CN1903022A - 新的糖尿病模型 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于产生糖尿病大鼠的方法，和用于鉴定逆转所述大鼠中糖尿病的化合物的方法。

Description

新的糖尿病模型

本发明涉及产生患糖尿病大鼠的方法，所述患糖尿病的大鼠可以用在鉴定能够逆转糖尿病的化合物的方法中并且适合于用在糖尿病的干预性疗法中。

在过去的数十年里，肥胖症和2型糖尿病(T2D)的流行主要是在美国急剧增加，但是在欧洲和发展中国家也有所发展。在全世界范围内，T2D占据了所有糖尿病病例(遗传性胰岛素依赖型糖尿病或T1D和非胰岛素依赖型糖尿病或T2D)的85-90％(King et al.，1998)。尽管已经鉴定了一些影响瘦蛋白途径的突变，胰岛素分泌或其受体，或GLUT4(对胰岛素敏感的葡萄糖转运)，大多数肥胖症和T2D的病例是来自非遗传起源的并且由生活方式(身体活动减少，高热量饮食等)所引发。T2D和肥胖症都与高发病率，死亡率(Stiegler et al.，1992)，和保健费用(Rubin et al.，1994)相关。

T2D的主要特点是胰岛素抗性和在胰岛素分泌中的缺陷。胰岛素是由胰腺β细胞合成和分泌的关键激素，其刺激各种器官(特别是肌肉，肝和脂肪组织)中的葡萄糖吸收。胰岛素还通过控制编码葡萄糖-6-磷酸酶的基因的表达来调节肝的葡萄糖产生(HGP)并且抑制脂肪组织中的脂解作用(Murrayet al.，2000)。当靶组织不能对正常浓度的胰岛素作出反应时，受损的胰岛素作用(即，胰岛素抗性)发生。

一旦这种去调节开始并且在缺乏治疗的状况下，β细胞分泌增加量的胰岛素(＝高胰岛素血症)从而维持血糖正常(正常循环葡萄糖水平)。然而，在缺乏治疗的情况下，β细胞不能产生足够的胰岛素，导致了循环的葡萄糖的增加(高血糖症(hyperglycaemia))(图1)。只要足够的β细胞是有生活力的，并且将分泌适当比率的胰岛素来维持血糖正常，T2D不会出现(Kahn，1998)。许多小组在过去数年里已经广泛研究了导致胰岛素抗性的机制。广泛接受的是，在胰岛素敏感性的非脂肪组织(肝&肌肉)中的游离脂肪酸(FFA)的累积会损害在这些组织中胰岛素调节的葡萄糖的吸收(Randle et al.，1963)。而且，增加的肝产生的脂质增加了脂肪酸氧化，减少肝的葡萄糖产生的胰岛素依赖型抑制，并且因此增加葡萄糖异生作用(GNG)，进一步恶化高血糖症(Boden，2003)。

T2D的发展与其它代谢紊乱相关。被称为代谢综合症(综合症X)的胰岛素抗性、受损的葡萄糖耐受性、动脉高血压、腹部肥胖和血脂异常的群体(Reaven，1988)，已经由成人治疗组(Adult Treatment Panel)III(ATPIII)定义为这样的因素的分组，所述因素是很多心血管危险的原因(Grundy et al.，2004)。许多临床前研究显示胰岛素在T2D患者中高血压的发展中起着主要作用(Scherrer et al.，1997)。然而，临床关注的主要焦点是诊断和治疗葡萄糖代谢中的异常。如UK预期糖尿病研究(UK Prospective Diabetes Study)(UKPDS，1998)所报道高血糖确实是微血管并发症的主要危险因素。显示了在T2D患者中，维持葡萄糖水平接近正常预防了缺陷诸如神经病(在T2D患者的50％到60％中发生)，视网膜病和肾病的发作(在美国，糖尿病是目盲和末期肾衰竭的主要原因)(Klein，1995；Teutsch et al.，1989)。

数年前，基于饮食、锻炼和减轻体重的非药物疗法在美国出现(Tinker etal.，1994)。这些主要的生活方式的改进不仅降低血糖浓度，而且还减少或延缓心血管疾病(CVD)在超重的糖尿病患者中的危险因素的发生(Schneider et al.，1995)。然而，具有晚期疾病的糖尿病患者需要特殊的药物治疗从而控制他们的糖血(glycaemia)并且基本预防或减少并发症的出现。目前的抗糖尿病治疗基于严格控制循环葡萄糖，其通过(1)使用常被称作胰岛素促分泌素的试剂来提高胰岛素的产生或(2)以被称为胰岛素致敏物的试剂来提高整个身体的胰岛素作用，其中抑制或不抑制肝的葡萄糖的产生来进行(图1)。

来自噻唑烷二酮类(TZDs)(自1997年，可在美国获得)，目前主要以罗西格列酮(Avandia)，吡格列酮(Actos)，和曲格列酮(Rezulin)为代表的抗糖尿病药物在增加外周胰岛素调节的葡萄糖吸收中是有效的药物。TZDs是过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARγ)的药用激动剂，一种控制在葡萄糖和脂质代谢中基因的表达的核激素受体家族的转录因子。PPARγ药物，特别是在外周脂肪库中，通过增加前脂肪细胞到成熟脂肪细胞的分化和增殖来减少高血糖症、高脂血症和高胰岛素血症并提高胰岛素敏感性(Gurnell et al.，2003)。因此PPARγ活化增加了外周脂肪细胞中脂肪酸的贮存，降低了循环的脂肪酸并减少了肌肉和肝中的甘油三酯的水平。PPARγ药物改变了一些循环因子诸如脂连蛋白，TNFα和抵抗素的表达，所述循环因素的水平与胰岛素抗性和对治疗的反应高度相关(Greenfield et al.，2004)。

T2D的适当动物模型和胰岛素抗性是鉴定治疗剂的体内功效的必需临床前工具。在过去20年里开发的大部分T2D动物模型是基于遗传的。天然发生的糖尿病(或胰岛素抗性和肥胖)的啮齿类动物模型诸如db/db和ob/ob小鼠，GK，ZDF和fa/fa大鼠是在药物发现中，在世界范围内最常用的(Chen et al.，2004)(表1)。在这些动物模型中，当饲以致糖尿病的饮食(Purina 5008或KLIBA 2437)时，Zucker糖尿病性肥胖(ZDF)大鼠代表最有吸引力的模型，因为其代谢疾病(葡萄糖不耐受，高血糖症，胰岛素抗性和高甘油三酯血症)，β细胞衰竭，肥胖症和轻度高血压的发展类似于人，尽管其以更快的速度进展。主要的血浆参数的早期变化起始于7-8周龄，导致在＞＝12周龄时明显的糖尿病(β细胞衰竭和肾衰竭)(图2)。

