CN1902493A - 底物和通过包括磷腈基团的系留化合物结合于底物的化合物 - Google Patents

Abstract

本发明描述了用于固定包含亲核体的材料的制品和这种制品的使用方法。在一个方面，本发明提供制品，其包括：具有第一表面和第二表面的底物；固定于底物第一表面的磷腈系留基团，磷腈系留基团包括底物第一表面上的官能团与磷腈系留化合物的反应产物。还描述了将包含亲核体的材料固定于底物的方法，该方法包括：提供磷腈系留化合物；提供具有能够与磷腈系留化合物反应的互补官能团的底物；通过磷腈系留化合物与底物上的官能团反应产生离子键、共价键、或其组合制备连接于底物的磷腈系留基团；和将连接于底物的磷腈系留基团与包含亲核体的材料反应，以固定包含亲核体的材料。

Description

底物和通过包括磷腈基团的 系留化合物结合于底物的化合物

技术领域

本发明涉及包括具有固定于底物的系留基团的底物的制品，和涉及用于将包含亲核体的材料固定到底物的方法。

背景技术

生物学活性分子对底物表面的共价连接可用于多种应用，如用于诊断设备、亲合性分离、高通量DNA测序应用、聚合酶链反应(PCR)的提纯等。例如固定化生物胺可用于疾病或遗传缺陷的医疗诊断或用于检测多种生物分子。

通过引入用于固定任何多种配体的活性官能团对固体载体(如颗粒状色谱法载体)进行改性是已知的。亲核体(如NH2、SH、OH等)对底物的连接可以通过使用系留化合物(tethering compounds)实现。系留化合物具有至少两个被连接基团分离的活性官能团。一个官能团提供通过与底物表面上的互补官能团反应而使系留化合物锚定于底物或载体的机构。第二个活性官能团可以选择为与包含亲核体的材料反应。包含羟基的载体(如纤维素、交联右旋糖酐、羊毛、和聚乙烯醇)可用氰尿酰氯(三氯三嗪)处理，用于酶、抗原、和抗体的连接。包含羟基的载体如琼脂糖凝胶(Sepharose)可与三氯三嗪(TCT)反应，然后其可以结合一个或多个亲核体。用氰尿酰氯衍生化的固体尼龙小珠已经被用于基于寡核苷酸的杂交试验。TCT涂层的纸和尼龙膜还显示出在DNA、RNA、和蛋白质的转移杂交实验中的实用性。

已知的系留化合物通常为与包含亲核体的材料(包括生物材料)具有高度反应活性。但是，当与亲核体的反应在水溶液中进行时，系留化合物与包含亲核体的材料的反应可以与其它反应如系留化合物的水解竞争。水解可以引起底物上的包含亲核体的材料不完全或低效率的固定。

需要改善固定底物和与这种底物相容的系留化合物。因此，期望提供可用于多种应用中任一种的配体固定的载体和系留化合物。

发明内容

本发明提供制品和这种制品在固定包含亲核体的材料方面的用法，所述包含亲核体的材料如含胺的被分析物、氨基酸、肽、DNA、RNA、蛋白质、酶、细胞器、免疫球蛋白、其片段、以及前述两种或多种的组合。包含亲核体的材料可以包括含胺的材料，诸如例如，抗原(包括结合于抗体的抗原)、免疫球蛋白等。在一些实施方案中，含胺的材料可另外结合于细菌如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。

