CN1936011A - 聚阳离子脂质体端粒酶反义寡核苷酸复合物及制备 - Google Patents
聚阳离子脂质体端粒酶反义寡核苷酸复合物及制备 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种聚阳离子脂质体端粒酶反义寡核苷酸复合物，由聚阳离子脂质体和反义寡核苷酸组成。以低分子量PEI和酰氯胆固醇(Cl－Chol)为原料，合成两亲性产物PEI－Chol。以磷脂、PEI－Chol和胆固醇为膜材，用薄膜分散法或逆相蒸发法制备聚阳离子脂质体。本发明提供的复合物能够显著提高细胞摄取anti－hTERT，比PEI－Chol具有更高的抑制端粒酶活性的作用；对肿瘤细胞的抑制率比阳离子聚合物高，毒性比阳离子脂质体小，本发明提供的复合物的制备方法设计合理，具有制备工艺简单优点，有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明与基因药物的载体有关，尤其涉及聚阳离子脂质体端粒酶反义寡核苷酸复合物的制备。
技术背景
随着人类基因组计划的完成，人们对疾病的遗传学物质基础有了更深的了解，基因治疗(gene therapy)成为了一种很有前途的治疗手段，被认为是治疗遗传性先天疾病、恶性肿瘤、传染病等最有希望的治疗方案之一。
反义寡核苷酸是具有专一序列的寡聚脱氧核苷酸，能特异阻断靶基因的复制、转录和翻译，是基因治疗的一种方法。端粒酶是一个特殊的核蛋白酶，能够以自身RNA序列为模板在染色体的3’端添加端粒重复序列TTAGGG。端粒酶的两个主要组成部分及许多相关蛋白使得其具备特有的功能。一个主要的组成部分是功能性模板RNA(hTR)，它是端粒酶添加染色体端粒上重复序列的模板。另一个主要组成部分是人端粒酶逆转录酶(hTERT)催化业基，它与端粒酶的活性密切相关。正常人体细胞除一些更新组织的增殖细胞，如生殖细胞、活动期淋巴细胞、造血干细胞和表皮基底细胞外，无端粒酶活性或hTERT表达。而90％以上的恶性肿瘤细胞存在hTERT高表达的端粒酶。在肿瘤发生的早期，端粒的长度急剧缩短，端粒的耗损能够明显改变肿瘤的发生。端粒酶最终被激活，尤其是在肿瘤发展晚期，能够重新稳定端粒的长度并使得癌细胞具有无限增殖能力。因为大多数人类肿瘤存在端粒酶的持续和高度表达，因此以端粒酶为靶点的机制正成为一种新型、广谱的抗癌治疗方案。
由于治疗基因(如DNA、RNA及反义核酸等)为高度亲水性的大分子物质，表面带有很强的负电荷，因此难以穿透细胞膜。因此，如何能有效的将治疗基因最大限度的导入到靶细胞是基因治疗的核心技术。基因载体系统可分为两大类：病毒载体系统和非病毒载体系统。病毒载体系统是至今为止临床研究应用最广泛的一类载体，然而由于病毒的免疫原性、重组性所导致的安全问题，使得目前对病毒载体系统临床运用控制得更加严格。非病毒载体避免了病毒类载体重大的安全隐患，但转运效率一直不如病毒载体，因此发展安全、高效、低毒的是基因治疗的关键技术。
阳离子脂质体和阳离子聚合物是目前应用最广泛的非病毒类载体。前者具有生物相容性好，制备简单，但稳定性差，且对细胞有一定毒性；后者种类繁多，聚乙烯亚胺(PEI)是常用一种，有线形、分支型，具不同的分子量。通常，分支型的高分子量(大于20KDa)具有较高转染效率，但对细胞毒性也大；而线形的低分子量(小于2KDa)对细胞无毒性，但亦无转染效率。
发明内容
本发明的目的是提供一种聚阳离子脂质体端粒酶反义寡核苷酸复合物，是以聚阳离子脂质体作为载体的端粒酶反义寡核苷酸复合物，由聚阳离子脂质体和反义寡核苷酸按N/P摩尔比(N指聚乙烯亚胺含有的氨基，P为寡核苷酸中的磷酸根)为0.5∶1～10∶1孵育所得。
所述聚阳离子脂质体由2～15mg聚乙烯亚胺-胆固醇(PEI-Chol)、2～50mg中性磷脂和0～50mg胆固醇(Chol)组成，在2～50mL去离子水化所得。
组成聚阳离子脂质体的中性磷脂是二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、大豆磷脂(SPC)、卵磷脂(EPC)中的任何一种。磷脂种类繁多，但制备脂质体的方法大同小异，本发明所用的中性磷脂不局限于以上所举实例。