由于这种迅速的代谢恶化，T2D在ZDF大鼠中的主要特征的逆转没有通过市售的抗糖尿病药(罗西格列酮(PPARγ)和Raziglitazar(PPARαγ))获得。然而，在经历长期性治疗(13周)的ZDF大鼠中(Shibata et al.，2000)或在非常幼小和仅有适度糖尿病的动物中(Brand et al.，2003；Pickavance etal.，2005)显示获得了对T2D的预防。一个工作组报道以很小程度的不同，来自Zucker和fa/fa品系的被称为VDF大鼠(Vancouver糖尿病性肥胖)的T2D模型能够部分提高葡萄糖耐受性，外周胰岛素敏感性和β细胞功能(Pospisilik et al.，2002a；Pospisilik et al.，2002b)，所述大鼠通过以DPPIV抑制剂进行的干预治疗来使用。必须注意的是，该模型不是糖尿病性的，特征在于缺乏高血糖症，弱葡萄糖耐受性和无外周胰岛素抗性。本发明的目的是开发一种临床前动物模型，其不仅更好地表现在人中的2型糖尿病的进展，还显示对药物治疗的更强烈反应。

表1代谢疾病的主要临床前啮齿类动物模型

A.由饮食或化学剂诱导的代谢疾病的啮齿类动物模型。

B：由基因缺陷诱导的胰岛素抗性和T2D的啮齿类动物模型。

A	人	诱导的饮食			化学诱导
						DIO大鼠(SD)	DIO小鼠(AKR/J)	蔗糖饲养的大鼠	STZ
		肥胖症起源	多基因的	多基因的	多基因的					多基因的	多基因的
T2D起源	多基因的					多基因的	多基因的	多基因的	多基因的
		瘦蛋白/瘦蛋白R	正常	正常	正常					正常	正常
肥胖症的程度	中度					严重	中度	无	无
		T2D发作	成熟	成熟	成熟					成熟	成熟
提高的TG	是					中度	是	是	是
		高血糖症	是	无	是					？	是
β细胞衰竭	可变					无/	？	？	？
		胰岛素抗性	是	中度	是					是	是
饮食亢进	无					无	无	无	无
		肾上腺皮质功能亢进	无	无	无					无	无
肝脂肪变性	可变					可变	可变	？	？

B	人	Zucker fa/fa大鼠	ZDF大鼠	ob/ob小鼠	db/db小鼠
						肥胖症起源	多基因的	单基因的：fa基因	单基因的：fa基因	单基因的	单基因的
T2D起源	多基因的	无	多基因的	多基因的	多基因的
						瘦蛋白/瘦蛋白R	正常	被破坏	被破坏	被破坏	被破坏
肥胖症的程度	中度	严重	严重	严重	严重
						T2D发作	成熟	无	成熟	幼小	幼小
提高的TG	是	是	是	是	是
						高血糖症(hyperglycaemia)	是	无	是	是	是
β细胞衰竭	可变	无	可变	无	是
						胰岛素抗性	是	是	是	无	是
饮食亢进	无	是	是	是	是
						肾上腺皮质功能亢进	无	是	是	是	是
肝脂肪变性	可变	？	？	是	是

因此，本发明的目的是使ZDF大鼠，与在致糖尿病的饮食(Purina 5008，即，包含6.6％脂肪，23.5％蛋白质的KLIBA 2437)的情况下正常获得的相比，糖尿病减轻(与人的情形接近)，从而增加它们对于用抗糖尿病药进行的干预治疗的敏感性，如同对于人的情形。出于此目的，给三组ZDF大鼠饲以不同的饮食。第一组在刚断奶时，开始接受致糖尿病的饮食(Kliba 2437)并连续进行11周(组_丰足的(group full))；给第二组饲以致糖尿病的食物达4周，随后饲以正常的饮食(chow diet)(Kliba 3436，包含4.5％脂肪，18.5％蛋白质)达7周(组_中度的(group mild))；第三组被饲以致糖尿病的食物达2周，接着饲以正常的饮食达9周(组_不足的(group low))。

致糖尿病的饮食是将使品系(小鼠或大鼠)患糖尿病(T2D或糖尿病(diabetic mellitus)或NIDDM：非胰岛素依赖型糖尿病)的饮食。这意味着高血糖症+高甘油三酯血症首先发生+胰岛素抗性，接着发展相关疾病诸如微血管疾病和大血管疾病，肾衰竭，心脏疾病等。没有这种特殊的饮食，动物将保持健康。

饮食对一般参数(BW，FI和WI)的影响

动物在研究的过程中体重增加。在6周龄，未处理的ZDF大鼠的BW是约230g(表2)，并在饲养11周后达到410-450g。在被饲以致糖尿病或/和正常饮食(高/中/低)的安慰剂组之间或与ZL组的比较中没有检测到在BW增加中的显著不同。不取决于饮食类型，每个动物每天约消耗30g。在未处理的组_丰足的和组_中度的的研究过程中观察到食物的吸收或体重的增加没有变化。组_不足的的显示在转换到正常饮食的时候FI有略微增加。

饮食对代谢血浆参数的影响

在研究的开始，健康的ZDF大鼠(6周龄)具有在膳食后条件下测量的相对正常的葡萄糖，HbA_1C胰岛素和TC水平(表2)。与此相对，年龄匹配的ZL大鼠的特征是非常低的胰岛素和TG水平以及与ZDF相比升高的NEFA。这些数据与由提供者报道的那些相一致(图2)。

饮食对葡萄糖代谢的影响

葡萄糖，HbA_1c和胰岛素水平

持续被饲以致糖尿病的饮食的ZDF大鼠(组_丰足的)，与在相同的饮食上的ZL大鼠中的缺乏影响相比，迅速患上高血糖症和高胰岛素血症，并具有升高的HbA_1C水平(图2)。在延长维持致糖尿病的饮食(ZDF组_丰足的)的过程中，该大鼠首先迅速发展高胰岛素血症并接着随后在4周后形成胰岛素抗性(即，在10周龄)。在被饲以致糖尿病的饮食4周并接着改变为正常饮食(组_中度的)的ZDF大鼠中，显示与组_丰足的相比关于在葡萄糖，HbA_1C和胰岛素水平的增加中的相似时间进程，但是具有更低程度的高血糖症(23.±1.7mM对29.5±1.8mM)(图4A)。

在仅被饲以致糖尿病的饮食2周的ZDF大鼠(组_不足的)中，在12周龄时(即，在饲以致糖尿病的饮食2周后+4周的正常饮食)，血浆葡萄糖开始升高，并且在研究的15周龄时达到18.7±2.0mM，这与组_丰足的(29.5±1.8mM)(p＜0.01)和组_中度的(23.9±1.7mM)相比，都要显著更低(图4)。

与组_丰足的和组_中度的相比，在饲以致糖尿病的饮食(≈6.5ng/ml)2周后达到的高胰岛素血症一直维持到15周龄时，暗示了β细胞衰竭的缺乏。在研究组_不足的结束的时候，显示胰岛素水平的减少(图4C)而葡萄糖水平则没有变化(17.3±1.9mM)(图4A)。这种在葡萄糖刺激的胰岛素分泌中的功能缺陷在严重的糖尿病状况发展之前可以反应向胰岛素不足的进展。

表2：在被饲以致糖尿病的饮食的6周龄ZDF和ZL大鼠中测量的基础血浆参数水平

^*p＜0.05或^**p＜0.01与ZL大鼠相比，ANOVA，随后进行Dunnett’s事后(post hoc)检验。

对膳食后葡萄糖的影响(OGTT)

