CN1970741A

CN1970741A - 一种超级工程菌及其表达的解毒酶和其构建方法及应用

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Publication number: CN1970741A
Application number: CNA2005100869573A
Authority: CN
Inventors: 乔传令; 申本昌; 兰文升; 丛健
Original assignee: Institute of Zoology of CAS
Current assignee: Liaoning middle science bioengineering Limited by Share Ltd
Priority date: 2005-11-23
Filing date: 2005-11-23
Publication date: 2007-05-30
Anticipated expiration: 2025-11-23
Also published as: CN1970741B

Abstract

本发明涉及一种降解农药残留的超级工程菌，该超级工程菌已于2005年11月10日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，其保藏号为CGMCC No.1529。其为将细胞色素氧化还原酶P450 CYP9G2和细胞色素P450还原酶的基因分别克隆到表达载体pETDuet－1上，构建得到融合表达载体pETDuet－CYP－POR，然后转化到大肠杆菌，筛选得到的。本发明还提供一种上述超级工程菌用异丙基硫代半乳糖苷诱导表达的解毒酶。该超级工程菌和解毒酶可以同时降解马拉硫磷、对硫磷、高效氯氰菊酯、三氯杀虫酯等有机酸酯和有机磷类农药；可以用于有机磷中毒温血动物的解毒。

Description

一种超级工程菌及其表达的解毒酶和其构建方法及应用

技术领域

本发明涉及一种超级工程菌及其构建和应用，以及该超级工程菌表达的解毒酶及其应用，具体地说是涉及一种可以降解农药残留的超级工程菌和其表达的解毒酶，以及它们的构建方法和应用。

背景技术

环境是人类活动空间及其周围一切要素的综合，是人类发展的前提和基础。环境的优美是生活质量和经济发展的主要标志。资源是人类赖以生存和发展的基础，是人类生产资料和生活资料的基本源泉。我们正在迈向下21世纪，中国的现代化已经进入一个新的阶段。我们的资源与环境能否支撑国民经济的快速发展？经济的快速发展会不会以资源过度耗竭和环境的破坏为代价？这都是关系到民族盛衰、国家兴亡的大事，决不可等闲视之。我们必须准确预测未来，早筹对策。

基因工程已成为环境保护的重要手段，其途径是培养微生物、转基因微生物和转基因藻类用之有效的降解固态废物和有毒化学物品、清除泄漏油、进行废水和有毒有害农药等污染水及土壤的处理。高技术发展到今天，各领域的进一步交叉融合已成为促进高技术发展的一种重要趋势。

近几十年来，化学农药一直是园林农业中控制病虫草、鼠害的主要手段品种和销量逐年增加。化学农药在控制病虫草、鼠害提高产量的同时，也破坏了生态，污染了环境，每年50万余吨的农药用量的70％将流入江河土壤，而且有的农药消解速度慢，空气中农药浓度将维持一个相当长的时间，并由于其残留对水域、食品的污染直接危害了人体健康以及动物的安全，污染的地表水又直接污染着地下水，正如伟大导师恩格斯教导的那样“人类正在承受着大自然所给予的报复”。而为确保粮食丰收，农药又是必不可少的，因此，脱毒、净化水资源，综合治理水环境污染刻不容缓，势在必行。

脱毒工程菌可用于降解被有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂污染的水源、土壤。国外有人已鉴定出耐药昆虫中与脱毒有关的酶类，然后从蚜虫中分离出控制该酶合成的基因，并将其克隆转入细菌中进行大规模培养，用于污水处理。但因其基因片段很小，故在细菌中的表达效率很低而没有应用价值。

农药是人们主动投放入环境中数量大、毒性强的一类化学物质。自从有机农药DDT问世以来，化学防治一直是病虫草鼠害防治中的重要组成部分，是农产品产量提高的重要措施之一。但是，大量不合理使用化学农药，引起害虫抗性的迅速发展，而农民对抗药性的反应则是加大用药量，反复使用农药，对农药的使用和依赖程度呈现出恶性循环状态。而且，这些弊端随着农药品种和生产销售量的逐年增加而继续着。

据估计，全世界大约每年有四百万吨农药施用于田间，但是大约不过1％的农药到达靶标生物(Pimentel，1983)，而99％的农药或附着于作物与土壤，或飘散在大气中，通过降雨等经地表径流进入地表水和地下水，对土壤、水系、空气、植物、野生动物都产生了负面影响。杀虫剂在杀灭有害生物的同时，也杀伤了有益生物(天敌、蜜蜂、鸟类、兽类、家蚕、蚯蚓、土壤微生物及一些濒危珍稀生物)，引起害虫再猖獗，使害虫的发生频次增加(Pimentel et al，1993)。到1990年，已有504种害虫与螨类对一种或数种化学农药产生了抗药性(Georghiou，1990)。由此引起害虫防治时化学农药用量的增加，更加重了环境污染。