在一个方面，本发明提供制品，其包括：

具有第一表面和第二表面的底物；

连接于底物第一表面的磷腈系留基团，磷腈系留基团包括底物第一表面上的官能团与磷腈系留化合物的反应产物。

在一些实施方案中，磷腈系留化合物包括式I所示的结构，

其中每个X可相同或不同，并且包括易受亲核攻击而与包含亲核体的材料结合的反应基团。

在另一个方面，本发明提供将包含亲核体的材料固定到底物的方法，该方法包括：

提供磷腈系留化合物；

提供具有能够与磷腈系留化合物反应的官能团的底物；

通过磷腈系留化合物与底物上的官能团反应产生离子键、共价键、或其组合制备连接于底物的磷腈系留基团；和

使连接于底物的磷腈系留基团与包含亲核体的材料反应从而固定包含亲核体的材料。

用于发明说明书中的某些术语应被理解为具有以下含义：

如本文中使用的，术语“一”、  “一个”和“该”可与“至少一个”互换地使用，是指一个或多个所述元素。

如本文中使用的，术语“酰基”是指式-(CO)R的单价基团，其中R为烷基，并且其中用于本文中的(CO)表示通过双键与氧连接的碳。

如本文中使用的，术语“酰氧基”是指式-O(CO)R的单价基团，其中R为烷基。

如本文中使用的，术语“酰氧基甲硅烷基”是指具有与Si连接的酰氧基的单价基团(即，Si-O(CO)R，其中R为烷基)。例如，酰氧基甲硅烷基可为式-Si[O(CO)R]_3-nL_n，其中n为0到2的整数，L为卤素或烷氧基。具体的例子包括-Si[O(CO)CH₃]₃、-Si[O(CO)CH₃]₂Cl、或-Si[O(CO)CH₃]Cl₂-。

如本文中使用的，术语“烷氧基”是指式-OR的单价基团，其中R为烷基。

如本文中使用的，术语“烷氧羰基”是指式-(CO)OR的单价基团，其中R为烷基。

如本文中使用的，术语“烷氧基甲硅烷基”为具有与Si连接的烷氧基的基团(即，Si-OR，其中R为烷基)。例如，烷氧基甲硅烷基可为式-Si(OR)_3-n(L^a)_n，其中n为0到2的整数，La为卤素或酰氧基。具体的例子包括-Si(OCH₃)₃、-Si(OCH₃)₂Cl、或-Si(OCH₃)Cl₂。

如本文中使用的，术语“烷基”是指烷烃的单价基团，其包括直链、支链、环状的基团，或其组合。烷基通常具有1到30个碳原子。在一些实施方案中，烷基包含1到20个碳原子、1到10个碳原子、1到6个碳原子、或1到4个碳原子。烷基的例子包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基、和乙基己基。

如本文中使用的，术语“烷基二硫化物”是指式-SSR的单价基团，其中R为烷基。

如本文中使用的，术语“亚烷基”是指烷烃的二价基。亚烷基可为直链、支链、环状的，或其组合。亚烷基通常具有1到200个碳原子。在一些实施方案中，亚烷基包含1到100个、1到80个、1到50个、1到30个、1到20个、1到10个、或1到4个碳原子。亚烷基的基团中心可在相同的碳原子上(即烷叉基)在不同的碳原子上。

如本文中使用的，“氨基硅烷”是指具有与Si连接的胺基的基团。例如，氨基硅烷可为式-Si(OR¹)_3-n[(R²)NH₂]_n，其中n为0到2的整数，R¹为碳链长度小于5的烷基，R2为碳链长度至少为2的另一个烷基。其具体例子包括3-氨基丙基三乙氧基硅烷、3-氨基三甲氧基硅烷。

如本文中使用的，术语“芳烷基”是指化合物R-Ar的单价基团，其中Ar芳香族碳环基团，R为烷基。

如本文中使用的，术语“亚芳烷基”是指式-R-Ar-的二价基，其中Ar亚芳基，R为亚烷基。

如本文中使用的，术语“芳基”是指单价的芳香族碳环基团。芳基可具有一个芳香环，或者包括连接或稠合于芳香环的最多5个碳环结构。其它环状结构可为芳香族的、非芳香族的、或其组合。芳基的例子包括但不限于苯基、联苯基、三联苯基、蒽基、萘基、苊基、蒽醌基、菲基、蒽基、芘基、苝基、和芴基。

如本文中使用的，术语“亚芳基”是指具有1到5个环(其可为连接的、稠合的、或其组合)的碳环芳香族化合物的二价基。在一些实施方案中，亚芳基具有最多5个环、最多4个环，最多3个环，最多2个环，或具有一个芳香环。例如，亚芳基可为亚苯基。