在整个研究过程中持续饲以致糖尿病的饮食(组_丰足的)或进行4周(组_中度的)随后转变成正常饮食使大鼠在禁食条件(升高的FBG)下患上严重的高血糖症以及葡萄糖不耐受，如通过在OGTT过程中获得的葡萄糖变化值(excursion values)所揭示的(图5)。在这2组之间注意到在FBG或葡萄糖变化(葡萄糖AUC)中没有差异，显示了通过将致糖尿病的饮食的饲养减少到4周，葡萄糖耐受性没有提高。持续接受致糖尿病的饮食的ZDF大鼠(组_丰足的)与ZL相比具有严重的葡萄糖不耐受(AUC 2213比779)。饲以致糖尿病的饮食达2周，随后转变为正常饮食的ZDF大鼠(组_不足的)与ZDF组_丰足的(9.6±1.0mM)相比，仅显示在禁食条件下的中等高血糖症(6.9±0.5mM)(表3，图5)。

表3：饮食条件在ZDF大鼠中对葡萄糖耐受性的影响

在研究和饲养阶段结束的时候，在OGTT之前和之中测量的禁食参数和葡萄糖变化(AUC)的总结。N＝8-10/组^**p＜0.01或^*p＜0.05，与ZL大鼠相比。F-检验随后t-检验或Mann Whitney。

然而，与ZL大鼠(4.3±0.0mM.p＜0.05)相比，组_不足的FBG水平仍旧显著更高。与ZL大鼠相比，用致糖尿病的饮食进行的短期饲养阶段导致了禁食胰岛素水平的相当大地升高，禁食葡萄糖水平的大大减少和随时间流逝维持的胰岛素抗性指数(HOMA)的升高(25.4±5.8比2.0±01，p＜0.01)。这显示了在这种中度糖尿病大鼠模型中的持续有力的胰岛素抗性。

总之，这些数据显示给ZDF大鼠饲以致糖尿病的饮食达4周或11周诱导了急剧的代谢变化到相似程度，导致高血糖症、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、葡萄糖不耐受和胰岛素抗性、β细胞衰竭。与此相对，在断奶后限制幼小的ZDF大鼠摄取致糖尿病的饮食达2周使它们具有适度的糖尿病和胰岛素抗性，而没有β细胞衰竭的体征。给ZDF大鼠饲以致糖尿病的饮食仅2周显著延缓了高血糖症的发展。本文显示的数据显示在组_不足中的代谢参数的总体变化在10周龄时稳定，除了从12周龄起，葡萄糖开始增加(图4)。

饮食对脂质代谢的影响

在ZDF(组_丰足的)中除了观察到高血糖症，升高的HbA_1C和β细胞衰竭，还发生了脂质参数的变化。例如，在饲以致糖尿病的饮食4周后，血浆TG从1.4±0.1mM急剧增加到10.6±1.8mM。在研究结束的时候，血浆TG稳定到9.59±1.31mM(图6)。血浆TG的升高伴随血浆TC从2.9±0.2mM到4.9±0.3mM和循环NEFA(从0.20±0.04mM到0.36±0.02mM)的逐步增加(图6)。在最初的4周限制摄取致糖尿病的食物延缓并短暂减轻了严重的高甘油三酯血症(图6A)，其在研究结束的时候最终没有不同于组_丰足的。与此相对，在断奶后最初2周被饲以致糖尿病的饮食的ZDF大鼠(组_不足的)仅逐渐具有高甘油三酯血症(图6A)。在饮食中的变化没有导致NEFA和TC增加中的差异(图6B & C)，但是在4周的饮食后显著增加了血浆脂连蛋白水平(在组_丰足的，组_中度和组_不足的中分别为37±7％，32±6％和2±11)，显示饮食诱导的胰岛素抗性效果。

对胰岛细胞形态和β细胞完整性的影响

在11周的时期内给幼ZDF大鼠饲以致糖尿病的饮食(组_丰足的)与被饲以相同饮食的ZL大鼠相比，诱导了β细胞结构的变化。在ZDF大鼠的胰腺中，注意到胰岛细胞构造的破坏(图7)。胰岛细胞以不规则的突起扩展到外分泌胰腺中，并且内分泌细胞在外分泌组织中分散。β细胞死亡增加，β细胞质量减少，并且在β细胞中的胰岛素含量减少(数据未显示)。(在当前的研究下，检查了组_不足的和组_中度的胰腺)。

用吡格列酮进行干预治疗

在治疗前ZDF大鼠的代谢状况

在10周龄的ZDF中开始干预治疗并且进行7周。在治疗开始时，组_丰足的和组_中度具有高血糖症(分别是17.4±2.6mM和13.6±14.0mM)，高胰岛素血症(4.8±1.0ng/ml和7.4±0.5ng/ml)并且与年龄匹配的ZL相比，所有的脂质参数(特别是甘油三酯)增加(图8和图)。尽管与完全糖尿病ZDF(组_丰足的)相比，饲以致糖尿病的饮食仅2周显著提高了血浆参数水平，而与健康的ZL大鼠相比，具有适度糖尿病ZDF大鼠(组_不足的)的特征仍旧是更高的甘油三酯，胆固醇和NEFA血浆水平(图6)。与此相对，血糖正常的组_不足的ZDF的值类似于ZL组(图4)(分别为6.9±0.5mM比4.3±0.0mM)。

吡格列酮对BW，FI和WI的影响

与它们各自的赋形剂组相比，用吡格列酮进行的长期性治疗增加了ZDF大鼠的BW(与文献数据一致)。由吡格列酮诱导的BW的增加在组_不足的，组中度和组_丰足的ZDF大鼠中程度相当，并且对赋形剂是约+30％。而且，在所有的处理组中，每日食物吸收(在24小时内测量)从≈30g增加到≈50g。如预期，WI的增加与FI的变化成比例。因此，在7周的治疗期间累积性FI的增加可能有助于BW的增加。由PPAR激动剂导致的BW的增加是众所周知的效果，与人相比，其在啮齿类动物(小鼠和大鼠)中过大。尽管在吡格列酮治疗下体重增加，但是代谢模式得到了显著改善(下面讨论)。

吡格列酮对葡萄糖代谢的影响

葡萄糖，HbA_1C和胰岛素水平

如上面讨论，致糖尿病的饮食在ZDF大鼠中增加血浆葡萄糖，胰岛素和HbA1c％水平。用吡格列酮来治疗组_丰足的ZDF大鼠大大减少了血液葡萄糖水平(图8A)。治疗2周后，在糖血(glycaemic)对照中的改善是明显的，并且在整个治疗的延续过程中部分维持。循环葡萄糖中的减少伴随着HbA_1C的显著减少(图8B)。

吡格列酮在治疗的开始显著减少了组_丰足的ZDF的高胰岛素血症，然而，这种效果在5周后失去(图8C)。在组_中度ZDF大鼠中观察到相似的发现，显示在组_丰足的或组_中度中通过治疗既没有获得糖尿病状态的改善，也没有获得延长的改善。与此相对，以吡格列酮进行的对具有适度糖尿病ZDF大鼠(组_不足的)的治疗完全阻止了高血糖症的发展和HbA_1C的增加到使得两者的值都相似于在未处理的ZL大鼠中的那些的程度(图8A，B)。另外地，吡格列酮在治疗的第2周开始强烈逆转了高胰岛素血症，并且这种效果维持到研究结束的时候。在7周治疗阶段结束的时候，被给药吡格列酮的组_不足的显示了明显减少的胰岛素水平(2.1±0.2ng/ml)，与非糖尿病ZL动物相比，所述胰岛素水平仅仅稍微更高(0.8±0.1ng/ml，p＜0.05)。