农药污染对人类健康亦造成极大危害。据估计，全世界每年有两百万人农药中毒，两万人死亡(龙惠珍等，1997)。Pimentel等(1992)认为农药的使用给美国造成的直接损失每年达30亿美元，引起社会与环境的总代价高达81亿美元，相当于美国化学农药效益值162亿美元的50％。所以寻找处理环境中农药污染的方法成为重要研究课题。

目前，农药污染的处理方法很多，概括起来包括化学处理、焚烧、掩埋和生物整治等方法。化学处理方法可行性强，但在处理过程中产生大量的酸和碱，这些物质还必须再加处理。焚烧可能是降解这些污染物最可靠的方法。但是，处理过程中放出大量的毒气，而且需要大量的热能。掩埋也存在问题，主要表现在对其周围的土壤和水源造成二次污染(Richard et al，1997)。

事实上，自从地球上产生生命以来，环境生物降解就已存在，而且在很多情况下，对一些生物的生长、发育来说是非常重要的。这就是生物协同进化的一个表现。环境科学中，生物整治定义为利用生物材料来降低或减轻环境中的有害物质。它包括直接利用自然环境材料来降解和利用基因工程改造过的材料来降解(Roe et al，1998)。所以生物整治有很多优点，比如不会造成二次污染，对环境友好，直接利用自然环境的材料、能源，公众易于接受等。其中最突出的优点是生物整治可在污染现场处理污染土壤或污染水体，最大限度地降低污染物浓度，环境负面影响小，对自然生态环境影响小。

近半个世纪以来，随着分子生物学的突破性进展和对微生物代谢机制的深入研究，利用遗传工程手段，对微生物的代谢途径和遗传机制进行优化和改造、增加其生物降解能力和降解范围、加强环境适应性，已不仅限于实验室研究，而且已在实际应用中初露锋芒，显示出环境生物技术在解决环境问题中的巨大潜力。

但是最近随着对昆虫抗药性机理的深入研究，昆虫基因在生物整治中地应用也引起了极大的关注。昆虫之所以能在不同的条件下存活下来，是由于它们惊人的适应能力，其中即包括独特的降解农药的能力。这些农药包括有机氮，有机磷，氨基甲酸酯，拟除虫菊酯，甚至Bt生物农药(Gould et al.，1995；Sparks et al.，1993)。许多与抗性相关的酯酶已被纯化和定性(Anspaugh et al，1995；Sparks et al.，1993)，它在抗性中起到降解和隔绝农药的作用。更使我们感受鼓舞的是，英国Devonshire教授已经加入澳大利亚联邦科学和工业研究会(CSIRO)，正在努力用昆虫体内酶进行有机磷农药的生物降解。他认为，抗性昆虫体内已经产生了分解有害化学物质的能力，如果我们能大量地生产这种酶，并以适当的方式使用于田间，那么环境中的有害化学物质的残留即也能被分解(Vries，2000)。目前有很多实验室在进行这方面的工作，比如，美国北卡罗莱那州的Roe教授等(1996)和Rose博士等(1997)将P450家族中的CYP9A1转入大肠杆菌和烟草等来进行底物的特异性实验和农药的降解实验。澳大利亚的Oakeshott博士等(2001)用果蝇esterase-6基因来进行灌溉废水的解毒处理和果蔬表面的净化处理。

发明内容

本发明的目的在于为了解决我国作为一个农业生产大国而不得不大量使用农药，在环境中存在着严重的农药残留的污染问题，为了消除农药残留污染对国民经济造成的损失和对人民健康的危害，从而提供一种能有效降解化学农药的超级工程菌。

本发明的另一目的在于提供上述超级工程菌表达的解毒酶。

本发明的再一目的在于提供上述超级工程菌和解毒酶的构建方法。

本发明的还一目的在于提供上述超级工程菌和解毒酶的应用。

本发明的目的是通过如下的技术方案实现的：

本发明提供一种降解农药残留的超级工程菌，该超级工程菌含有细胞色素氧化还原酶(P450 CYP9G2)和NADPH-细胞色素P450还原酶(POR)的基因，能表达细胞色素氧化还原酶(P450 CYP9G2)和NADPH-细胞色素P450还原酶(POR)。该超级工程菌CYP9G2-POR已于2005年11月10日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》(北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所)，其保藏号为CGMCC No.1529，其分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli。

所述的细胞色素氧化还原酶(P450 CYP9G2)为具有如下氨基酸序列的蛋白质：

(i)具有图1所述的氨基酸序列；或

(ii)将图1所述的氨基酸序列经过取代、缺失或叠加一个或几个氨基酸残基且具有与(i)相同的细胞色素氧化还原酶(P450 CYP9G2)功能的衍生的蛋白质。

所述的NADPH-细胞色素P450还原酶为具有如下氨基酸序列的蛋白质：

(iii)具有图2所述的氨基酸序列；或

(iv)将图2所述的氨基酸序列经过取代、缺失或叠加一个或几个氨基酸残基且具有与(iii)相同的辅酶功能的衍生的蛋白质。

本发明提供一种上述降解农药残留的超级工程菌的构建方法，包括如下步骤：

1)按常规方法，分别克隆细胞色素氧化还原酶(P450 CYP9G2)和细胞色素P450还原酶(POR)的基因；

所述的细胞色素氧化还原酶(P450 CYP9G2)的基因为具有图1所示的核苷酸序列；

所述的细胞色素P450还原酶的基因为具有图2所示的核苷酸序列；

2)将步骤1)得到的细胞色素氧化还原酶P450 CYP9G2和细胞色素P450还原酶的基因按照如图3所示的构建程序，分别克隆到表达载体pETDuet-1上，构建得到融合表达载体pETDuet-CYP-POR，具体构建方法如下；

