CN1961213A - 新的在清醒大鼠中静脉给药和血液取样模型 - Google Patents

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Abstract

持续需要在根据体内药物代谢动力学(PK)参数对新化学个体(NCE)进行的检查中增加产量。目标在于确立一种产生更高产量的新研究方法，检查动物间变化性和减少清醒大鼠中NCE的常规生物利用度研究所需的动物数量。该设计采用经由隐静脉静脉(iv)施用，结合经由尾静脉的连续血液取样的新方法。比较了该多次取样方法与单次取样(断头)，研究了其对于血细胞比容(Tct)水平的影响。将在隐静脉中直接注射与采用留置颈静脉导管的iv施用相比较。采用结构不同的CE，显示出经由隐静脉的直接注射与从尾静脉的多次取样的联合产生了可与比较方法比拟的血浆浓度和随后的PK结果。而且，采用每天至多2.1ml的总血液取样体积，Hct水平保持在推荐水平内。新技术通过减少准备性手术所需的时间，增加了产量，通过允许动物间主要PK参数的比较提高了质量，因为浓度时间曲线可以从每只动物中收集，并且减少了所需动物数量。

Description

新的在清醒大鼠中静脉给药和血液取样模型
发明领域
本发明涉及一种新的在清醒大鼠中静脉给药和血液取样模型，包括至少步骤(a)通过隐静脉静脉施用化学个体，和(b)从尾静脉取血样。
发明背景
总体上，制药工业强烈地意识到将新的化学个体(NCE)投放到市场所产生的研发时间和成本。在药物发现ADME(吸收、分布、代谢、排泄，Absorption Distribution Metabolism Excretion)领域，存在研究化学个体(CE)的早期药物状性质的很多不同途径。两个主要区域是那些涉及研究一/二个参数或终点的体外试验系统和采用整只动物体系的体内模型。迄今为止，已有许多努力集中于研发高通量体外代谢和吸收试验(Bajpai，M.；Adkison，K.K.Curr.Opin.Drug Discovery Dev.2000，3，63-71)以及增加生物分析试验中分析能力的速度(Cox，K.A.；White，R.E.；Korfinacher，W.A.Comb.Chem.High Throughput.Screen.2002，5，29-37)。作为药物发现努力的一部分，持续需要在体内药物代谢动力学(PK)参数方面对CE进行的检查的通量增加。为获得CE的生物利用度和这些参数，化合物经由静脉(iv)和口服(po)途径给药，在多个时间点取血样，随后通过例如偶联于串联质谱法的液相色谱(LC-MS/MS)分析目标化合物。随后由血浆浓度时间曲线计算得到该PK参数(例如清除率、分布体积、消除半衰期和口服生物利用度)，该参数描述了在整只动物中的吸收和布置。为在CE的体内PK评估中增加通量的努力集中于混合物给药和样品混和集中(pooling)以使得生物分析工作负荷最小((Allen，M.C.；Shah，T.S.；Day，W.W.Pharm.Res.1998，15，93-97；Olah，T.V.；McLoughlin，D.A.；Gilbert，J.D.Rapid Commun.Mass Spectrom.1997，11，17-23；Hop，C.E.；Wang，Z.；Chen，Q.；Kwei，G.J.Pharm.Sci.1998，87，901-903和Shaffer，J.E.；Adkison，K.K.；Halm，K.；Hedeen，K.；Berman，J.J.Pharm.Sci.1999，88，313-318)。然而这些方法伴有缺点。盒式给药会增加动物中不利效应和药物-药物相互作用的可能性，并且损害生物分析。对于血浆样品的后给药混和集中，生物分析也会由于样品稀释和为防止LC-MS/MS中不当的共洗脱与随后的离子抑制的额外方法发展时间而被损害。
发明描述
