前已知的载体相比，获得给定剂量的生物活性物质注射非常少的载体，或者说，每次注射获得较高剂量的生物活性物质。
在一个实施方案中，可磁性靶向载体颗粒的制备在乙醇中进行，并用产生增高温度和压力的高能量碾磨机进行碾磨。使用之前将碳干燥以降低含水量。制备后用丝裂霉素测试吸附能力。在一个实施方案中，使用的铁和碳除使可磁性靶向载体颗粒具有可磁性靶向以及吸附和释放生物活性样品外还具有其它性质。例如，在一个实施方案中，可以期望铁和碳具有表1中列出的特征。KB型碳是一种满足这些标准的碳。
表1：原料和相关测试
  原料   进行的测试   规格
  活性炭   酸溶性物质   符合USP
  氯化物   符合USP
  氰化合物   符合USP
  重金属   符合USP
  反应   符合USP
  炽灼残渣   符合USP
  硫酸盐   符合USP
  硫化物   符合USP
  非碳化组分   符合USP
  鉴别   95-105％碳
  铁   外观   均一粉末
  颜色   灰色
  表观密度   1.5-3.0g/cc
  真密度   7.5-7.8g/cc
  过200目筛   最大残渣0.2％
  平均粒径   1-3μm
  ％铁   98％
  ％碳   ＜1％
  ％氧   ＜0.7％
  ％氮   ＜1％
  鉴别   通过测试
活性炭可以在真空烤箱中在80℃下至少干燥42小时，一旦干燥则在干燥条件下储存。活性炭可以分为亚批(sub-lot)进行干燥。
USP无水乙醇可用作溶剂。USP无水乙醇可用于碾磨、分离和均化步骤中。可磁性靶向载体颗粒可在氮气覆盖的手套箱中包装。所使用的氮气的规格除没有作气味试验外均满足或超出美国国家处方集(NF)的规定。
以下描述制备该实施方案的少量铁碳组合物的方法实施方案，应理解除碾磨之外其它方法或机制也可用于联合使组成载体制备的基本原料的铁粉和碳粉变形。所使用的方法对碳和铁颗粒的混合物施加机械压力使铁颗粒变形并形成捕获碳的基本亚结构。铁碳颗粒的形成过程中不伴有额外热量的加入(尽管混合物在机械变形步骤中温度升高)，并在液体如乙醇存在下进行以抑制铁的氧化和确保产生的颗粒是干净的。该液体还可以作为铁粉和碳粉碾磨中的润滑剂，并可以减少加工过程中对碳的压实。结果，所述组合物中碳沉积物的密度被保持，从而使可磁性靶向载体颗粒的吸附能力最大化。
例如，为制备平均铁∶碳质量比例为约75∶25的可磁性靶向载体颗粒，将一重量份的基本纯的铁颗粒与约0.1至1.0重量份的基本纯的碳颗粒一起碾磨。在一个实施方案中，95％(数量)的所得可磁性靶向载体颗粒的直径低于或等于5.00微米，且平均粒径为0.6微米至3.5微米。将铁颗粒与碳颗粒剧烈碾磨以在整个体积中获得较好的分布。优选碳颗粒是活性炭。每种生物活性物质都应该与各型碳一起分别评价以确定最佳的可逆活性炭结合。诸如pH、温度、粒径、盐溶液粘度以及溶液中其它潜在的竞争化学物质等因素可能影响吸附能力、速率和解吸参数。有用的活性炭类型包括但不限于A、B、E和K型，特别是KB型和它们的化学修饰体。发现这些特定类型的活性炭与生物活性物质具有意想不到高的结合能力。在一个实施方案中，碳含量为总质量的18-25％。
将所述混合物置于粉末冶金中使用的标准实验室行星式球磨机或磨碎机中。例如所述碾磨机的磨球直径可以为6mm。加入适当量的液体如乙醇润滑。将混合物碾磨1-12小时，或者制备上述可磁性靶向载体颗粒所必须的时间。取决于所使用的碾磨机，碾磨速度可以为约120rp至约1000rpm(通常约270-330rpm)。
所述铁碳混合物联合变形后，将可磁性靶向载体颗粒从碾磨机中移出，用例如过滤器将颗粒从磨球中分离出来。可以将颗粒再悬浮于乙醇中，均化以将颗粒彼此分离。例如通过旋转蒸发除去乙醇，然后真空干燥。可以使用任何合适的干燥技术。对于可磁性靶向载体颗粒的操作应该保护铁不被氧化，例如在氮气环境中操作。在一个实施方案中，干燥失重为≤5.0重量％。
可以测试可磁性靶向载体颗粒的残余溶剂。总残余溶剂低于或等于5000ppm。
干燥后，应该按照适当的粒径收集可磁性靶向载体颗粒。例如可磁性靶向载体颗粒可以过20μm筛，并用空气旋流器收集以除去粒径大于20μm的颗粒。旋流器只收集某一粒径和密度的颗粒，为除去碳细末和松散的碳提供方法。将过筛后的颗粒在氮气下包装，并在室温下储存。
可以将可磁性靶向载体颗粒再等分成剂量单元，例如每剂量为50-500mg，并可以例如进一步用氮气覆盖。可以将剂量单元例如用丁基橡胶塞和铝箍密封。然后可以通过适当的灭菌技术如γ射线将剂量单元灭菌。
当准备使用时，或者如果载体要用预先选定的吸附于其上的生物活性物质制备则在包装前，将约50mg至150mg的生物活性物质溶液加入1克载体中。当准备施用于患者时，利用常规方法例如递送载体将所述组合物置于生物相容液体如水或盐水的悬浮液(如5-100ml)中。
描述制备所述可磁性靶向载体颗粒的方法的两个实施方案的流程图显示在图2和3中。
优选的用于丝裂霉素C的可磁性靶向载体颗粒
在优选实施方案中，用于吸附丝裂霉素C的可磁性靶向载体颗粒是一种通过机械化学碾磨金属铁和活性炭形成的复合颗粒(Volkonsky等，美国专利5,651,989，(1997)；Rudge等，Biomaterials，21，1411-1420，(2000)，本文引入这两篇文献全文作为参考)。在一个实施方案中，可磁性靶向载体颗粒的碾磨可以从65％金属铁粉和35％活性炭粉开始。所得的可磁性靶向载体颗粒的粒径为约0.5-5μm。可磁性靶向载体颗粒本身不具有描述其总组分的分子结构或分子式。
可磁性靶向载体颗粒的铁部分是细分散的纯铁晶体，具有体心立方(bcc)晶体结构。这一结构是可磁性靶向载体颗粒的磁性反应的主要原因。其它形式铁的磁饱和低得多，如表2所示。该表表明对于产品而言期望保留尽可能大比例的晶体铁以在施加的磁场内保留最高可能的磁饱和。该形式的铁也称作金属铁。
表2：bcc铁、可磁性靶向载体颗粒和其它形式铁的磁饱和
 铁形式   磁饱和(Am2/kg)
 bcc铁   218
 可磁性靶向载体颗粒物质，Lot   145.6
 Fe3C   128
 FeO·Fe2O3   98
 Fe3O4   92
 γFe2O3   74
