CN1952145A - 水稻抗病相关基因OsDR6 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物生物技术领域。具体涉及包含水稻抗病相关基因OsDR6的DNA片段的分离克隆和功能验证。利用基于RNA干扰(RNA interference，RNAi)原理的转基因技术，将OsDR6基因的部分DNA片段与能够表达双链RNA的载体连接并转化感病水稻品种，抑制感病水稻品种中OsDR6基因的表达。OsDR6基因表达量显著降低的遗传转化水稻对白叶枯病菌的抗性明显增强，证明OsDR6基因是水稻抗白叶枯病反应中的负调控因子，可以通过抑制它的功能增强水稻的抗病能力。

Description

水稻抗病相关基因OsDR6

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域。具体涉及一个水稻抗病相关基因OsDR6的分离克隆和功能验证。OsDR6基因是水稻抗病反应中的负调控因子。抑制OsDR6基因的功能可以显著增强水稻抵抗病害的能力。

背景技术

植物在生长的过程中，受到多种病原物的侵害。植物病原物的种类繁多，包括病毒、细菌、真菌和线虫等。病原物侵入植物导致两种结果：(1)病原体成功的在寄主植物内繁殖，引起相关的病症；(2)寄主植物产生抗病反应，杀死病原物或阻止其生长。利用抗性基因资源改良植物的抗病性，是预防病害同时又保护环境的根本出路。

植物的抗病反应是多基因参于调控的复杂过程。参于植物抗病反应的基因分为两类：(1)抗病基因，又称R(resistance)基因和(2)抗病相关基因。

根据目前人们对抗病基因功能的认识，这类基因的产物主要是作为受体，直接或间接与病原蛋白相互作用，启动植物体内的抗病信号传导路径(Tang等，1996，Physical interaction ofavrPto and the Pto kinase defines a recognition event involved in plant disease resistance，Science 274：2060-2063；Baker等，1997，Signaling in Plant-Microbe interactions，Science276：726-733；Jia等，2000，Direct interaction of resistance gene and avirulence gene productsconfers rice blast resistance，EMBO J.19：4004-4014；Dangl和Jones，2001，Plant pathogens andintegrated defence responses to infection，Nature 411：826-833；Nimchuk等，2001，Knowing thedancer from the dance：R-gene products and their interactions with other proteins from host andpathogen，Curr.Opin.Plant Biol.4：288-294)。抗病基因介导的抗病反应抗性强，是很好的基因资源。但由于下述原因，使利用抗病基因改良植物抗性受到限制：(1)抗病基因的资源有限，如目前知道的抵抗水稻重要病害白叶枯病的抗病基因少于30个，抵抗另一水稻重要病害—稻瘟病的抗病基因也只有大约40个；(2)抗病基因具有病原种类和病原生理小种特异性，抗病范围有限；(3)因为病原的快速突变，一个抗病基因的作用往往几年或者十几年后就丧失了。

抗病相关基因是指除抗病基因外所有参于抗病反应的基因，它们的编码产物参于合成植物体内抗病信号分子、参于信号传导、阻止信号传导或参于防卫反应等。这类基因的共同特点是病原诱导后它们的表达量升高或减少，因此人们可以根据病原诱导前后基因的表达量的差异大规模地鉴定植物抗病相关基因(Maleck等，2000，Use microarrays to monitortranscriptional changes during development of SAR，Nature Genet.26：403-410；Schenk等，2000，Coordinated plant defense responses in Arabidopsis revealed by microarray analysis，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：11655-11660；Zhou等，2002，The defense-responsive genes showing enhancedand repressed expression after pathogen infection in rice(Oryzae sativa L.)，Science in China(Series C)45：449-467)。目前，人们对抗病相关基因的认识有限。根据已有报道，绝大多数抗病相关基因单独作用时的抗性能力可能比抗病基因小。但根据下述原因，它们是值得大力开发的基因资源：(1)由于绝大多数抗病相关基因的产物不需要直接与病原物相互作用，这类基因是具有持久抗性的基因资源；(2)大多数抗病相关基因参于的抗病反应没有病原特异性，因此它们是具有广谱抗性的基因资源；(3)这类基因的资源丰富。但是，水稻中虽然鉴定了很多抗病相关基因(Zhou等，2002，Science in China(Series C)45：449-467；Chu等，2004，Genome-wide analysis of defense responsive genes in bacterial blight resistance of rice mediatedby a recessive R gene，xa13，Mol.Gen.Genomics 271：111-120)，这些基因在水稻抗病反应中的作用机理、以及单个抗病相关基因是否会引起水稻抗病表型的改变都不清楚。

水稻是世界上重要的粮食作物，但病害的影响常常造成其产量和品质的下降。因此，了解病害的发病机制，有助于利用高效途径改良水稻品种的抗性，控制病害的发生，减少或避免植物病害所带来的损失。