以噬粒λTriplEx2-CYP9G2为模板作PCR，扩增CYP9G2基因和以pGEM-POR载体为模板作PCR，扩增POR基因；

CYP9G2基因的引物：

CYP-上游：5′GA G GAT CCC ATG ATT GCG GAA ATA TTA AT 3’

CYP-下游：5′AC C TGC AGT TAA TTC CTG GAG CGG AAC T 3’

POR基因的引物：

POR-上游：5′TC A GAT CTG ATG AAA TAC CTG CTG CCG ACC 3′

POR-下游：5′TA C TCG AGG CTC CAA ACG TCC GCG GAA T 3

经PCR扩增得到的CYP9G2基因和POR基因分别插入双表达载体pETDuet的第一和第二多克隆位点，并且保证两个基因阅读框正确；CYP9G2基因自身具有完整的开放阅读框，并且与载体上的His-Tag融合表达；POR基因自带起始密码子，它的终止密码子克隆时被缺失，在载体上与S-Tag序列正确通读，使用载体上自带的终止密码子，使表达的B1蛋白携带有S-Tag标签；两个基因均带有融合标签，以利于表达产物的检测和纯化；

3)转化重组菌株：

将步骤2)构建得到的表达载体pETDuet-CYP-POR转化到大肠杆菌，筛选得到重组菌株CYP9G2-POR，即本发明的超级工程菌，已于2005年11月10日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，其保藏号为CGMCC No.1529。

所述步骤1)的细胞色素氧化还原酶P450 CYP9G2是从抗有机磷磷的小菜蛾中克隆得到的，构建对农药具有抗性的小菜蛾(diamondback moth)cDNA文库，从文库中钓取细胞色素氧化还原酶P450 CYP9G2，提交GenBank注册(Accession number：AB096739)，命名为CYP9G2；其为具有图1所示的核苷酸序列。

所述步骤1)的细胞色素P450还原酶的基因是从家蝇中克隆得到的，根据家蝇的NADPH-细胞色素P450还原酶的cDNA序列(GenBank登录号：L19897)设计引物，从单个家蝇提取的mRNA合成cDNA，以此cDNA为模板，用RT-PCR的方法获得家蝇细胞色素P450还原酶基因，命名为POR；其为具有图2所示的核苷酸序列。

本发明提供一种由上述超级工程菌表达的解毒酶，由如下的方法得到的：将上述超级工程菌CYP9G2-POR的培养液，用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，在14～25℃诱导16～22小时，在5000×g离心5分钟，收集经诱导的超级工程菌，重新用PBS调节细菌的浓度为OD₆₀₀＝1,5000×g离心，5分钟重新收集细胞，再次加入培养液的1/10的体积(OD₆₀₀＝1)的PBS，10倍浓缩菌液，细菌菌液中加入溶菌酶使其终浓度为100μg/ml，加入1/10体积的1％Triton X-100，30℃温浴15分钟，在冰浴条件下超声波裂解处理，再离心去除沉淀，得到的上清液即为本发明的超级工程菌(CYP9G2-POR)表达的解毒酶粗酶液。

本发明提供一种上述降解农药残留的超级工程菌和解毒酶的用途，该超级工程菌和解毒酶可以同时降解马拉硫磷、对硫磷、高效氯氰菊酯、三氯杀虫酯等有机酸酯和有机磷类农药；可以用于有机磷中毒温血动物的解毒。

本发明提供的降解农药残留的超级工程菌的解毒酶的优益之处在于，其为用分子生物学方法构建的超级工程菌，该超级工程菌利用了可以共表达两个目的基因的表达载体pETDuet，在载体的多克隆位点上同时引入了表达编码昆虫的P450氧化还原酶和其辅酶NADPH-细胞色素P450还原酶的基因，其中P450氧化还原酶基因在微生物细胞内的融合表达量占总蛋白量的56％。因而，由该超级工程菌制得的P450氧化还原酶和其辅酶NADPH-细胞色素P450还原酶有较好地降解有机磷类、氨基甲酸酯类化合物的功能，对农药残留的降解谱加宽，对有机磷类、氨基甲酸酯类和拟除虫菊酯类等都能有效降解。该P450氧化还原酶和其辅酶NADPH-细胞色素P450还原酶具有较高的降解有机酸酯类农药的能力，在2hrs即可降解杀螟硫磷64.0％、甲基对硫磷62.0％，乐果53％。本发明提供的降解残留农药的P450氧化还原酶和其辅酶NADPH-细胞色素P450还原酶为利用真核和原核生物的自然资源对残留在水源、土壤中农药等有毒有害化合物污染的生物治理提供了一条新途径，其可以降解污染水中的有机磷类农药残留、有机磷神经毒剂和一些内分泌干扰化合物，氨基甲酸酯类以及拟除虫菊酯类等。