如本文中使用的，术语“叠氮基”是指式-N₃的基团。

如本文中使用的，术语“氮丙啶基”是指下式的氮丙啶的环状单价基团

其中R^d为氢或烷基。

如本文中使用的，术语“苯并三唑基”是指具有与三唑基稠合的苯基团的单价基团。苯并三唑基的结构式为C₆H₄N₃-。

如本文中使用的，术语“羰基”是指式-(CO)-的二价基团。

如本文中使用的，术语“羰基亚氨基”是指式-(CO)NR⁴-的二价基团，其中R⁴为氢、烷基、或芳基。

如本文中使用的，术语“羰基氧基”是指式-(CO)O-的二价基团。

如本文中使用的，术语“羰基氧基羰基”是指式-(CO)O(CO)-的二价基团。这种基团为酸酐化合物的一部分。

如本文中使用的，术语“羰基硫基”是指式-(CO)S-的二价基团。

如本文中使用的，术语“羧基”是指式-(CO)OH的单价基团。

如本文中使用的，术语“氯代烷基”是指具有至少一个氢原子被氯原子代替的烷基。

如本文中使用的，术语“氰基”是指式-CN的基团。

如本文中使用的，术语“二硫化物”是指式-S-S-的二价基团。

如本文中使用的，术语“烯键不饱和”是指具有式-CY＝CH₂的碳-碳双键的单价基团，其中Y为氢、烷基、或芳基。

如本文中使用的，术语“氟代烷基”是指具有至少一个氢原子被氟原子代替的烷基。

如本文中使用的，术语“卤代烷基”是指至少一个氢原子用选自F、Cl、Br、或I的卤素代替的烷基。全氟烷基为卤代烷基的子集。

如本文中使用的，术语“卤代羰基氧基”是指式-O(CO)X的单价基团，其中X为选自F、Cl、Br、或I的卤素原子。

如本文中使用的，术语“卤代羰基”是指式-(CO)X的单价基团，其中X为选自F、Cl、Br、或I的卤素原子。

如本文中使用的，术语“卤代甲硅烷基”为具有连接于卤素的Si的基团(即，Si-X，其中X为卤素)。例如，卤代甲硅烷基为-SiX_3-n(L^b)_n，其中n为0到2的整数，L^b选自烷氧基、或酰氧基。一些具体的例子包括基团-SiCl₃、-SiCl₂OCH₃、和-SiCl(OCH₃)₂。

如本文中使用的，术语“杂亚烷基”是指具有一个或多个被硫、氧、或NR^d代替的碳原子的二价亚烷基，其中R^d为氢或烷基。杂亚烷基可为直链、支链、环状的、或其组合，并且可包括最多400个碳原子和最多30个杂原子。在一些实施方案中，杂亚烷基包括最多300个碳原子，最多200个碳原子，最多100个碳原子，最多50个碳原子，最多30个碳原子、最多20个碳原子，或最多10个碳原子。

如本文中使用的，术语“羟基”是指式-OH的基团。

如本文中使用的，术语“异氰酸根合”是指式-NCO的基团。

如本文中使用的，术语“巯基”是指式-SH的基团。

如本文中使用的，“亲核体”或“包含亲核体的材料”是指与含氧、硫和/或氮的基团如取代氨基有反应性的部分。包含亲核体的材料的例子包括具有部分如氨基、烷基或芳基取代的氨基、烷基氨基、芳基氨基、氧基烷基、氧基芳基、硫基烷基、和硫基芳基的那些；含氨基的染料的残基如硝基染料、偶氮染料，包括噻唑染料、吖啶染料、oxyazine染料、噻嗪染料、和吖嗪染料、靛蓝类染料；氨基蒽醌、芳族二胺、氨基苯酚、氨基萘酚、和前述物质的N-和O-酸基(acidyl)或烷基、芳烷基或芳基衍生物；硝胺、苯硫酚、或氨基硫醇。示例性的包含亲核体的材料包括以下残基：OCH₂COOH、NHCH₂COOH、SCH₂COOH、NHC₂H₄SO₃H、OC₄H₈N(C₂H₅)₃、NHC₆H₄SO₃H、OC₆H₄COOH、SC₆H₄COOH、NHC₂H₄OH、OC₂H₄OH、和NHC₃H₆NH(C₂H₄OH)₂。