分离克隆抗病相关基因是对水稻抗病机理研究的前提。同时，与抗病基因的应用相比，抗病相关基因的应用能提供植物更为广谱及长效的抗性。通过抑制作为抗病反应负调控因子的抗病相关基因的功能进行水稻品种的改良，将进一步增强植物的抗病性，拓宽植物的抗谱。这些方面是采用常规植物育种和改良技术所不能达到的。

发明内容

本发明的目的是分离克隆水稻中携带的一个抗病相关基因完整DNA片段，并利用RNA干扰技术(RNA interference，RNAi)通过使目标基因沉默鉴定该基因在抗病反应过程中所起作用，为利用这个基因改良水稻品种或其它植物抵御病害的能力奠定基础。

本发明涉及分离一种包含OsDR6(Oryza sativa defense responsive 6)基因的DNA片段并鉴定其功能，该片段赋予植物对由白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)所引起的病害产生感病反应。其中，所述片段如序列表SEQ ID NO：1所示，或者基本上相当于SEQ IDNO：1所示的DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID NO：1所示序列的亚片段。对其序列进行分析表明它与拟南芥的AtMPK4(mitogen-activated protein kinase 4，细胞激动素激活的蛋白激酶4)基因高度同源。抑制序列表SEQ ID NO：1所示序列的表达可以增强水稻对白叶枯病的抗性。

可以采用已经克隆的OsDR6基因作探针，从cDNA和基因组文库中筛选到本发明的基因或同源基因。同样，采用PCR(polymerase chain reaction)技术，也可以从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的OsDR6基因以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。采用以上技术，可以分离得到包含OsDR6基因的序列或者包含一段OsDR6基因的序列，将这一序列与合适的载体连接，可以转入植物细胞抑制其自身的OsDR6基因的表达，产生抗病转基因植物。采用这种转基因技术创造抗病植物是传统育种技术所不能达到的。

在本发明的实施例部分，我们阐述了OsDR6基因的分离和功能验证过程以及该基因的特点；将OsDR6基因的一段片段和适当的载体连接，转入植物体中抑制其自身OsDR6基因的表达，是创造抗病植株的一条途径。

序列表、附图及其说明

序列表SEQ ID No：1.OsDR6基因的序列和它编码的蛋白质的氨基酸序列。

图1.本发明鉴定和分离克隆水稻抗病相关基因OsDR6以及验证OsDR6基因功能的流程图。

图2.用Northern杂交技术检测水稻品种明恢63四叶期植株的离体叶片在抗病信号分子水杨酸(SA)、苯并噻二唑(BTH)、2，6-二氯异烟酸(INA)和茉莉酸(JA)处理后OsDR6基因的表达模式。用Northern杂交技术检测水稻品系IRBB4接白叶枯菌株PXO61后OsDR6基因的表达模式。用RT-PCR技术检测明恢63接种稻瘟病菌株V86013后OsDR6基因的表达模式。ck代表对照(水处理)样品，0代表没有任何处理的样品对照、15、30、60、90、120分别代表处理后15分钟、30分钟、60分钟、90分钟、120分钟的样品。4h、8h、12h、16h、1d、3d、5d代表接种后4小时、8小时、12小时、16小时、1天、3天、5天的样品。

图3.OsDR6基因的结构。线条表示内含子；柱条表示外显子，其中黑色部分代表编码序列，白色部分代表5’和3’非翻译区(UTR)；数字表示各个结构的碱基数。“ATG”和“TAA”分别是翻译起始密码和终止密码。长箭头蛋白序列表SEQ ID NO：1所示序列的DNA片段。短箭头代表进行基因结构分析中所用PCR引物位置。

图4.(A)OsDR6基因的cDNA克隆EI106L06结构，示载体pSPORT1上的EI106L06插入酶切位点和cDNA内部的AccI酶切位点。(B)改造后携带表达OsDR6双链RNA片段(755bp)的pCAMIA1301载体，即克隆D87R。RB和LB代表pCAMIA1301载体(Sun等，2004，Plant J.37：517-527)上的T-DNA右和左边界；GUS代表pCAMIA1301载体上的β-葡萄糖苷酸酶基因(标记基因)；Hpt代表潮霉素磷酸转移酶基因(筛选基因)。35S代表pMCG161载体构件上的花椰菜花叶病毒启动子；AdhI代表pMCG161载体构件上的玉米乙醇脱氢酶基因内含子I；OCS代表pMCG161载体构件上的章鱼碱合成酸基因终止子；Waxy-a代表pMCG161载体构件上的水稻Waxy基因内含子。

图5.阳性T0代遗传转化植株(D87RZ1-20、D87RZ1-28、D87RZ1-10)接种白叶枯病菌PXO61三周后形成的病斑明显比感病水稻品种中花11(对照)的短。中花11为遗传转化受体材料。

图6.用Northern杂交技术检测OsDR6基因在对照材料(中花11)和T₀代遗传转化植株(D87RZ1)中的表达量。D87RZ1-3是阴性转化植株，其它植株是阳性转化植株。

