CN1959413B

CN1959413B - 一种用于活性导向筛选抗aids天然产物的方法

Info

Publication number: CN1959413B
Application number: CN2005100476127A
Authority: CN
Inventors: 张卫; 袁景利; 胡政; 靳艳; 王桂兰; 虞星炬; 金美芳
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2005-11-02
Filing date: 2005-11-02
Publication date: 2011-08-10
Anticipated expiration: 2025-11-02
Also published as: CN1959413A

Abstract

本发明涉及HIV-1逆转录酶抑制剂的筛选方法，依据HIV-1逆转录酶以单一碱基RNA为模板催化DNA合成，利用biotin-dUTP和digoxigenin-dUTP随机掺入DNA中，形成digoxigenin-biotin双标记的DNA；再通过抗digoxigenin抗体特异性捕获DNA，利用荧光标记链亲和素与biotin标记DNA的特异性结合进行检测，根据荧光强弱可知合成DNA中生物素的量，从而推算HIV-1逆转录酶的活性。本发明克服了以往方法中生物素干扰造成假阳性的难题，对天然产物中的HIV-1逆转录酶抑制活性进行高效、灵敏检测，方法简便，抗干扰能力强，在抗AIDS天然产物的筛选中具有广泛应用前景。

Description

一种用于活性导向筛选抗AIDS天然产物的方法

技术领域

本发明涉及一种HIV-1逆转录酶抑制剂的筛选方法，具体说是其在天然产物粗提物中活性导向发现抗AIDS化合物方面的应用。

背景技术

HIV-1逆转录酶(HIV-1 RT)抑制剂是获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的潜在治疗药物，目前AIDS治疗药物的大部分是逆转录酶抑制剂。逆转录酶具有突出的靶点特异性，是当前AIDS治疗药物的研究热点，发现新型、高效的HIV-1逆转录酶抑制剂极具应用价值。天然产物中蕴含种类繁多、结构新颖的化合物，是新药的重要来源之一。目前对于天然产物的活性筛选大多集中于分离后获得的纯化合物的筛选，在这些纯化合物中发现真正高活性物质的几率很低，这是由于分离提取工作的盲目性导致的。活性导向分离提取有助于解决这个问题，提高工作效率。虽然HIV-1逆转录酶抑制剂抑制活性检测方法检测手段多样，但局限于纯化合物的逆转录酶抑制活性检测。由于天然产物粗提物中含有大量内源性生物素的干扰，因此目前用于HIV-1逆转录酶抑制剂抑制活性检测的方法无法用于粗提物的筛选，个别方法尽管影响较小，但由于操作复杂难以广泛使用。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简单、可对粗提物进行HIV-1逆转录酶抑制活性跟踪筛选抗AIDS天然产物的方法。

方法原理：HIV-1逆转录酶以RNA为模板催化DNA合成，在反应过程中生物素标记dUTP(biotin-dUTP)和digoxigenin标记dUTP(DIG-dUTP)随机掺入DNA。HIV-1逆转录酶活性通过单位时间内掺入的biotin-dUTP体现，活性越高，单位时间内掺入的biotin-dUTP越多。合成的DNA通过掺入的DIG-dUTP捕获到已包被抗digoxigenin抗体(anti-DIG)的孔板上。加入过量的BHHCT-Eu³⁺标记链亲和素SA(BSA)_0.9(BHHCT-Eu³⁺)₄₆溶液后，标记链亲和素和biotin-dUTP特异性结合，以时间分辨荧光模式测定结合的SA(BSA)_0.9(BHHCT-Eu³⁺)₄₆的荧光强度，得到HIV-1逆转录酶的活性。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种用于活性导向筛选抗AIDS天然产物的方法，以HIV-1逆转录酶抑制活性的检测来对天然产物粗提物进行活性筛选；具体为，将天然产物粗提物加入到HIV-1逆转录酶催化的以单一碱基组成的RNA为模板的DNA合成反应中，biotin标记dUTP和digoxigenin标记dUTP随机掺入DNA，形成digoxigenin-biotin双标记的DNA；再通过digoxigenin标记DNA与抗digoxigenin抗体的特异性结合进行捕获，通过biotin标记DNA与荧光标记链亲和素的特异性结合进行检测，根据荧光强弱可知合成DNA中生物素的量，从而推算HIV-1逆转录酶的活性。HIV-1逆转录酶活性直接影响DNA的合成进而体现在单位时间内掺入的biotin-dUTP，最终以荧光强度检测得到，HIV-1逆转录酶活性越高，单位时间内掺入的biotin-dUTP越多。本发明克服了以往方法中生物素干扰造成假阳性的难题。