铁是指金属铁。本文使用的用于制备可磁性靶向载体颗粒的“金属铁”是基本化学纯的，铁原子高于约85％，最优选高于约90％。用于制备本实施方案中使用的可磁性靶向载体颗粒的铁也是通常含有低于约20％的氧化铁，更优选低于约10％，最优选低于约5％，要注意所述可磁性靶向载体颗粒除氧化铁之外还可能含有其它杂质。金属铁是磁饱和高、密度大(218emu/g和7.8g/cm3)的材料，其磁饱和及密度均高于磁铁矿(92emu/g和5.0g/cm3)。金属铁的密度为7.8g/cm3，而磁铁矿密度为约5.0g/cm3。因此，金属铁的每单位体积的磁饱和比磁铁矿高约4倍。(CRC Handbook，77th版，CRC Press(1996-1997)和Craik，D.，Magnetism Principles and Applications，Wileyand Sons(1995)。
可磁性靶向载体颗粒中的活性炭相同样没有确定的化学结构。活性炭是一种多孔物质，主要由芳香碳环组成。
在一个实施方案中，通过天然纤维源如橡木的炭化来形成活性炭原料。用热磷酸激活炭化。用水洗涤活性炭并进行粒径分类。在一个实施方案中，使用上述的活性炭类型。
通过在制备可磁性靶向载体颗粒中采用的碾磨方法将活性炭引入可磁性靶向载体颗粒中，而不降低其活性，即其中的孔和孔状结构基本完整无损。
由于氧化铁(Fe3O4，磁铁矿)的磁饱和低于金属铁，所以期望保护可磁性靶向载体颗粒的铁部分免受水分或空气的氧化。基于这一原因，所有的制备步骤，从碾磨到可磁性靶向载体颗粒的干燥，都在乙醇中或氮气下进行。
为保证粒径大于20μm的可磁性靶向载体颗粒不被包装在产物中，采用过筛步骤用于制备可磁性靶向载体颗粒。该筛采用真空将可磁性靶向载体颗粒抽过20μm目，并用旋流器从真空上游收集过筛的颗粒。
用PSS ACusizer 770(Particle Sizing Systems，Santa Barbara，CA)对单个分选的颗粒进行激光散射以确定可磁性靶向载体颗粒的粒径分布。基于光路中检测到的阴极脉冲数和与该脉冲相关的平均散射光强度的高度，激光散射使得传感器对颗粒进行计数。对于不规则颗粒或非球状颗粒，所得的直径是相当的球体直径。传感器的范围是0.5μm至400μm(标示值)。在一个实施方案中，所述可磁性靶向载体颗粒样品的可磁性靶向载体粒径分布通常为0.5-5μm。图4显示代表性可磁性靶向载体粒径分布，以颗粒数计。
在一个实施方案中，95％(数量)的可磁性靶向载体颗粒的直径低于或等于5微米，平均直径为0.6-3.5微米。
通过氮气吸附来测量可磁性靶向载体颗粒的表面积。测量的一特定批次的表面积为289m2/g。经氮气吸附测量的体积加权平均孔径为4.2nm。
对一特定批次的进行电子显微镜检查。将可磁性靶向载体颗粒重悬于可磁性靶向载体颗粒递送载体中，经超声处理，然后照像。显微照片显示有大量的粒径为0.5-5微米的可磁性靶向载体颗粒，其形状不规则。在一个实施方案中，全部显微照片均显示粒径为1-5μm的单个可磁性靶向载体颗粒占多数，全部颗粒均低于10μm。图6表示放大1000倍的可磁性靶向载体颗粒的反向散射图象。该图象显示碳的轮廓为暗色，铁为亮色。
如这些显微照片(图7、8和9)中所示，进一步放大表明可磁性靶向载体颗粒在整个粒径范围内都保持不规则的形态和混合的组成。
图10和11显示单个可磁性靶向载体颗粒的图象，旨在阐述可磁性靶向载体颗粒的组成和结构信息，并证实所述颗粒由活性炭和金属铁不同的固相组成，并且在碾磨后碳仍然保留着孔结构。碳的表面积对于可磁性靶向载体颗粒的吸附能力是重要的。
在一个实施方案中，通过将可磁性靶向载体颗粒材料的样品置于磁场中并测量该样品磁性矢量在磁场轴线方向上的排列方向程度来测量可磁性靶向载体颗粒的磁化率。例如，这可通过将样品引入振动磁力计(LakeShore Cryotronics 7404型，Westerville，OH)来完成。
在这一实例中，磁饱和为约145.6A·m2/kg。与其它含铁物质相比，可磁性靶向载体颗粒的磁饱和仅次于bcc铁，如表2所示。对于可磁性靶向载体颗粒测量的磁饱和(图5)与对于含有约75％bcc铁的材料所预期的一致。
在一个实施方案中，所述可磁性靶向载体颗粒在氮气下包装以保护该物质不受水分和氧的氧化。在另一个实施方案中，所述可磁性靶向载体颗粒在相对湿度低于60％的气氛下包装以降低颗粒的氧化还原电位。
在一个实施方案中，所述可磁性靶向载体颗粒可以在氮气下包装以保护该物质不受水分和氧的氧化。为确定湿度对可磁性靶向载体颗粒的影响，可以通过重量吸附分析法测定可磁性靶向载体颗粒的水吸附等温线。可磁性靶向载体颗粒在相对湿度低于50％时不明显吸收水分。活性炭具有主要为疏水性的表面，吸收第一层水需要很大的活化能。吸收单层之后，之后各层的吸附需要较低的活化能，导致等温线呈“凹型向上”的形状。相对湿度低于50％时的低增重表明可以在相对湿度为0-50％之间的气氛下对可磁性靶向载体颗粒进行操作，而不显著影响其性质。解吸循环表明相对湿度较高时有磁滞。磁滞有时由吸附后分子重排引起，这表明吸附具有多重机制。增重看起来是可逆的。
以上提供的特征数据表明，在一个实施方案中可磁性靶向载体颗粒具有与活性炭相似的孔隙率和吸附性质，以及如可磁性靶向载体颗粒的磁化所表明的金属铁性质。电子显微镜证实粒径主要为0.5-5μm的复合铁/碳颗粒的存在。通过这些测量可知，所述可磁性靶向载体颗粒能够完成用于将丝裂霉素在磁场影响下携带至肿瘤位点的预期目的。
可磁性靶向载体颗粒的包装
在一个实施方案中，将以上制备的可磁性靶向载体颗粒以150mg可磁性靶向载体颗粒粉末等分式样装入50mL小瓶中。在顶空大气气氛下将小瓶用塞子塞住。用γ射线对产品进行灭菌。在一个实施方案中，在1000级的环境中，在100级层流通风橱中将各批次的可磁性靶向载体颗粒装入50mL洁净的无热原I型硼硅小瓶中。用洁净橡胶塞将小瓶塞住。然后用铝箍将小瓶密封，目测检查是否有缺陷，包装用于辐射。将小瓶在室温下储存和运输。进行辐射。小瓶从钴源吸收灭菌剂量，例如25kGy。
在一个实施方案中，可磁性靶向载体颗粒小瓶含有150±7.5mg所述可磁性靶向载体颗粒。为确保可获得足以吸附所述临床负载的丝裂霉素C的150mg可磁性靶向载体颗粒，已在小瓶中“过量装入”7.5mg可磁性靶向载体颗粒。在一个实施方案中，装入量为157±7.5mg。
在一个实施方案中，所述可磁性靶向载体颗粒还经冻干。它们可以在有或没有赋形剂和有或没有MMC和/或其它生物活性物质下被冻干。之后，将它们装入小瓶中，余出的任何顶空可以用氮气、空气氧气或任何适当的混合物回填充。
可磁性靶向载体颗粒的分析
