CN1970739B - 降解氯苯类化合物的细菌和方法 - Google Patents
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Abstract
一种可降解氯苯类化合物的细菌，它是光合细菌。利用该细菌在水中降解氯苯类化合物的方法，步骤包括：在含氯苯类化合物的光合细菌培养液中驯化菌种；将驯化菌种接入含20-200mg/L氯苯类化合物的光合细菌培养液中，在20-45℃、光照1000-3000Lx厌氧或微好氧条件下培养48-136h；或在20-45℃、自然光或黑暗、好氧条件下，培养4-120h，均可有效降解氯苯类化合物。该细菌可用于含有氯苯类化合物废水的处理。
Description
技术领域
本发明涉及废水生物处理，具体属于可降解氯苯类化合物的细菌以及利用该细菌降解水中氯苯类化合物的方法。
背景技术
随着工农业的发展，进入环境中的人工合成化合物越来越多，其中卤代芳香族化合物所占的比例也日趋增大。卤代芳香族化合物是芳香族化合物分子或其衍生物分子中一个或几个氢原子被卤素原子取代之后的产物。由于化学结构的改变使原化合物的性质发生了很大的变化，特别是生物降解性明显地降低。环境中最常见的为氯代芳香化合物，如氯苯、氯酚、氯代苯氧酸、氯代联苯等几类。这些化合物广泛用于工农业生产中，是一类污染面广、毒性较大、难生物降解、大多是具有“三致”作用的化合物。美国环保局(EPA)公布的129种优先控制污染物中有25种是氯苯类化合物。如何有效地消除氯苯类化合物对环境的影响，是目前众多研究者关注的问题，在利用微生物对其进行生物降解的研究方面，到目前为止，已经国外已有研究者从土壤、水体和底泥中分离获得了能够降解氯代芳香化合物的微生物，但这些微生物对氯苯类化合物的耐受浓度较低，只能处理水中较低浓度的氯苯类化合物，如Jechorek，M等用Methylocystis sp.GB 14 DSM 12955菌，在T＝20-30℃、pH＝6.8条件下厌氧降解氯苯的适宜浓度范围为20-40mg/L(文献参见Jechorek，M，Wendlandt K.-D，Beck M.Cometaabolicdegradation of chlorinated aromatic compounds.Journal of Biotechnology，2003，102(1)，93-98)。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够承受并能有效降解水中高浓度氯苯类化合物的微生物以及用这种微生物降解氯苯类化合物的方法。
本发明提供一种可降解氯苯类化合物的细菌，其特征在于，它是光合细菌。所述的光合细菌是红螺菌属(Rhodospirillium)，如深红红螺菌(Rhodospirillium rubrum)；红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)，如沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、绿色红假单胞菌(Rhodopseudomonas viridis)、绿硫红假单胞菌(Rhodopseudomonas sulfoviridis)、海洋红假单胞菌(Rhodopseudomonas marina)；红细菌属(Rhodobacter)，如球形红细菌(Rhodobactersphaeroides)中的任意一株菌或它门的任意组合。
上述光合细菌由山西大学生命科学与技术学院光合细菌研究室分离、鉴定并保存。地址：山西省太原市坞城路92号山西大学生命科学与技术学院。
这些光合细菌菌种的文献出处：张肇铭，邓松录，赵良启等.紫色非硫光合细菌的研究A.球形红假单胞菌的分离、鉴定和生理特性的研究.山西大学学报(自然科学版)，1984，(4)：54-59；姚竹云，张肇铭.几株光合细菌的表型特征及其DNA-DNA同源性分析.应用与环境生物学报，1996，2(1)：84-89；张肇铭，杨素萍，赵春贵.沼泽红假单胞菌的分离鉴定研究.山西大学学报(自然科学版)，1992，(4)：379-385；杨素萍，张肇铭，赵春贵.绿色红假单胞菌和绿硫红假单胞菌的分离与鉴定.微生物学报，1995，35(2)：91-96.