具体操作过程为：

1)将anti-DIG稀释在PBS缓冲液中，配制终浓度为8～16mg/l的包被液；在96孔板中每孔加入60～100μl包被液，包被18～36小时；

2)用Tris-HCl缓冲液洗板，每孔用60～100μl 1～2％BSA封闭液封闭30～60分钟；然后再用Tris-HCl缓冲液洗板；

3)配制反应混合物：0.5～1.0 A_260nm/ml模板/引物，0.1～10μM底物，0.1～10μM biotin-dUTP，0.1～10μM DIG-dUTP，45～50mM Tris，200～300mMKCl，20～30mM MgCl₂，8～12mM DTT；

4)将HIV-1 RT稀释在裂解缓冲液中，裂解缓冲液组成为45～50mMTris-HCl，pH 7～8，80～100mM KCl，1～5mM DTT，0.5～1.0mM EDTA，0.5～1.0％(v/v)Triton X-100，配制终浓度为50～100 mU/μl HIV-1 RT溶液；

5)将一定量的天然产物粗提物溶解在裂解缓冲液中；

6)将20～40μl反应混合物、20～40μl天然产物粗提物溶液和20～40μlHIV-1 RT溶液加入到聚合酶链式反应管(PCR tube)内，在PCR仪上37℃逆转录反应20分钟以上；

7)将PCR tube中的混合物移入到包被、封闭好的板孔中，保鲜膜封板37℃孵育30～60分钟；用Tris-HCl缓冲液洗板；

8)每孔加入稀释的 BHHCT-Eu³⁺标记链亲和素SA(BSA)_0.9(BHHCT-Eu³⁺)₄₆溶液60～100μl，保鲜膜封板37℃孵育1～2小时，其中链亲和素浓度1～10μg/ml；用Tris-HCl缓冲液洗板，在时间分辨荧光免疫分析仪上检测；以时间分辨荧光模式测定结合的SA(BSA)_0.9(BHHCT-Eu³⁺)₄₆的荧光强度，得到HIV-1逆转录酶的活性。

步骤6)以20～40μl反应混合物、20～40μl裂解缓冲液进行逆转录反应，作为背景信号；以20～40μl反应混合物、20～40μl裂解缓冲液和20～40μl HIV-1 RT溶液，作为阳性对照。

抑制率计算：

本发明与现有技术相比具有如下优点：

1.本发明方法灵敏度、准确度与精密度高，抗生物素干扰能力强。

2.应用范围宽。本发明由于有效避免了内源性生物素带来的干扰，可以用于天然产物粗提物的活性导向筛选，检测粗提物的HIV-1 RT抑制活性，进而指导提取分离工作；可以准确定量实际样品的HIV-1 RT活性，例如AIDS患者的血清；可以筛选纯化合物的HIV-1 RT抑制活性，并确定其半数抑制浓度；由于使用了微量滴定板，配合自动化操作仪器和数据处理系统，即可用于高通量筛选。