具体实施方式

以下实施例中进一步定义本发明，图1描叙了鉴定和分离克隆OsDR6基因以及验证OsDR6基因功能的流程。根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明作出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例一：OsDR6基因在水稻品种中的表达模式分析

拟南芥中编码AtMPK4的基因是抗病反应中的负调控基因(Asai等，2002，MAP kinasesignaling cascade in Arabidopsis innate immunity，Nature，415：977-983)。为了检测AtMPK4基因在水稻中的同源基因是否也是抗病反应的负调控因子，我们用BLASTP分析方法(Altschul等，1997，Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs，Nucleic Acids Res.25：3389-3402)、以AtMPK4基因编码的氨基酸序列检索水稻品种明恢63的EST (expressed sequence tag)序列数据库(Zhang等，2005，Features of the expressedsequences revealed by a large-scale analysis of ESTs from a normalized cDNA library of the eliteindica rice cultivar Minghui 63.Plant J.42：772-780)，发现推测的cDNA EI106L06的编码序列与拟南芥AtMPK4蛋白的同源性为84％(E值＝e-180)，提示cDNA EI106L06所代表的基因可能就是水稻中与拟南芥AtMPK4基因同源的基因，它可能也是抗病反应的负调控基因。我们将cDNA EI106L06所代表的基因命名为OsDR6(Oryza sativa defense responsive 6)。

采用M13-R和M13-F通用引物、美国Perkin Elmer公司的测序试剂盒(Big Dye Kit)、以双脱氧核苷酸末端终止法(美国Perkin Elmer公司)分别从cDNA克隆EI106L06两端测序。得到一长1537bp的cDNA序列。

为了进一步证实OsDR6基因参于抗病反应的调控，我们采用Northern杂交技术(Chu等，2004，Mol.Gen.Genomics 271：111-120)和RT-PCR(reverse transcriptase-PCR)技术(Zhou等，2002，Science in China(Series C)45：449-467)分析了OsDR6基因在抗病信号分子水杨酸(SA)、苯并噻二唑(BTH)、2，6二氯异烟酸(INA)和茉莉酸(JA)以及白叶枯病菌PXO61和稻瘟病菌V86013诱导后的表达模式。抗病信号分子的处理方法是取四叶期水稻叶片剪成2厘米的长度后用100μM的抗病信号分子溶液浸泡处理(Agrawal等，2000，A novel rice(Oryzasativa L.)acidic PR1 gene highly responsive to cut，phytohormones，and protein phosphataseinhibitors，Biochem.Biophys.Res.Commun.274：157-165)。白叶枯病菌接种采用剪叶法(Kauffman等，1973，An improved technique for evaluating resistance of rice varieties toXanthomonas oryzae，Plant Dis.Rep.57，537-541)对成株期的水稻进行接种。稻瘟病菌接种采用喷雾法对四叶期的水稻进行接种(Chen等，2001，Pathotypes of Pyricularia grisea in rice fieldsof central and southern China，Plant Dis.85：843-850)。RT-PCR技术中的OsDR6基因特异PCR引物是MPK2F(5’-ATGAATTCTGTACCAGTTGCTACGAGGG-3’)和MPKR(5’-ATAAGCTTCTCTGAGCTCTTAGTAGGGAGG-3’)。

分析结果显示抗病信号分子都诱导增强OsDR6基因的表达(图2)；白叶枯病菌和稻瘟病菌接种后短暂抑制OsDR6基因的表达，但随后OsDR6基因的表达增强(图2)。这些结果证实OsDR6基因不仅参于抗白叶枯病反应的调控，也参于抗稻瘟病反应的调控。

实施例二：确定OsDR6基因的基因组序列和基因结构分析

1.OsDR6基因结构的预测

以OsDR6基因的cDNA序列EI106L06作模板，用BLAST方法检索核苷酸数据库，发现数据库中来自水稻品种日本晴的一条位于水稻10号染色体、长300029bp序列(核苷酸数据库GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)注册号：AE017115)的一段序列(第55596至59326bp处)与EI106L06的同源性达到100％(E值＝0)，提示AE017115中包含与OsDR6同源的基因，即OsDR6的等位基因。

利用GENSCAN(http://genes.mit.edu/GENSCAN.html)、GeneFinder(http://genomic.sanger.ac.uk/gf/gf.shtml)、Gene Feature Searches(http://dot.imgen.bem.tmc.edu:9331/)、GeneMark(http://genemark.biology.gatech.edu/GeneMark/hmmchoice.html)等多个基因结构的预测软件分析预测AE017115序列中与cDNA EI106L06同源基因的结构，同时比较分析EI106L06序列，分析判断EI106L06是OsDR6基因的全长cDNA序列。