本发明是将一高效解毒酶基因构建重组质粒，再将该重组质粒转化大肠杆菌，在特定抗生素的选择下得到的阳性克隆——即为带有高效解毒基因的菌株。该菌株可高效表达解毒酶基因，特异性降解有机磷酸酯、氨基甲酸酯和有机氯酯类等有毒有害化合物，其解毒酶基因表达量高，脱毒功能显著，且能够遗传，故被称为脱毒工程菌。目前，国内外农业环境污染日益加重，被农药等有毒有害物质污染的水源和土壤较多，中国受污染的耕地近2000万公顷，约占耕地总面积的1/5；全国每年因环境污染减产粮食130亿公斤。因此，研究与开发农业环境污染治理技术仅在我国就具有十分广阔的市场需求前景。所以本发明具有较好的应用前景及深远的社会经济效益。我们还拟研制投产条件并不苛刻的生物反应器，用于各农药厂等的排污前处理等，以便使排出的污水达到可排放指标。

附图说明

图1为小菜蛾p450氧化还原酶的基因编码区和其相应的氨基酸序列；

图2为NADPH-细胞色素P450还原酶的基因编码区和其相应的氨基酸序列；

图3为重组质粒pETDuet-CYP-POR的构建示意图；

图4为解毒酶在E.Coli BL21(DE3)中表达的SDS-PAGE分析图；其中，M.蛋白质分子量标准，1.诱导转化pETDuet-CYP的E.coli菌体总蛋白，2.未经诱导的转化pETDuet-CYP的E.coli菌体总蛋白(对照)3.诱导转化pETDuet-CYP-POR的E.coli菌体总蛋白，4.未经诱导的转化pETDuet-CYP-POR的E.coli菌体总蛋白(对照)；

图5为本发明的解毒酶对杀螟硫磷的降解曲线。

具体实施方式

实施例1、构建本发明的重组质粒pETDuet-CYP-POR表达的超级工程菌

本发明提供的含有细胞色素氧化还原酶P450 CYP9G2和细胞色素P450还原酶的基因的超级工程菌的克隆如下：

1.1质粒和受体菌

小菜蛾CYP9G2基因的克隆

1)总RNA的提取

1-1)按TRIzol试剂盒操作程序，提取小菜蛾幼虫总RNA：2RT-PCR反应

1-2)用反转录的第一链cDNA作为模板进行PCR反应，向PCR反应管中加入以下试剂，轻轻混匀反应体系；

10×PCR Buffr 2.5μl

50mM MgCl₂ 0.75μl

10mM dNTPs mixture 0.5μl

Forward primer(10μM) 0.5μ1

Reverse primer(10μM) 0.5μl

cDNA 1μl

Taq DNA polymerase(5U/μl) 0.5μl

autoclaved distilled water 18.75μl

1-3)PCR反应的反应程序为：95℃热变性5min，然后94℃30s，60℃退火1min，72℃延伸2min，共30个循环，最后进行72℃延伸10min；

1-4)用1％的普通琼脂糖电泳，检查PCR扩增产物。

2)cDNA文库的构建、扩增、筛选等参照Sambrook等的方法进行，具体步骤如下：

2-1)用序列特异性引物筛选基因文库，根据RT-PCR产物测序的结果，设计一对序列特异性引物，用逐步富集文库中阳性克隆的方法，利用变性的文库作为模板，进行PCR(Lardelli et al，1994)；

GSP1：5′-GCTAATGAGGCACTGAGGAAGTGGT-3′

GSP2：5′-ATGCAATTCCTAGGTCCAGTTCCAA-3′

反应条件：

95℃热变性5min，然后94℃保持30s，62℃保持30s，72℃延伸1min，共30个循环，最后进行72℃延伸10min；

PCR反应体系如下：

10×PCR buffer 5μl

dNTP(1mM) 5μl

MgCl₂(25μM) 2.5μl

文库模板 1μl

H₂O 33.5μl

Primer GSP1(10μM) 1.25μl

GSP2(10μM) 1.25μl

Taq polymerase(5U/μl) 0.5μl

2-2)阳性噬菌体插入序列的测序：

为了对阳性的噬菌体文库进行测序，必须将阳性的噬菌体载体(λTriplEx)转换为可以测序的质粒载体(pTriplEx)。

首先将重组的阳性噬菌体和大肠杆菌BM25.8共同培养，让噬菌体转染BM25.8，而BM25.8在31℃生长时，可以产生一种Cre重组酶，该酶能使噬菌体的插入片段经过位点特异性的重组，使插入片段准确地重组到质粒载体的loxP位置上。这样转染后重组的质粒载体就可以在大肠杆菌中大量繁殖，因此可以得以测序。