总而言之，这些数据显示在长期性治疗下，在具有适度糖尿病的ZDF大鼠中(组_不足的)中实现了将高血糖症，HbA1c和高胰岛素血症正常化到与ZL大鼠相当的水平，但是在组_中度或组_丰足的中没有获得这样的正常化。

吡格列酮对膳食后葡萄糖(OGTT)的影响

被饲以致糖尿病的饮食达11(组_丰足的)或4周(组_中度)的ZDF大鼠与被饲以致糖尿病的饮食仅2周(组_不足的)的ZDF大鼠相比，具有极度的葡萄糖不耐受，所述组_不足的的ZDF大鼠仅有适度的葡萄糖不耐受。然而，在研究的10周后在组_不足的中测量的葡萄糖变化仍旧显著高于ZL(AUC：1565±188对779±15，见表3)。用吡格列酮治疗6周分别显著提高了(组_中度)和(组_丰足的)的葡萄糖耐受性29％和31％，其程度与赋形剂比较相似，尽管没有将所述葡萄糖耐受性正常化到ZL大鼠的水平(图9)。与此相对，组_不足的对于吡格列酮的治疗稍微更敏感一些，因为与赋形剂相比，AUC被减少了36％，但是所述组_不足的达到了接近于ZL的葡萄糖变化值(分别地，AUC：1000±48和779±15)。

吡格列酮在组_不足的中改善葡萄糖代谢的强烈功效还反映在与赋形剂比较，FBG的显著减少(5.1±0.1mM比6.9±0.4mM，p＜0.05)，其也接近非糖尿病AL大鼠中的FBG水平(4.3±0.0mM)(图9A)。在组_中度和组_丰足的中，在7周的治疗后，吡格列酮减少FBG的能力是适度的，因为水平分别达到6.6±1.3mM和6.7±0.9mM。这些数据显示在疾病的晚期阶段，吡格列酮在动物中(组_丰足的和组_中度)的效果更低。

吡格列酮对脂质代谢的影响

与赋形剂相比，用吡格列酮对具有强烈糖尿病的ZDF大鼠(组_丰足的)进行的治疗大大减少了血浆甘油三酯的水平达69.5±5.2％。在治疗开始后(2周)早期发现TG水平的提高并且持续了整个治疗期间。然而，血浆TG水平保持着比在ZL大鼠中的血浆TG水平显著更高的水平(2.9±0.6mM比1.1±0.1mM，p＜0.01)(图10A)。此外，观察到血浆NEFA水平的适度提高，与血浆TG的减少平行(数据未显示)。吡格列酮降低血浆TG的效果在组_中度和组_丰足的中的量级相似。与此相对，吡格列酮几乎完全和立即将组_不足的的高甘油三酯血症正常化。在治疗结束的时候，组_不足的的平均血浆TG水平明显低于组_丰足的平均血浆TG水平(1.6±0.1mM对2.8±0.5mM)，达到接近于非糖尿病的ZL组的值(1.1±0.1mM)。

有趣的是，吡格列酮在治疗组的任一个中都没有改变血浆总胆固醇水平(图10B)。有或无吡格列酮的治疗，与在非糖尿病ZL组中的更低(2.2±0.1mM，p＜0.01)水平相比，总胆固醇水平在所有的ZDF组中保持升高。吡格列酮没有降低TC并不意味着在脂蛋白颗粒中没有变化。事实上，吡格列酮可以减少LDLc和VLDLc，同时增加HDLc而不改变TC水平。要解决该问题，将需要对血浆的脂蛋白组成进行FPLC分离和分析。

吡格列酮对胰岛素抗性的影响

在治疗6周后，吡格列酮在所有的组中将禁食胰岛素水平减少到相当的水平(丰足的，中度和不足的分别为：2.0±0.4，1.6±0.3和1.7+0.1ng/ml)。HOMA值说明与组_中度或组_不足的相比，组_丰足的仍旧具有更高的胰岛素抗性，(14.1±2.7(丰足的)，10.9±1.9(中度)和9.4±0.8(不足的))。

尽管在组_不足的中，吡格列酮导致了代谢参数，葡萄糖耐受性和胰岛素抗性的明显提高，HOMA值仍旧比在ZL中(2.0±0.1)更重要。在所有的组中，用吡格列酮进行的治疗在治疗7周后，与基线(数据未显示)相比使脂连蛋白的水平增加达3-5倍，证实了它的胰岛素致敏作用。

因此，本发明涉及产生具有糖尿病的大鼠的方法，所述方法包括在断奶后，用高脂肪的饮食饲养大鼠达1-2周。在一个优选的实施方案中，所述大鼠是ZDF大鼠。所述高脂肪饮食是本文描述的致糖尿病的饮食。

高脂肪饮食是这样的饮食，其包含超过6％的脂肪，优选地超过10％的脂肪(饱和的和/或不饱和的)。正常饮食包含高达6％的脂肪，优选地约4.5＞％的脂肪(饱和的和/或不饱和的)。

优选地，所述大鼠的断奶发生在5-6周龄后。在优选的实施方案中，所述高脂肪饮食包括Kliba 2437。在最优选的实施方案中，大鼠在断奶后用所述高脂肪饮食进行饲养达2周。

通过该方法产生的小鼠的一个重要优点是糖尿病是可逆转的，并且因此可以鉴定用于干预治疗的化合物，而用已知的模型，仅能鉴定用于预防性治疗的化合物，因为糖尿病的诱导是不可逆转的。

本发明还提供鉴定可以逆转糖尿病的化合物的方法，所述方法包括下列步骤：a)在断奶后，用高脂肪饮食随后用正常饮食喂养来饲养大鼠达1-2周；b)施用目标化合物；和c)测定糖尿病是否被所述化合物所逆转。优选地，所述大鼠是ZDF大鼠。更优选地，所述具有糖尿病的大鼠是通过上文所述的方法产生的大鼠。能够逆转糖尿病的化合物是这样的化合物，所述化合物当与参比化合物的效果，或与单独的赋形剂的效果相比时，将指示糖尿病的参数逆转到与非糖尿病对照动物相当的水平。与阴性对照，赋形剂的参考相比，所述化合物对糖尿病的逆转可以是，例如，血液葡萄糖水平的减少，HbA1c的减少，它们被优选地减少到与未处理的ZL大鼠的水平类似的水平；高胰岛素血症的减少；FBG的减少；AUC的减少；减少高甘油三酯血症。对于测定化合物对糖尿病的逆转而言，可以测定所述参数的单独一个或组合，或它们所有的参数，并且它们可以组合以另外的参数的测量。这些另外的参数可以包括，例如，对下列关键器官的结构的检查：胰腺(β细胞)，肾(肾小球硬化症)和眼睛(白内障，微血管改变)。蛋白尿和清蛋白尿的分析将完善这种T2D新模型的特征。此外，它将对于测定这种新模型的高血压程度也是重要的，因为要求常规的ZDF大鼠是具有中度高血压的。