2.确定明恢63中的OsDR6基因的基因组序列

我们根据OsDR6基因在水稻品种日本晴中的等位基因(序列AE017115第55596至59326bp处的基因)的序列设计了5条PCR引物MPK1F(5’-ATGAATTCCCATGGATTCCTCCTCCGGC-3’)、MPK2F(5’-ATGAATTCTGTACCAGTTGCTACGAGGG-3’)、MPKR(5’-ATAAGCTTCTCTGAGCTCTTAGTAGGGAGG-3’)、MPK3F(TCTTCATCACCCATACTTG)和MPK3R(5’-TGTCCATGCCTCTACATT-3’)，采用分步扩增方法，从明恢63中扩增OsDR6基因的不同DNA片段(图3)。将PCR扩增片段与pUC19载体(美国Amersham Bioscience公司)连接，电转化大肠杆菌DH10B(Sun等，2004，Plant J.37：517-527)，通过蓝白斑筛选获得3个阳性克隆。采用M13-R和M13-F通用引物、美国Perkin Elmer公司的测序试剂盒(BigDye Kit)、以双脱氧核苷酸末端终止法(美国Perkin Elmer公司)分别从阳性克隆两端测序。序列拼接后得到一长3850 bp的DNA序列，它包括完整的OsDR6基因组序列。

3.OsDR6基因结构分析

比较分析OsDR6基因的基因组序列和cDNA序列，确定OsDR6基因由3735个核苷酸组成，包含7个外显子(位于序列表SEQ ID NO：1的12-277bp、547-676bp、1701-1838bp、2020-2352bp、2570-2753bp、2827-3007bp和3442-3746 bp处)和6个内含子(位于序列表SEQ ID NO：1的278-546bp、677-1700bp、1839-2019bp、2353-2569bp、2754-2826bp和3008-3441bp处)。OsDR6基因的5’端非翻译区(untranslated region，UTR)由93个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的12-104bp处)，3’端UTR由316个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的2997-3007bp和3442-3746bp处)。OsDR6基因的编码区由1128个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的105-277bp、547-676bp、1701-1838bp、2020-2352bp、2570-2753bp和2827-2996bp处)，编码376个氨基酸。

实施例三：OsDR6基因编码产物的分析

根据BLAST分析结果，OsDR6基因编码的蛋白质与拟南芥AtMPK4基因的编码产物(National Center for Biotechnology Information(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)蛋白质数据库注册号：S40470)同源，氨基酸一致性为84％(E值＝e-180)，与拟南芥AtMPK5的编码产物(NCBI蛋白质数据库注册号：S40471)的氨基酸一致性为74％(E值＝e-161)，与玉米盐诱导的SIMK1(salt-induced MAP kinase 1)蛋白(NCBI蛋白质数据库注册号：AAR11450.1)氨基酸一致性为93％(E值＝0.0)。因为上述拟南芥和玉米的基因都编码细胞激动素激活的蛋白激酶，故OsDR6基因的编码产物极有可能是一种细胞激动素激活的蛋白激酶

实施例四：OsDR6基因的功能验证

本发明采用RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术、通过抑制水稻品种中花11中OsDR6基因的表达，验证该基因的功能。这个技术途径的主要机理：将目标基因的部分片段以反向重复的形式与能够表达双链RNA(double strand RNA，dsRNA)的载体连接，通过遗传转化将该载体导入植物中。获得的转化植株大量表达与目标基因部分片段同源的dsRNA。这些dsRNA迅速形成短干扰RNA(short interfering RNA，siRNA)。这些siRNA与目标基因的转录子(mRNA)互补配对，在细胞内特殊酶的作用下使目标基因的转录子降解，从而在mRNA水平上抑制目标基因的功能。研究者可以通过转基因植株表型的改变，验证目标基因的功能。RNA干扰技术已被广泛用于基因功能的验证(Smith等，2000，Total silencing by intron-splicedhairpin RNAs，Nature 407：319-320)。

本发明中cDNA克隆EI106L06是包含OsDR6基因完整编码区的全长cDNA，载体是pSPORT1(储昭晖等，2002，水稻全生育期均一化cDNA文库的构建和鉴定，科学通报47：1656-1662)，cDNA EI106L06被插入在pSPORT1载体的SalI和NotI多克隆位点；分析EI106L06的序列显示它内部具有限制性内切酶AccI的消化位点(图4A)。本发明首先用限制性内切酶AccI和NotI消化cDNA克隆EI106L06，使cDNA EI106L06的3’端被截短782个核苷酸，然后使截短后的载体自连；截短后的EI106L06克隆只包含OsDR6基因的一部分cDNA片段(755bp，位于序列表SEQ ID NO：1的12-277bp、547-676bp、1701-1838bp和2020-2240bp处)。用下列dsF和dsR序列作为PCR引物，以截短后的EI106L06克隆为模板，通过PCR扩增得到待转化的DNA片段。为了便于PCR产物的克隆，dsF和dsR引物的5’-端标有下划线的部分为限制性酶SpeI和AscI或者SacI和AvrII的消化位点，随后的3’-端的序列则分别与载体pSPORT1多克隆位点两侧的序列匹配。