所述反义寡核苷酸是针对互补于端粒酶逆转录酶催化亚基设计的反义寡核苷酸anti-hTERT，具有SEQ ID NO：1的序列：ACT CAC TCA GGC CTC AGACT。针对端粒酶不同序列的反义核酸可能具有不同的反义活性，但它们之间的理化性质很接近，如分子量大、水溶性高、带负电荷，而且均需要载体才能发挥疗效，因此，本发明的聚阳离子脂质体不仅适用于anti-hTERT，而且也适用其它序列的端粒酶反义寡核苷酸。
本发明的另一个目的是提供聚阳离子脂质体端粒酶反义寡核苷酸复合物的制备方法，通过以下步骤实现即：以酰氯胆固醇和低分子量PEI为起始合成原料，将酰氯胆固醇(DC-Chol，过量)和低分子量聚乙烯亚胺(PEI，Mw＝800)分别溶于无水二氯甲烷(CH2Cl2)中，以三乙胺(TEA)为催化剂，在冰浴条件下将酰氯胆固醇溶液缓慢滴加至PEI溶液中，继续反应10～14小时后，旋转蒸发挥去二氯甲烷。用0.1mol/L盐酸溶解反应后的体系，加二氯甲烷萃取3～5次，取水层经冷冻干燥即得聚乙烯亚胺-胆固醇(PEI-Chol)。将PEI-Chol、中性磷脂和/或胆固醇溶于三氯甲烷，采用薄膜分散法或逆向蒸发法制备，经探头超声(功率为100～400W，工作时间为1～3秒，间隙时间为2～4秒，循环次数为60～240次，超声条件为冰浴)和挤压过膜(膜孔的直径为0.1～0.22μm)后得到。将聚阳离子脂质体与反义寡核苷酸桉N/P摩尔为0.5∶1～10∶1等体积混合，室温孵育5～30分钟，获得目的复合物。聚乙烯亚胺的分子量为600～1800Da。
本发明结合阳离子脂质体和阳离子聚合物优点，提供一种聚阳离子脂质体端粒酶反义寡核苷酸复合物，能显著提高反义疗效，对肿瘤细胞的抑制率比阳离子聚合物高，毒性比阳离子脂质体小，本发明提供的复合物的制备方法设计合理，具有制备工艺简单优点，有广阔的应用前景。
附图说明：
图1聚乙烯亚胺-胆固醇(PEI-Chol)的合成路线。
图2聚乙烯亚胺-胆固醇(PEI-Chol)的红外图谱。
图3聚乙烯亚胺-胆固醇(PEI-Chol)的1H-NMR图谱。
图4PEI-Chol/DOPE聚阳离子脂质体的透色电镜图。
图5几种载体的细胞毒性及其与anti-hTERT形成的复合物对肿瘤细胞生长抑制率。
具体实施方式
实施例1
取聚乙烯亚胺-胆固醇(PEI-Chol)5mg、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)5mg，溶于适量三氯甲烷中，用薄膜分散法制备，减压蒸发除去三氯甲烷，用去离子水水合并定容至5mL。经探头超声(功率400W、工作时间1秒，间隙时间2秒，120个循环、冰浴)和挤压过聚碳酸酯膜(0.1μm)处理，得到PEI-Chol/DOPE脂质体。将该聚阳离子脂质体和anti-hTERT用无血清培养基(RPMI 1640)适量稀释，按N/P比1.9∶1～9.5∶1将两者等体积混合，室温孵育20分钟即得。复合物总体积为100μL，anti-hTERT终浓度均为2.0μmol/L。
实施例2
取聚乙烯亚胺-胆固醇(PEI-Chol)3mg、大豆卵磷脂(SPC)10mg、胆固醇(Chol)10mg溶于适量三氯甲烷中，用薄膜分散法制备，减压蒸发除去三氯甲烷，用去离子水水合并定容至10mL。经探头超声(功率400W、工作时间1秒，间隙时间2秒，120个循环、冰浴)和挤压过聚碳酸酯膜(0.1μm)处理，得到PEI-Chol/SPC/Chol脂质体。将该聚阳离子脂质体和anti-hTERT用无血清培养基(RPMI1640)适量稀释，按N/P比0.5∶1～2.5∶1将两者等体积混合，室温孵育20分钟即得。复合物总体积为100μL，anti-hTERT终浓度均为2.0μmol/L。
实施例3