3.简便省时。本发明操作步骤仅包括包被、封闭、逆转录反应、捕获、标记物特异性结合和检测，后四步仅需要约2.8小时，目前现有技术方法均超过4小时。

4.应用方便。可根据本发明检测方法开发出相应的检测试剂和试剂盒，其应用将十分方便快捷。

总之，本发明方法可对天然产物粗提物中的HIV-1逆转录酶抑制活性进行高效、灵敏检测，方法简便，抗干扰能力强，在抗AIDS天然产物的筛选和发现中具有广泛应用前景。

附图说明

图1为不同HIV-1 RT浓度与背景扣除的荧光强度的关系曲线图；

注：荧光计数(Fluorescence Counts)

图2为生物素对本发明方法在检测已知抑制剂抑制HIV-1 RT活性时的干扰图谱；

图3为掺入生物素对已知抑制剂抑制率的影响图谱；

图4为本发明方法检测繁茂膜海绵粗提物中添加已知抑制剂的效果图谱；

图5为相同量的Efavirenz在空白和添加入繁茂膜海绵粗提物中的抑制率图谱。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的方法与结果进行说明，本发明使用铕荧光标记物BHHCT-Eu³⁺标记链亲和素进行荧光定量测定，其中BHHCT-Eu³⁺是带有生物标记功能的有机配位体与3价铕离子形成的荧光化合物，荧光测定方法包括常规的荧光测定法与时间分辨荧光测定法；其中BHHCT-Eu³⁺采用申请人已申报的专利制备(申请号03133857.7，发明名称：β-二酮-三价铕配合物纳米荧光探针及其制备和应用)，所用的BHHCT-Eu³⁺标记链亲和素，SA(BSA)_0.9(BHHCT-Eu³⁺)₄₆，采用申请人已报道的方法制备(文献：J.Yuan，G Wang，H.Kimura，K.Matsumoto，Anal.Biochem.，1997，254，283-287)，其他试剂均为商业化的试剂。

实施例1

将anti-DIG稀释在PBS缓冲液(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mMNa₂HPO₄，2mM KH₂PO₄)中，配制终浓度为8mg/l的包被液。每孔加入60μl包被液，包被24hr。用缓冲液A(50mM Tris-HCl，pH 7.8，0.15M NaCl，0.05％Tween-20)洗板3次，用冲洗缓冲液B(50mM Tris-HCl，pH 7.8，0.15M NaCl)洗板1次。每孔用75μl封闭液(1％BSA，50mM Tris-HCl，pH7.4，0.15M NaCl)封闭1小时。用缓冲液A洗板3次，用缓冲液B洗板1次。配制反应混合物(0.75 A_260nm/ml模板/引物[poly[A]/poly[dT]₁₅]，10μM dTTP，5μM biotin-dUTP，5μM DIG-dUTP，45.8mM Tris，265.8mMKCl，27.5mM MgCl₂，9.17mM DTT)，将HIV-1 RT稀释在裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.8，80mM KCl，2.5mM DTT，0.75mM EDTA，0.5％TritonX-100)中，配制终浓度为0.05～500mU/μl HIV-1 RT溶液，将20μl反应混合物、20μl裂解缓冲液和20μl HIV-1 RT溶液加入到PCR管内，在PCR仪上37℃逆转录反应。1小时后将PCR管中的混合物移入到包被、封闭好的板孔中，保鲜膜封板37℃孵育45分钟。用冲洗缓冲液A洗板3次，用冲洗缓冲液B洗板1次。每孔加入稀释的SA(BSA)_0.9(BHHCT-Eu³⁺)₄₆溶液60μl，保鲜膜封板37℃孵育1小时。用缓冲液C(50mM Tris-HCl，pH9.1，0.05％Tween-20)洗板。在时间分辨荧光免疫分析仪上检测。以20μl反应混合物、40μl裂解缓冲液进行逆转录反应，作为背景信号。

对所有数据点扣除本底后用双对数坐标作图，得到HIV-1 RT浓度与荧光强度的关系曲线，如图1所示，相关方程为Log(Y)＝0.58109Log(X)+2.67356，相关系数为R＝0.997，R²＝0.994。用本底溶液荧光信号标准偏差的3倍计算该方法的最低检测下限为2.94 mU。该法的批内相对标准偏差(CV)小于10％，批间CV小于16％，表明方法具有高的灵敏度和精密度。