在一个实施方案中，制备可磁性靶向载体颗粒后对其进行分析。在这一实施方案中，铁含量应为总质量的约64-86％，碳含量应为总质量的约18-25％，氧化铁形式的铁量应低于原子铁的约5％。此外，干燥失重的标准约为≤5.0重量％。为测量重金属，将样品消化并在Perkin Elmer Elan 5000质谱仪相连的电感耦合等离子体中电离。质谱的检测限约为0.1ppb。重金属规格列于下表3中。
表3：重金属规格
  元素   接受标准
  钠   ≤10000ppm
  磷   ≤10000ppm
  硅、铬和镍   3种元素总和≤3000ppm，没有单个结果＞1000ppm
  Mn、Mo、Al、Ti、Cu、Hg、Bi、As、Pb、Sb、Sn、Cd和Ag   13种元素总和≤1000ppm，没有单个结果＞100ppm
在一个实施方案中，所述可磁性靶向载体颗粒应去除热原，且含有≤0.2EU/mg。表4为两批代表性可磁性靶向载体颗粒的释放结果。
表4：两批可磁性靶向载体颗粒的释放测试结果
  测试   批次1   批次2
  颜色   达标   达标
  外观   达标   达标
  可磁性靶向载体颗粒粒径(95％＜直径)(μm)   2.73   2.21
  可磁性靶向载体颗粒粒径(平均直径)(μm)   1.12   1.02
  铁％   73％   74％
  碳％   20％   21％
  氧化铁原子％   1％   1％
  总残余溶剂％   0.2％   0.2％
  干燥失重％   ＜1.5   ＜1.5
  重金属   达标   达标
  鉴别   达标   达标
  内毒素   0.0EU/mg   0.0EU/mg
在一个实施方案中，可以测量残余溶剂如乙醇的含量作为可磁性靶向载体颗粒干燥步骤的终点，碳含量和可磁性靶向载体颗粒粒径可以在可磁性靶向载体颗粒过筛步骤中测试。
在一个实施方案中，可以使用测量可磁性靶向载体颗粒与丝裂霉素总结合能力的测定法。
制备可磁性靶向载体-MMC颗粒
在一个实施方案中，其上吸附有丝裂霉素C的可磁性靶向载体颗粒(可磁性靶向载体-MMC颗粒)的制备如下。丝裂霉素为USP级，以在50mL小瓶中的20mg丝裂霉素和40mg甘露糖醇的干燥无菌混合物提供。为制备可磁性靶向载体-MMC颗粒，将丝裂霉素用26.7mL注射用无菌水复制，使丝裂霉素浓度为0.75mg/mL，甘露糖醇浓度为1.5mg/mL。这与常规方法大不相同，在常规方法中是加入40mL注射用无菌水制备0.5mg/mL MMC和1mg/mL甘露糖醇。在一个实施方案中，铁和碳的总重量与MMC的比例为约1∶100至约10∶100。在优选实施方案中，该比例为5∶100。
如本领域技术人员所理解，碳与铁之间的比例以及碳铁总和与丝裂霉素C之间的比例是不同的。当该比例涉及碳与铁之间的比较时，相对量基于100％。另一方面，将MMC与铁和碳进行比较时，相对量则严格地只与彼此有关，因此，例如10重量份的MMC与100重量份的铁碳可磁性靶向载体颗粒。
递送载体
在一个实施方案中，所述可磁性靶向载体颗粒可以与递送载体结合。递送载体是指可磁性靶向载体颗粒可以加至其中的物质，以将可磁性靶向载体颗粒递送至患者。在一个实施方案中，所述递送载体以具有足够粘度以延迟载满药物的载体的沉降并同时具有足够的流动性以维持良好输注性质的介质提供。在一个实施方案中，递送载体可以以50mL和30mL I型透明硼硅玻璃瓶中的无菌溶液提供。表5中列出了每一可磁性靶向载体颗粒递送载体小瓶中的内容物。
表5：每一可磁性靶向载体颗粒递送载体小瓶中的内容物
  批号   小瓶大小(mL)   标签标示量(ml)   每克内容物
  A   50   40   100mg USP甘露糖醇NLT 3mg羧甲基纤维素USP钠USP注射用水至1g
  B   30   21   100mg USP甘露糖醇5mg羧甲基纤维素USP钠USP注射用水至895mg
以下是一种可以制备可磁性靶向载体颗粒递送载体的实施方案。在USP注射用水中制备10重量％USP甘露糖醇、0.5重量％USP羧甲基纤维素钠溶液。在一个实施方案中，甘露糖醇是增溶剂(即赋形剂)。但是，在一个实施方案中，也可以使用能够提高可磁性靶向载体颗粒溶解度的任何化合物。当用布鲁克菲尔德粘度计在40℃和60rpm下测量时所述溶液的粘度为约14±2cP。将可磁性靶向载体颗粒递送载体通过5μm/1μm/0.45μm过滤器列滤入空气分级室内。在100级环境中将可磁性靶向载体颗粒递送载体装入30mL洁净无热原小瓶中。将小瓶塞住并密封，然后在高压灭菌锅中最后灭菌。高压灭菌周期为在至少121℃下30分钟。
或者，可以开始时只用0.3％USP羧甲基纤维素钠制备溶液。然后用也是用USP注射用水制备的3％USP羧甲基纤维素钠、10％USP甘露糖醇调节溶液的粘度。高压灭菌锅可以使用40分钟，＞121℃。高压灭菌周期结束时可以用水瀑冷却小瓶。在本申请的教导下，很多其它的制备方法对于本领域技术人员而言是清楚的。
在一个实施方案中，所述递送载体的重量克分子渗透浓度为610-650m/Osm/kg。
在一个实施方案中，在校正的布鲁克菲尔德锥型和板型粘度计中用#TL5锭子在60rpm和40℃下测量递送载体的粘度。一优选粘度为6-12cP。
在一个实施方案中，可以进行细菌内毒素测试。在一个实施方案中，内毒素限为≤2.8EU/mL。
在一个实施方案中，可磁性靶向载体-MMC颗粒是丝裂霉素与甘露糖醇、可磁性靶向载体颗粒和可磁性靶向载体颗粒递送载体的组合。可以通过加入26.7mL注射用无菌水将丝裂霉素(于50mL小瓶中的20mg注射用丝裂霉素和40mg甘露糖醇)复制为0.75mg/mL。可以将10mL复制的丝裂霉素加入150mg包装于无菌小瓶中的可磁性靶向载体颗粒中，在室温下温育30分钟。吸附于可磁性靶向载体颗粒上的丝裂霉素称为可磁性靶向载体-MMC颗粒。吸附步骤后，可以加入20ml可磁性靶向载体颗粒递送载体。丝裂霉素吸附至可磁性靶向载体颗粒的重量比可以为约5％，因此得到的可磁性靶向载体-MMC颗粒悬液的浓度为约0.25mg/mL丝裂霉素和约5mg/mL可磁性靶向载体颗粒。从小瓶中取出所需剂量，给药前用注射器混合。图13显示一个制备可磁性靶向载体-MMC颗粒悬液方法的实施方案。