2-3)cDNA和λTripIEx2载体左右臂的连接

取1μl载体，1μl对照插入片段，1.5μl去离子水及其他相关试剂。16℃连接过夜。包装并测定滴度，滴度应不小于10⁷pfu/μg；按下表(cDNA与载体连接反应的优化方案)在3个0.5ml离心管中加入试剂，轻轻混匀混合物，稍离心收集内容物于管底，16℃连接过夜即可得到噬粒λTriplEx2-CYP9G2。

将此噬粒λTriplEx2-CYP9G2用作P450基因的模板，质粒pGEM-POR作为P450还原酶基因来源，构建方法如上。Escherichia coli strain BL-21(DE3)用作表达菌，质粒pETDuet购自Novagen公司用作表达CYP基因和POR基因的载体，该质粒在大肠杆菌E.coli.DH5α增殖，所有宿主菌株BL-21(DE3)。

所述的细胞色素氧化还原酶P450 CYP9G2为具有图1所示的核苷酸序列，也可以是从抗有机磷磷的小菜蛾中克隆得到。构建对农药具有抗性的小菜蛾(diamondbackmoth)cDNA文库，从文库中钓取细胞色素氧化还原酶P450，CYP9G2，提交GenBank注册(Accession number：AB096739)，命名为CYP9G2。

所述的细胞色素P450还原酶的基因为具有图2所示的核苷酸序列，也可以从家蝇中克隆得到。根据家蝇的NADPH-细胞色素P450还原酶的cDNA序列(GenBank登录号：L19897)设计引物，从单个家蝇提取的mRNA合成cDNA，以此cDNA为模板，用RT-PCR的方法获得家蝇细胞色素P450还原酶基因，命名为POR。

1.2工具酶及试剂

Ex Taq DNA聚合酶、各种限制性内切酶BamHI、PstI、BglII、XhoI和T₄ DNA连接酶均为TaKaRa产品；连二亚硫酸钠、NADPH和DTT(1，4-二硫代苏糖醇)购自上海生物工程有限公司；δ氨基γ酮戊酸(δ-Aminolevulinic acid，δ-ALA)购自百灵威公司。

1.3培养基和培养条件

细菌增殖培养所使用培养基为LB培养基，含质粒菌体的培养基中加氨苄青霉素终浓度为50μg/ml，经转化重组质粒的细菌培养至菌体密度为OD₆₀₀＝0.6时加入终浓度为1mM IPTG，同时加入δ-ALA(500mM)50μl，使终浓度为0.5mM在30℃继续诱导培养。

1.4表达载体的构建

根据本研究组在GenBank(登录号：AB096739)注册的小菜蛾细胞色素P450基因的cDNA序列，设计了一对特异引物，并在引物上引入了不同的限制性内切酶位点。以噬粒λTriplEx2-CYP9G2为模板作PCR，扩增CYP 9G2基因。引物由上海博雅生物工程公司合成，序列为：

CYP-up：5′GA G GAT CCC ATG ATT GCG GAAATA TTAAT 3’

CYP-down：5′AC C TGC AGT TAA TTC CTG GAG CGG AAC T3’

上游引物引入BamHI位点，下游引物引入PstI位点，5`端各引入两个酶切位点保护碱基。

根据家蝇的还原酶cDNA序列(GenBank登录号：L19897)设计引物，以本研究室保存的pGEM-POR载体为模板作PCR，扩增POR基因。引物由上海博雅生物工程公司合成，序列为：

POR-up：5′TC A GAT CTG ATG AAA TAC CTG CTG CCG ACC 3′

POR-down：5′TA C TCG AGG CTC CAA ACG TCC GCG GAA T 3

上游引物引入BglII位点，下游引物引入XhoI位点，5`端各引入两个酶切位点保护碱基。

PCR扩增体系：取模板2μl加入上游引物1μl、下游引物1μl、2.5mM dNTP2μl、10×buffer 2.5μl、ExTaq DNA聚合酶0.25μl，补充去离子水至总反应体系为25μl，进行PCR扩增，PCR反应条件：

扩增CYP9G2基因PCR反应条件：

95℃ 3min 1个循环

94℃ 1min

58℃ 1min 30个循环

72℃ 1min

72℃ 7min 1个循环

扩增POR基因PCR反应条件：

95℃ 3min 1个循环

94℃ 1min

54℃ 1min 30个循环

72℃ 1min

72℃ 7min 1个循环

经PCR扩增得到的CYP 9G2基因和POR基因分别插入双表达载体pETDuet的第一和第二多克隆位点，并且保证两个基因阅读框正确。CYP 9G2基因自身具有完整的开放阅读框，并且与载体上的His-Tag融合表达。POR基因自带起始密码子，它的终止密码子克隆时被缺失，在载体上与S-Tag序列正确通读，使用载体上自带的终止密码子，使表达的B1蛋白携带有S-Tag标签。两个基因均带有融合标签，以利于表达产物的检测和纯化。

构建程序如图3所示，经过克隆程序，得到融合表达载体pETDuet-CYP-POR。

1.5转化大肠杆菌BL-21(DE3)

将构建得到的表达载体pETDuet-CYP-POR转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌，即本发明的超级工程菌，已于2005年11月10日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，其保藏号为CGMCC No.1529。