本发明目的在于通过设计并确立一种分析方法来增加常规大鼠PK研究的活体(in life)或体内部分的通量，该分析方法为采用隐静脉的新iv施用途径与血液取样的组合，所述取样特别是通过清醒大鼠中尾静脉的多次血液取样。该分析方法也可以包括合适的生物分析技术以进行对血液/血浆样品的处理/分析和对主要PK参数的估计。
本发明因此涉及确定清醒大鼠中药物代谢动力学参数的分析方法，包括以下步骤：
(a)通过隐静脉静脉施用化学个体；
(b)从尾静脉取血样。
在本申请的上下文中，CE是任何天然或合成来源的化合物或化学物质，例如但不限于药物、活性化合物、维生素、蛋白质和病毒。
隐静脉施用
在本申请的上下文中，隐静脉是位于后肢表面以使血液从后肢流出的静脉。
几种关于大鼠PK研究的活体阶段(给药施用和血液取样)的方法已经应用于工业，且所有的方法均有其优缺点。对于iv给药途径和取样而言，现有技术描述如下：
1)分别向尾静脉iv施用和从尾静脉取样；优点在于不需要准备性手术，但是血样可能由于在施用位点残留的残余给药溶液而在早期取样时间点被污染。并且，若一个静脉取样不好，则其它侧脉会由于取样过度而受损；
2)尾静脉施用和经由眼窝神经丛取样；优点在于给药和取样是来自两个分离的位点且不需要准备性手术，但是动物在抽血之前必须被麻醉。在24h时期内，每只动物仅应经历有限次的此类工序。必须采用数只动物来在所需时间点获得足够血样，从而能够构建充分的浓度时间曲线和PK参数；
3)尾静脉施用和从颈动脉/颈静脉连续取血；优点在于给药和取样是来自两个分离的位点且可在同一动物内频繁取出少量血样用于充分描述血浆浓度时间曲线，但是需要准备性手术。对于经由留置的颈静脉插管的iv施用与从尾静脉取样的组合，也存在相同问题；
4)iv施用和从同一留置的颈静脉插管取血；优点在于可在同一动物内频繁取出少量血样用于充分描述血浆浓度时间曲线，但是由于残余的给药溶液保持在插管中，早期时间点的血液样品可能被污染，并且也需要准备性手术。
5)通过隐静脉的iv施用和从麻醉大鼠的尾静脉取血(EP 1 284 139A1，公开于2003年2月19日)。与本申请的区别在于实际上大鼠是清醒的而非被麻醉。尽管这一区别可能看上去较小，但是以前从未公开过根据本发明的方法，尽管在该科学领域进行并公开了大量的工作。显然，本发明克服了技术偏见，且进一步提供o.a.下述优点：消除了施用的化学个体与麻醉剂和/或麻药例如戊巴比妥钠之间的相互作用。不言而喻，在根据本发明的方法中，尤其是在测试CNS-药物例如抗-抗焦虑药、安定药、抗抑郁药和抗痛药的情况下，可能被麻醉剂和/或麻药的施用影响的其它参数不会受到影响。还进一步提供了在不扰乱例如大鼠的代谢的情况下以快得多的速率从同一大鼠中抽取样品的优点，因为大鼠不需要在被麻醉之后清醒过来。
本发明的一个方面是设计并证实一种新的iv施用途径，该途径经由直接注射CE进入清醒大鼠的隐静脉。该方法a.o.减少了准备性手术和康复过程(1-2天)。具有不同化学结构(n＝11)的CE经由颈静脉或隐静脉施用。在不同时间点采用多次血液取样技术经由尾静脉取血(参见下文)，为合适的CE而分析血浆样品，并且比较两种iv途径之间的主要PK参数。
需要指出，隐静脉是血液取样现有技术中已知的(A.Hem，A.J.Smith and P.Solberg Laboratory Animals 1998，32，364-368)。
多次血液取样
对于血液取样工序而言，有几种用于在所需时间点收集样品的现有技术方法。一个可能性是CE被施用到一组动物(例如n＝3)，其在合适的时间点被杀死以收集血液(通过断头)。其优点在于可获得大量血液样品，然而如今LC/MS/MS的使用允许收集并分析极小量的样品。源自该方法的血浆浓度水平获得自一组多只动物的血液样品，每只动物在不同时间点被取样。对因此，主要PK参数的数据分析和计算只能在平均血浆浓度时间曲线上进行。因此该取样方法并不允许研究PK结果中个体之间的变化。主要缺点在于该研究需要大量动物。