一旦可磁性靶向载体-MMC颗粒和递送载体的组合制备完，就可以将该制剂给予患者。为将可磁性靶向载体-MMC颗粒定位于期望的部位，在机体外部邻近靶点处建立恒定磁场，其具有的磁场强度足以将大量注射的可磁性靶向载体颗粒引导至靶点并使该大量颗粒保留在靶点。这一磁场可以在注射前即刻、注射期间或注射后建立。优选磁场强度足以将可磁性靶向载体颗粒吸引入邻近血管网络的位点处的软组织中，这样在特定的治疗/诊断中不期望栓塞形成时，可以避免颗粒在任何较大血管中形成大的栓塞。用于本发明的方法的磁铁的实例是在感兴趣的区域(靶点)产生至少100高斯恒定磁通量的磁铁，准确的磁场强度取决于应用，如血流速率、内皮厚度以及肿瘤组织的深度和扩散。例如在N极表面产生约5kG的通量，具有直径约5厘米，长6厘米尺寸的NdFeB磁铁可以在健康和患病的肝组织中用于引导本文描述的可磁性靶向载体颗粒(Part No.MSD12691-NC，Magnet Sales，Culver City，CA)。NdFeB的其它组合物以及其它稀土磁铁、陶瓷磁铁或电磁铁或超导磁铁也可以是适合的。
有许多其它的机制用于将可磁性靶向载体颗粒引导至个体中期望的区域。对于给定的情况期望哪种方法将取决于要达到的目标，根据本发明的公开内容，本领域技术人员将能够容易地确定应该使用哪种方法。在一个实施方案中，根据2002年12月3日授予Mitchiner等的美国专利6,488,615、2003年12月16日授予Mitchiner等的美国专利6,663,555以及Thomas Kent于2003年12月12日递交的美国专利申请10/734651的发明来引导和控制所述可磁性靶向载体颗粒，本文引入这些文献的全部内容作为参考。该文献既提供了向患者给予磁场的装置以捕获这些颗粒也提供了使用方法。简言之，该装置是保磁用衔铁屏蔽装置(magnet keeper-shield assembly)，适用于容纳和储存用于产生高梯度磁场的永久磁铁。该磁场可以穿入深的靶肿瘤部位以吸引可磁性靶向载体颗粒。该保磁用衔铁屏蔽装置包括可磁性通透的衔铁屏蔽和其大小被设定为容纳磁铁的孔。使用传动器将磁铁部分地推出衔铁屏蔽之外。传动器由几个在整个衔铁屏蔽基底上延伸的弹簧辅助。
所述可磁性靶向载体颗粒可以通过插管术给予患者。插管术的实践在本领域是熟知的，适宜地放入导管以治疗器官也是熟知的。通过任何方法，例如通过血管内或插管技术安置导管对于本领域技术人员而言是已知的。
制备可磁性靶向载体-MMC颗粒后，可以使用毒性研究评价所述可磁性靶向载体-MMC颗粒的安全特征，例如如实施例7中的猪模型所示。在实施例7中，主要通过局限于左肺下叶的递送部位存在的可磁性靶向载体颗粒的组织病理学检查证明靶向。由于没有相对大的动物肺肿瘤模型，所以本次研究中健康肺组织区域也必须作为靶点。预期可磁性靶向载体颗粒更容易从通常血管过多的肿瘤组织中溢出。需要考虑可磁性靶向载体-MMC颗粒对正常细胞和肿瘤细胞作用的潜在差异。磁性靶向递送可磁性靶向载体-MMC颗粒之后循环中具有可测量到的MMC水平，没有肿瘤存在可能是这一事实的原因。与MMC对照动物相比，用可磁性靶向载体-MMC颗粒处理的动物循环血液中MMC水平仍然低了接近50％，这表明用可磁性靶向载体-MMC颗粒处理的动物中药物与靶点接触更长时间。对于可磁性靶向载体-MMC颗粒，每个时间点以及整个3小时的取样期间测量的MMC量比单独使用MMC低。已证明即使是在静脉内给药后，MMC在恶性组织中的蓄积也多于正常组织中的蓄积，并且其主要在肝脏、脾脏、肾、大脑和心脏中被灭活(Fujita，Jap.J.Clin.Oncol.12：151-162，1971)。
在一个实施方案中，经肺动脉将可磁性靶向载体-MMC颗粒递送至肺组织。该方法在实施例7中使用。
用动脉内输注化疗药以治疗肺肿瘤的方法是可能在人中使用的方法。在Hellekant等(Acta RadiolDiagn(Stockh)，20：478-496，1979)中，对9名患有肺鳞状细胞癌的患者进行支气管血管造影。然后将用盐水稀释的10mg MMC经动脉内给药。28至48日之后，2名患者的肿瘤完全消退，2名患者的肿瘤部分消退。在另一项研究中，Hellekant在39名患有支气管癌的患者中进行支气管血管造影和动脉内输注MMC(Hellekant 1979)。未发生神经系统并发症，并且副作用不显著。该方法看起来在治疗支气管癌中有治疗价值。在Ekholm等进行的研究中，经选择性动脉内给予4次MMC输注，2-3周的时间间隔来对51名患有鳞状细胞癌或腺癌的患者进行治疗(Ekholm等，Ann Radio(Paris)，23：346-348，1980)。每种情况下，患者都接受在100mL盐水中稀释的10mg MMC，向支气管动脉输注的速率为每分钟5-7mL。在这些完全接受一系列4次治疗的患者中，5名患者的肿瘤面积减少了50％，3名患者的肿瘤面积减少了20-50％。
在一个实施方案中，可磁性靶向载体-MMC颗粒使肿瘤面积减少至少20％，同时减少了健康组织与MMC的接触。在另一实施方案中，可磁性靶向载体-MMC颗粒使肿瘤面积减少20-50％，同时减少了健康组织与MMC的接触。在另一实施方案中，可磁性靶向载体-MMC颗粒使肿瘤大小降低51％，52-59％，58-70％，70-80％，80-90％，90-99％，使肿瘤接近完全消退或全部消退。在一个实施方案中，每个剂量为15mg至150mg可磁性靶向载体-MMC颗粒。在另一实施方案中，剂量为至多20mg/m2MMC，其中一般美国男性为2m2。在一个实施方案中，给药频率为3-8周。在一个实施方案中，可以进行完全的血液筛选以确定是否应该继续给药或减少剂量。
从本发明的实施例例如实施例7中所见的安全性和靶向效率表明所述可磁性靶向载体-MMC颗粒将发挥作用以达到预期目的，并可以如本文所述给药。没有出现死亡或临床症状。临床病理参数的变化一般是小的或暂时的。在接受可磁性靶向载体-MMC颗粒的动物中MMC的循环水平下降。组织病理学检查时所见的治疗相关作用都局限在靶肺，其中在肺泡毛细血管中观察到可磁性靶向载体颗粒。给予可磁性靶向载体-MMC颗粒的高剂量组的一只动物具有多发的含可磁性靶向载体颗粒的肺肉芽肿。在靶肺区之外未观察到可磁性靶向载体颗粒。尤其是，在网状内皮系统内未发现可磁性靶向载体颗粒。经肺动脉递送可磁性靶向载体-MMC颗粒使得可磁性靶向载体颗粒在靶肺叶中位点特异性定位。在给予含有80mg可磁性靶向载体颗粒和4mg MMC的可磁性靶向载体-MMC颗粒的单个动物中，具有生物学显著性的大体可见和显微镜可见的损伤都局限在肺的靶区。磁性靶向使得在较长时间内高的局部MMC水平，这应该增加抗肿瘤功效。此外，在一个实施方案中，该给药方法减少了MMC的全身接触，因此减少了经全身给药后可能观察到的不良反应。因此，用可磁性靶向载体-MMC颗粒治疗对于患有不能手术的NSCLC患者特别有用。
