CN113657799B - 一种土壤中苯并[a]芘环境健康风险测评方法及动物模型 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种土壤中苯并[a]芘环境健康风险测评方法及动物模型，该方法包括如下步骤：S1：采集污染场地土壤样品；S2：制备生物暴露样品；S3：构建动物模型、血液采样；S4：制备待检测全血样品；S5：样品前处理、测定其中苯并[a]芘的浓度含量；S6：计算相对生物有效性；S7：计算实际暴露量数据；S8：进行环境健康风险评价。本发明还公开了实施该方法的动物模型，其是基于啮齿类实验动物内暴露的标准化动物模型。本发明通过合理的设计实验与检测步骤，配合标准化的可定量检测的动物模型，精确测定污染场地土壤样品中苯并[a]芘的相对生物有效性，应用于受污染土壤修复治理，在保障人群健康的前提下，降低治理成本。
Description
技术领域
本发明涉及场地土壤有机污染物检测及环境健康风险治理技术领域，具体涉及一种土壤中苯并[a]芘环境健康风险测评方法及动物模型。
背景技术
苯并[a]芘（Benzoapyrene，BaP）是多环芳烃类挥发物中的一种，具体是一种五环多环芳香烃，化学式为C20H12，英文表示为BaP。苯并[a]芘存在于煤焦油中，而煤焦油可见于汽车废气（尤其是柴油引擎）、烟草与木材燃烧产生的烟，以及炭烤食物等污染源中。苯并[a]芘为一种突变原和致癌物质，从18世纪以来，便发现其与许多癌症有关。其在体内的代谢物二羟环氧苯并芘，是具有致癌性的物质。由污染源扩散的苯并[a]芘广泛存在于大气、水和土壤等各类环境介质中，其中土壤介质是这类化学物质的最终归宿，特别是污染场地土壤中含有较高浓度水平的苯并[a]芘，如炼焦行业、石油加工业和煤化工产业等场地中该物质污染非常普遍。
苯并[a]芘属于国际癌症组织（IRIS）分类中的Ⅰ类致癌物，即对人类明确的致癌物，另外，苯并[a]芘还具有神经毒性，其经由环境介质通过吸入、摄食和皮肤接触进入人体，严重威胁人类健康。针对污染场地土壤中的苯并[a]芘，现有技术中，一般是采用环境健康风险评价来评估其健康危害，为场地的污染修复奠定基础。
生物有效性是用来表示污染物被生物吸收以后在其生物体内的利用率以及对自身潜在的危害。研究自然环境中有害污染物的生物有效性对污染现状的生物修复、污染物对生物体的生态毒理以及对环境污染现状的风险评估的研究都具有重要的意义。
现有技术中，中国发明专利申请CN201911088924.0公开了基于光谱分析预测土壤中高环PAHs生物有效性的建模方法，属于多环芳烃的生物有效性预测技术，包括以下步骤：（1）土壤样品收集和前处理，（2）用化学氧化法氧化土壤样品，（3）将原土样以及其对应氧化后的土样进行红外光谱测定，得到各波长红外吸光度占比，（4）建立16种PAHs的浓度与各红外占比的拟合曲线，比较不同环数多环芳烃与不同波长吸光度占比的回归模型，（5）对回归模型进行筛选，获得相关度最佳的回归模型，得到该场地高环多环芳烃与吸光度占比的函数关系；该发明建立了相对精确快速，基于PAHs有效态预测污染土壤中PAHs的生物有效性的光谱模型，便于后续对PAHs的生物有效性及其所带来的环境健康风险进行研究。但是，该发明技术方案是通过PAHs不同效态而预测生物有效性，其相对生物法存在一定偏差，数据可信度较低。目前我国进行污染场地健康风险评价时，均认为土壤中的污染物可100%被人体吸收，即生物有效性为100%，并在此基础上进行风险评价和确定修复目标。然而，实际上土壤中污染物进入人体后其生物利用程度小于等于100%，因此当前的场地风险评价会高估污染物的健康风险并导致过度修复，容易造成修复成本高昂和资源浪费。但是，目前尚无准确的生物有效性检测方式及基于生物有效性的土壤中苯并[a]芘环境健康风险测评方法及动物模型，尤其缺少大范围、低成本、精确度高的风险测评方法及动物模型。
目前，污染物进入生物体利用程度可用体外研究和体内研究的方法进行测定，一般体外研究获得生物利用程度称为生物可利用性（也称为生物可给性），通过体内研究获得的为生物有效性。生物有效性分两类（bioavailability）：其一是指绝对生物有效性（absolute bioavailability，AB），即为物质口服摄入后到达体循环的百分比，通常使用生物口服摄入剂量与静脉注射剂量的血浆浓度-时间曲线下面积（AUC）比计算得到；另一个是指相对生物有效性（relative bioavailability，RB），即为相同暴露途径给予生物不同介质载体下的化学物质进入生物体的百分比，通常使用生物经口摄入土壤与含相同浓度化学物质的标准材料的血浆浓度-时间曲线下面积（AUC）比计算得到。目前在风险评估研究中常应用相对生物有效性。