SpeI    AscI

dsF：5’-TA  ACTAGT  GGCGCC TGCAGGTACCGGTCCG-3’

SacI    AvrII

dsR：5’-TA  GAGCTC  GCCTAG GTGCACGCGTACGTACGTAAGC-3’

将pMCG161载体(McGinnis等，2005，Transgene-induced RNA interference as a tool forplant functional genomics.Methods Enzymol.392：1-24)中能够表达dsRNA的构件酶切下，插入pCAMIA1301载体(见Sun等，2004，Plant J.37：517-527；王石平等，中国发明专利申请公开说明书，专利申请号：02139212.9)的EcoRI和HindIII多克隆位点处；使改造后的pCAMIA1301载体携带能够表达dsRNA的构件(图4B)。

构建OsDR6基因片段的第一重复链(正向链)：用AscI和AvrII消化部分PCR产物及改造后的pCAMIA1301载体，消化完全后在75℃水浴10min灭活限制性内切酶，置于冰上，用T₄ DNA连接酶进行连接反应(图4B)。电转后获得的克隆质粒用dsF和dsR引物扩增筛选阳性克隆。

构建OsDR6基因片段的第二重复链(反向链)：用SacI和SpeI消化剩余的PCR产物和连接了第一重复链的克隆质粒，消化完全后在75℃水浴10min灭活限制性内切酶，用T₄ DNA连接酶进行连接反应(图4B)。电转后获得的克隆质粒用SacI和SpeI双酶消化反应筛选阳性克隆，阳性克隆命名为D87R。

采用农杆菌介导的遗传转化方法(Lin和Zhang，2005，Optimising the tissue cultureconditions for high efficiency transformation of indica rice，Plant Cell Rep.23：540-547)将D87R导入水稻品种中花11。获得的遗传转化植株被命名为D87RZ1(其中前面部分为遗传转化载体名称，Z1代表水稻品种中花11)。本发明共获得独立转化植株36株。对全部转化植株在成株期阶段接种白叶枯病菌株PXO61，发现13株转化植株的抗性显著增强，与阴性转化植株相比，这些抗性增强的转化植株的病斑面积(病斑长/病叶长×％)减少33-58％(表1)(图5)。

表1.部分T₀代转化植株(D87RZ1)对白叶枯病菌株PXO61的反应

水稻材料	病斑面积(％)(1)	P值
			D87RZ1-7	33％	0.0000195
D87RZ1-10	28％	0.0000330
			D87RZ1-13	24％	0.0000042

D87RZ1-17	32％	0.0225120
			D87RZ1-18	27％	0.0000549
D87RZ1-19	21％	0.0000041
			D87RZ1-20	7％	0.0000002
D87RZ1-28	8％	0.0000069
			D87RZ1-29	8％	0.0000033
D87RZ1-30	20％	0.0012982
			D87RZ1-34	7％	0.0000002
D87RZ1-35	8％	0.0000069
			D87RZ1-36	8％	0.0000033
D87RZ1-3(2)	74％
			D87RZ 1-8(2)	58％
D87RZ1-11(2)	73％
			D87RZ1-12(2)	60％
D87RZ1-14(2)	61％

⁽¹⁾每株转化基因植株接种3-5片叶，21天后调查病斑和病叶长度，每个数据来自于多个叶片的平均值。

⁽²⁾阴性转化植株，其它植株为阳性转化植株。

为进一步验证转化植株的抗病能力减弱是否与OsDR6基因表达量相关，本发明对13株转化植株抽提总RNA，用Northern杂交检测基因表达量。实验结果显示转化植株中OsDR6基因的表达量变化与植株的表型变化密切相关(图6)。抗病性增强的转化植株中OsDR6基因的表达量与对照材料中花11相比显著减少。而抗病表型无明显变化的阴性转化植株D87RZ1-3中OsDR6基因表达量与中花11相比无明显变化。该结果说明了OsDR6基因的编码产物在水稻抗白叶枯病反应发挥负调控因子的作用。抑制水稻中OsDR6基因的表达，可增强水稻对白叶枯病的抗性。

                   序列表SEQ ID NO：1

<110>华中农业大学

<120>水稻抗病相关基因OsDR6

<130>

<141>2005-10-21

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>3850

<212>DNA

<213>Oryza sativa

<220>

<221>gene

<222>(12)..(3746)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(105)..(277)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(547)..(676)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(1701)..(1838)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(2020)..(2352)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(2570)..(2753)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(2827)..(2996)

<223>

<220>

<221>Intron

<222>(278)..(546)

<223>

<220>

<221>Intron

<222>(677)..(1700)

<223>

<220>

<221>Intron

<222>(1839)..(2019)

<223>

<220>

<221>Intron

<222>(2353)..(2569)

<223>

<220>

<221>Intron

<222>(2754)..(2826)

<223>

<220>

<221>Intron

<222>(3008)..(3441)

<223>

<220>

<221>3’UTR

<222>(2997)..(3007)