实验证据表明，与以前已知的磁控分散体相比，使用这一实施方案的磁控载体组合物和抗肿瘤制剂对肿瘤生长具有增强的治疗功效。
除非明确指出，以下实施例仅是为例示的目的，无意于限制本发明的实施方案。
                       实施例
实施例1
以下方法提供制备可磁性靶向载体颗粒的一个实例。制备可磁性靶向载体颗粒的方法由10步组成：
原料调配：将铁粉和碳粉、USP无水乙醇和4mm磨球在碾磨罐中混合。
碾磨和微粉化：碾磨在行星式碾磨机中在碾磨罐中进行。碾磨罐和球由铬加硬的不锈钢制成。将物质在270-330rpm下碾磨200-240分钟，然后在120rpm下碾磨160-200分钟。
分离：碾磨处理后，将碾磨罐中的内容物倒空至过滤器上，其下由收集盘支撑。将碾磨罐内容物通过过滤器以将粗的可磁性靶向载体颗粒与球分离。用USP无水乙醇洗涤碾磨罐和磨球。这步中使用的过滤器和收集盘是不锈钢的。收集后，将可磁性靶向载体颗粒浆状物转移至玻璃容器中，并用USP无水乙醇稀释。
混合：用均化器将可磁性靶向载体颗粒在7000±500rpm的速度下均化5分钟。该步骤将可磁性靶向载体颗粒作为单个颗粒分散在USP无水乙醇中。该方法中其余的步骤用于将可磁性靶向载体颗粒分散成干粉。
蒸发溶剂：将可磁性靶向载体颗粒浆状物转移至玻璃真空烧瓶中。在15-20英寸Hg的真空下，将从混合步骤中得到的无水乙醇/可磁性靶向载体颗粒浆状物在60-70℃下旋转蒸发使体积减小。继续旋转蒸发直至有固体物质在蒸发烧瓶的瓶壁上出现。
干燥：旋转蒸发结束后，将所得物质转移至旋转蒸发筒中。最终的干燥在用氮气净化的真空烘箱中在75-80℃和至少24英寸Hg真空下进行。
掺合：将干燥的可磁性靶向载体颗粒转移至用氮气净化的手套箱中。将可磁性靶向载体颗粒在Waring掺合器中在约11500rpm下搅拌2分钟。
过筛：在6-12英寸水真空下，将搅拌后的可磁性靶向载体颗粒通过20μm网筛过筛。用筛网下游的旋流器将超细颗粒状物质与产物部分分离。该方法得到绝对截留粒径为20μm的粒径分布高端的可磁性靶向载体颗粒，并减少在旋流器中粒径分布低端的颗粒目。
最终掺合：将过筛后的可磁性靶向载体颗粒的产物部分转移至用氮气净化的手套箱中，在Waring掺合器中在约7000rpm下掺合20分钟。最终的掺合处步骤保过筛步骤后的粉末均一。
包装：然后将所得物质转移至用氮气净化的手套箱中以分配至容器中。取出样品用于测试(例如包括稳定性和适当的保留)，并将剩余的可磁性靶向载体颗粒分配至储存容器中。包装中对可磁性靶向载体颗粒所有的操作都在用氮气净化的手套箱中进行。
实施例2
该实施例阐述可如何制备可磁性靶向载体-MMC颗粒组合物的一个实施方案。将10mL复制的MMC(0.75mg/mL；BedfordLaboratories，Bedford，OH)与包装于小瓶中的含有150mg可磁性靶向载体-MMC颗粒的无菌可磁性靶向载体在室温下一起温育30分钟来制备可磁性靶向载体-MMC颗粒。用20mL粘性甘露糖醇和羧甲基纤维素缓冲液稀释悬液使得MMC以5％(重量∶重量)浓度吸附至可磁性靶向载体颗粒上。
实施例3
本实施例阐述如何确定多少MMC已经吸附在可磁性靶向载体颗粒上。在室温和40℃下测量丝裂霉素结合动力学。将25mg可磁性靶向载体颗粒与1.66mL 0.755mg/mL丝裂霉素溶液混合得到5.6％的MMC负载。将混合物在室温和40℃下温育不同的时间，直至60分钟。将在预定的时间点过滤样品获得结合上清液中剩余的丝裂霉素的浓度，然后经HPLC分析测定结合百分率。结合上清液中剩余的丝裂霉素百分率比温育时间显示在图14中。
结果表明5分钟内，在室温下起始丝裂霉素中有2％剩余在上清液中，而在40℃下有3％剩余。在室温和40℃下，都是不到5分钟就达到了吸附平衡，这表明吸附快速发生。丝裂霉素溶液在两种温度下都是稳定的，在温育期间未观察到显著差异。这表明吸附看起来是快的，且与温度无关。
实施例4
以下实施例阐述可如何确定可磁性靶向载体-MMC颗粒-递送载体的剂量准确度。将浓度为0.83mg/mL的10mL MMC溶液加入可磁性靶向载体颗粒(150mg)的小瓶中，并充分混合。将混合物在室温下温育30分钟，定期搅拌。然后向小瓶中加入20mL载体，使可磁性靶向载体-MMC颗粒悬浮，使体积为30mL，可磁性靶向载体颗粒的终浓度为约5mg/mL，而MMC的终浓度为～0.25mg/mL。在预定的时间点1小时和6小时制备6小瓶，用注射器泵输注之前即刻用注射器冲洗悬液5次。通过充满盐水的微导管使用注射器泵以120mL/hr输注10mL每种悬液。然后用5mL盐水冲洗空的注射器，盐水通过导管以120mL/hr进行泵输注。收集样品，根据600nm处吸光度分析颗粒浓度。通过将于输注悬液中的可磁性靶向载体-MMC颗粒浓度与未经导管输注的悬液中的浓度进行比较计算剂量准确度。
可磁性靶向载体-MMC颗粒的回收率为96-106％，且可磁性靶向载体-MMC颗粒随时间的回收率没有显著差异。
实施例5
以下实施例阐述可磁性靶向载体-MMC颗粒与生物衍生介质接触后MMC成为可生物利用的。测量人血浆中丝裂霉素从可磁性靶向载体-MMC颗粒中的解吸。将复制的丝裂霉素与25mg和10mg可磁性靶向载体颗粒在室温下温育30分钟以制备有约5重量％的MMC吸附的可磁性靶向载体-MMC颗粒。离心并移出吸附的上清液后，将所述可磁性靶向载体颗粒在37℃下重悬于人血浆中。在预定的时间点，移去血浆上清液，并用等体积的新鲜血浆代替。解吸研究以可磁性靶向载体颗粒与人血浆体积的不同比例在直至6小时内进行。用乙腈萃取样品以使蛋白质沉淀出，然后用1mg/mL甘露糖醇溶液稀释，并经HPLC分析。解吸在人血浆中的MMC量根据与标准曲线的比较来计算。解吸特征表明MMC的解吸在起始时快，2小时后变慢。看起来可磁性靶向载体颗粒与人血浆体积的比例较小时MMC的解吸水平较高，如图15所示。在人血浆中高达约75％的吸附MMC从可磁性靶向载体颗粒上解吸。
解吸特征表明丝裂霉素在生物液体如血浆中能够从可磁性靶向载体颗粒上解吸。丝裂霉素的解吸为单个纯峰，保留时间与丝裂霉素标准品一致。释放不是立即发生，而是取决于可磁性靶向载体-MMC颗粒与血浆的相对比例。