关于球形红细菌的说明：根据Bergey细菌鉴定手册第八版(1975)，球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)名称为球形红假单胞菌(Rhodopseudomonas sphaeroides)，但是1989年出版的Bergey系统细菌学手册以及1992年出版的Bergey细菌鉴定手册第九版将该光合细菌命名为球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)。
本发明提供一种降解氯苯类化合物的方法，包括如下步骤：
(1)在无菌条件下，将光合细菌培养基中加入氯苯类化合物，配成含有20-100mg/L氯苯类化合物的培养液；
(2)在上述培养液中按体积比5％-50％接入光合细菌，在20-45℃、光照1000-3000Lx、厌氧条件下，驯化培养3-30天，作为驯化菌种；
(3)在无菌条件下，将驯化菌种按体积比5％-30％接入含20-200mg/L氯苯类化合物的培养液中，在20-45℃、光照1000-3000Lx厌氧或微好氧条件下培养48-136h；或在20-45℃、自然光或黑暗、好氧条件下，培养4-120h；水中氯苯类化合物降解率可达96-100％。
所述的驯化菌种也可进行固定化。所述固定方法可采用包埋法。
所述的氯苯类化合物可以是氯苯、二氯苯、三氯苯、四氯苯、五氯苯、六氯苯。
所述的光合细菌培养基的主要成分及配比范围为：MgSO4 0.2-0.5g，CaSO4 0.05-0.1g，NH4SO4 0.1-1.0g，苹果酸0.5-2.0g，KH2PO4 0.5-1.0g，K2HPO4 0.5-1.5g，酵母膏0.5-1.5g，蒸馏水1000mL，pH 6.5-7.5。优选配比为：MgSO4 0.2g，CaSO4 0.076g，NH4SO4 0.1g，苹果酸1.0g，KH2PO4 0.6g，K2HPO4 0.9g，酵母膏1g，蒸馏水1000mL，pH 7.0。该培养基适合光合细菌生长并能有效降解氯苯类化合物。所述的培养基也可以采用普通的其它光合细菌培养基。
本发明所述的细菌可用于含有氯苯类化合物废水的处理。
本发明降解完氯苯后的菌体，经收集可用作有机肥料或饲料添加剂。
本发明具有以下优点和效果：
1.本发明采用光合细菌对氯苯类化合物进行降解，它不仅能在厌氧、微好氧光照的条件下以低级脂肪酸、多种二羧酸、醇类、糖类、芳香族化合物等低分子有机物作为光合作用的电子供体，氯苯类化合物作为电子受体以共代谢方式进行降解，而且能在好氧黑暗及自然光的条件下，利用二加氧酶的作用，对氯苯类化合物进行好氧降解。因此，利用光合细菌能在多种环境条件下降解氯苯类化合物，利于实际应用。
2.利用光合细菌降解氯苯类化合物，处理效率高，处理效率可达90％以上，成本低，操作简便，易于工业化实施。
3.光合细菌对氯苯类化合物耐受浓度高，可承受并处理氯苯类化合物浓度为200mg/L的废水。
4.光合细菌降解完氯苯类化合物后的菌体，可直接用作有机肥料和饲料添加剂，没有二次污染产生。
附图说明
图1光合细菌球形红细菌厌氧降解氯苯0h的GC-MS分析图
图2光合细菌球形红细菌厌氧降解氯苯64h的GC-MS分析图
图3光合细菌球形红细菌厌氧降解氯苯136h的GC-MS分析图
图4固定化深红红螺菌降解氯苯动态实验装置图
图5不同好氧条件下固定化深红红螺菌降解氯苯曲线图
具体实施方式：
实施例1：
培养基：MgSO4 0.2g，CaSO4 0.076g，NH4SO4 0.1g，苹果酸1.0g，KH2PO4 0.6g，K2HPO4 0.9g，酵母膏1g，蒸馏水1000mL，pH 7.0。
降解步骤：
培养基经高压灭菌，将光合细菌培养基中加入氯苯类化合物，制备成含有40mg/L氯苯类化合物的培养液；
在上述培养液中按体积比10％接入球形红细菌，在30℃、2000Lx光照培养箱中厌氧驯化培养3天，作为驯化菌种；
在无菌条件下，将25mL驯化菌种的悬液以10000r/min离心10min，弃上清液，菌体用磷酸缓冲液洗涤2次后加入250mL含100mg/L氯苯的培养液中，在30℃、2000Lx光照培养箱中厌氧培养，每隔一定时间取样，样品经10000r/min离心10min后，取上清液测氯苯浓度和降解产物。
氯苯浓度采用高效液相色谱法(SHIMADZU LC-10ATVP)测定.分离柱为Nova2Pak C18，4Lm，3.9mm×150mm；紫外检测器，检测波长254nm；流动相为甲醇/水(体积比为75∶25)；流速1.0mL/min，进样量10μL。
降解产物用美国Agilent公司HP 6890GC-5973N MSDGC-MS联用仪分析.气相条件，以高纯氦气(99.999％)为载气，恒流10mL/min；分流进样，分流比1∶20；进样口温度230℃；柱温起始为60℃，以5℃/min至160℃，色谱质谱传输温度250℃.质谱条件，离子源温度230℃；倍增电压1200V；发射电子能70eV；全扫描范围为50-350amu。吹扫捕集条件，高纯氦气，吹扫流速40mL/min，吹扫时间10min，解吸温度225℃，解吸时间8min，烘烤时间10min，烘烤温度225℃。