现有技术中，一般通过体外研究获得生物可给性的操作较为简便，只通过模拟实验即可实现，但是结果相对偏差较大；通过体内研究获得生物有效性相对更准确，但是需要通过动物实验实现，对技术操作和场地要求较高，而且缺乏标准化的可定量检测的试验模型。例如中国发明专利201910387560.X公开的一种测定锑相对生物有效性的小鼠模型建立方法，通过连续暴露含锑物质后测定靶器官中的锑计算相对生物有效性，该发明专利测定各种器官确定靶器官的方式，不适用其他物质，同时大量的组织样品采集和测定显著提高了实验人员的技术要求和测定成本，较难标准化推广；中国发明专利201911245086.3公开的一种测定土壤和食品中镍的小鼠生物有效性方法，通过测定尿中镍含量来推算出镍的小鼠相对生物有效性，该发明专利通过测定尿中排出污染物含量的方式来推算被生物体吸收后生物有效性，推算过程不能精确反应实际被生物体吸收的量，另外该方法更适宜用在检测较容易的无机物上，对于代谢和检测更复杂的有机物降低了适用性。
由于目前关于有机物的体内定量化的测定研究较少，且由于在体内研究中不同类型污染场地土壤的性质和污染物的性质对生物有效性有较大影响，因此往往需要持续开展包括多种场地类型的多种场地土壤的生物有效性研究，需要进行的实验室检测数量较多，但是现有的检测方式并不支持大通量、大范围土壤的试验和检测，导致耗时较长、检测材料消耗较多。
此外，传统的动物模型实验，由于需要保证检测准确性，一般需要采集5~10mL血液进行采集；对于大鼠等小型实验动物而言，一般采用染毒后短时间内在腹主动脉取血、一次可得到约10mL血液，取血后大鼠即死亡，无法将其用于后续的较长时间的代谢毒性水平试验，以及重复染毒的代谢试验。而如果要保持大鼠等实验动物存活、进行长时间的试验，则单次采样取血量不能超过1mL血液。现有的检测技术，尚无法通过对1mL血液的小容量样品，进行准确的检测，因此都是采取一次取样10mL血液、然后处死大鼠，导致动物试验需要消耗大量的实验动物，因此只能采用较少的实验动物进行检测、难以解决个体实验数据差异大的问题；同时，采用同一批实验动物不能进行多次采血，以实现对较多地点采集的不同土壤样品进行检测，导致检测成本高。
发明内容
为克服现有技术所存在的上述不足之处，本发明的目的在于，提供一种土壤中苯并[a]芘环境健康风险测评方法，提出了新的以经口暴露血样中苯并[a]芘作为标志物计算相对生物有效性，再根据实际暴露量数据进行环境健康风险评价的技术构思，具体通过合理的设计实验与检测步骤、配合标准化的可定量检测的动物模型，进行精准的测定污染场地土壤样品中苯并[a]芘的相对生物有效性、进行环境健康风险评价，达到减少单次血样容量、降低检测耗材总消耗量、缩短评价周期、提高测评准确性；
同时，提供一种动物模型，使同一批实验动物能够对不同地点采集的土壤样品进行生物暴露后的批量采样，适用于多处土壤样品、多次生物暴露和采样，实现长时间、大通量的生物暴露试验和检测，减少实验动物的消耗，并且平抑个体实验差异，提高检测数据的准确性。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：
一种土壤中苯并[a]芘环境健康风险测评方法，其特征在于，其包括如下步骤：
S1：采集污染场地含苯并[a]芘的土壤样品；
S2：将土壤样品制备为实验动物的生物暴露样品；
S3：构建基于啮齿类实验动物暴露的标准化动物模型，根据设定的生物暴露方式和剂量，将生物暴露样品灌胃给实验动物，在染毒后达到预定的体内代谢时间点后，分别对实验动物进行血液采样；
S4：将在设定的多个代谢时点采集的实验动物血样，分别制备为待检测全血样品；
S5：对各全血样品进行前处理，然后，采用气相色谱/质谱联用仪测定其中苯并[a]芘的浓度含量；
S6：计算出各个代谢时点、基于实验动物的苯并[a]芘相对生物有效性；
S7：计算出基于动物试验的苯并[a]芘相对生物有效性的场地土壤污染物经口暴露的实际暴露量数据；
S8：基于实际暴露量数据，进行环境健康风险评价。
一种用于所述土壤中苯并[a]芘环境健康风险测评方法的动物模型，其特征在于，其是基于啮齿类实验动物内暴露的标准化动物模型，其采用如下步骤构建：
S31：实验动物准备：将实验动物，于实验开始前一周置于动物房中适应性饲养；饲养期间常规饮食，12小时光照/12小时黑暗，温湿度控制及其他条件均符合动物房管理规定；
S32：生物暴露及采样方式：
取不少于20只的实验动物作为实验组，禁食水16h后灌胃，分别给予设定剂量的第一处场地各地点采集的油溶场地土壤污染物，灌胃即刻设置时间点为0小时，之后分别于灌胃后0.25、0.5、1、2、4、6、12、24小时采集血液样品，每个时间点随机选择2只实验动物采样；单次单体采集容量10mL的新鲜血液，而且各次采样的实验动物均为不重复；
同时另取一批不少于20只的实验动物作为对照组，分别给予相同剂量（200μg/kgbw 浓度）的油溶苯并[a]芘标准品制剂，灌胃即刻设置时间点为0小时，之后分别于灌胃后0.25、0.5、1、2、4、6、12、24小时采集血液样品，每个时间点随机选择2只实验动物采样；单次单体采集容量10mL的新鲜血液，而且各次采样的实验动物均不重复；
将两组实验动物鼠经口暴露后，采集血样，所有血样样品采集使用添加抗凝剂的采血管，每次采样得到不少于1mL血液的样品，完成第一处场地的油溶场地土壤污染物实验组及对照组实验动物鼠的血液样品采集。
本发明相比现有技术的有益效果在于：