<223>

<220>

<221>3’UTR

<222>(3442)..(3746)

<223>

<220>

<221>5’UTR

<222>(12)..(104)

<223>

<400>1

cctcctccta ctccgatcaa cgactagtcg cggcgaccaa gagccaaacc ctacgcctcc    60

tcccctcccc ctccacctcg tcctccccgc gagcggcggc ggcc atg gat tcc tcc     116

                                                 Met Asp Ser Ser

                                                 1

tcc ggc ggc gcg ggc ggc ggc ggc ggc gcg cag atc aag ggg atg ggg      164

Ser Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Ile Lys Gly Met Gly

5                   10                  15                  20

acg cac ggg ggc cgc tac gtg ctg tac aac gtg tac ggg aac ttc ttc      212

Thr His Gly Gly Arg Tyr Val Leu Tyr Asn Val Tyr Gly Asn Phe Phe

                25                  30                  35

gag gtc tcc tcc aag tac gcc cct ccc atc cgc ccc atc ggc cgg ggc      260

Glu Val Ser Ser Lys Tyr Ala Pro Pro Ile Arg Pro Ile Gly Arg Gly

            40                  45                  50

gcc tac ggc att gtc tg gtgcgtttgc ctcgccctcc cctcccctcc              307

Ala Tyr Gly Ile Val Cys

        55

cgagttatgc gtgtgggttt actaattaat agcgaatccg agttgctatt tttgttcgaa    367

aattcgcgag ggcgtttatg tgttcgtgac acatcgcgta gatttggctc cggatgttgt    427

gttttaggca taaggatgtg tgggggaaat gggtcacggc ggcccaaaaa tgttatggtt    487

tgactgcttg agtagatgtg attatattgt agtagtaatt ttgtttttcc tatttgtag     546

c gcg gct gtt aac tcg gag aac ggc gag gaa gtt gcc atc aag aag att    595

  Ala Ala Val Asn Ser Glu Asn Gly Glu Glu Val Ala Ile Lys Lys Ile

      60                  65                  70

ggc aat gca ttc gac aac cat atc gat gcc aag cgg aca ctg aga gaa      643

Gly Asn Ala Phe Asp Asn His Ile Asp Ala Lys Arg Thr Leu Arg Glu

75                  80                  85                  90

atc aag ctg ctt cgc cac atg gac cac gag aat gtaagagctg tttgtttaaa    696

Ile Lys Leu Leu Arg His Met Asp His Glu Asn

                95                  100

ttggttttcg acattcctag tgattattga tcgaacttgg ccttaccact attaggtaat    756

ttattgggtg tgatttacat ttagtttaca ttggtaacta acttttccta aggacatttt    816

tcgagtgcaa acaccatatt ccataatttg ttagaaaagc ggcagcaaca ctttagacct    876

ttctgtagtt acttacttgc ttgtaaagag tgcattacta attgctatta ttggttatga    936

tagattaatt gtactccact gaaagatcat cctatccctt atattccact cattgcttca    996

ctcatactct gctatcaagt tgtgtgacta gttggactag tcgacaagtc atccaagggg    1056

catgacttaa cttgttggca gcagaagatg ctatggagta agggcagcat caatgagcca    1116

ctattgagca aattgggcct cgcttgggag gcctggtgca tcgggcccat tgttaatgag    1176

tgaaacagag aggagaggca aacagattaa cagtagaggc aatcggtata tatatgttgt    1236

aatggtctaa tagaccagtc aaccagaaca atagtcctaa ctagccacaa ctagtcgggc    1296

aagtcagcag agggatgact caactcgact ttacgattta acaaccttgc actcatgtgg    1356

gccgtagggg atgtcaacac tcttatactt acaaagaact gctatgctac aagtggaata    1416

cttcatcttt agtcgtttca ttactaagtc atagtagtgc cagatccaag ccaggatgtt    1476

gtacataagg agtaaccttg ggctcagctg acaccatatg tttattaggt ttctatctct    1536

acaggtagtt ttgtttgctt tatttaaaca tacaaactgg aatgtggttt tcactttctg    1596

ttatttcctt ttttttttgt tgggcggtca agagcgtgtg atacattttt gactcacaca    1656

tttatatcat atagtctgat ggtgatttta acactggatc acag att att gcc ata     1712

                                                 Ile Ile Ala Ile

                                                             105

aag gac ata att cgc ccc cca aga aga gac aac ttt aat gat gtt tac      1760

Lys Asp Ile Ile Arg Pro Pro Arg Arg Asp Asn Phe Asn Asp Val Tyr

                110                 115                 120

att gtt tct gag ttg atg gat act gat ctc cat cag atc ata cgc tca      1808

Ile Val Ser Glu Leu Met Asp Thr Asp Leu His Gln Ile Ile Arg Ser

            125                 130                 135

aat caa cca ttg act gat gac cac tgc cag gtttgttgct tccagcttgt        1858

Asn Gln Pro Leu Thr Asp Asp His Cys Gln

        140                 145

gctttgctga aacattttgc ttgcagaaaa tctagacaga gatttccatg caccttgttc    1918

ctttggtcgc tatatgtttt cttcatccta tccatatttc agcttaacat tctcttgttt    1978

atctggttta ataatcacaa gtgacatgtt ttgcattgca g tac ttc ctg tac cag    2034

                                              Tyr Phe Leu Tyr Gln

                                                      150

ttg cta cga ggg cta aaa tat gtg cac tcg gca aat gtc ttg cac cgt      2082

Leu Leu Arg Gly Leu Lys Tyr Val His Ser Ala Asn Val Leu His Arg

        155                 160                 165

gat ctg aag cca agc aat ttg ttc ctt aat gca aat tgt gat ctc aag      2130

Asp Leu Lys Pro Ser Asn Leu Phe Leu Asn Ala Asn Cys Asp Leu Lys

    170                 175                 180

att gct gat ttt ggg ctt gca aga acc act acg gag act gac ctc atg      2178

Ile Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Thr Thr Thr Glu Thr Asp Leu Met