到目前为止，没有这样的研究的报道，所述研究关于PPARγ或PPARαγ对动物模型的显著有利的影响，所述动物模型聚集诸如在ZDF大鼠模型中T2D，胰岛素抗性和血脂异常的特征。在以前的研究中，代谢模式的提高仅在用PPARαγ激动剂进行的预防治疗的过程中(内部数据，Shibataet al.，1998)或在糖尿病极早期在ZDF中(8周龄，没有胰岛素抗性，适度高血糖症)获得(Pickavance et al.，2005；Brand et al.，2002)。对于表征本发明的适度T2D模型而言，我们考虑了广泛用在人中的吡格列酮(Actos)。在啮齿类动物模型中，当口服施用时，在介于3-30mg/kg/d之间的剂量范围内证明了吡格列酮的功效。在肥胖和胰岛素抗性Zucker fa/fa大鼠中产生的数据证明了10mg/kg/d是非常有功效的剂量(尽管不是最大的)。

在本发明的研究中，我们定义了使成年ZDF大鼠具有适度和稳定的糖尿病并且对于用抗糖尿病药进行的干预治疗高度敏感的实验条件。本研究显示将5-6周龄的ZDF大鼠限制在高脂肪饮食上仅4周使它们如持续维持高脂肪饮食的ZDF大鼠一样具有糖尿病。这些具有高度糖尿病的动物对于用吡格列酮进行的治疗敏感性很差。与此相对，将在高脂肪饮食上的时间从4周减少到2周，随后恢复常规的正常饮食，延缓了糖尿病症状的发作和严重性(高血糖症，高甘油三酯血症)，预防了明显的胰岛素抗性，预防了β细胞衰竭并限制了葡萄糖不耐受的程度。这种被延缓了的适度T2DZDF模型阶段在研究的11周的时期内一直维持，并且对用抗糖尿病药进行的干预治疗更加敏感。

本文给出的数据显示施加高脂肪饮食达4周不可逆转地使ZDF患上强烈的糖尿病，但是当饲以高脂肪饮食2周时，则不是这样。这些数据显示，在给ZDF大鼠饲以致糖尿病的饮食4周的过程中的一些点上，动物逐渐发展到糖尿病的晚期阶段，类似地伴随使它们对药物治疗更不敏感的β细胞衰竭。这种差异可以是由于更大的脂毒性或葡萄糖毒性造成的。在未治疗的情况下，补偿性高胰岛素血症存在于组_不足的中，但是不足以使高血糖症正常化。最终，在17周龄，胰岛素水平开始减少，可能反映了β细胞衰竭。在ZDF大鼠中减少的胰岛素浓度似乎由胰腺β细胞的有缺陷的功能导致，与减少的胰岛素含量相关。到研究结束的时候，因为胰岛素分泌仍高，似乎在12周龄时，2周的致糖尿病的饮食，使ZDF大鼠的胰岛细胞中的胰岛素含量增加。由于2周的致糖尿病的饮食减少了高血糖症并延缓了甘油三酯的累积，在组不足的中观察到的β细胞功能的保存与这样的考虑一致，所述考虑为β细胞衰竭是提高β细胞上的负担的结果。1周的致糖尿病性饮食的饲养对于诱导这样的代谢紊乱可以是足够的，所述代谢紊乱与具有适度糖尿病ZDF大鼠(组_不足的)中的代谢紊乱相似。

由于吡格列酮在所有的组中在外周组织中增加胰岛素敏感性(用吡格列酮进行的治疗将脂连蛋白水平增加了3-5倍)(Shibata et al，1998)，认为吡格列酮通过提高胰岛素的敏感性来抑制了β细胞的过度工作，接着预防了高血糖症和高脂血症。

在本发明研究中，吡格列酮预防了高血糖症和高脂血症，但是没有观察到其对血清胆固醇水平有影响。已经报道了PPARα调节脂质代谢(Brandet al.，2003；Pickavance et al.，2005)并且已经描述了使用双重PPARα/β激动剂降低胆固醇对ZDF的影响。

因此，本发明首次提供，使成年ZDF大鼠(1)以稳定方式患上适度糖尿病和(2)对用抗糖尿病药进行的干预治疗强烈敏感的实验条件。

参考文献

B_ODEN，G.(2003).Effects of free fatty acids on gluconeogenesis andglycogenolysis.Life sciences，72，977-88.

B_RAND，C.，L.，S_TURIS，J.，G_OTFREDSEN，C.，F.，F_LECKNER，J.，F_LEDELIUS，C.，H_ANSEN，B.，F.，A_NDERSEN，B.，YE，J.，M_ING，S_AUERBERG，P.& W_ASSERMANN，K.(2003).Dual PPARalpha/gamma activation provides enhancedimprovement of insulin sensitivity and glycemic control in ZDF rats.InAmerican journal of physiology.Endocrinology and metabolism.pp.E841-54.United-States.：NLM.

C_HEN，D.et al.(2004).Development and applications of rodent models fortype 2 diabetes.Diabetes，Obesity and Metabolism，10，1-13.

G_OLDSTEIN，B.J.(2002).Insulin resistance as the core defect in type 2diabetes mellitus.American Journal of Cardiology，90，3G-10G.

G_REENFIELD，J.，R.& C_AMPBELL，L.，V.(2004).Insulin resistance andobesity.Clinics in dermatology，22，289-95.

G_RIFFIN，M.E.，M_ARCUCCI，M.J.，C_LINE，G.W.，B_ELL，K.，B_ARUCCI，N.，L_EE，D.，G_OODYEAR，L.J.，K_RAEGEN，E.W.，W_HITE，M.F.& S_HULMAN，GI.(1999).Free fatty acid-induced insulin resistance is associated with activation ofprotein kinase C theta and alterations in the insulin signaling cascade.Diabetes，48，1270-4.

G_RUNDY，S.，M.，B_REWER，H.，B_RYAN，JR，C_LEEMAN，J.，I.，S_MITH，S.，C，J_R，L_ENFANT，C.& A_MERICAN H_EART A_SSOCIATION，Y.N.H.，L_UNG，AND B_LOODI_NSTITUTE.(2004).Definition of metabolic syndrome；Report of the NationalHeart，Lung，and Blood Institute/American Heart Association conference onscientific issues related to definition.Circulation，109，433-8.

G_URNELL，M.，S_AVAGE，D.，B.，C_HATTERJEE，V.，K_RISHNA，K.& O′R_AHILLY，S.(2003).The metabolic syndrome：peroxisome proliferator-activated receptorgamma and its therapeutic modulation.The Journal of clinical endocrinologyand metabolism，88，2412-21.

K_AHN，B.B.(1998).Type 2 diabetes：when insulin secretion fails tocompensate for insulin resistance.Cell，92，593-596.

K_ING，H.，A_UBERT，R.E.& H_ERMAN，W.H.(1998).Global burden of diabetes，1995-2025：prevalence，numerical estimates，and projections.Diabetes care，21，1414-31.

K_LEIN，R.(1995).Hyperglycemia and microvascular and macrovasculardisease in diabetes.Diabetes care，18，258-68.