1、本发明提供的土壤中苯并[a]芘环境健康风险测评方法及其动物模型，以苯并[a]芘为标志物，利用动物的体内实验分析方法，可定量获得准确的污染场地土壤并[a]芘的相对生物有效性数据，不再将污染物在生物体内的利用程度认定为100%；基于该方法和模型得到的相对生物有效性数据，可显著提高场地土壤污染的精准暴露评估，同时提高场地污染物经口暴露途径环境健康风险的准确度。将本发明的技术构思、测评方法及所获得的暴露评估和风险评价数据，应用于大范围的受污染土壤修复治理工作，针对性更强，可显著降低修复成本，在保障人群健康的前提下，降低土壤污染治理成本，提高测评的准确性。
2、本发明提供的准确的相对生物有效性检测方式及基于生物有效性的土壤中苯并[a]芘环境健康风险测评方法及动物模型，通过合理的设计实验与检测步骤、配合标准化的可定量检测的动物模型，实现精确测定污染场地土壤样品中苯并[a]芘的相对生物有效性的目的。对明确基于生物有效性的环境污染物生物修复、研究污染物对生物体的生态毒理以及精确评价环境污染的健康风险都具有重要的意义。
3、本发明提供的土壤中苯并[a]芘环境健康风险测评方法及其动物模型，动物模型为标准化方式批量化构建、可重复性高、单批次采用的实验动物数量多、样本差异小，可适用于对多种土壤类型、多处场地采集的样品的多次重复、长时间、大通量的试验和检测。该动物模型，通过综合考虑污染物半衰期、动物体形、数量、血液内的代谢时间点、生命存续等多方面的因素，使同一批实验动物能够对不同地点采集的土壤样品进行不同时长的生物暴露后的批量采样，从而适用于多处土壤样品、多次生物暴露和批量采样，实现长时间、大通量的生物暴露试验和检测，减少实验动物的消耗，并且平抑个体实验差异，为制定不同的治理方案提供实验数据支撑。
4、本发明提供的土壤中苯并[a]芘环境健康风险测评方法及其动物模型，针对小型实验动物可采集检测样本体积小的情况，改进了样品采集、前处理等步骤，采用眼眶或尾静脉取血、每次取血量约1ml，可根据需要多次、重复、少量、长期取血检验，不影响实验动物长时间存活，可适用于采用大鼠、小鼠等小体积实验动物开展的动物模型试验，不同地点采集的污染物多次暴露、动态暴露评估或长期低剂量暴露评估模型等科研活动。
5、本发明提供的土壤中苯并[a]芘环境健康风险测评方法及其动物模型，提供的标准化动物模型，适合的场地类型包括但不限于：煤化工污染、石油加工和化工污染、焦化污染、电镀污染等各种污染类型场地土壤。
6、本发明提供的血样检测方案，采用超声提取的方式，并选择性采用冷冻去除乳化的方式，可对大批量样本同时进行处理，提高了分析通量和分析效率。本发明提供的血样检测方案，经过独特的小容量样品处理步骤，使其可采用单级质谱测定，极大地降低了检测操作的成本，有利于大范围的推广使用。发明提供的血样检测方案，除可以用于测定血浆中苯并[a]芘外，还可用于测定血清中的苯并[a]芘。
7、本发明通过构建标准化动物模型、进行大鼠毒理实验发现，得到的污染场地土壤中苯并[a]芘的相对生物有效性不大于40%。对于我国在工业化发展进程中所产生的较大范围的污染地块，均可以采用本发明提供的技术构思和技术方案，持续开展污染场地土壤污染物的生物有效性研究，为后续开展针对大范围的土壤有机污染物的治理、修复工作，降低修复成本，有效保护人群，提供技术方案和数据支持。
附图说明
图1是发明实施例测定的经口暴露油溶土壤及油溶标准品后不同时间点血液样品中的苯并[a]芘浓度示意图。
图2 为本发明实施例场地土壤中的苯并[a]芘谱图（20.276为苯并[a]芘）；
图3 本发明实施例大鼠血浆中的苯并[a]芘谱图（ 20.276为苯并[a]芘）。
具体实施例
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明的技术方案进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
基础的实施例方案：
本实施例提供的土壤中苯并[a]芘环境健康风险测评方法，其具体采用实验大鼠，针对某煤化工污染的土壤进行环境健康风险测评，包括如下步骤：
S1：采集污染场地含苯并[a]芘的土壤样品：
选取受含苯并[a]芘的第一处场地，在该场地污染核心区，用土钻采集地表至10cm深的土壤样品5份，混合装袋，带回实验室自然风干后，用手工研磨，过300目筛，使得其粒径小于50μm，制得土样；
S2：将土壤样品制备为实验动物的生物暴露样品：
初步检测场地土壤中苯并[a]芘浓度值，根据实验动物大鼠的体重，给予设定比例苯并[a]芘的暴露剂量（本实施例中为200μg/kg bw）；按照实验动物体重准备土样，并用植物油为溶剂制备苯并[a]芘土样悬浊液待用；另使用苯并[a]芘标准品，配置出相同剂量（本实施例中为200μg/kg bw）的苯并[a]芘标准品油溶灌胃制剂。
S3：构建基于啮齿类实验动物暴露的标准化动物模型，根据设定的生物暴露方式和剂量，将生物暴露样品灌胃给实验动物大鼠，在染毒后达到预定的体内代谢时间点后，分别对实验动物进行血液采样：