1.6解毒酶的制备与提取

从新鲜转化的平板挑取单克隆菌落，加入含50μg/ml氨苄青霉素的2ml LB培养基37℃震荡培养8-10hr，然后将2ml培养液注入50ml含氨苄青霉素的培养液继续培养。当细胞的浓度OD₆₀₀＝0.6时加入500μl IPTG(浓度为100mM)使IPTG终浓度为1mM，加入δ-ALA(500mM)50μl，使终浓度为0.5mM，用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，在25℃诱导，继续培养22小时。5000×g离心5min收集经诱导的细菌，重新用PBS调节细菌的浓度为OD₆₀₀＝1，5000×g离心5min重新收集细胞，再次加入1/10体积(OD₆₀₀＝1)的PBS，使菌液浓缩倍数为10×，细菌菌液中加入溶菌酶使其终浓度为100μg/ml，加入1/10体积的1％Triton X-100，30℃温浴15min，在冰浴条件下超声波裂解处理，得到本发明的解毒酶。

以类似的方法，构建融合表达载体pETDuet-CYP，并转化到大肠杆菌BL-21(DE3)，得到CYP9G2 P450单表达基因工程菌。以同样条件进行诱导表达，得到以CYP9G2P450单表达P450 9G2的酶。

用12％SDS-PAGE进行分析，电泳完毕后将凝胶用考马斯亮蓝染色，然后用脱色液脱色，同时用薄层扫描仪分析目的蛋白的相对含量。结果如图4所示，由各种菌在E.Coli BL21(DE3)中表达的SDS-PAGE分析图可知本发明的超级工程菌诱导表达产生的解毒酶的效率与细胞色素氧化还原酶P450 CYP9G2(CYP9G2)单独表达的效率是一致的。

实施例2、本发明的解毒酶对杀螟硫磷(fenitrothion)、乐果(dimethoate)、甲基对硫磷(methyl parathion)等的降解作用的测定

在100ml三角瓶中加入20ml水，1ml 2％TritonX-100，加入适量农药的乙醇溶液，使农药的终浓度为10ppm，加入0.02M，pH7.0磷酸缓冲液补齐体积，使总体积为10mL。将其充分混匀后加入4mL实施例1制备的解毒酶粗酶液(约合30mg总蛋白)，置30℃-32℃摇床摇动。分别在0min，20min，40min，60min，80min和120min取样。每个时间点取两个重复，实验以实施例1制备的CYP9G2 P450单表达P450 9G2的酶为对照组。取出1ml处理液置于5ml试管中，加入1ml重蒸正己烷，在混旋器上振荡3min充分混匀、提取，然后于6500rpm离心15min，取上清液，重复提取一次，将取出的上清液合并后使用气相色谱仪和氮磷检测器测定不同时间正己烷提取液中杀螟硫磷的残留量的含量，以检测解毒酶对杀螟硫磷的降解速率，具体测试条件如下：使用惠普5890II型气相色谱仪，配自动进样器(HP 7673 autosampler)，载气：N₂气，1mL/min流量，检测器：氮磷检测器(GC-NPD)和色谱柱：fused silica capillary column(0.53mm i.d.×30m×0.5μm film thickness，Supelco Corp.USA)，进样口温度：300℃，检测气温度：300 ℃，柱温：220℃，分流不分流：不分流进样，进样量：1μL。其实验结果列于表1。

表1、本发明的解毒酶对以下有机磷农药的降解作用

1.本实验以实施例1制备的CYP9G2 P450单表达P450 9G2的酶作为对照组。

2.降解效果中，“+”为与对照组相比较有显著降解效果，“-”为与对照组相比较降解效果不显著。

3.其中，敌敌畏(dichlorovos)在对照组中有降解，为41％，与以CYP9G2 P450基因和NADPH双表达在E.coli中的实验组降解数据39％，相接近，刨除误差等因素，视为无降解效果。原因可能有两点：a)单表达的P450酶或E.coli中原有的酶对敌敌畏有降解作用。b)敌敌畏在实验水溶液所给定的条件下，自身能迅速降解。

图5为本发明的解毒酶对杀螟硫磷的降解曲线。如图所示的结果可知，本发明的解毒酶在2小时可以降解64％杀螟硫磷，而同样条件下测得对照样品没有任何降解。从而可以可知：超级工程菌用一次诱导表达发酵培养的时间同时得到2种酶，p450氧化酶和p450氧化还原酶，该2种基因共表达后得到的2种酶同时都具有活性，如图显示的那样只使用p450氧化酶对杀螟硫磷没有任何降解效果，说明该氧化酶的降解活性必须有p450 NADPH还原酶的参与才能使反应进行。

本研究可以通过1次发酵过程得到具有生物活性的酶，大大减少了诱导表达发酵培养生产工程菌所需要的各种原材料，缩短时间，节约能源，降低成本，这样便可以提高在单位时间内大大降解毒物的速率，在处理水污染时将可以有效降低运行的成本，减少开支。