实施例2

将anti-DIG稀释在PBS缓冲液中，配制终浓度为8mg/l的包被液。每孔加入60μl包被液，包被24小时。用缓冲液A洗板3次，用缓冲液B洗板1次。每孔用75μl封闭液封闭1小时。用冲洗缓冲液A洗板3次，用冲洗缓冲液B洗板1次。配制反应混合物(0.75 A_260nm/ml模板/引物[poly[A]/poly[dT]₁₅]，10μM dTTP，5μM biotin-dUTP，5μM DIG-dUTP，45.8mM Tris，265.8mM KCl，27.5mM MgCl₂，9.17mM DTT)，将HIV-1 RT稀释在裂解缓冲液中，配制终浓度为50 mU/μl HIV-1 RT溶液，将一定量Efavirenz溶解在裂解缓冲液中，配制Efavirenz溶液，将20μl反应混合物、20μl Efavirenz溶液和20μl HIV-1 RT溶液加入到PCR管内，在PCR仪上37℃逆转录反应。1小时后将PCR管中的混合物移入到包被、封闭好的板孔中，保鲜膜封板37℃孵育45分钟。用缓冲液A洗板3次，用缓冲液B洗板1次。每孔加入稀释的SA(BSA)_0.9(BHHCT-Eu³⁺)₄₆溶液60μl，保鲜膜封板37℃孵育1小时。用缓冲液C洗板。在时间分辨荧光免疫分析仪上检测。以20μl反应混合物、40μl裂解缓冲液进行逆转录反应，作为背景信号。以20μl反应混合物、20μl裂解缓冲液和20μl HIV-1 RT溶液，作为阳性对照。抑制率计算：

使用SPSS软件计算半数抑制浓度(IC₅₀)，得Efavirenz的IC₅₀为0.83μM，变异系数(CV)为1.4％，表明本方法具有非常好的再现性。

实施例3

将Efavirenz溶解在裂解缓冲液中，终浓度为250ng/ml。将生物素溶解在裂解缓冲液中，终浓度为2μg/ml。将Efavirenz和生物素共同溶解在裂解缓冲液中，终浓度为250ng/ml Efavirenz，2μg/ml生物素。将这3种溶液和阳性对照用于方法检测，结果如图2和图3所示。生物素的掺入对阳性对照和已知抑制剂的检测几乎没有影响，根据文献报道使用商业试剂盒的方法在检测时掺入0.2μg/ml生物素即可造成77.78％的抑制率，这是生物素对方法本身产生影响而造成的假阳性。本方法即使在掺入10倍浓度即2μg/ml生物素时仍然对测定几乎没有影响，表明本方法可以有效避免内源性生物素带来的干扰，可用于天然产物粗提物对HIV-1 RT抑制活性的检测以及分离时的活性跟踪。

实施例4

繁茂膜海绵(Hymeniacidon perleve)采集于中国大连凌水，采集后剪碎，反复冻融破碎细胞，冷冻干燥48小时，于甲醇中机械搅拌提取，重复3次，离心取上清液，合并一起减压蒸馏至粉末状固体，真空干燥72小时，作为粗提物样品。

为避免天然产物粗提物中一些大分子(例如RNase、DNase、Proteinase等)可能带来的干扰，在用于筛选方法前，先对粗提物溶液(使用裂解缓冲液配制)进行离心超滤处理，该操作使用Millipore公司的Microcon YM-3型离心超滤管(分子量截留值为3000)。