选取啮齿类实验动物构建基于暴露的标准化动物模型，准备符合实验条件的40只实验动物作为实验组，根据设定的暴露剂量、采用灌胃的生物内暴露方式，将生物暴露样品中的苯并[a]芘土样悬浊液经口饲喂给每只实验动物，在样品达到预定的体内代谢时间点0.25、0.5、1、2、4、6、12、24小时后，分别于各时间点随机选取5只实验动物，进行血液采样，各时间点采样所选取的实验动物不重复；
另外选取与实验组等量40只实验动物作为对照组，每只给予相同剂量（本实施例中为200μg/kg bw浓度）的苯并[a]芘标准品油溶灌胃制剂，灌胃之后分别于0.25、0.51、2、4、6、12、24小时的时间点，分别随机选取5中实验动物，进行血液采样；各时间点采样所选取的实验动物为不重复。
S4：将在设定的多个代谢时点采集的实验动物血样，分别并制备为待检测全血样品；
将两组实验动物经口暴露到设定的时间点后，分别采集血样，所有血样样品采集使用添加抗凝剂的采血管，单次单体采集容量不大于1mL的新鲜血液后充分摇匀，静置后，于低温离心机离心取上层液置于棕色玻璃瓶中，旋紧内置聚四氟乙烯垫的瓶盖；然后将所有瓶装样品在-20℃温度下冰冻保存待用；
S5：对各全血样品进行前处理，然后，采用气相色谱/质谱联用仪测定其中苯并[a]芘的浓度含量：
样品前处理：将各瓶装血样取出后至冰冻融化，充分混匀后，取0.5mL血浆，按体积比1:3比例加入1.5mL正己烷，充分振摇后，冰浴下超声提取40min，离心机上4500rpm离心10min，分离上清液至新试管中，再向血浆中加入1.5mL正己烷，重复上述操作，将上清液取出，与第一次提取液合并；氮吹至100μL，取90μL上清液，加入10μL 0.05μg/mL内标物，使内标物浓度和校准溶液一致，按制作校准曲线的仪器条件测定样品；在该前处理过程中若出现乳化，则通过冷冻去除，以提高提取效率；
检测：采用气相色谱/质谱联用仪测定各瓶装样品中的苯并[a]芘浓度，色谱载气为1.5mL/min氦气，恒流不分流进样口，无填充玻璃棉衬管，进样体积1.0µl，进样口温度200℃，柱箱程序升温；质谱接口温度300℃，EI离子源温度240℃，四级杆温度180℃，离子化电压70eV，溶剂延迟3min，质谱参数设为选择离子扫描收集数据，分别获得实验组及对照组瓶装样品中的苯并[a]芘浓度数据。
S6：计算出各个代谢时点、基于实验动物的苯并[a]芘相对生物有效性：
将步骤S5获得的实验组及对照组数据代入下列公司中，计算得到相对生物有效性RB：
（1）
其中：AUCsoil是实验组、油溶污染土壤暴露后血浆中苯并[a]芘浓度—时间曲线曲下面积；
AUCoil是对照组、油溶标准品暴露后大鼠血浆中苯并[a]芘浓度—时间曲线曲下面积；
Dsoil是实验组给予实验动物的苯并[a]芘剂量；
Doil是对照组给予实验动物的苯并[a]芘剂量；
AUC数值是由数据经非房室模型拟合后获取；
S7：计算出基于动物试验的相对人体生物有效性的场地土壤污染经口暴露的实际暴露量数据：
将步骤S6所得数据代入公式（2），计算基于人体相对生物有效性的场地土壤污染经口暴露的实际暴露量，即单一污染物的致癌效应：
E=(C_site×RB×IR×EF×ED)/(BW×AT) （2）
其中：
E是人体经口摄入的场地土壤中污染物的日均暴露剂量（致癌效应），mg/(kg·d)；
C_site是场地土壤中污染物的浓度，mg/kg，采用场地污染物实测值；
RB为场地土壤中污染物的相对生物有效性，无量纲，采用动物模型实测值；
IR是人体摄入速率，kg/d，取值1×10-4 kg/d；
EF是人体暴露频率，d/a，取值350d/a；
ED是人体持续暴露时间，a，取值24a；
BW是人体体重，kg，取值56.8kg；
AT是人体平均暴露时间，d，取值70×365 d；
S8：基于实际暴露量数据，进行环境健康风险评价：
将步骤S7所获得数据代入公式（3），进行基于实际暴露量的环境健康风险评价：
CR=E×SF （3）
其中：CR是经口摄入土壤污染物的致癌风险，无量纲；
E是经公式（2）计算获得的经口摄入土壤污染物致癌效应的日均暴露剂量，mg/(kg·d)；
SF是污染物经口暴露致癌斜率因子，[mg/(kg·d)]-1，取值1.0 [mg/(kg·d)]-1。
所述的步骤S1-S8，还分别包括如下步骤：选取80只及以上的实验动物，批量构建动物模型，分多个时点、多次、多只实验动物，批量采集、制备、前处理、测定与计算20-200份样品，进行大通量的实验、检测和分析。
一种用于所述土壤中苯并[a]芘环境健康风险测评方法的动物模型，其是基于啮齿类实验动物内暴露的标准化动物模型，其采用如下步骤构建：
S31：实验动物准备：实验采用90只SPF级成年雄性大鼠，于实验开始前一周置于SPF级动物房中适应性饲养；饲养期间常规饮食，12小时光照/12小时黑暗，温湿度控制及其他条件均符合SPF级动物房管理规定；
S32：生物暴露方式：
取40只的SD大鼠作为实验组，禁食水16h后灌胃，分别给予设定剂量的第一处场地各地点采集的油溶场地土壤污染物，灌胃即刻设置时间点为0小时，之后分别于灌胃后0.25、0.5、1、2、4、6、12、24小时采集血液样品，每个时间点随机选择5只大鼠采样；单次单体采集容量10mL的新鲜血液，而且各次采样的SD大鼠均为不重复；