R_ANDLE，P.J.，G_ARLAND，P.B.，H_ALES，C.N.& N_EWSHOLME，E.A.(1963).The glucose fatty-acid cycle Its role in insulin sensitivity and the metabolicdisturbances of diabetes mellitus.Lancet，1，785-9.

M_ATSUZAWA，Y.，F_UNAHASHI，T.& N_AKAMURA，T.(1999).Molecularmechanism of metabolic syndrome X：contribution of adipocytokinesadipocyte-derived bioactive substances.Annals of the New York Academy ofSciences，892，146-54.

M_URRAY，R.K et al.(2000).Harper’s biochemistry，Appleton &Lange.

P_ICKAVANCE，L，C.，B_RAND，C.，L.，W_ASSERMANN，K.& W_ILDING，J.，P.H.(2005).The dual PPARalpha/gamma agonist，ragaglitazar，improves insulinsensitivity and metabolic profile equally with pioglitazone in diabetic anddietary obese ZDF rats.British journal of pharmacology，144，308-16.

P_OSPISILIK，J.，A.，S_TAFFORD，S.，G.，D_EMUTH，H.，U_LRICH，M_CINTOSH，C.，H.S.& P_EDERSON，R.，A.(2002a).Long-term treatment with dipeptidylpeptidase IV inhibitor improves hepatic and peripheral insulin sensitivity in theVDF Zucker rat：a euglycemic-hyperinsulinemic clamp study.Diabetes，51，2677-83.

P_OSPISILIK，J.A.，S_TAFFORD，S.G.，D_EMUTH，H.U.，B_ROWNSEY，R.，P_ARKHOUSE，W.，F_INEGOOD，D.，T.，M_CINTOSH，C.H.S.& P_EDERSON，R.A.(2002b).Long-term treatment with the dipeptidyl peptidase IV inhibitor P32/98causes sustained improvements in glucose tolerance，insulin sensitivity，hyperinsulihemia，and beta-cell glucose responsiveness in VDF fa/fa Zuckerrats.Diabetes，51，943-50.

R_EAVEN，G.M.(1988).Banting lecture 1988 Role of insulin resistance inhuman disease.Diabetes，37，1595-607.

R_UBIN，R.J.，A_LTMAN，W.M.& M_ENDELSON，D.N.(1994).Health careexpenditures for people with diabetes mellitus，1992.The Journal of clinicalendocrinology and metabolism，78，809A-809F.

S_CHERRER，U.& S_ARTORI，C.(1997).Insulin as a vascular andsympathoexcitatory hormone：implications for blood pressure regulation，insulin sensitivity，and cardiovascular morbidity.Circulation，96，4104-13.

S_CHNEIDER，S.H.& M_ORGADO，A.(1995).Effects of fitness and physicaltraining on carbohydrate metabolism and associated cardiovascular risk factorsin patients with diabetes.Diabetes Reviews，3，378-407.

S_HIBATA，T.，T_AKEUCHI，S.，Y_OKOTA，S.，K_AKIMOTO，K.，Y_ONEMORI，F.&W_AKITANI，K.(2000).Effects of peroxisome proliferator-activatedreceptor-alpha and-gamma agonist，JTT-501，on diabetic complications inZucker diabetic fatty rats.British journal of pharmacology，130，495-504.

S_TIEGLER，H.，S_TANDL，E.，S_CHULZ，K.，R_OTH，R.& L_EHMACHER，W.(1992).Morbidity，mortality，and albuminuria in type 2 diabetic patients：a three-yearprospective study of a random cohort in general practice.Diabetic medicine，9，646-53.

T_EUTSCH，S.，N_EWMAN，J.& E_GGERS，P.(1989).The problem of diabeticrenal failure in the United States：an overview.American journal of kidneydiseases，13，11-3.

T_INKER，LF.，H_EINS，J.M.& H_OLLER，H.J.(1994).Commentary andtranslation：1994 nutrition recommendations for diabetes Diabetes Care andEducation，a Practice Group of the American Dietetic Association.Journal ofthe American Dietetic Association，94，507-11.

UKPDS.(1998).Intensive blood-glucose control with sulphonylureas orinsulin compared with conventional treatment and risk of complications inpatients with type 2 diabetes UKPDS 33 UK Prospective Diabetes StudyUKPDS Group.Lancet，352，837-53.

图例

图1：代谢缺陷的概括：器官和途径的关系

图解总结了(1)葡萄糖和脂质代谢之间的相互关联(2)导致胰岛素抗性和T2D的因素和紊乱。来自：Prospects of research in Diabetes Mellitus(JAMA，2001；285：628-632)。

图2：在雄性ZDF大鼠的代谢参数中的年龄依赖型变化

图3：研究设计

研究设计图解描述了用致糖尿病的饮食(黄色棒条

)或正常饮食(黑色直线

)在ZDF大鼠中进行的不同饲养阶段。在整个研究持续阶段给瘦(lean)ZDF(ZL)大鼠饲以致糖尿病的饮食。用吡格列酮进行的治疗(由红线表示

)在10周龄的时候开始，并且一直进行直到17周龄时。每个组中有10只大鼠。在治疗阶段结束的时候(在治疗的6周后)进行葡萄糖耐受性检验(OGTT)。在治疗之前和之中进行数次血液采样用于生化分析。仅考虑了6只大鼠进行OGTT。

图4：在被饲以致糖尿病的或/和正常饮食的ZDF大鼠中的葡萄糖，HbA1c和胰岛素水平的变化。

N＝8-10/组。将数据表示为平均值±SEM。ZDF和ZL为6周龄，处于基线(治疗-4周)。^*p＜0.05或^**p＜0.01，与组_丰足的比较，ANOVA，随后进行Dunnett’s事后检验。通过Mann-Witney检验ZL与组_丰足的比较。

图5：在10周的饲养后，饮食对ZDF大鼠的葡萄糖耐受性的影响N＝8-10/组。^**p＜0.01或^*p＜0.05，与组_丰足的比较。ANOVA，随后进行事后Dunnett’s检验。通过Mann-Whithney或t-检验ZL与组_丰足的比较。

图6：在用致糖尿病的或/和正常饮食饲养的ZDF大鼠中的血浆TG，NEFA和TC水平的变化。

N＝8-10/组。将数据表示为平均值±SEM。ZDF和ZL为6周龄，处于基线(治疗-4周)。^*p＜0.05或^**p＜0.01，与组_丰足的比较，ANOVA，随后进行Dunnett’s事后检验。

图7：ZDF大鼠中的β细胞的免疫组织化学对比ZL大鼠中的β细胞的免疫组织化学

使用针对胰岛素的抗体来对胰岛素进行染色(免疫组织化学方法)。显示代表性的照片(在n＝6/组中)。

图8：在不同的饮食组(组_丰足的，组_中度和组_不足的)中吡格列酮(10mg/kg)对葡萄糖参数(葡萄糖[A]，HbA_1C[B]和胰岛素[C])的影响。

治疗在10周龄的时候开始，并且作为食物-掺和物进行施用。将年龄匹配的赋形剂未处理ZDF和lean(ZL)大鼠用作对照。将值表示为平均值+SEM。N＝8-10/组。^**p＜0.01或^*p＜0.05与各自的赋形剂处理的ZDF大鼠比较。与ZL大鼠比较，++p＜0.01或+p＜0.05。F-检验，随后进行T检验。