本发明的另一方面在于研究新的取样方案，其中在不同时间点从同一大鼠的尾静脉抽取血液样品，尤其是多个血液样品。多次血液取样的方法使得从单只动物获得充分的浓度时间曲线，允许从每只动物来计算主要PK参数。以这种方式，动物之间的变化性可得以检查，并且对一种CE进行常规生物利用度研究所需的动物数量可得以显著减少。具有不同化学结构的CE被口服施用到大鼠内，并且血液通过单次血液取样(断头)或通过在多个时间点从尾静脉的多次取样抽取。为合适的CE而分析样品，并且比较两种取样技术之间的血浆浓度时间曲线和计算出的PK参数。需要来自每只大鼠的、数目和体积均足够的血液样品，以能够构建合适的血浆浓度时间曲线，以进行合适的取出工序以及随后的LC-MS/MS分析，但是不影响动物健康。因此，在以不同体积经过所需时期取出血液之后，得以对多次取样对于血液学参数例如血细胞比容(Hct)的影响加以研究。
因此，本发明进一步涉及确定清醒大鼠中药物代谢动力学参数的分析方法，其中步骤(b)中多个血液样品从尾静脉取得。
本发明进一步涉及确定清醒大鼠中药物代谢动力学参数的分析方法，其中该方法进一步包括步骤(c)，其被合并在步骤(b)之后，其中采用生物分析技术分析血液/血浆样品以确定药物代谢动力学参数。
试验
1.材料和方法
1.1.动物
在研究中采用雄性SPF Sprague-Dawley大鼠(200-300g，CharlesRiver，Germany)。在研究的各个部分之前允许动物驯化1周。可随意获取自来水和食物。
1.2.多次血液取样技术的确立
为经由尾静脉进行多次血液取样，将动物置于ScientificInstrument Division(Johnson & Johnson，Pharmaceutical Research andDevelopment，division of Janssen Pharmaceutica)开发的啮齿动物筒形限制器内。采用红外灯将大鼠尾部温热以帮助取样。用27G针将静脉血液收集进含有EDTA(Sarstedt，Germany)的Multivette 600KE管。
1.2.1.多次血液取样对血细胞比容水平的影响
对经过所需取样时期取出的血液体积对大鼠Hct水平的影响加以研究(每组n＝5)。比较多次(7×)0.3ml(血液体积共2.1ml)和0.4ml(血液体积共2.8ml)的血液取样体积。在7和20分钟、1、2、4、8和24小时抽取血液。
使用诊断仪器(Advia 120，Bayer Diagnostics，Brussel，Belgium)计算Hct的％体积，其分析全血以对白和红血细胞、血小板和网织红细胞进行计数。
1.2.2.确立多次取样方法的药物代谢动力学
在口服施用之后，研究不同化学结构的血浆浓度曲线和主要的PK参数。通过多次或单次取样方法从尾静脉取出血液样品。
1.2.2.1.试验化合物和配方
对于两种方法而言，每种化合物采用相同配方以确保结果中的任何差异并非由配方影响。试验化合物JNJ1(法呢基转移酶化合物)，JNJ2(加兰他敏(galantamine hydrobromide))和JNJ3(CRF拮抗剂)在软化水或10％羟丙基--β环糊精(HP--CD)溶液中以0.25-1mg/ml的最终浓度配制。所有配方都在室温下储存，避光保护并且定量分析。通过胃插管法用10ml/kg的体积对动物进行口服给药。
1.2.2.2.血液取样
在给药化合物之后，在所需时间点取出血液样品。对于单次取样方法而言，在每个时间点通过断头杀死三只动物，并且通过放血将血液收集到10mlB-D无菌EDTA K3 Vacutainer管中。对于多次取样技术而言，按如上所述，从尾静脉重复收集0.3ml静脉血液。对于每种化合物，采用3只大鼠进行完整的血浆浓度时间曲线。对于合适的化合物，采用2.4节所述的单个合格的研究LC-MS/MS方法分析血浆样品。
1.3比较在经由颈静脉或隐静脉施用之后的血浆PK参数
比较在清醒的大鼠中经由颈静脉(导管)或隐静脉(直接注射)施用之后，覆盖了不同疾病标靶和化学种类/结构的化合物(n＝11，在此并未全部报导)的血浆浓度曲线和主要PK参数。