同时另取一批40只的SD大鼠作为对照组，分别给予相同剂量（200μg/kg bw 浓度）的油溶苯并[a]芘标准品制剂，灌胃即刻设置时间点为0小时，之后分别于灌胃后0.25、0.5、1、2、4、6、12、24小时采集血液样品，每个时间点随机选择5只大鼠采样；单次单体采集容量10mL的新鲜血液，而且各次采样的SD大鼠均为不重复；
S33：将两组大鼠经口暴露后以戊巴比妥那腹腔注射麻醉，腹主动脉采集血样，所有血样样品采集使用添加抗凝剂的采血管，每次采样可得到约10mL血液的样品，然后将大鼠人道处死，完成第一处场地的油溶场地土壤污染物实验组及对照组大鼠的血液样品采集；
S35：另取5只SD大鼠作为独立对照组，禁食水16h后直接采集背景值血液样品，所获得的检测数据用于交叉验证；
S36：另取5只大鼠作为独立实验组，同时灌胃给予设定剂量（200μg/kg bw 浓度）的第一处场地的油溶场地土壤污染物，暴露待用，在实验组大鼠发生死亡或其他影响试验进行的状况时，进行替换；或者重复步骤S32-S34采样，获得的检测数据用于交叉验证，平抑个体试验数据差异。
在其他实施例中，还可以采用灌胃方式连续染毒2~7天，可以获得在该煤化工污染的土壤中其他持久性有机污染物在大鼠持续生活状态下的环境健康风险评价数据。
本实施例为保障实验顺利进行，以及最大程度降低大鼠的组内差异，设计了冗余实验动物，以替换可能出现问题的实验动物，或者补充实验过程中死亡的实验动物。在油溶土壤及油溶标准品暴露后，分别在每个暴露时间点取5只大鼠的血浆样本0.5mL，通过上述前处理后测定的结果如表1和附图1所示。本实施例通过非房室模型拟合获取两种暴露方式下的AUC，通过公式（1）计算场地土壤苯并[a]芘经口摄入的相对生物有效性（RB）为39.8%。
本实施例发现，经灌胃给予苯并[a]芘后该物质在大鼠血液中的代谢均呈单峰分布，均在暴露后1h达到峰值，而后随时间逐渐下降，24小时后，基本达到暴露前水平。但在暴露浓度相同的条件下，油溶标准品的峰值浓度明显高于土壤样品，这主要是因为土壤中的基质复杂，土壤中一些物质阻碍了苯并[a]芘在大鼠体内的吸收。
在场地土壤苯并[a]芘浓度为48.35mg/kg时，基于动物模型实测得到相对生物有效性来计算成人经口摄入暴露土壤苯并[a]芘的致癌风险为1.1×10-5，不经相对生物有效性校准的成人经口摄入暴露土壤苯并[a]芘的致癌风险为2.8×10-5，二者具有较大差异。若对污染场地以健康风险为基础进行污染修复时，以不经相对生物有效性校准的成人经口摄入暴露土壤苯并[a]芘的致癌风险为基础开展治理会显著提高治理成本。
表1经口暴露油溶土壤及油溶标准品后不同时间点血液中的苯并[a]芘浓度（ng/mL）
本发明在环境健康风险研究技术领域中，首次提出以苯并[a]芘为标志物、采用直接获得土壤污染物的绝对生物有效性数据，用以准确评价健康风险的技术构思。基于人群生物样品不易获取性，在进行大范围健康效应评估时具有一定局限性。因此本发明通过进行苯并[a]芘的相对生物有效性研究，分析不同环境介质中污染物进入生物（实验动物）体后的利用比例，再进行计算，对于评价环境污染物的健康风险具有重要意义。同时，对于污染场地来说，通过相对生物有效性研究可为场地人群精确的风险评价提供基础数据，也对以人群保护为目的的场地土壤污染修复工作具有重大的经济意义。本发明提出了土壤修复方案制定的新的试验、检测及分析技术构思，以适合在大范围内低成本的开展污染场地土壤中苯并[a]芘的生物有效性测定，并进一步制定针对性强的治理方案、降低治理成本、提升治理效果，具有重要的社会意义和经济意义。
本发明实施例通过上述构建标准化动物模型，进行大鼠毒理实验批量采样发现，该污染场地土壤中苯并[a]芘的相对生物有效性为39.8%，可以据此而进行污染土壤治理、修复的方案设计，以降低治理成本。
通过本实施例以上动物模型实验、检测和分析数据可知，土壤中苯并[a]芘的生物有效性（RB）小于100%，约为40%，通过相对生物有效性校准后的风险值显著减小，在此基础上给予土壤修复目标的修正数据是科学的、而且是可行的。
推荐的实施例方案：
通过分析上述基础实施例的实验结果可知，苯并[a]芘在实验动物经口暴露12~24小时后，其血液中检测值均恢复到背景值，表明苯并[a]芘在实验动物血液中代谢时间较快，半衰期较短。基于该结果及实验动物使用减量化原则，在对血液中代谢较快、半衰期较短类污染物进行生物有效性测定时，可将暴露取血后实验动物间隔恢复3~5个代谢周期后，优化动物模型设计，使实验动物能够重复应用于下一场地土壤中苯并[a]芘的生物有效性检测。
本实施例提供的土壤中苯并[a]芘环境健康风险测评方法及动物模型，其与基础实施例的技术方案基本上相同，其不同之处在于，减少单只实验动物单次血液采样容量。同一批实验的动物待完成一个场地土壤中苯并[a]芘的生物有效性检测后，间隔恢复3~5天后，再次应用于另一处场地土壤中苯并[a]芘的生物有效性检测，再次间隔恢复3~5天后，继续应用于第三处场地土壤中苯并[a]芘的生物有效性检测。该操作可减少所采用的实验动物的累积数量。
本实施例是针对某食品化工污染的土壤进行环境健康风险测评，与基础实施例不同的具体不同的步骤为（与基础实施例相同的部分不再重复说明）：