如本文中使用的，术语“氧基”是指式-O-的二价基团。

如本文中使用的，术语“全氟烷基”是指其中所有的氢原子都被氟原子代替的烷基。全氟烷基为氟代烷基的子集。

如本文中使用的，术语“磷酸根合”是指式-OPO₃H₂的单价基团。

如本文中使用的，“磷腈部分”或“磷腈基团”是指以下通式的结构：

如本文中使用的，“磷腈系留化合物”或“磷腈系留基团”是指具有至少一个磷腈部分或基团的系留化合物或系留基团。

如本文中使用的，术语“膦酰基”是指式-PO₃H₂的单价基团。

如本文中使用的，术语“磷酰胺基”是指式-NHPO₃H₂的单价基团。

如本文中使用的，术语“芳香族伯氨基”是指式-ArNH₂的单价基团，其中Ar为芳基。

如本文中使用的，术语“芳香族伸氨基”是指式-ArNR^hH的单价第基团，其中Ar为芳基，R^h为烷基或芳基。

如本文中使用的，术语“叔氨基”是指式-NR₂的基团，其中R为烷基。

如本文中使用的，术语“系留化合物”是指具有至少两个反应基团的化合物。一个反应基团(即底物-反应性官能团)可与底物表面上的互补官能团反应形成系留基团。另一个反应基团可与包含亲核体的材料反应或与另一个系留化合物(或其衍生物或低聚物)或另一个能够与包含亲核体的材料结合的部分反应。系留化合物的两个反应基团的反应引起在底物和固定在底物上的包含亲核体的材料如含胺材料之间形成连接体基团。

如本文中使用的，术语“系留基团”是指通过系留化合物与底物表面上的与系留化合物为互补的官能团反应形成的连接于底物的基团。

前述内容并非意在包括本发明所有可能的实施方案。本领域技术人员应该在考虑公开的其余部分，包括优选实施方案的详细说明、不同的实施例、和权利要求后更完全地理解本发明的特点和优点。

优选实施方案的详细说明

本发明提供用于将包含亲核体的材料固定到底物的制品和方法。描述了具有活性官能团的磷腈化合物作为底物和至少一种包含亲核体的材料之间的系留化合物。可用于本发明的系留化合物包括易受亲核攻击的反应基团。系留化合物上的至少一个活性官能团提供系留化合物连接于底物表面的机构。其余的官能团可各自与包含亲核体的材料如胺官能的蛋白质、酶、其它生物分子等反应。另外，官能团可与包含亲核体的基团反应，或可以提供对其它部分如其它类似的系留化合物或其它活性部分的另外连接，其它类似的系留化合物或活性部分在结构上可为简单的或复合的(如支链、直链、等)并且通常包括也能够与包含亲核体的材料结合的另外的反应基团。

在本发明的实施方案中，用于将生物分子结合到底物表面的系留化合物包括磷腈基团，并且可具有式I所示的一般结构：

其中

其中每个X可相同或不同，并且包括易受亲核攻击以与包含亲核体的材料结合的反应基团。通常为，X包括卤素，并且最通常地，X为氯。

可用于本发明的磷腈系留化合物包括氯化磷腈三聚物(“PNC”)，其中式I中的每个X为氯。在将PNC系留到底物时，至少一个氯与底物表面上的部分反应，以将PNC部分结合于底物。当PNC部分结合于底物时，磷腈系留化合物包括另外的反应基团，各自能够与包含亲核体的材料如生物学活性物质反应，通过磷腈部分将生物学活性物质系留于底物。

在本发明的一些实施方案中，磷腈系留基团可唯一衍生自PNC分子。在一些实施方案中，磷腈系留基团可衍生自被认为是PNC的低聚物或衍生物的化合物。参考式I，唯一衍生自PNC的系留基团为其中每个X为氯的那些式I的化合物。

适用于本发明的磷腈三聚物的低聚物包括其中至少一个X基团为氯的式I的化合物。

适合于包括在本发明的磷腈系留基团中的PNC的衍生物包括其中至少一个X被取代基取代的式I的化合物，取代基可以包括单官能团、双官能团、或其它多官能团，其中官能团通常为亲核体。这种官能团可完全或部分地为脂肪族(直链或支链的)或芳香族的有机部分。在一些实施方案中，可以在将磷腈部分与底物连接之前使单官能、双官能和/或多官能部分结合于磷腈部分。在一些实施方案中，可以在磷腈部分已经与底物连接(如结合)之后使单官能、双官能和/或多官能部分结合于磷腈部分。