实施例6
以下实施例阐述可磁性靶向载体-MMC颗粒保留单独MMC的活性，如通过细胞毒性所测定的。具体而言，该方法可以证明使用基于所述可磁性靶向载体颗粒的给予患者MMC的方法具有优异的益处。使用人非小细胞肺癌细胞系H460分析细胞培养物中的可磁性靶向载体-MMC颗粒的细胞毒性特征。将吸附至可磁性靶向载体颗粒上的MMC与单独的MMC和可磁性靶向载体颗粒以及从可磁性靶向载体颗粒上解吸的MMC样品相比。将细胞接种于96孔微量滴定板中，每孔2000-4000个细胞。铺板后24小时，加入已知量的丝裂霉素、可磁性靶向载体-MMC颗粒悬液、从可磁性靶向载体-MMC颗粒上解吸的丝裂霉素和单独的可磁性靶向载体颗粒。将所有处理的细胞培养24小时，然后分析细胞存活率。MTT分析表明MMC、从可磁性靶向载体颗粒中释放的MMC以及可磁性靶向载体-MMC颗粒具有相似的导致细胞死亡的药物浓度，而单独的可磁性靶向载体颗粒却没有表现出任何对细胞生长的抑制(参见Shetty等，Journal of PostgraduateMedicine，42：72-75，1996对MTT测定法的描述)(图16)。所有的结果基于MMC作图，除可磁性靶向载体颗粒外，其基于假定加载5％MMC作图。
这些结果表明MMC保持作为细胞毒性剂的功能，经过吸附和解吸过程效价没有改变。
实施例7
以下实施例阐述在猪模型中如何给予可磁性靶向载体-MMC颗粒和评价其毒性特征。本实施例还提供特别是向人患者递送MMC和将MMC定位于靶区如肺的原理的证明。
在28天的对18只猪进行的毒性研究中评价肺动脉递送可磁性靶向载体-MMC颗粒的安全性。将MMC吸附至含有提供磁化率的铁的可磁性靶向载体-MMC颗粒上。在荧光透视引导下进行肺动脉插管以递送可磁性靶向载体-MMC颗粒或单独的可磁性靶向载体颗粒或MMC至特定的肺区。给药期间使用外部磁铁以使测试物质保留在靶区。在4周内对动物进行毒性症状的评价。
由于大动物肺肿瘤模型不够大，不足以适应肺动脉插管，因此在正常猪中研究作用，因为它们与人体解剖相似(McLaughlin，Am RevRespir Dis，128(2Pt 2)：S57-8，1983)。
选择了雌性Yorkshire猪用于该研究。年青的成年动物从PineviewFarms，Valley City，OH获得，研究开始之前至少7日适应实验室环境。共有18只动物，给药时体重为35±5kg，将它们随机分配至6个治疗组，每组3只动物，如表6所示。给予的测试品包括三种不同剂量的可磁性靶向载体-MMC颗粒以及可磁性靶向载体颗粒、MMC和载体对照。
表6：治疗组分配和剂量水平
组号 动物/组 治疗组   剂量(mg/kg)1MMC可磁性靶向载体颗粒   总剂量(mg)MMC可磁性靶向载体颗粒 给药体积(mL)
1 3   可磁性靶向载体颗粒-MMC低 0.01 0.15 0.25 5 12
2 3   可磁性靶向载体颗粒-MMC中 0.03 0.62 1 20 42
3 3   可磁性靶向载体颗粒-MMC高 0.12 2.30 4 80 162
4 3   可磁性靶向载体颗粒高对照 0 2.37 0 80 163
  5   3   MMC高   0.11   0   4   0   164
  对照
  6   3   载体对照   0   0   0   0   16
1mg/kg剂量基于每个治疗组猪的平均体重计算。
2给药溶液浓度为0.25mg/mL丝裂霉素和5.0mg/mL可磁性靶向载体颗粒药物载体。
3给药溶液浓度为5.0mg/mL可磁性靶向载体颗粒药物载体。
4给药溶液浓度为0.25mg/mL丝裂霉素。
在使用前，将用于低、中和高剂量组的以上实施例的可磁性靶向载体-MMC颗粒可注射悬液经超声处理并用注射器混合。每只动物经肺动脉输注接受固定浓度的单剂量对照品或测试品。低剂量可磁性靶向载体-MMC颗粒组接受0.25mg丝裂霉素和5mg可磁性靶向载体颗粒，给药体积为1mL。中剂量可磁性靶向载体-MMC颗粒组接受1mg MMC和20mg可磁性靶向载体颗粒，给药体积为4mL。高剂量可磁性靶向载体-MMC颗粒组接受4mg MMC和80mg可磁性靶向载体颗粒，给药体积为16mL。可磁性靶向载体颗粒对照组接受80mg可磁性靶向载体颗粒，给药体积为16mL，而MMC对照组接受4mg MMC，给药体积为16mL。载体对照组接受16mL载体。
给予组合物：
手术前动物禁食过夜。为此操作准备，将每只动物用氯胺酮(20mg/kg im)和甲苯噻嗪(1.25mg/kg im)进行预麻醉。在异氟烷全身麻醉下，用21号单壁针(Boston Scientific，Natick，MA)经皮进入右股总静脉中。在荧光透视引导下使0.018″镍钛合金线(Boston Scientific，Natick，MA)沿中心前进，将4French同轴导引器(Boston Scientific，Natick，MA)在线上方穿过。这可以引入0.035″滑线(Terumo，Elkton，MD)，然后置入5French血管鞘(Terumo，Elkton，MD)。置入鞘后立即全身给予动物5000IU肝素以预防插管引起的血栓形成。
在荧光透视下，使用5French Cobra 2血管造影导管(Cook，Inc，Bloomington，IN)或5French Kumpe角度血管造影导管(Cook，Inc，Bloomington，IN)开始进入右室和肺流出道。用血管造影照片描述右侧和左侧主肺动脉。可控滑线与血管造影导管联合使用与期望的肺动脉连接。另外，进行选择性血管造影以选择肺动脉分支，所述分支提供充分地接近测试品打靶的期望肺叶。在引导线上方的交换使得可以向较远端肺动脉引入直的锥形5French 100cm滑导管(BostonScientific，Natick，MA)。在所有的研究动物中，选择给每只动物左肺下后肺叶供血的肺动脉分支。然后进行血管造影以证实导管放置在期望的肺动脉分支中。导管放置的代表性血管造影图像见图17和18。
用于将这些物质定位于期望组织的磁铁的放置也由血管造影确定。侧视图像使得可通过测量导管尖至胸骨的距离来测量深度(10-14cm)。前面投影使得可测量从导管尖至横肋骨架上的皮肤的距离(4-7cm)。通过确定位于毛细血管充盈处(capillary blush)中心以及导管尖远端约1-2cm的皮肤腹面的位点来确定磁铁的放置。置于弹性磁铁支架中的5高斯稀土磁铁的N极位于该皮肤表面上标记的位置的中心。在1-4组的整个输注过程中以及输注结束后另外15分钟内磁铁都保持原位置。