S1、污染场地土壤样品的采集和制备：分别在基础实施例记载的第一处场地之外的第二处场地、第三处场地等多处场地的污染核心区，分别用土钻采集地表至10cm深的土壤样品15份，各处场地样品分别编号、混合装袋，带回实验室自然风干用手工研磨，过300目筛，使得其粒径小于50μm；
S3：构建基于啮齿类实验动物暴露的标准化动物模型，包括：
S33-1：将采样完成的全部实验大鼠，继续置于SPF级动物房中常规饮食饲养，依次间隔3~5个苯并[a]芘在血中的代谢周期（约3~5天）、待前次土壤污染物样品中苯并[a]芘在血液中的代谢和转化完成之后，将第二处场地各地点采集的油溶场地土壤污染物，重复步骤S32的生物暴露方式，分别对实验组和对照组的实验大鼠灌胃，然后进行第二处场地采集的土壤污染物生物暴露后大鼠的血液样品采集。
S34：将第二处场地各地点采集的土壤污染物生物暴露、采样完成后的全部实验大鼠，重复步骤S31的饲养期间常规饮食，继续置于SPF级动物房中常规饮食饲养，分别间隔3~5个苯并[a]芘在血中的代谢周期（约3~5天）后，重复步骤S32，分别给予设定剂量的第三处场地各地点采集的油溶场地土壤污染物，在达到设定的时点后再次进行血样采集，完成对第三处场地各地点采集的油溶场地土壤污染物暴露后大鼠的血液样品采集；
如此类推，依次完成第三处及其他的多处场地采集的油溶场地土壤污染物暴露后大鼠的血液样品采集；
S4、生物暴露方式：
取40只SD大鼠作为实验组，禁食水16h后灌胃，按照设定的时间间隔（大于24小时），分别给予200μg/kg bw 剂量的第一、第二、第三处场地的油溶场地土壤污染物，灌胃即刻设置时间点为0小时，之后分别于灌胃后0.25、0.5、1、2、4、6、12、24小时采集血液样品，每个时间点均随机选择5只大鼠采样；另取5只SD大鼠禁食水16h后直接采集背景值血液样品，同时为了避免实验中大鼠损耗，另取5只SD大鼠同时灌胃暴露待用。
同时另取一批40只SD大鼠作为对照组，给予200μg/kg bw 浓度的油溶苯并[a]芘标准品制剂，灌胃即刻设置时间点为0小时，之后分别于灌胃后0.25、0.5、1、2、4、6、12、24小时采集血液样品，每个时间点随机选择5只大鼠采样；
S5：血样采集：将在设定的8个代谢时点采集的实验动物大鼠的血样，分别并制备为待检测全血样品；
将两组实验动物经口暴露到设定的时间点后，分别采集血样，所有血样样品采集使用添加抗凝剂的采血管，单次单体采集容量不大于1mL的新鲜血液后充分摇匀，静置后，于低温离心机离心取上层液置于棕色玻璃瓶中，旋紧内置聚四氟乙烯垫的瓶盖；然后将所有瓶装样品在-20℃温度下冰冻保存待用；采样后的大鼠继续置于SPF级动物房中常规饮食饲养；本实施例是采用在大鼠的眼眶取血，每次采样得到约1mL血液的样品，取血后大鼠可恢复正常饲养，保持正常存活。本实施例通过检测和计算可得到第二、第三处污染场地土壤中中苯并[a]芘的相对生物有效性，可据此进行污染土壤治理和修复的方案设计以降低治理成本。
对照基础实施例所采用技术方案，其采用90只大鼠（40只作为实验组、40只作为对照组、10只冗余）完成对第一处地点采集的油溶场地土壤污染物进行经口暴露后，以每只大鼠采用戊巴比妥那腹腔注射麻醉，然后在其腹主动脉采集血样10ml，完成采样后大鼠因失血过多无法继续存活，因此将其全部人道处死。由此，对一处场地采集的油溶场地土壤污染物进行采样，就需要消耗90只大鼠，而对于本实施例中3处场地的油溶场地土壤污染物全部完成采样，累计需要270只大鼠，成本高昂。而采用本推荐实施例的动物模型，对于3个场地的油溶场地土壤污染物全部完成采样，仅仅需要90只大鼠，实验动物的成本仅为传统方式的30%，而且，当需要采样的场地数量越多，本实施例的成本优势、时间优势就越明显；结合本发明小容量血液样品检测方案，对于大多数区域性土壤污染物的采样，整体可节省90%以上的成本，有利于大范围推广应用于。
采用本实施例提供的技术思路，还可以针对其他的半衰期较短的有机污染物如苯并[a]芘等，采用单次暴露并取血测定的方式计算污染物的相对生物有效性。针对其他的一些持久性有机污染物，也可采用每天经灌胃暴露一次，持续暴露一段时间的方式（如7天或30天等）进行动物建模，之后多次采集不同时间段的血样，分别进行相对生物有效性计算，并进行该持久性污染物的健康风险评价。
此外，在本发明其他实施例中，所述的实验动物还可以为其他品种的大鼠、小鼠、家兔（含幼兔）、禽类（含幼禽）、猪及灵长类动物等，均可以达到本发明记载的技术效果，因此不再将其一一列出。实验动物具体的采血方式还可以采用如下方式之一：使用采血针在小鼠、大鼠尾静脉，家兔耳缘静脉、耳廓中央动脉、后肢胫部皮下静脉取血。
本发明适合的土壤污染场地类型包括但不限于：煤化工污染、石油加工和化工污染、焦化污染、电镀污染、食品化工污染等各种污染类型场地土壤。
本发明也可以应用于对多处、不同土壤类型样品中苯并[a]芘的生物有效性分析，同时也可应用于同一土壤类型样品中多种污染物的生物有效性分析，以提高分析效率、降低分析成本。