图9：在用吡格列酮治疗6周后，禁食血液葡萄糖水平和葡萄糖耐受性

A：对FBG的影响；B：被表示为δ基线的对AUC葡萄糖的影响；C：在组_丰足的，组_中度和组_不足的之中，在OGTT过程中和在用吡格列酮治疗6周后，测量的葡萄糖变化的曲线。N＝8-10/组。

^**p＜0.05，与各自的赋形剂处理的ZDF大鼠比较。

++p＜0.01pr+p＜0.05与ZL大鼠比较。

F-Test随后进行t-检验。

图10：在不同的饮食组(组_丰足的，组_中度和组_不足的)中，吡格列酮(10mg/kg)对ZDF脂质参数(甘油三酯[A]，胆固醇[B])的影响。

治疗在10周龄的时候开始，并且作为食物-掺和物进行施用。将年龄匹配的赋形剂未处理ZDF和lean(ZL)大鼠用作对照。将值表示为平均值+SEM。N＝8-10/组。^**p＜0.01或^*p＜0.05，与各自的赋形剂处理的ZDF大鼠比较。++p＜0.01或+p＜0.05，与ZL大鼠比较。F-检验，随后进行T检验。

缩写词列表

AUC      在曲线下的面积

BRdU     溴脱氧尿苷

BW       体重

FBG      禁食血液葡萄糖

FPLC     快速液相色谱(fast performance liquid chromatography)

HbA_1c   糖基化的血红蛋白A1

HDLc    高密度脂蛋白胆固醇

HGP     肝的葡萄糖产生

HOMA    胰岛素抗性指数

LDLc    低密度脂蛋白胆固醇

NEFA    非酯化的脂肪酸

OGTT    口服葡萄糖耐受性检验

PAS     过碘酸希夫试剂

PPAR    过氧化物酶体增殖物激活受体

SEM     平均值的标准偏差

T2D     2型糖尿病

TC      总胆固醇

TG      甘油三酯

VLDLc   极低密度脂蛋白胆固醇

WAT     白色脂肪组织

WI      水摄取

ZDF     Zucker患糖尿病的肥胖大鼠

ZL      Zucker消瘦的大鼠

实施例

实施例1：动物

在该研究中，5周龄的非糖尿病性，雄性ZDF大鼠(ZDF fa/fa或ZDF)和消瘦的同窝出生的仔畜(年龄匹配)大鼠(ZDF+/？或ZL)购自Ch.RiverLaboratories。将动物置于室内，3或4只/笼，所述室内温度为22到24℃，50％到60％的湿度，12：12的日-夜循环(从6:00AM到6:00PM光照)。将大鼠随意饲养并且保持其对水的长期取用。每周一次提供新鲜食物，一周两次的更换水，并且一周3次清洁笼子。

对于非功能的瘦蛋白受体纯合(fa/fa)的雄性ZDF大鼠发展了肥胖症，高脂血症和高血糖症。与此相对，具有纯合显性 和杂合

基因型的大鼠保持消瘦的(lean)，血糖正常和不具有糖尿病(表1)。

在5周龄的时候定购ZDF和ZL大鼠。在所述大鼠到达并适应了1周后，在6周龄的大鼠中，经过短暂麻醉(异氟烷)后从眼眶后收集1ml的血液。按照葡萄糖，胰岛素，甘油三酯，NEFA，胆固醇血浆水平和BW，将大鼠随机分成6组，每组10只ZDF肥胖大鼠。组成10只大鼠的一组，随后在研究过程中将其作为对照组(图3)。三组的ZDF大鼠接受作为食物掺和物的赋形剂(未处理)或吡格列酮(处理)。在每一个ZDF大鼠的未处理/处理组中，在11周(组_丰足的)，在4周(组_中度)，或在2周(组_不足的)的过程中被饲以高脂肪的饮食。

实施例2：食物和处理准备

将处理进行口服施用，并将其制备为食物掺和物。优选这种施用的方式通过口服管饲法进行从而减少给动物的压力，避免给药错误并使操作最少化。将吡格列酮(对于90kg食物是充足的)溶解在18升水中。对于每组10只大鼠的三个治疗组而言，将6升溶液组合以30kg的致糖尿病的饮食(具有7％脂肪的KLIBA 2437)或将12升溶液与60kg的正常饮食(Kliba 3436)混合。在不超过40℃的温度上将食物进行仔细干燥并接着将其做成丸状。假定平均食物消耗为约100g/kg体重/天，预期每只动物将接受10mg/kg体重/天的吡格列酮的剂量。图和表显示根据预期的每日剂量的数据。在研究过程中记录每日食物摄取，并证实每只大鼠的消耗平均为100g食物/kgBW/天(数据未显示)。

将随后的详细方法用作非限制性的实例：

用高糖饮食(KLIBA 2437，35％淀粉，5％蔗糖)来饲养5周龄的一组60ZDF/GMI-fa/fa和一组10ZDF/GMI-+/？消瘦大鼠(GMI/Charles River)。将消瘦的ZDF大鼠组保持作为对照。

适应时期后5天，于上午9点，在用异氟烷短暂麻醉后，从眼眶后收集1ml血。按照葡萄糖，胰岛素，甘油三酯，NEFA，胆固醇血浆水平和体重，将大鼠随机分成每组10只ZDF肥胖大鼠的6组和每组10只ZDF消瘦大鼠的1组。用赋形剂来处理6组中的3组，并用吡格列酮来处理另外3组。在12周，4周或2周的时期内，一组的每只以高脂肪饮食进行饲养。将来自相同时间段(slot)的4只大鼠用于基线组织病理学测量。

组1随意接受在饮食2437中的ZDF KLIBA MIX1赋形剂缓冲液。

组2和3随意接受在饮食3430中的ZDF KLIBA MIX2赋形剂缓冲液。

组4随意接受ZDF KLIBA MIX3(吡格列酮10mg/kg饮食2437)。

组5和6随意接受ZDF KLIBA MIX4(吡格列酮10mg/kg饮食3430)。

组7(消瘦)随意接受在饮食2437中的ZDF KLIBA MIX1赋形剂缓冲液。

每2周，在用异氟烷短暂麻醉后，从眼眶后收集1ml的血液用于不同的血液和血浆参数。在处理开始，中间和结束的时候，使用用于尿分析的条(来自拜尔的Labstix)来收集尿参数。

在7周的处理后，在6只禁食的大鼠上进行OGTT。1周后，在所有动物中，在饲养状态下以异氟烷短暂麻醉后，从眼眶后收集2.5ml的血液。最终，在最后一次收集血液后，将每组7只大鼠处死，将肝移去并进行称重。1周后，将每组最后3只大鼠(来自OGTT组)施加到E.Atzpodien从而进行组织学和免疫组织学检查。

制剂：

化合物(9g)分散在18升水性赋形剂中。

将6升溶液混合在30kg的磨成粉的食物2437中并且通过KLIBA确定食物的可口性。

将12升溶液混合在60kg的磨成粉的食物3430中并且通过KLIBA确定食物的可口性。

食物：

在12周，4周，或2周过程中，ZDF饮食(Kliba 2437±化合物)

ZDF稳定饮食(Kliba 3430±化合物)

饮食组成(Kliba 2437 & Kliba 3436)