1.3.1.试验化合物和配方
对于两种iv施用途径而言，每种化合物采用相同配方以确保结果中的任何差异并非由配方影响。化合物(n＝11；其中为JNJ4(具有5HT2-拮抗作用、D2-拮抗作用和SSRI活性的安定药)，JNJ5(NK123-拮抗剂)和JNJ6(HSD11β拮抗剂)配制为水溶液或HP-β-CD溶液(10-20％，pH范围4-7)，最终浓度为1.25mg/ml。所有配方由甘露醇制成等渗液，在室温下储存，避光保护并且定量分析。对于所有化合物，配方的两种施用途径均以2ml/kg给药。
1.3.2.静脉注射途径
1.3.2.1.经由颈静脉的iv施用
在全身麻醉情况下将留置插管放入颈静脉。在无菌条件下进行手术；进行手术的所有表面上均盖有无菌吸水不透手术台布(Unidrape，Vygon，France)，手术仪器在1/10的氯己定(5％)/乙醇(70％)混合物中灭菌，用无菌手术无粉手套(NuTex，Ansell Medical，Malaysia)进行手术。在30/70的O2/N2O混合物中在4％异氟烷(Forene；Abbott，England)下引入麻醉和气管插管。在30/70的O2/N2O混合物中采用1.5％异氟烷将大鼠保持全身麻醉。从SilasticLaboratory管材(4cm，ID 0.64mm OD 1.19mm；Dow Coming，USA)和聚乙烯管材(4cm，PE 50；ID 0.58mm且OD 0.965mm；Becton Dickinson，Belgium)来构建iv导管。该导管由Loctite 404工业粘合剂(Loctite，USA)固定到一起。将导管插入颈静脉并且推入锁骨下以允许良好的血液抽取。导管的位置通过将血液返回到插管且随后由肝素化盐水(100I.U./ml；Heparin Leo，Belgium)冲洗而得以验证。采用两条缝线将导管固定在适当位置。用肝素化盐水再次充满插管以保持其通畅。该插管从皮下穿过并且采用大针穿过颈背中的小切口而穿出(externalised)。插管末端由可取出的钢塞封闭。所有伤口采用无菌缝线缝合(Mersilk4/0，Ethicon，Belgium)。在给药施用之前允许所有动物在单独的笼子里恢复48小时并且自由获取食物和自来水。配方给药之后(n＝3，对于各化合物)，用0.1ml盐水冲洗导管。
1.3.2.2.经由隐静脉的iv施用
用连接于聚乙烯管PE 10(ID 0.28mm和OD 0.61mm；BectonDickinson，Belgium)的针(MicrolanceTM 3，27G3/4，0.4×19，BectonDickinson，Ireland)经由隐静脉向清醒大鼠(n＝3，对于各化合物)直接注射。在施用之前，给大腿刮毛，并且在近侧轻微夹捏隐静脉以使其更加可见。在给药施用期间用毛巾限制大鼠。
1.3.2.3.血液取样
在给药7和20分钟、1、2、4、8和24小时后通过多次取样技术收集各血液样品(0.3ml/时间点；总血量2.1ml)。对于每种化合物和每种施用途径，针对完整的血浆浓度时间曲线，使用3-5只大鼠。采用如下所述的单个合格的研究LC-MS/MS方法为合适的化合物分析血浆样品。
试验方案遵照NIH公布的“Principles of Laboratory AnimalCare”(1985)。
1.4.生物分析
1.4.1.方法进展
根据FDA(Guidance for Industry，Bioanalytical method validation，US department of Health and Human Services，Food and DrugAdministration，CDER，2001)的生物分析方法确认(validation)在发现、早期发展或理论PK研究中并非必需的。然而，采用能够提供具有足够准确度和精确度的血浆浓度以产生有效决定的分析方法是必要的。为了该目的，针对每种化合物开发合格的研究LC-MS/MS方法。所得方法显示了与FDA标准相似的准确度和精确度，这是通过校正曲线和与每一组研究样品一起分析的独立的质量对照样品的统计学显示的。此外，研究有限的血浆稳定性(37℃，2h)以覆盖动物取样和分析之间血浆样品的所有变化(manipulations)。没有研究试验之间的准确性和精确度。