在其中磷腈部分衍生自PNC的实施方案中，氯(式I的X都是氯)的反应通常为顺序进行的，并且每个氯的反应性根据保留在PNC分子上的氯的数目、与PNC反应的残基的性质(如亲核性、位阻)和反应条件(温度、水的存在、化学计量或反应物等)而定。在例如式I的一个基团X与底物表面上部分反应以将磷腈部分与底物结合时，其余的未反应的X基团仍然能够与包括单官能、双官能和/或多官能部分的包含亲核体的材料反应。

单官能团包括具有能够与式I化合物的X基团之一反应的反应基团(如亲核体)，但是通常不包括另外的反应基团。在一些实施方案中，单官能团可以包括具有在本发明的底物或系留基团中需要或期望的一种或多种期望性质的基团。适合的单官能团包括使反应产物为亲水性或疏水性的基团、增强在某些溶剂中的溶解度的基团、增强分子间相互作用的基团、等等。其例子包括单官能的有机醇、胺和硫醇。

双官能团可为连接基团，它们包括可与磷腈部分反应的第一反应基团，和还可与磷腈部分反应或可与包括式I的第二化合物诸如例如PNC的另一个化合物或部分反应的第二反应基团。在一些实施方案中，双官能团包括可以将磷腈部分彼此连接以形成由至少两个通过双官能连接基团彼此连接的磷腈部分组成的系留基团。在这种结构中，磷腈部分包括能够与其它包含亲核体的材料诸如例如生物学活性分子结合的未反应的基团(如式I的未反应的X基团)。在一些实施方案中，未反应的基团可以在通过一个或多个双官能连接基团系留或连接在一起的一个、两个或多个磷腈部分上包括氯。在一些实施方案中，双官能团可与同一磷腈部分上的两个反应基团(式I的两个X基团)反应。

适合的双官能部分包括具有两个反应基团如两个亲核基团的化合物。一些具体的双官能部分包括例如4，7，10-三氧杂-1，13-十三烷二胺1，6-己二胺、甲基环氧乙烷、对苯二胺、2-氨基乙醇、4，4-硫基双苯硫酚、二甲基-1，6-己二胺。其它双官能部分为本领域技术人员已知的，本发明不在任何方面受前述具体部分的限制。

多官能部分也可包括连接基团，其中它们包括可与结合于底物的第一磷腈部分反应的第一反应基团，和可与同一磷腈部分或其它化合物或部分(包括其它磷腈部分或式I化合物(如TCT))反应的第二、第三和可能的其它另外的反应基团。在一些实施方案中，多官能团包括可以使两个或多个磷腈部分彼此连接以形成由通过多官能连接基团连接在一起的两个或多个磷腈部分组成的支链的系留基团的连接基团。在这种结构中，磷腈部分包括能够与其它包含亲核体的材料诸如例如一种或多种生物学活性分子结合的未反应的基团(如，式I的未反应的X基团)。在一些实施方案中，未反应的基团可以在通过一个或多个多官能连接基团系留或连接在一起的一个、两个或多个磷腈部分上包括氯。在一些实施方案中，多官能连接基团可与第一磷腈基团上超过一个的反应基团反应，然后还可与其它磷腈基团或其它基团上的其它反应基团反应。

适合的多官能部分包括具有超过两个反应基团(如，亲核基团)的化合物。在一些实施方案中，多官能部分可为低聚物或聚合物部分。一些具体的多官能部分包括例如水解的2-乙基-4，5-二氢-唑均聚物、聚氮丙啶(包括直链和支链的结构)，以及本领域技术人员已知的其它部分。

应该理解，不应将前述说明解释为是限于本文中所述的具体的单官能、双官能或其它多官能的基团。本发明意在包括具有至少一个磷腈部分的系留化合物和系留基团。

本发明提供制品，其包括连接于底物的如本文中所述的磷腈系留基团。连接于底物的系留基团为底物表面上的互补官能团“G”与式I化合物的至少一个X基团的反应产物。连接于底物的系留基团具有至少一个、通常为两个或多个可与另一种分子或材料(如包含亲核体的材料)反应以捕获该材料并且将其系留于底物的反应基团。

底物为可以连接磷腈系留化合物的固相材料。底物不溶于在使式I的化合物连接于底物表面时可能使用的溶液或溶剂中。通常，磷腈系留化合物只连接于底物的外部，而底物的其余部分在将磷腈系留基团连接于底物的过程中不被改变。如果底物具有遍及底物范围分布的基团“G”，典型地只有外部(在表面上或接近表面)的那些基团通常能够与式I化合物的X基团反应。