第1和2组的测试品单次输注给药，其它各组两次输注给药。15分钟的磁铁保留期将第3和4组的两次输注分开。输注速率保持在流速2mL/min。在磁铁保留期15分钟结束时，进行血管造影以证实所选择的肺叶中动脉是开放的。处理后的毒性评价包括实验室测试，其中给药前(第0日)和给药后第1、3、7、14、21和28日收集血样用于评价血清化学、血液学和凝血参数。给药前和处理后3小时从所有接受可磁性靶向载体-MMC颗粒或单独MMC的动物中收集额外血样用于毒理代谢动力学分析。离心后从血样中收集血浆，用HPLC(QuestPharmaceutical Services，Newark，DE)测量MMC水平。给药后28日研究结束时对所有处死的动物进行彻底的尸体剖检。从每个动物中收集整套40多个组织和/或器官，保存在10％缓冲的中性福尔马林中。将组织在石蜡中包埋并切片，用苏木素和曙红染色进行光学显微镜检查。
导管在每只动物的左肺下后肺叶中的位置相似，这样测试品被递送至肺内尽可能相同的部位。处理后通过血管造影确定血栓形成的程度或对肺血管的潜在影响。给予低剂量的可磁性靶向载体-MMC颗粒或MMC或载体对照未发生血栓形成。用中剂量可磁性靶向载体-MMC颗粒处理的动物3只中有1只观察到肺动脉分支远端削减，而单独用可磁性靶向载体颗粒处理的动物3只中有2只观察到肺动脉分支远端削减(图19和20)。第二次输注后在所有用高剂量可磁性靶向载体-MMC颗粒处理的动物中都见到侧面实质增强的块状缺失，并有相邻外周轻度削减。所有的动物看起来都很耐受这些处理。
没有死亡，而临床症状也仅限于单独MMC组的两只动物和载体对照组两只动物的暂时腹泻。实验过程中体重增加量减少，但所有治疗组之间都相似。
处理相关的临床化学、血液学和凝血参数的变化是小的且为暂时的。各组间丙氨酸转氨酶、白蛋白、碳酸氢盐、肌酸激酶、肌酸酐、钾、硝酸脲、平均红细胞血红蛋白浓度、平均红细胞容积、淋巴细胞、嗜中性粒细胞、血小板、白细胞和凝血酶原时间有些差异，在一日或多日不一致，但一般与剂量无关。血液学参数在治疗组之间或随时间有些变化。一般而言，血清化学和血液学参数看起来不受处理影响。用Dunnett′s t检验将每个治疗组与载体对照组进行比较。表7包括这些参数，其中各治疗组与载体对照组比较时显著性p值＜.05。凝血酶原时间在多个时间点(即第1、4、7、21和28日)之间显示有差异，但几乎没有证实是剂量相关反应。激活的部分凝血激酶未受处理影响。
表7：临床病理差异：治疗组与载体对照组的比较
  实验室测量   时间点  治疗组
  临床化学
  ALT   第28日  高剂量可磁性靶向载体-MMC颗粒可磁性靶向载体
  绝对活性淋巴细胞   第21日  高剂量可磁性靶向载体-MMC颗粒
  绝对淋巴细胞   第14、21日  中剂量可磁性靶向载体-MMC颗粒
  绝对单核细胞   第7日  中剂量可磁性靶向载体-MMC颗粒
  白蛋白   第7日  中剂量可磁性靶向载体-MMC颗粒高剂量可磁性靶向载体-MMC颗粒
  碳酸氢盐   第4日  可磁性靶向载体颗粒
  CK   第1日  低剂量可磁性靶向载体-MMC颗粒
  肌酸酐   第28日  高剂量可磁性靶向载体-MMC颗粒可磁性靶向载体
  钾   第4和28日  第4日高剂量可磁性靶向载体-MMC颗粒第28日低剂量可磁性靶向载体-MMC颗粒和高剂量可磁性靶向载体-MMC颗粒
  硝酸脲   第14、28日  第14日高剂量可磁性靶向载体-MMC颗粒第28日中剂量可磁性靶
  向载体-MMC颗粒
  血液学
  淋巴细胞％   第4日   可磁性靶向载体颗粒
  MCHC   第21日   所有组
  MCV   第1日   可磁性靶向载体颗粒
  单核细胞％   第7日   中剂量可磁性靶向载体-MMC颗粒
  分叶核嗜中性粒细胞％   第4日   可磁性靶向载体颗粒
  绝对分叶核嗜中性粒细胞   第4日   低剂量可磁性靶向载体-MMC颗粒
  血小板   第1日   高剂量可磁性靶向载体-MMC颗粒
  WBC   第1日   中剂量可磁性靶向载体-MMC颗粒
用可磁性靶向载体-MMC颗粒处理的动物中MMC的循环水平在3小时取样期间内测量的所有时间点都低于单独用MMC处理的动物。计算的药代动力学参数见表8。这些数据表明无论MMC作为可磁性靶向载体-MMC颗粒给药还是作为MMC自身给药，该药都迅速分布，具有约8分钟的分布半衰期，然后是65分钟的消除半衰期。可磁性靶向载体-MMC颗粒表现为线性药代动力学，即曲线下面积(AUC)随剂量增加而增加且全身清除率(CL)值看起来不依赖于剂量。用MMC作为MMC而不是可磁性靶向载体-MMC颗粒给药时观察到的CL和稳态容积(Vss)的降低与当给予4mg MMC而不是4mg MMC相当量的可磁性靶向载体-MMC颗粒时观察到的较高血浆AUC一致。
表8：在猪中MMC药代动力学参数的计算值
  处理  AUC(ng/m1)xmin   Cmaxng/ml   CLml/min   VssL   αt1/2min   β或λt1/2min
  第一组可磁性靶向载体-MMC颗粒(0.25mgMMC)  208±75   3.0±1.1   1344±595   67.9±29.2   -   39.0±2.3
  第2组可磁性靶向载体-MMC颗粒(1mgMMC)  1433±307   40.0±2.0   718±143   52.6±12.4   8.3±1.3   65.9±18.6
  第3组可磁性靶向载体-MMC颗粒(4mgMMC)  3553±993   108.2±34.9   1181±295   89.8±36.3   7.9±2.5   68.0±24
  第5组单独MMC(4mg MMC)  6507±568   177.8±27.1   618±54   47.3±13.2   8.3±2.4   67.0±16.7
给药后28日研究结束尸体剖检时，18只动物中的7只中观察到大体损伤，其中包括中剂量可磁性靶向载体-MMC颗粒组的两只，高剂量可磁性靶向载体-MMC颗粒组的两只，单独可磁性靶向载体颗粒组的两只和载体对照组的一只。但是认为唯一与处理有关的大体损伤是在用高剂量可磁性靶向载体-MMC颗粒处理的一只动物的靶肺中存在的多发肺肉芽肿(图21)。许多肉芽肿在其中心处含有可磁性靶向载体颗粒。