实施例3、本发明的解毒酶对氨基甲酸酯类杀虫剂的的降解作用的测定

在100ml三角瓶中加入20ml水，1ml 2％TritonX-100，加入适量农药的乙醇溶液，使杀螟硫磷农药的终浓度为10ppm，加入0.02M，pH 7.0磷酸缓冲液补齐体积，使总体积为10mL。将其充分混匀后加入4mL实施例1制备的解毒酶粗酶液(约合30mg总蛋白)，置30℃-32℃摇床摇动。分别在0min，20min，40min，60min，80min和120min取样。每个时间点取两个重复，实验以实施例1制备的CYP9G2 P450单表达P450 9G2的酶为对照组。取出1ml处理液置于5ml试管中，加入1ml重蒸正己烷，在混旋器上振荡3min充分混匀、提取，然后于6500rpm离心15min，取上清液，重复提取一次，将取出的上清液合并后使用气相色谱仪和氮磷检测器测定不同时间正己烷提取液中杀螟硫磷的残留量的含量，以检测解毒酶对杀螟硫磷的降解速率，具体测试条件如下：使用惠普5890II型气相色谱仪，配自动进样器(HP 7673 autosampler)，载气：N₂气，1mL/min流量，检测器：氮磷检测器(GC-NPD)和色谱柱：fused silica capillarycolumn(0.53mm i.d.×30m×0.5μm film thickness，Supelco Corp.USA)，进样口温度：300℃，检测气温度：300℃，柱温：220℃，分流不分流：不分流进样，进样量：1μL。其实验结果列于表2。

表2、解毒酶对氨基甲酸酯类农药的降解

1.实验以实施例1制备的CYP9G2 P450单表达P450 9G2的酶作为对照组。

由表2中的数据可知，本发明提供的解毒酶对氨基甲酸酯类的农药的降解效果不够理想，在所测定的农药中只对克百威和抗蚜威的效果较明显，对其他的降解效果较差。

SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院动物研究所

<120>一种超级工程菌及其表达的解毒酶和其构建方法及应用

<130>FPI05336

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1566

<212>DNA

<213>Plutella xylostella

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1563)

<400>1

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<212>PRT

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Val Ser Thr Thr Glu Asn Ser Phe Ile Lys Lys Leu Lys Ala Ser Gly