用于ZDF大鼠2437的特殊饮食

小的啮齿

类动物

所有的PUPOSE饮食，挤出物

3436

在风干的饲料成分中将给定值计算为平均值

递送形式：3436.0.13：    在12.5kg纸包中的挤出物15mm

          3436.0.12：    在12.5kg纸包中的挤出物15mm

其中具有密封的聚乙烯内层

实施例3：化学产物

吡格列酮[(±)-5-[[4-[2-(5-乙基-2-吡啶基)乙氧基]苯基]甲基]-2，4-]具有C₁₉H₂₀N₂O₃S·HCl的分子式和392.90道尔顿的分子量。结构式如下所示：

吡格列酮由Sequoia，U.K提供并且以Actos的名称进行注册。

实施例4：血液和器官收集和生化分析

一直在上午(9-11am)，在饲养阶段后2-5小时并且在最后一次口服给药(食物在7:00am移走)后2小时，进行血液采样。从轻微麻醉(异氟烷)的大鼠中眼眶后收集血液(≈200μl)到包含EDTA的管中并且将其置于冰床上直到离心(6000RPM，20分钟，4℃)。血液采样的时间进程开始在6周龄，在基线(10周)和在处理2周，4周，5周和7周后，(即，分别在12周，14周，15周和17周)。

使用荧光方法来量化主要的血浆生化参数(葡萄糖(Gluco-quant，例如Ref.1447513)，TG(例如11730711)，TC(CHOL(例如11491458)，NEFA(Cat No.11 383 175 001)；所有的来自Roche Molecular Diagnostics)。使用免疫。浊度测定(Tina-quant，例如11822039来自Roche MolecularDiagnostics)，在全血中进行HbA_1c(％)的量化。通过葡萄糖与正常血红蛋白(HbA)的非酶促共价连接来形成糖基化的血红蛋白(HbA_1c)。在红细胞中，HbA转化为HbA_1c的比率随着血液葡萄糖的平均比率增加。由于HbA_1c在红细胞中稳定了约10周，其水平反映了在测量前的过去数周中的血糖(glycaemic)平衡。HbA_1c是糖尿病并发症的预测物，并且相应减少HbA_1c的干预减少了并发症的危险(UKPDS，1998)。如下计算HbA_1c(％)：HbA_1c％＝87.6*(HBA1c/Hb)+2.27。

将商购ELISA试剂盒(LINCO)用于量化胰岛素和脂连蛋白的血浆浓度。脂连蛋白是促脂肪移动因子(adipokine)，其与胰岛素敏感性和禁食血浆胰岛素浓度成负相关(Goldstein，2002)。脂连蛋白的血浆浓度在T2D患者中减少，并且尽管其是由脂肪组织产生的事实，当个体变得更加肥胖时，脂连蛋白(adiponectine)减少并且胰岛素抗性增加(Matsuzawa et al.，1999)。

在每组10只动物中的6只中进行口服葡萄糖耐受性检验(OGTTs)。在处理6周后(16周龄)，将大鼠禁食过夜(≈16h)。接着，在有知觉的动物(尾静脉)中收集血液用于基线葡萄糖和胰岛素测量。接着，给动物口服施用葡萄糖(1g/kg BW)，并通过定向血液葡萄糖浓度测定(通过Gluco Trend)，在+15’，+30’，+60’和+120’测定血浆葡萄糖的时间进程。在加载葡萄糖后的时间内研究血液葡萄糖浓度的变化将给出关于生物使用葡萄糖的能力的信息。使用梯形法则(trapezoidal rule)，将葡萄糖耐受性计算为在120分钟内葡萄糖浓度的曲线下面积(AUC)并且计算来自基线的变化(δAUC)。还通过考虑禁食胰岛素和禁食血液葡萄糖(FBG)水平来在OGTT的过程中评估HOMA指数。HOMA：[FBG(mM)^*(禁食胰岛素(μU))/22.5]。HOMA指数说明了外周胰岛素抗性。使用Mercodia大鼠胰岛素ELISA试剂盒来进行胰岛素的测量。

在研究结束的时候，通过断头术(在轻微麻醉后)将大鼠处死，从所有的动物中收集血液并且从每组的3只动物中收集器官(胰腺，肝，肾，WAT，眼)以用于组织学和免疫组织学检查。

实施例6：体重/食物吸收测量

使用电子秤，以在线数据获得系统(DATATOX)来记录体重和食物消耗。

实施例7：组织病理学和免疫组化分析

在7周处理阶段结束的时候，用CO₂将所有的动物处死，放血并进行尸体剖检。在尸体剖检前6小时，用100mg/kg BrdU(溴脱氧尿苷，它是在检测活组织中增殖(活)细胞的检测中的常用化学品)来腹膜内注射3只大鼠/组。对肝、肾、胰腺、和肠系膜白色脂肪组织(WAT)进行取样并在10％缓冲的福尔马林中固定至少24小时。此外，将肾和胰腺的块固定在于0.1MNa-二甲胂酸盐缓冲液(pH7.4)中的具有2mg/ml的2％CaCl₂的2％甲醛和2.5％的戊二醛中以用于透射电镜。固定后，将所有的器官包埋在透明质(Paraplast)中。将切片切成2-3μm并如下进行染色：苏木精-伊红染色(HE)：肝，肾，胰腺，WAT；PAS：肾；Fat Red：冷冻肾切片。将包含胰腺切片的载玻片进行染色用于以抗体进行的免疫组织化学评估以检测BrdU，-胰岛素，-胰高血糖素，-促生长素抑制素，或BrdU和胰岛素两者。

实施例8：数据收集和分析

人工或在excel表上收集所有的原始数据(一般参数(BW，FI)和血液和血浆参数)，接着将其以电子形式整理为格式化的excel图表并储存在包括每日备份的安全的Roche服务器上。将值分析为平均值±SEM。

将数据表示为平均值±SEM。通过不成双的t-检验或用于非正常分布的数据的Mann-Whitney检验来比较在糖尿病性(ZDF)和消瘦对照之间的参数。以一次(one way)ANOVA和随后的Dunett’s检验，其用于与对照的多次比较，来比较不同的饮食组中的每个的值与在组_丰足的数值来测量饮食对每个参数的影响。通过t-检验或Mann-Whitney检验(先进行F-检验来测试方差的一致性)来评价在每个处理组和它们各自的对照未处理组之间的差异的意义。

使用Windows的软件STATVIEW(5.01版，SAS institute Inc.，SASCampus Drive，Cary，NC 27513)来进行数据分析。

Claims (6)

1.一种产生糖尿病大鼠的方法，所述方法包括在断奶后用高脂肪饮食来饲养大鼠1-2周。

2.权利要求1的方法，其中所述大鼠是ZDF大鼠。

3.权利要求1或2任一项的方法，其中断奶发生在5-6周后。

4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述高脂肪饮食包括Kliba 2437。

5.一种鉴定可以逆转糖尿病的化合物的方法，所述方法包括下列步骤：

a)在断奶后，用高脂肪饮食接着用正常饮食喂养来饲养大鼠1-2周

b)施用目标化合物

c)确定是否糖尿病由所述化合物所逆转。

6.权利要求5的方法，其中所述大鼠是ZDF大鼠。

Images