称取一定量粗提物溶解在裂解缓冲液中，此液用于方法检测作为粗提物背景。以Efavirenz作为已知抑制剂，称取一定量粗提物和Efavirenz溶解在裂解缓冲液中，此液用于方法检测获得Efavirenz在粗提物中的检测信号，结果如图4和图5所示。本法测得250ng/ml Efavirenz掺在粗提物中对HIV-1RT活性的抑制率是46.59％，而直接使用250ng/ml Efavirenz对HIV-1 RT活性的抑制率是46.16％，回收率为100.93％，这表明本方法具有高度的准确性。

Claims

1.一种用于活性导向筛选抗AIDS天然产物的方法，其特征在于：以HIV-1逆转录酶抑制剂抑制活性的检测来对天然产物粗提物进行筛选；具体为，在逆转录反应体系中加入天然产物粗提物，逆转录反应体系包括HIV-1逆转录酶、单一碱基组成的RNA及引物、生物素-dUTP、异羟基洋地黄毒甙元-dUTP、dTTP，HIV-1逆转录酶以单一碱基组成的RNA为模板催化DNA合成，生物素-dUTP和异羟基洋地黄毒甙元-dUTP随机掺入DNA，形成异羟基洋地黄毒甙元-生物素双标记的DNA；再通过异羟基洋地黄毒甙元标记DNA与抗异羟基洋地黄毒甙元抗体的特异性结合进行捕获，通过生物素标记DNA与荧光标记链亲和素的特异性结合进行检测，HIV-1逆转录酶活性通过单位时间内掺入的生物素-dUTP体现，活性越高，单位时间内掺入的生物素-dUTP越多。

2.按照权利要求1所述用于活性导向筛选抗AIDS天然产物的方法，其特征在于：具体操作过程为，

1)将抗异羟基洋地黄毒甙元抗体稀释在PBS缓冲液中，配制终浓度为8～16mg/l的包被液；在96孔板中每孔加入60～100μl包被液，包被18～36小时；

2)用Tris-HCl缓冲液洗板，每孔用60～100μl1～2％BSA封闭液封闭30～60分钟；然后再用Tris-HCl缓冲液洗板；

3)配制反应混合物：0.5～1.0A_260nm/ml模板/引物，0.1～10μM底物，0.1～10μM生物素-dUTP，0.1～10μM异羟基洋地黄毒甙元-dUTP，45～50mMTris，200～300mM KCl，20～30mM MgCl₂，8～12mM DTT；

4)将HIV-1逆转录酶稀释在裂解缓冲液中，裂解缓冲液组成为45～50mM Tris-HCl，pH 7～8，80～100mM KCl，1～5mMDTT，025～1.0mM EDTA，0.5～1.0％Triton X-100，配制终浓度为50～100mU/μl HIV-1逆转录酶溶液；

5)将天然产物粗提物溶解在裂解缓冲液中；

6)将20～40μl反应混合物、20～40μl天然产物粗提物溶液和20～40μl HIV-1逆转录酶溶液加入到聚合酶链式反应管内，在PCR仪上37℃逆转录反应20分钟以上；

7)将PCR管中的混合物移入到包被、封闭好的板孔中，保鲜膜封板37℃孵育30～60分钟；用Tris-HCl缓冲液洗板；

8)每孔加入稀释的BHHCT-Eu³⁺标记链亲和素SA(BSA)_0.9(BHHCT-Eu³⁺)₄₆溶液60～100μl，保鲜膜封板37℃孵育1～2小时，其中链亲和素浓度1～10μg/ml；用Tris-HCl缓冲液洗板，在时间分辨荧光免疫分析仪上检测；以时间分辨荧光模式测定结合的SA(BSA)_0.9(BHHCT-Eu³⁺)₄₆的荧光强度，得到HIV-1逆转录酶的活性。

3.按照权利要求2所述用于活性导向筛选抗AIDS天然产物的方法，其特征在于：步骤6)以20～40μl反应混合物、20～40μl裂解缓冲液进行逆转录反应，作为背景信号；以20～40μl反应混合物、20～40μl裂解缓冲液和20～40μl HIV-1逆转录酶溶液，作为阳性对照。