取聚乙烯亚胺-胆固醇(PEI-Chol)3mg、蛋黄卵磷脂(EPC)10mg，胆固醇(Chol)10mg溶于适量三氯甲烷中，用薄膜分散法制备，减压蒸发除去三氯甲烷，用去离子水水合并定容至10mL。经探头超声(功率400W、工作时间1秒，间隙时间2秒，120个循环、冰浴)和挤压过聚碳酸酯膜(0.1μm)处理，得到PEI-Chol/EPC/Chol脂质体。将该聚阳离子脂质体和anti-hTERT用无血清培养基(RPMI1640)适量稀释，按N/P比0.5∶1～2.5∶1将两者等体积混合，室温孵育20分钟即得。复合物总体积为100μL，anti-hTERT终浓度均为2.0μmol/L。
实施例4
取聚乙烯亚胺-胆固醇(PEI-Chol)10mg、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)10mg溶于15mL三氯甲烷，用逆向蒸发法制备。先加入去离子水6mL水合，水浴超声形成W/O乳剂，减压蒸发除去三氯甲烷后，补加去离子水至10ml，经探头超声(功率200W、工作时间1秒，间隙时间2秒，180个循环、冰浴)和挤压过聚碳酸酯膜(0.1μm)处理，得到PEI-Chol/DOPE脂质体。将该聚阳离子脂质体和anti-hTERT用无血清培养基(RPMI1640)适量稀释，按N/P比0.5∶1～2.5∶1将两者等体积混合，室温孵育20分钟即得。复合物总体积为100μL，anti-hTERT终浓度均为2.0μmol/L。
实施例5
取聚乙烯亚胺-胆固醇(PEI-Chol)6mg、大豆卵磷脂(SPC)20mg，胆固醇(Chol)20mg溶于30mL三氯甲烷，用逆向蒸发法制备。先加入去离子水15mL水合，水浴超声形成W/O乳剂，减压蒸发除去三氯甲烷后，补加去离子水至20ml，经探头超声(功率200W、工作时间1秒，间隙时间2秒，180个循环、冰浴)和挤压过聚碳酸酯膜(0.1μm)处理，得到PEI-Chol/SPC/Chol脂质体。将该聚阳离子脂质体和anti-hTERT用无血清培养基(RPMI1640)适量稀释，按N/P比0.5∶1～2.5∶1将两者等体积混合，室温孵育20分钟即得。复合物总体积为100μL，anti-hTERT终浓度均为2.0μmol/L。
实施例6测定和实验
聚乙烯亚胺-胆固醇(PEI-Chol)是以酰氯胆固醇和低分子量PEI为起始合成原料，其中酰氯胆固醇过量，PEI分子量为800。两者分别溶于无水二氯甲烷(CH2Cl2)中，以三乙胺(TEA)为催化剂，在冰浴条件下将酰氯胆固醇溶液缓慢滴加至PEI溶液中，继续反应12小时后，旋转蒸发挥去二氯甲烷。用0.1mol/L盐酸溶解反应后的体系，加二氯甲烷萃取多次，取水层经冷冻干燥即得PEI-Chol。参见附图1，是聚乙烯亚胺-胆固醇(PEI-Chol)合成反应方程式。
实施例7 聚乙烯亚胺-胆固醇(PEI-Chol)的红外和核磁共振表征
将适量PEI-Chol与溴化钾混合，置玛瑙碾钵碾磨，制成样品片后进行红外扫描(参见附图2)；适量PEI-Chol溶于氘代氯仿，进行400MHz 1H NMR扫描(参见附图3)。
实施例8 聚阳离子脂质体的形态观察
取按实例1制备的聚阳离子脂质体适量，加双蒸水适宜稀释后，加至专用铜网上，0.2％磷钨酸染色，在透射电子显微镜下观察粒子的大小和形态(参见附图4)。
实施例9 各种载体的细胞毒性
96孔板按5×103/孔接种HeLa细胞，待细胞贴壁后加入以下不同量的空白载体：聚乙烯亚胺(PEI800)、聚乙烯亚胺-胆固醇(PEI-Chol)、阳离子脂质体(DC-Chol/DOPE)、按实例1制备的聚阳离子脂质体(PEI-Chol/DOPE)和按实例2制备的聚阳离子脂质体(PEI-Chol/SPC/Chol)。采用磺基罗丹明B法(sulforhodamine B，SRB)测定细胞存活率(见下)。
实施例10 各种载体介导的anti-hTERT对肿瘤细胞的抑制效果