与处理直接相关的显微变化仅限于给予可磁性靶向载体颗粒或可磁性靶向载体-MMC颗粒的那些组的肺部靶区。可磁性靶向载体颗粒的存在局限于这些动物的靶肺叶。多数动物的肺泡毛细血管中都观察到可磁性靶向载体颗粒(图22和23)。接受含有5mg可磁性靶向载体颗粒的低剂量可磁性靶向载体-MMC颗粒的动物中有两只的靶肺未观察到可磁性靶向载体颗粒。在这些情况中未检测到可磁性靶向载体颗粒可能是因为给予的可磁性靶向载体颗粒量少，或者可能是因为在肺部取样未包括靶区。除了在注意到用高剂量可磁性靶向载体-MMC颗粒处理的一只动物中存在多发肺肉芽肿之外，可磁性靶向载体颗粒在靶肺中的存在似乎与病理损伤无关。在许多肉芽肿的中心处可看可磁性靶向载体颗粒。在单独用高剂量可磁性靶向载体颗粒处理的动物中未见类似损伤，这表明MMC与高剂量的可磁性靶向载体颗粒的联合可能在引发异物反应中起作用。
在任何动物的非靶肺中都没有发现可磁性靶向载体颗粒或处理相关的异常。支气管和细支气管壁内、气道腔内和两叶肺的肺泡中血管周围预先存在的炎症比较普遍。该炎症是多灶性的，从急性至亚急性，大多数情况下是极轻度至轻度的。非靶肺叶以及对照组动物的肺中存在相似的炎症过程，这表明与测试品无关的病理过程预先存在。
除靶肺之外任何组织中都不存在可磁性靶向载体颗粒。特别地，在网状内皮系统中未发现可磁性靶向载体颗粒。认为非肺组织中的损伤是预先存在的，与给予测试品无关。接受可磁性靶向载体-MMC颗粒的一些动物出现胸腺萎缩，接受可磁性靶向载体-MMC颗粒或MMC的一些动物出现胃溃疡，但与剂量无关。所见损伤主要为肾脏、膀胱、食道、舌、皮肤、胆囊、唾液腺和胃的亚急性和极轻度至轻度的炎症。对照组炎症的发生率与治疗组相似。
生物学显著性的大体损伤和显微损伤仅限于接受含有80mg可磁性靶向载体颗粒和4mg MMC的高剂量可磁性靶向载体-MMC颗粒的一只动物的肺靶区。只在用可磁性靶向载体-MMC颗粒或可磁性靶向载体颗粒处理的动物的靶肺叶中发现可磁性靶向载体颗粒，这表明药物载体的定位和保留作用。在可磁性靶向载体-MMC颗粒处理的动物中，循环血液中MMC的水平至少是MMC对照动物的一半，这表明在可磁性靶向载体-MMC颗粒治疗组中该药物与靶点接触更长的时间。无不良反应的水平被认为是含有20mg可磁性靶向载体和1mg MMC的中剂量可磁性靶向载体-MMC颗粒治疗组。

Claims (34)

1.一种可磁性靶向载体组合物，其包含活性炭和铁的复合颗粒，其中所述碳随机分布于整个颗粒体积中，其中每个颗粒中含有的铁与活性炭的重量比为约95∶5至约50∶50，且其中每个颗粒中含有的丝裂霉素C与碳和铁总重量的重量比为约1∶100至约20∶100。
2.权利要求1的可磁性靶向载体组合物，其中所述丝裂霉素C与碳和铁总重量的重量比为约1∶100至约10∶100。
3.权利要求1的可磁性靶向载体组合物，其中所述丝裂霉素C与碳和铁总重量的重量比为约5∶100。
4.权利要求1的可磁性靶向载体组合物，其中所述颗粒的平均粒径小于5μm。
5.权利要求1的可磁性靶向载体组合物，其中所述磁性组合物中所述颗粒的平均粒径为约0.1μm至约20μm。
6.权利要求1的可磁性靶向载体组合物，其中所述颗粒的平均粒径为约0.5μm至约5μm。
7.权利要求1的可磁性靶向载体组合物，其中约95％颗粒的主要尺寸为约0.5μm至约5μm。
8.权利要求1的可磁性靶向载体组合物，其中所述活性炭选自Norit A、B、E和K和它们的化学修饰体及组合。
9.权利要求1的可磁性靶向载体组合物，其中所述活性炭是KB型碳。
10.权利要求8或权利要求9的可磁性靶向载体组合物，其中所述铁与活性炭的重量比为约85∶15至约60∶40。
11.权利要求8或权利要求9的可磁性靶向载体组合物，其中所述铁∶碳比例为86∶14至64∶36。
12.权利要求8或权利要求9的可磁性靶向载体组合物，其中所述铁∶碳比例为65％∶35％。
13.权利要求1、8或9的可磁性靶向载体组合物，其中所述铁含有约低于5％的氧化铁。
14.权利要求8或权利要求9的可磁性靶向载体组合物，其中所述颗粒的平均粒径为约0.6至约3.5微米。
15.权利要求1的可磁性靶向载体组合物，其中所述颗粒对其它生物活性物质的吸附能力达到所述颗粒质量的20％。
16.权利要求1的可磁性靶向载体组合物，其中复合颗粒具有吸附于其上的治疗有效量的其它生物活性物质，所述生物活性物质不同于丝裂霉素C，且所述碳是活性炭。
17.权利要求16的可磁性靶向载体组合物，其中所述其它生物活性物质选自药物、放射性物质、遗传物质或其组合。
18.权利要求16的可磁性靶向载体组合物，其中所述一种或多种其它生物活性物质选自抗生素、抗真菌剂和其它抗肿瘤剂。
19.权利要求1的可磁性靶向载体组合物，其中所述复合颗粒具有吸附于其上的诊断有效量的其它生物活性物质。
20.一种可磁性靶向载体组合物和丝裂霉素C的制剂，其中所述制剂包含：
权利要求1的可磁性靶向载体组合物；和
递送载体。
21.权利要求20的制剂，其中在吸附于所述可磁性靶向载体上之前丝裂霉素C的浓度为约0.5至约1mg/mL。
22.权利要求20的制剂，其中在吸附于可磁性靶向载体上之前丝裂霉素C的浓度为约0.75mg/mL。
23.权利要求20的制剂，其中所述制剂中含有赋形剂。
24.权利要求23的制剂，其中所述赋形剂是甘露糖醇。
25.权利要求23的制剂，其中所述赋形剂的浓度为终制剂重量的约5％至约10％。
26.权利要求25的制剂，其中所述赋形剂的浓度为约6.7％。
27.权利要求20的制剂，其中所述递送载体包含：
盐；
聚合物；和
溶剂。
28.权利要求27的制剂，其中所述糖是甘露糖醇。
29.权利要求27的制剂，其中所述甘露糖醇的浓度为100mg/mL。
30.权利要求27的制剂，其中所述聚合物是羧甲基纤维素。
31.权利要求27的制剂，其中羧甲基纤维素的浓度为3mg/mL。
32.权利要求27的制剂，其中所述递送载体包含甘露糖醇、羧甲基纤维素和水。
33.权利要求27的制剂，其中所述递送载体包含约100mg甘露糖醇、约3mg羧甲基纤维素和约897mg水。
34.权利要求27的制剂，其中所述递送载体包含溶液，所述溶液当经布鲁克菲尔德粘度计在40℃和60rpm下测定时粘度为约14±2cP。
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