以上所述仅为本发明的示例性实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种土壤中苯并[a]芘环境健康风险测评方法，其特征在于，其包括如下步骤：
S1：采集污染场地含苯并[a]芘的土壤样品；
S2：将土壤样品制备为实验动物的生物暴露样品；
S3：构建基于啮齿类实验动物暴露的标准化动物模型，以苯并[a]芘为标志物，根据设定的生物暴露方式和剂量，将生物暴露样品灌胃给实验动物，在染毒后达到预定的体内代谢时间点后，分别对实验动物进行血液采样；
选取啮齿类实验动物构建基于暴露的标准化动物模型，准备符合实验条件的多只实验动物作为实验组，根据设定的暴露剂量，将生物暴露样品苯并[a]芘土样悬浊液经灌胃给予每只实验动物，在样品达到预定的体内代谢时间点0.25、0.5、1、2、4、6、12、24小时后，分别于各时间点随机选取部分实验动物，进行血液采样，各时间点采样所选取的实验动物不重复；
另外选取与实验组等量的实验动物作为对照组，经灌胃给予每只实验动物相同剂量的苯并[a]芘标准品油溶制剂，灌胃之后分别于0.25、0.5、1、2、4、6、12、24小时的时间点，分别随机选取部分实验动物，进行血液采样，各时间点采样所选取的实验动物不重复；
S4：将在设定的多个代谢时点采集的实验动物血样，分别制备为待检测全血样品；
S5：对各全血样品进行前处理，然后，采用气相色谱/质谱联用仪测定其中苯并[a]芘的浓度含量；
S6：计算出各个代谢时点、基于实验动物的苯并[a]芘相对生物有效性，具体为：
将步骤S5获得的实验组及对照组数据代入下列公式中，计算得到相对生物有效性RB：
（1）
其中：AUCsoil是实验组、油溶污染土壤暴露后血浆中苯并[a]芘浓度—时间曲线下面积；
AUCoil是对照组、油溶标准品暴露后大鼠血浆中苯并[a]芘浓度—时间曲线下面积；
Dsoil是实验组给予实验动物的苯并[a]芘剂量；
Doil是对照组给予实验动物的苯并[a]芘剂量；
AUC数值由数据经非房室模型拟合后获取；
S7：计算出基于动物试验的苯并[a]芘相对生物有效性的场地土壤污染物经口暴露的实际暴露量数据；
基于相对人体生物有效性的场地土壤污染经口暴露的实际暴露量数据的计算，具体包括如下步骤：
将步骤S6所得数据代入公式（2），计算基于苯并[a]芘相对生物有效性的场地土壤污染经口暴露的实际日均暴露量：
E=(C_site×RB×IR×EF×ED)/(BW×AT) （2）
其中：
E是人体经口摄入的场地土壤中污染物的日均暴露剂量，mg/(kg·d)；
C_site是场地土壤中污染物的浓度，mg/kg，采用场地污染物实测值；
RB为场地土壤中污染物的相对生物有效性，无量纲，采用动物模型实测值；
IR是人体摄入速率，kg/d，取值1×10-4 kg/d；
EF是人体暴露频率，d/a，取值350d/a；
ED是人体持续暴露时间，a，取值24a；
BW是人体体重，kg，取值56.8kg；
AT是人体平均暴露时间，d，取值70×365 d；
S8：基于实际暴露量数据，进行环境健康风险评价，具体的：
基于实际日均暴露量数据进行该污染物致癌健康风险计算，具体包括如下步骤：
将步骤S7所获得数据代入公式（3），进行基于实际暴露量的环境健康风险评价：
CR=E×SF （3）
其中：CR是经口摄入土壤污染物的致癌风险，无量纲；
E是经公式（2）计算获得的经口摄入土壤污染物致癌效应的日均暴露剂量，mg/(kg·d)；
SF是污染物经口暴露致癌斜率因子，[mg/(kg·d)]-1，取值1.0 [mg/(kg·d)]-1。
2.根据权利要求1所述土壤中苯并[a]芘环境健康风险测评方法，其特征在于，所述的步骤S1，污染场地土壤样品的采集和处理，具体包括如下步骤：
选取土壤中含苯并[a]芘的场地，在该场地污染核心区用土钻采集地表至10cm深的土壤样品不少于5份，混合装袋，带回实验室自然风干后，用手工研磨，过300目筛，使得其粒径小于50μm，制得土样。
3.根据权利要求1所述土壤中苯并[a]芘环境健康风险测评方法，其特征在于，所述的步骤S2，制备生物暴露样品，具体包括如下步骤：
初步检测场地土壤中苯并[a]芘浓度值，根据实验动物体重，给予设定比例苯并[a]芘的暴露剂量；按照实验动物体重准备土样，并用植物油为溶剂制备苯并[a]芘土样悬浊液待用；另使用苯并[a]芘标准品，配置出相同剂量的苯并[a]芘标准品油溶灌胃制剂。
4.根据权利要求1所述土壤中苯并[a]芘环境健康风险测评方法，其特征在于，所述的步骤S5，样品前处理及检测，具体包括如下步骤：
样品前处理：将各瓶装血样取出后置冰排上融化，充分混匀后，取0.5mL血浆，按体积比1:3比例加入1.5mL正己烷，充分振摇后，冰浴下超声提取40min，离心机上4500rpm离心10min，分离上清液至新试管中，再向血浆中加入1.5mL正己烷，重复上述操作，将上清液取出，与第一次提取液合并；氮吹至100μL，取90μL上清液，加入10μL 0.05μg/mL内标物，使内标物浓度和校准溶液一致，按制作校准曲线的仪器条件测定样品；