85 90 95

Arg Ser Leu Val Val Phe Tyr Gly Ser Gln Thr Gly Thr Ala Glu Glu

100 105 110

Phe Ala Gly Arg Leu Ala Lys Glu Gly Leu Arg Tyr Arg Met Lys Gly

115 120 125

Met Val Ala Asp Pro Glu Glu Cys Asp Met Glu Glu Leu Leu Gln Met

130 135 140

Lys Asp Ile Pro Asn Ser Leu Ala Val Phe Cys Leu Ala Thr Tyr Gly

145 150 155 160

Glu Gly Asp Pro Thr Asp Asn Ala Met Glu Phe Tyr Glu Trp Ile Thr

165 170 175

Asn Gly Glu Val Asp Leu Thr Gly Leu Asn Tyr Ala Val Phe Gly Leu

180 185 190

Gly Asn Lys Thr Tyr Glu His Tyr Asn Lys Val Ala Ile Tyr Val Asp

195 200 205

Lys Arg Leu Glu Glu Leu Gly Ala Thr Arg Val Phe Glu Leu Gly Leu

210 215 220

Gly Asp Asp Asp Ala Asn Ile Glu Asp Asp Phe Ile Thr Trp Lys Asp

225 230 235 240

Arg Phe Trp Pro Ser Val Cys Asp Phe Phe Gly Ile Glu Gly Ser Gly

245 250 255

Glu Glu Val Leu Met Arg Gln Phe Arg Leu Leu Glu Gln Pro Asp Val

260 265 270

Gln Pro Asp Arg Ile Tyr Thr Gly Glu Ile Ala Arg Leu His Ser Met

275 280 285

Gln Asn Gln Arg Pro Pro Phe Asp Ala Lys Asn Pro Phe Leu Ala Ser

290 295 300

Val Ile Val Asn Arg Glu Leu His Lys Gly Gly Gly Arg Ser Cys Val

305 310 315 320

His Ile Glu Leu Asp Ile Asp Gly Ser Lys Met Arg Tyr Asp Ala Gly

325 330 335

Asp His Ile Ala Met Tyr Pro Ile Asn Asp Lys Ile Leu Val Glu Lys

340 345 350

Leu Gly Lys Leu Cys Asp Ala Asn Leu Asp Thr Val Phe Ser Leu Ile

355 360 365

Asn Thr Asp Thr Asp Ser Ser Lys Lys His Pro Phe Pro Cys Pro Thr

370 375 380

Thr Tyr Arg Thr Ala Leu Thr His Tyr Leu Glu Ile Thr Ala Ile Pro

385 390 395 400

Arg Thr His Ile Leu Lys Glu Leu Ala Glu Tyr Cys Ser Asp Glu Lys

405 410 415

Asp Lys Glu Phe Leu Arg Asn Met Ala Ser Ile Thr Pro Glu Gly Lys

420 425 430

Glu Lys Tyr Gln Asn Trp Ile Gln Asn Ser Ser Arg Asn Ile Val His

435 440 445

Ile Leu Glu Asp Ile Lys Ser Cys Arg Pro Pro Ile Asp His Ile Cys

450 455 460

Glu Leu Leu Pro Arg Leu Gln Pro Arg Tyr Tyr Ser Ile Ser Ser Ser

465 470 475 480

Ser Lys Leu Tyr Pro Thr Asn Val His Ile Thr Ala Val Leu Val Gln

485 490 495

Tyr Glu Thr Pro Thr Gly Arg Val Asn Lys Gly Val Ala Thr Ser Tyr

500 505 510

Met Lys Glu Gln Asn Pro Ser Val Gly Glu Val Lys Val Pro Val Phe

515 520 525

Ile Arg Lys Ser Gln Phe Arg Leu Pro Thr Lys Ser Glu Ile Pro Ile

530 535 540

Ile Met Val Gly Pro Gly Thr Gly Leu Ala Pro Phe Arg Gly Phe Ile

545 550 555 560

Gln Glu Arg Gln Phe Leu Arg Asp Gly Gly Lys Val Val Gly Val Thr

565 570 575

Ile Leu Tyr Phe Gly Cys Arg Lys Lys Asp Glu Asp Phe Ile Tyr Arg

580 585 590

Glu Glu Leu Glu Gln Tyr Val Gln Ash Gly Thr Leu Thr Leu Lys Thr

595 600 605

Ala Phe Ser Arg Asp Gln Gln Glu Lys Ile Tyr Val Thr His Leu Ile

610 615 620

Glu Gln Asp Ala Asp Leu Ile Trp Lys Val Ile Gly Glu Gln Lys Gly

625 630 635 640

His Phe Tyr Ile Cys Gly Asp Ala Lys Asn Met Ala Val Asp Val Arg

645 650 655

Asn Ile Leu Val Lys Ile Leu Ser Thr Lys Gly Asn Met Asn Glu Ser

660 665 670

Asp Ala Val Gln Tyr Ile Lys Lys Met Glu Ala Gln Lys Arg Tyr Ser

675 680 685

Ala Asp Val Trp Ser

690

Claims

1、一种降解农药残留的超级工程菌，其于2005年11月10日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，保藏号为CGMCC No.1529。

2、如权利要求1所述的降解农药残留的超级工程菌，其特征在于：所述的超级工程菌含有细胞色素氧化还原酶P450 CYP9G2和NADPH-细胞色素P450还原酶POR的基因，能表达细胞色素氧化还原酶P450 CYP9G2和NADPH-细胞色素P450还原酶POR。

3、一种权利要求1所述的降解农药残留的超级工程菌的构建方法，包括如下步骤

1)按常规方法，分别克隆细胞色素氧化还原酶和细胞色素P450还原酶的基因；

所述的细胞色素氧化还原酶的基因为具有图1所示的核苷酸序列；

2)将步骤1)得到的细胞色素氧化还原酶和细胞色素P450还原酶的基因分别克隆到表达载体pETDuet-1上，构建得到融合表达载体pETDuet-CYP-POR，具体构建方法如下；

CYP9G2基因的引物：

CYP-上游：5′GA G GAT CCC ATG ATT GCG GAA ATA TTA AT3’

CYP-下游：5′AC C TGC AGT TAA TTC CTG GAG CGG AAC T3’

POR基因的引物：

POR-上游：5′TC A GAT CTG ATG AAA TAC CTG CTG CCG ACC 3′

POR-下游：5′TA C TCG AGG CTC CAA ACG TCC GCG GAA T3

3)转化重组菌株：

将步骤2)构建得到的表达载体pETDuet-CYP-POR转化到大肠杆菌，筛选得到重组菌株CYP9G2-POR，即本发明的超级工程菌。

4、如权利要求3所述的降解农药残留的超级工程菌的构建方法，其特征在于：所述步骤1)的细胞色素氧化还原酶P450 CYP9G2是从抗有机磷磷的小菜蛾中克隆得到的，其为具有图1所示的核苷酸序列；所述步骤1)的细胞色素P450还原酶的基因是从家蝇中克隆得到的，其为具有图2所示的核苷酸序列。

5、一种由权利要求1或2所述的超级工程菌表达的解毒酶，其为由如下的方法得到的：将所述的超级工程菌CYP9G2-POR的培养液，用异丙基硫代半乳糖苷诱导表达，在14～25℃诱导16～22小时，得到的本发明的超级工程菌表达的解毒酶。

6、一种权利要求1或2所述的降解农药残留的超级工程菌的用途，该超级工程菌可以同时降解马拉硫磷、对硫磷、高效氯氰菊酯、三氯杀虫酯等有机酸酯和有机磷类农药；可以用于有机磷中毒温血动物的解毒。

7、一种权利要求5所述的解毒酶的用途，该解毒酶可以同时降解马拉硫磷、对硫磷、高效氯氰菊酯、三氯杀虫酯等有机酸酯和有机磷类农药；可以用于有机磷中毒温血动物的解毒。