实验结果表明球形红细菌在厌氧条件下处理136h，氯苯去除率可达96.4％；GC-MS分析球形红细菌降解氯苯在处理时间0h、64h、和136h时的产物(图1、图2、图3)可知，降解产物主要为CHCl3、CHCl2和CH2ClCH2Cl。
实施例2：
无菌条件下，将沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)驯化菌种接种量10％、含氯苯浓度为100mg/L的培养液在30℃、140r/m的恒温振荡培养箱中好氧培养，其它实验条件和步骤同实施例1。结果表明沼泽红假单胞菌在好氧条件下当培养时间仅2h时，氯苯去除率就达77％，6h氯苯完全被降解，去除率为100％；GC-MS分析沼泽红假单胞菌好氧降解氯苯在处理时间0h、6h、和108h时的产物可知，降解中间产物主要为CHCl3。
实施例3：
无菌条件下，在含100mg/L的邻二氯苯培养液中加入接种量10％的球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)驯化菌种，进行厌氧降解邻二氯苯的实验，其它实验条件和步骤同实施例1.实验结果表明球形红细菌在厌氧条件下104h内能完全降解邻二氯苯，GC-MS分析球形红细菌降解邻二氯苯在处理时间0h、54h、和104h时的产物可知，主要降解过程为二氯苯首先脱氯生成氯苯，然后进一步被降解成CHCl3。
实施例4：
菌种的驯化将10％深红红螺菌(Rhodospirillium rubrum)原始菌液接入氯苯含量为40mg/L的驯化培养基，在30℃、2000Lx光照培养箱中厌氧驯化培养3天，作为驯化菌种。
将经离心脱水后的深红红螺菌菌体30g加入到1000mL40℃已完全溶解的10％聚乙烯醇溶液中均匀混合，通过注射器针头将上述混合液滴入10％过饱和硼酸溶液中，形成3mm左右的小球，18h后取出固定化微生物小球，用生理盐水冲洗干净，在无菌条件下放入培养基中活化24h备用。
固定化深红红螺菌(Rhodospirillium rubrum)降解氯苯实验：在反应器中加入含200mg/L氯苯的模拟废水(氯苯模拟废水成分为实施例1所述培养基按200mg/L加入氯苯)1500mL、固定化深红红螺菌小球14g/L、水力停留时间24h、pH＝7.0、T＝30℃、自然光在废水的DO分别为7.3、5.49、4.87、1.26mg/L条件下，进行固定化深红红螺菌降解氯苯的动态实验，实验装置见图4。每隔一定时间取上清液测氯苯浓度。
实验结果如图5所示。图5表明，氯苯的去除率不仅随废水的DO增加而增加，而且随着废水的DO的增加，达到氯苯的最高去除率的时间逐渐缩短。当废水的DO为7.3、5.49、4.87、1.26mg/L时，达到氯苯最高去除率的时间依次为48h、96h、96h、120h。当DO为7.3mg/L时，氯苯去除率最高为90.0％。
实施例5：首先将海洋红假单胞菌(Rhodopseudomonas marina)和球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)1∶1(体积比)混合并按实施例1步骤进行驯化培养；然后将驯化培养好的混合菌种以12％接种量接入含1，2，4，5-四氯苯80mg/L的培养基中，在30℃、2000Lx光照培养箱中进行厌氧降解四氯苯的实验，反应时间72h，去除率达88％。
Claims (3)
1.一种降解氯苯类化合物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)在无菌条件下，将光合细菌培养基中加入氯苯类化合物，配成含有20-100mg/L氯苯类化合物的培养液；
(2)在上述培养液中按体积比5％-50％接入光合细菌，在20-45℃、光照1000-3000Lx、厌氧条件下，驯化培养3-30天，作为驯化菌种；
(3)在无菌条件下，将驯化菌种按体积比5％-30％接入含20-200mg/L氯苯类化合物的培养液中，在20-45℃、光照1000-3000Lx厌氧或微好氧条件下培养48-136h；或在20-45℃、自然光或黑暗、好氧条件下，培养4-120h；
所述的光合细菌是球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、深红红螺菌(Rhodospirillium rubrum)和海洋红假单胞菌(Rhodopseudomonas marina)中的一种或它们的任意组合。
2.按照权利要求1所述的降解氯苯类化合物的方法，其特征在于，所述的驯化菌种进行固定化。
3.按照权利要求1所述的降解氯苯类化合物的方法，其特征在于，所述的氯苯类化合物是氯苯、二氯苯、三氯苯、四氯苯、五氯苯或六氯苯。
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