96孔板按5×103/孔接种HeLa细胞，待细胞贴壁后。加入以下载体：聚乙烯亚胺(PEI800)、聚乙烯亚胺-胆固醇(PEI-Chol)、阳离子脂质体(DC-Chol/DOPE)、按实例1制备的聚阳离子脂质体(PEI-Chol/DOPE)、按实例2制备的聚阳离子脂质体(PEI-Chol/SPC/Chol)和它们与anti-hTERT形成的不同比例的复合物，anti-hTERT的终浓度均为2.0μmol/L(此浓度的anti-hTERT对肿瘤细胞无抑制作用，抑制率为100.40±10.94％)。待培养72小后，用SRB测定细胞存活率。方法如下：每孔加入50μl 10％三氯乙酸(4℃)，4℃固定30分钟，蒸馏水洗涤5次以除去残留的三氯乙酸，室温干燥24小时，之后每孔加入70μl SRB(1％乙酸溶液)染色20分钟，用1％乙酸洗5次除去多余的染料，待干后每孔加200μl Tris缓冲液(10mM)，溶解后490nm处测定A值。另不加anti-hTERT，按以上相同的方法测定不同载体的用量对细胞的毒性。按公式：Asample/Acontrol×100％，计算空白载体对细胞的毒性或载体介导anti-hTERT的对肿瘤细胞的抑制率。结果参见附图5。
参见附图5，聚乙烯亚胺(PEI800)对细胞几乎没有毒性，但不能增加anti-hTERT抑制肿瘤细胞生长的作用，参见图5a：聚乙烯亚胺(PEI800)；聚乙烯亚胺-胆固醇(PEI-Chol)能够增加anti-hTERT对肿瘤细胞生长的抑制作用，但对细胞有一定毒性，随N/P比例的增加，细胞毒性亦增大，参见图5b：聚乙烯亚胺-胆固醇(PEI-Chol)；制成PEI-Chol/DOPE聚阳离子脂质体后，与PEI-Chol相比，在相同的N/P比例时，PEI-Chol/DOPE能够进一步增加anti-hTERT抑制肿瘤细胞的生长，且对细胞的毒性低于PEI-Chol，参见图5c：聚阳离子脂质体(PEI-Chol/DOPE)；普通的阳离子脂质体(DC-Chol/DOPE)同样也能够增加anti-hTERT抗肿瘤生长作用，但对细胞的毒性较大，在相同的N/P比例，其对细胞的毒性远大于PEI-Chol/DOPE聚阳离子脂质体，参见图5d：阳离子脂质体(DC-Chol/DOPE)。
另用磷脂SPC/Chol替代DOPE制成的聚阳离子脂质体也能得到相似的作用，参见图5e：聚阳离子脂质体(PEI-Chol/SPC/Chol)。
Claims (7)
1.一种聚阳离子脂质体端粒酶反义寡核苷酸复合物，其特征是：由聚阳离子脂质体和反义寡核苷酸组成，聚阳离子脂质体与反义寡核苷酸的N/P摩尔比为0.5∶1～10∶1。
2.根据权利要求1所述的聚阳离子脂质体端粒酶反义寡核苷酸复合物，其特征是：聚阳离子脂质体由2～15mg的聚乙烯亚胺-胆固醇、2～50mg中性磷脂和0～50mg胆固醇、2.5～100mL去离子水组成。
3.根据权利要求2所述的聚阳离子脂质体端粒酶反义寡核苷酸复合物，其特征是：组成聚阳离子脂质体的中性磷脂选用二油酰磷脂酰乙醇胺、大豆磷脂、卵磷脂中的一种。
4.根据权利要求1所述的聚阳离子脂质体端粒酶反义寡核苷酸复合物，其特征是：聚阳离子脂质体与反义寡核苷酸的N/P摩尔比中N指聚乙烯亚胺含有的氨基，P为寡核苷酸中的磷酸根。
5.根据权利要求1所述的聚阳离子脂质体端粒酶反义寡核苷酸复合物，其特征是：所述反义寡核苷酸是针对互补于端粒酶逆转录酶催化亚基设计的反义寡核苷酸。
6.根据权利要求1所述的聚阳离子脂质体端粒酶反义寡核苷酸复合物的制备方法，其特征是通过以下步骤实现：低分子量聚乙烯亚胺和酰氯胆固醇，反应条件为无水和冰浴，反应时间为10～14小时，酰氯胆固醇过量，获得聚乙烯亚胺-胆固醇，由聚乙烯亚胺-胆固醇和中性磷脂和/或胆固醇组成聚阳离子脂质体，采用薄膜分散法或逆向蒸发法制备，探头超声为100～400W，工作时间为1～3秒，间隙时间为2～4秒，循环次数为60～240次，超声条件为冰浴，挤压过膜的孔径为0.1～0.22μm，将聚阳离子脂质体与反义寡核苷酸按照N/P摩尔比0.5∶1～10∶1的比例，按等体积混合，室温孵育5～30分钟，获得目的组合物。
7.根据权利要求6所述的聚阳离子脂质体端粒酶反义寡核苷酸复合物的制备方法，其特征是：所述聚乙烯亚胺的分子量为600～1800Da。
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