1.4.2.样品制备
对于所有的化合物，在空白EDTA大鼠血浆中构建单个校正曲线(覆盖了预期的浓度范围)。在大鼠EDTA血浆中以4种浓度水平，采用两份重复制备独立的质量对照样品(QC)，覆盖了整个校正范围。用普通样品制备方法取出研究样品、校正和QC样品。在样品制备之后，在聚丙烯自动取样器小瓶中滴定(重组)残余物并且采用单种合格的研究方法分析。
1.4.3.LC-MS/MS
用偶联于串联质谱法的多反应监控(MRM)液相色谱(LC-MS/MS)(API-3000或4000，Applied Biosystems，Canada)分析各等分残余物。在不同商品名的商业性碱去活C-18柱上获得色谱分离，这取决于待分析的化合物的色谱行为。
质谱仪在TurboIonSprayTM模式(正离子电喷射电离)下工作。对于各化合物，使质谱仪最优化以测量选择性母子转变(parent-daughter transition)。采用1.2版本的Analist软件(Applied Biosystem，Canada)进行色谱峰的积分。使用线性回归模式，从校正曲线响应通过内插法计算出最终浓度。所有化合物的准确度和精确度处于期望值内，从而允许了准确的PK计算。
1.5.数据分析
使用WinNonlinTM Professional(3.3版)进行有限的PK分析。对于单次取样方法，在平均血浆浓度曲线(n＝3/时间点)上进行非区域(non-compartmental)数据分析。对于多次取样方法，在获得自各动物(n＝3)的血浆浓度曲线上进行非房室(non-compartmental)数据分析。随后计算平均值以比较多次和单次取样方法。计算的PK参数是观察到的最大血浆浓度(Cmax)、达到最大血浆浓度的时间(Tmax)、血浆半衰期(t1/2)和由曲线下的面积计算得到的化合物暴露量(AUClast和AUCinf)。为比较注射途径(颈静脉和隐静脉)，确定每只单独的动物的主要参数：半衰期(t1/2)、分布体积(Vdss(区域分析)或Vdz(非区域分析))、总血浆清除率(Cl)和曲线下的面积(AUClast和AUCinf)，从而允许动物之间的比较。
2.结果
2.1.多次血液取样技术的确立
2.1.1.多次血液取样对于血细胞比容水平的影响
附图1显示了在以0.3ml体积多次取样之后大鼠(n ＝6)中体积％血细胞比容(Hct)。最初的血液样品显示Hct值为42-45体积％，中值为42％。中值Hct值略微下降，导致在最后的取样点(t＝24h)为39％。单因素ANOVA以及事后(post hoc)学生t-实验显示：在第5次血液样品(t＝8和24h)后Hct水平相对于最初的时间点显著(p＜0.05)下降。然而，这些水平(37-42％)依然在健康大鼠的期望值范围内(36-48％)(Havenaar，R.；Ritskes-Hoitinga，J.；Meijer，J.C.；Zwart，P.Biologie en zootechniek.In Proefdieren En Dierproeven；vanZutphen，L.F.M.，Baumans，V.，Beynen，A.C.，Eds.；Wetenschappelijke uitgeverij Bunge：Utrecht，1991；pp.20-74)。
附图2显示了在以0.4ml体积多次取样之后大鼠(n＝6)中体积％血细胞比容(Hct)。最初的血液样品显示Hct值为42-51体积％，中值为44％。中值Hct值略微下降，导致在最后的取样点(t＝24h)为38％。单因素ANOVA以及事后学生t-实验显示在第2次血液样品(t＝1、2、4、8和24h)后Hct水平相对于最初的时间点显著下降。在t＝24h，这些水平为35-39％。