检测：采用气相色谱/质谱联用仪测定各瓶装样品中的苯并[a]芘浓度，色谱载气为1.5mL/min氦气，恒流不分流进样口，无填充玻璃棉衬管，进样体积1.0µL，进样口温度200℃，柱箱程序升温；质谱接口温度300℃，EI离子源温度240℃，四级杆温度180℃，离子化电压70eV，溶剂延迟3min，质谱参数设为选择离子扫描收集数据，分别获得实验组及对照组瓶装样品中的苯并[a]芘浓度数据。
5.根据权利要求1所述土壤中苯并[a]芘环境健康风险测评方法，其特征在于，
所述的步骤S1-S8，包括如下步骤：批量构建动物模型，分多个时点、多次、多只实验动物，批量采集、制备、前处理、测定与计算20-200份样品，进行大通量的实验、检测和分析。
6.一种用于权利要求1-5之一所述土壤中苯并[a]芘环境健康风险测评方法的动物模型，其特征在于，其是基于啮齿类实验动物内暴露的标准化动物模型，其采用如下步骤构建：
S31：实验动物准备：实验采用90只SPF级成年雄性大鼠，于实验开始前一周置于SPF级动物房中适应性饲养；饲养期间常规饮食，12小时光照/12小时黑暗，温湿度控制及其他条件均符合SPF级动物房管理规定；
S32-(1)：生物暴露方式：
取40只的SD大鼠作为实验组，禁食水16h后灌胃，分别给予设定剂量的第一处场地各地点采集的油溶场地土壤污染物，灌胃即刻设置时间点为0小时，之后分别于灌胃后0.25、0.5、1、2、4、6、12、24小时采集血液样品，每个时间点随机选择5只大鼠采样；单次单体采集容量10mL的新鲜血液，而且各次采样的SD大鼠均为不重复；
同时另取一批40只的SD大鼠作为对照组，分别给予相同剂量的油溶苯并[a]芘标准品制剂，灌胃即刻设置时间点为0小时，之后分别于灌胃后0.25、0.5、1、2、4、6、12、24小时采集血液样品，每个时间点随机选择5只大鼠采样；单次单体采集容量10mL的新鲜血液，而且各次采样的SD大鼠均为不重复；
S33-(1)：将两组大鼠经口暴露后以戊巴比妥那腹腔注射麻醉，腹主动脉采集血样，所有血样样品采集使用添加抗凝剂的采血管，每次采样可得到约10mL血液的样品，然后将大鼠人道处死，完成第一处场地的油溶场地土壤污染物实验组及对照组大鼠的血液样品采集；
S35：另取5只SD大鼠作为独立对照组，禁食水16h后直接采集背景值血液样品，所获得的检测数据用于交叉验证；
S36：另取5只大鼠作为独立实验组，同时灌胃给予设定剂量的第一处场地的油溶场地土壤污染物，暴露待用，在实验组大鼠发生死亡或其他影响试验进行的状况时，进行替换。
7.一种用于权利要求1-5之一所述土壤中苯并[a]芘环境健康风险测评方法的动物模型，其特征在于，其包括如下步骤：
S31：实验动物准备：将实验动物，于实验开始前一周置于动物房中适应性饲养；饲养期间常规饮食，12小时光照/12小时黑暗，温湿度控制及其他条件均符合动物房管理规定；
S32-(2)：生物暴露及采样方式具体为：
取不少于40只的实验大鼠作为实验组，禁食水16h后灌胃，分别给予设定剂量的第一处场地各地点采集的油溶场地土壤污染物，灌胃即刻设置时间点为0小时，之后分别于灌胃后0.25、0.5、1、2、4、6、12、24小时采集血液样品，每个时间点随机选择5只大鼠采样；单次单体采集容量约1mL的新鲜血液，而且各次采样的实验大鼠均为不重复；
同时另取一批不少于40只的实验大鼠作为对照组，分别给予相同剂量的油溶苯并[a]芘标准品制剂，灌胃即刻设置时间点为0小时，之后分别于灌胃后0.25、0.5、1、2、4、6、12、24小时采集血液样品，每个时间点随机选择5只大鼠采样；单次单体采集容量约1mL的新鲜血液，而且各次采样的实验大鼠均为不重复；
直至完成第一处场地的油溶场地土壤污染物实验组及对照组大鼠的血液样品采集；
S33-(2)：将采样完成的全部实验大鼠，继续置于SPF级动物房中常规饮食饲养，依次间隔3~5个苯并[a]芘在血中的代谢周期3~5天、待前次土壤污染物样品中苯并[a]芘在血液中的代谢和转化完成之后，将第二处场地各地点采集的油溶场地土壤污染物，重复步骤S32-(2)的生物暴露方式，分别对实验组和对照组的实验大鼠灌胃，然后进行第二处场地采集的土壤污染物生物暴露后大鼠的血液样品采集；
S34：将第二处场地各地点采集的土壤污染物生物暴露、采样完成后的全部实验大鼠，重复步骤S31的饲养期间常规饮食，继续置于SPF级动物房中常规饮食饲养，分别间隔3~5个苯并[a]芘在血中的代谢周期3~5天后，重复步骤S32-(2)，分别给予设定剂量的第三处场地各地点采集的油溶场地土壤污染物，在达到设定的时点后再次进行血样采集，完成对第三处场地各地点采集的油溶场地土壤污染物暴露后大鼠的血液样品采集；
如此类推，依次完成第三处及其他的多处场地采集的油溶场地土壤污染物暴露后大鼠的血液样品采集。
8.根据权利要求7所述的动物模型，其特征在于，其包括如下步骤：
S35：另取5只实验大鼠作为独立对照组，禁食水16h后直接采集背景值血液样品，所获得的检测数据用于对比分析及交叉验证；
S36：另取5只实验大鼠作为独立实验组，同时灌胃给予设定剂量的油溶场地土壤污染物，暴露待用，在实验组大鼠发生死亡或其他影响试验进行的状况时，进行替换。
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