185                 190                 195                 200

aca gag tat gtg gtc act cgt tgg tat cga gca cca gag ctg ctg ttg     2226

Thr Glu Tyr Val Val Thr Arg Trp Tyr Arg Ala Pro Glu Leu Leu Leu

                205                 210                 215

aac tgc tcg cag tat act gct gct att gat gtc tgg tca gtt gga tgc     2274

Asn Cys Ser Gln Tyr Thr Ala Ala Ile Asp Val Trp Ser Val Gly Cys

            220                 225                 230

ata ctt ggt gaa att gtg act cgt caa ccc ctg ttt cct gga agg gat     2322

Ile Leu Gly Glu Ile Val Thr Arg Gln Pro Leu Phe Pro Gly Arg Asp

        235                 240                 245

tac att cag caa cta aaa ttg atc act gag gtaaggcttg tctggttcat       2372

Tyr Ile Gln Gln Leu Lys Leu Ile Thr Glu

    250                 255

tgcttgcata cttttaatgt ctgcataaac gtaatttttt atttgtactt gaataagaga   2432

tacattactt gaactctgaa tatgtaaatg tgtttttttt tgggtccatt tttttttctg   2492

ttttctttgc ttttctaaaa tgtatccctg taacccaagt ggtatcaata ttaatcagac   2552

ccttttctct tcaaaag ctg ata ggg tcg cca gat gac tca agc cta ggg      2602

                   Leu Ile Gly Ser Pro Asp Asp Ser Ser Leu Gly

                       260                 265

ttt ctt cgg agt gat aat gca aga aga tac atg aaa cag cta cca cag     2650

Phe Leu Arg Ser Asp Asn Ala Arg Arg Tyr Met Lys Gln Leu Pro Gln

270                 275                 280                 285

tac cca agg cag gac ttc cgc ttg cgc ttc cgc aac atg tct gct ggt     2698

Tyr Pro Arg Gln Asp Phe Arg Leu Arg Phe Arg Asn Met Ser Ala Gly

                290                 295                 300

gca gtc gat ctg tta gag aaa atg ctg gtg ttt gac cca agc aga cgg     2746

Ala Val Asp Leu Leu Glu Lys Met Leu Val Phe Asp Pro Ser Arg Arg

            305                 310                 315

ata act g gtacattgac tttacaccaa ctactccact tttgttgcct ttactgtaaa    2803

Ile Thr

ttgaacatta tttttccatg cag tt  gat gag gct ctt cat cac cca tac ttg   2855

                          Val Asp Glu Ala Leu His His Pro Tyr Leu

                                                  325

gct tct ctt cat gac atc aat gaa gaa ccc acc tgc cca gca cct ttc     2903

Ala Ser Leu His Asp Ile Asn Glu Glu Pro Thr Cys Pro Ala Pro Phe

330                 335                 340                 345

agc ttt gat ttt gag caa cca tcc ttt act gaa gaa cat ata aaa gaa      2951

Ser Phe Asp Phe Glu Gln Pro Ser Phe Thr Glu Glu His Ile Lys Glu

                350                 355                 360

ctc atc tgg agg gaa tcc ttg gca ttt aat ccg gat cct ccc tac          2996

Leu Ile Trp Arg Glu Ser Leu Ala Phe Asn Pro Asp Pro Pro Tyr

            365                 370                 375

taagagctca ggttcgttct agagaaccaa tgatctaaaa tattgtagat ggctaattct    3056

agcatcctgc agagattttt tgaagacttc atatggatag ttttccagat tgactaattt    3116

agaccctggg agaatgaatg ttcttttaaa gccaaacaaa tgcctattcc actgcgattt    3176

tatactcgta atataccatt gcataaaatt ctgttcataa ctcaagttta tgagacaaaa    3236

ctattctata cctttttgcc acaaatttca tgttttctga taattctcaa cagtcaatat    3296

gctcacttca ccattttgaa tgttacctcc ctgttaagat ctgctttgaa gaattcaaat    3356

gctaatttgc catacctgca catttcaaaa atgaaattcc tcatttaatc tctaaccttt    3416

tgcatttctt ttgccttgag tgcagagcaa tttatcaatg ctggcatctg aagatcggta    3476

gctctagaaa agccaaatcc ccttgctttg tgcatctatt aattttatgc ccacttgttg    3536

ggcgaatgag catggattat tgttatagtg acaatttttc ttaaggcctg tctaaagaaa    3596

caacatttgt attccttatc agatagcctg aacttgggcc tgtattatac cggttgattg    3656

cataactgtt cttatgtatc taagcctgta attgtcttca caatggcttg aactgcccgt    3716