2.1.2.多次取样方法的药物代谢动力学确认
表1-3中显示了口服各化合物(此后称为JNJ1，JNJ2和JNJ3)之后，单次或多次血液取样后的单个或平均的基本PK参数。可从结果中看出，对于所示三种化合物，这两种取样技术都产生了可比较的PK参数。将JNJ1作为例子，对于多次取样组，平均最大血浆浓度(Cmax)在1±1h达到63.6±17.5ng/ml，而单次取样组在1h达到41.4ng/ml。对于多次取样组，半衰期(t1/2)是2.02±0.3h，单次取样组是1.92h。对于多次取样组，通过AUCinf测量的暴露量是294±46ng.h/ml，而单次取样组是224ng.h/ml。对于其它两种JNJ化合物，该图保持不变。从多次取样组观察到的血浆浓度和主要PK参数方面的动物间的变化性低。
2.2.在经由隐静脉或颈静脉施用之后的血浆PK参数的比较
通过两种途径给药11种化合物(在此并未全部报导)。所有化合物都在血浆浓度时间曲线和主要PK参数水平显示了可相当的结果。作为例子，在通过颈静脉插管或直接进入隐静脉将2.5mg/kg的化合物JNJ4、JNJ5和JNJ6单次iv施用之后的血浆浓度时间曲线和基本PK参数在表4-6中呈现并且在图3-5中绘制。从结果中可看出，对于所示三种化合物，这两种取样技术都产生了可相当的血浆浓度时间曲线和主要PK参数。将JNJ4作为例子，两种施用途径的平均(n＝5)血浆浓度时间曲线显示了相似的模式(附图3)。血浆浓度单相下降，对于颈静脉施用，计算的半衰期(t1/2)是2.9h，对于隐静脉施用来说是3.2h(表4)。对于颈静脉施用，估计平均血浆清除率(Cl)为1.7l/h/kg，对于隐静脉施用是1.6l/h/kg。对于颈静脉施用，估计平均分布体积(Vdss)为7.3l/kg，对于隐静脉施用是7.5l/kg。对于颈静脉施用，计算的平均暴露量(VUCinf)是1445ng.h/ml，对于隐静脉施用是1512ng.h/ml。从关于JNJ5的图4可看出，血浆浓度直到给药后8小时才可检测到。然而，可计算出相似的浓度时间曲线和相应的PK参数(表5)。
可从图表中看出，JNJ6的血浆浓度在第一小时下降得很快，在随后的时间点产生低血浆水平(附图5)。来自两种施用途径的PK参数在血浆清除率和AUC(曲线下的面积)方面显示了可比较的值，但是在最终血浆半衰期和分布体积的值方面显示了较大区别(表6)。这是由于在给药后2-24小时之间血浆浓度中的少量下降。总体上，就大鼠而言，认为该范围的血浆半衰期长且分布体积高。根据通过该化合物进行的其它研究(在此并未报导)，该化合物广泛分布于主要器官，这确证了在此观察到的高分布体积值。
3.讨论
3.1.多次取样技术
单次血液取样的方法是研究大鼠中血浆PK所用的数种方法之一。源自该方法的结果获得自多只动物，在不同时间点取样并且混和集中(在每个时间点的血液样品或分析的数据)。随后在混和集中的数据的平均血浆浓度时间曲线上进行对主要PK参数的数据分析和计算。该取样方法并不允许研究动物之间的PK结果中的变化。因此探索了涉及在各动物中多次取样的新取样方案。从各大鼠取出足够的血浆样品以构建合适的浓度时间曲线，但是不影响动物健康，即以Hct的水平影响。在Hct中的变化显示了血细胞数量改变，这可能影响很多内源或外源物质的结合和分布并且由此是药物的PK中的重要因素。在经过所需时期以不同体积取出血液之后，检查大鼠的Hct水平。血液样品的多少必须是足以进行生物分析的体积，即适合抽取工序和随后的LC-MS/MS分析。看上去在7个不同的时间点(t＝7和20分钟、1、2、4、8和24h)经由各动物的尾静脉以0.3ml体积进行的取样(总体积为2.1ml/天)对大鼠的Hct值影响有限。尽管由于血样的取出，在Hct的％体积方面有所下降，但是最后的血液样品的值(37-42％)仍然处于健康大鼠预期值范围(36-48％)以内。7通过0.4ml体积的取样(总体积2.8ml)看上去对Hct值有更大的影响。