gtatatctga gttgacatct tctctctgat attatcccat ccatgttatt tccatttcgg    3776

actaatatct taagttaaca ctgattctgc tcattggtac agtgctacta ggctgtccca    3836

atgtagaggc atgg                                                      3850

<210>2

<211>376

<212>PRT

<213>Oryza sativa

<400>2

Met Asp Ser Ser Ser Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Ile

1               5                   10                  15

Lys Gly Met Gly Thr His Gly Gly Arg Tyr Val Leu Tyr Asn Val Tyr

            20                  25                  30

Gly Asn Phe Phe Glu Val Ser Ser Lys Tyr Ala Pro Pro Ile Arg Pro

        35                  40                  45

Ile Gly Arg Gly Ala Tyr Gly Ile Val Cys Ala Ala Val Asn Ser Glu

    50                  55                  60

Asn Gly Glu Glu Val Ala Ile Lys Lys Ile Gly Asn Ala Phe Asp Asn

65                  70                  75                  80

His Ile Asp Ala Lys Arg Thr Leu Arg Glu Ile Lys Leu Leu Arg His

                85                  90                  95

Met Asp His Glu Asn Ile Ile Ala Ile Lys Asp Ile Ile Arg Pro Pro

            100                 105                 110

Arg Arg Asp Asn Phe Asn Asp Val Tyr Ile Val Ser Glu Leu Met Asp

        115                 120                 125

Thr Asp Leu His Gln Ile Ile Arg Ser Asn Gln Pro Leu Thr Asp Asp

    130                 135                 140

His Cys Gln Tyr Phe Leu Tyr Gln Leu Leu Arg Gly Leu Lys Tyr Val

145                 150                 155                 160

His Ser Ala Asn Val Leu His Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn Leu Phe

                165                 170                 175

Leu Asn Ala Asn Cys Asp Leu Lys Ile Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg

            180                 185                 190

Thr Thr Thr Glu Thr Asp Leu Met Thr Glu Tyr Val Val Thr Arg Trp

        195                 200                 205

Tyr Arg Ala Pro Glu Leu Leu Leu Asn Cys Ser Gln Tyr Thr Ala Ala

    210                 215                 220

Ile Asp Val Trp Ser Val Gly Cys Ile Leu Gly Glu Ile Val Thr Arg

225                 230                 235                 240

Gln Pro Leu Phe Pro Gly Arg Asp Tyr Ile Gln Gln Leu Lys Leu Ile

                245                 250                 255

Thr Glu Leu Ile Gly Ser Pro Asp Asp Ser Ser Leu Gly Phe Leu Arg

            260                 265                 270

Ser Asp Asn Ala Arg Arg Tyr Met Lys Gln Leu Pro Gln Tyr Pro Arg

        275                 280                 285

Gln Asp Phe Arg Leu Arg Phe Arg Asn Met Ser Ala Gly Ala Val Asp

    290                 295                 300

Leu Leu Glu Lys Met Leu Val Phe Asp Pro Ser Arg Arg Ile Thr Val

305                 310                 315                 320

Asp Glu Ala Leu His His Pro Tyr Leu Ala Ser Leu His Asp Ile Asn

                325                 330                 335

Glu Glu Pro Thr Cys Pro Ala Pro Phe Ser Phe Asp Phe Glu Gln Pro

            340                 345                 350

Ser Phe Thr Glu Glu His Ile Lys Glu Leu Ile Trp Arg Glu Ser Leu

        355                 360                 365

Ala Phe Asn Pro Asp Pro Pro Tyr

    370                 375

Claims (3)

1.赋予水稻对白叶枯病产生抗性的DNA序列，它是SEQ ID NO：1中所示的DNA序列，它包括完整的OsDR6基因。

2.OsDR6基因的编码区，它是SEQ ID NO：1中第105-277位、第547-676位、第1701-1838位、第2020-2352位、第2570-2753位和第2827-2996位所示的DNA序列或者是编码与SEQ ID NO：1编码的蛋白质相同的蛋白质的DNA序列。

3.权利要求1-2任一项所述的DNA序列在增加水稻对白叶枯病抗性中的应用。

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