体积％Hct在第二次血液样品之后开始显著下降并且在最后(t＝24h)血液样品显示出低于健康大鼠预期的值(35-39％)。这些数据显示：具有在24小时内2.1ml总体积的血液取出对于Hct水平没有明显影响，而在高于2.4ml的体积时，这些值开始下降到预期的健康水平之下。然而，需要提及的是这些水平是仍然是边界。为使得取样体积对Hct值的影响最小化，对于进一步的研究推荐每天总取样体积为2.1ml或更低。在每个时间点从尾静脉取出0.3ml血液使得能从每只动物抽取足够的样品(7)，以充分描述血浆浓度曲线和对主要PK参数的计算。
采用多次和单次取样技术在所示化合物的血浆浓度曲线上进行的PK研究结果的比较使得该比较以及随后的新取样方法的确认可行。该结果阐述了：在限定的时间点从三只动物取出的7份少量(0.3ml)血样给出了与在每个时间点采用三只动物可相当的结果，且因此该多次取样技术可用作备选方法。多次取样方法的优点在于在不同的时间点的多个血液样品可从同一动物抽取，从而可检查动物间的变化性。对于该三种化合物而言，其显示：实际上动物间的变化性是低的。并且其显著地减少了对于一种CE进行常规生物利用度研究所需的动物数量。该取样方法是耐用且可再现的，并且现已在大鼠中的所有生物利用度研究中实施。
当采用该取样技术时，由于来自施用位点的污染危险以及随后的取样问题(由于过度使用和静脉的萎陷)，因此理想的是尾静脉不应用作化合物的iv施用途径。为克服这一方面，在我们的药物发现小组中，化合物是经由留置颈静脉导管通过注射常规施用的。然而，在麻醉条件下将留置导管放入颈静脉是费时的(用于手术和康复时间)并且引起一些动物创伤。因此，探索了一种新的iv施用途径，经由清醒大鼠中隐静脉直接注射。
3.2.隐静脉施用
隐静脉相对于颈静脉较小，然而，经过该注射位点的血液流应当具有足够的能力来将化合物携带到全身循环。这种新技术的优势在于相比于导管的长期植入，不会出现任何血管结扎，使得动物中的血液供应保持不变。另一优势在于由于不需要手术和康复时间，其节约了时间。这进而帮助在根据iv PK参数对NCE进行的检查中加快通量。本研究被设计来探求经由隐静脉的施用是否产生与使用传统施用技术(经由颈静脉)之一所获得的相似PK曲线。具有化学结构与溶解性多样性的化合物被用于显示，这种新的技术可用于很多种化学研究，包括不同的疾病区域标靶(5)和不同配方(蒸馏水，10-20％羟基-β-环糊精)。在经由两种不同途径给药12种不同化合物之后，对所得PK结果的比较显示，直接注射进入隐静脉，结合从尾静脉的多次取样，产生了与在颈静脉施用并且采用同样的血液取样方法之后产生的相似血浆浓度曲线和可比较的PK结果。对于所有化合物，显示：经由两种iv途径的施用产生了一些个体间的血浆浓度水平变化性，但是这处于在用动物进行操作时所预期的并且可接受的范围之内。
3.3.结论
该新技术减少了准备性手术和康复所需的时间(1-2天)，并且因为浓度时间曲线可以从每只动物收集，从而允许了对主要PK参数进行动物间的比较。常规少量血液样品的取样对大鼠的Hct并没有任何重大影响，且对于生物分析考虑而言是相容的。最后，如果与在每个时间点使用单个动物的那些或者包括麻醉的取样工序相比较，其可能减少这种常规研究所需的动物数量。
结合多次取样技术，该经由隐静脉的新施用途径将常规地用于药物发现中需要iv施用的所有进一步的大鼠研究。

Claims (3)

1.用于确定清醒大鼠中药物代谢动力学参数的分析方法，包括以下步骤：
(a)通过隐静脉静脉施用化学个体；
(b)从尾静脉取血样。
2.根据权利要求1的分析方法，特征在于步骤(b)中多个血液样品从尾静脉取得。
3.根据权利要求1或2任一项的分析方法，特征在于该方法进一步包括步骤(c)，所述步骤(c)合并在步骤(b)之后，其中采用生物分析技术分析血液/血浆样品以确定药物代谢动力学参数。
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