底物可为任何有用的形式，包括但不限于薄膜、片材、膜、过滤器、非织造或织造纤维、中空或固体小珠、瓶、板、管、棒、管道、或小圆片。底物可为多孔的或无孔的、刚性的或挠性的、透明的或不透明的、澄清的或彩色的、和反射性的或非反射性的。适合的底物材料包括例如聚合物材料、玻璃、陶瓷、金属、金属氧化物、水合金属氧化物、或其组合。

底物可为单层或单一材料，并且可具有一种或多种材料的多个层。例如，底物可具有一个或多个内层或第一层，其为最外层提供支持，其中底物的外层包括能够与式I化合物的X基团反应的互补官能团。在一些实施方案中，外层的表面可经过化学改性或涂有另一种材料，以提供包括能够与磷腈基团(包括式I的基团)反应的互补官能团。

适合用作底物或底物的一部分的适当的聚合物材料包括但不限于聚烯烃、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯腈、聚(乙酸乙烯酯)、聚乙烯醇、聚氯乙烯、聚甲醛、聚碳酸酯、聚酰胺、聚酰亚胺、聚氨酯、酚醛塑料、多胺、氨基环氧树脂、聚酯、聚硅氧烷、纤维素基聚合物、多糖、或其组合。在一些实施方案中，聚合物材料是使用具有能够与磷腈基团(包括式I化合物中的基团X)反应的互补官能团的共聚单体制备的共聚物。例如，共聚单体可包含羧基、巯基、羟基、氨基、或烷氧基甲硅烷基。

在一些实施方案中，适当的聚合物材料包括由热致相分离(“TIPS”)产生的那些，热致相分离为相转化方法，其中浇铸最初均一的聚合物溶液，然后使其暴露在较冷界面下(水浴或冷却浇铸轮)并通过降温在溶液膜中诱导相分离。适合的TIPS薄膜或膜可具有广泛的物理薄膜性质和细微孔径。它们可为从任何多种聚合物制备的相对刚性的或非刚性的底物。根据美国专利4,539,256、5,120,594、和5,238,623的教导制备的TIPS膜都适合用于本发明中。TIPS膜可以包括例如高密度聚乙烯(HDPE)、聚丙烯、聚偏氟乙烯(PVDF)、聚乙烯-乙烯醇共聚物(如得自EVAL Company of America(EVALCA)，Houston，Texas)的商业名称EVAL F101A下)。膜可以包括材料的组合如TIPS、HDPE或涂有亲水性聚合物(聚乙烯-乙烯醇共聚物或EVAL)的聚丙烯膜、或涂有亲水性的、强碱性的、带正电的涂层如聚二烯丙基二甲基氯化铵或结合了季铵化的二甲氨基乙基丙烯酸酯的聚合物的TIPS聚丙烯载体。用于本发明的适合的TIPS膜的另一个例子为购自St.Paul，Minnesota的3MCompany的HDPE膜。这种膜的特征在于包括约0.09μm的孔径大小和约0.9密耳(0.023mm)的厚度。通常，TIPS技术可以提供孔径尺寸在微米和超滤范围内的多种物理薄膜性质，如包括孔径为约80nm到约0.5微米范围内的那些。

可将材料的组合用作固体支撑件，并且前述说明应该被理解为包括单独的上述材料和上述材料与其它材料的组合。

本发明的一些实施方案可利用具有施用于TIPS膜或另一种聚合物底物上的类金刚石玻璃(DLG)涂层的多层底物。DLG涂层可使用已知技术使用，诸如通过在EP 1 266 045 B1(David等人)中描述的等离子体沉积工艺。在使用TIPS底物的实施方案中，DLG涂层通常使用在TIPS膜的整个表面上，以便DLG延伸进入TIPS膜的孔中。如所述，其它材料可用于生产TIPS膜，并且可类似地将DLG涂层施用于这种其它材料，以提供用于本发明适合的底物。

适合的玻璃和陶瓷底物材料可以包括例如钠、硅、铝、铅、硼、磷、锆、镁、钙、砷、镓、钛、铜、或其组合。玻璃通常包括各种类型的含硅酸盐材料。

在一些实施方案中，底物包括如国际专利申请WO 01/66820 A1中所述的类金刚石玻璃层，所述申请的公开被全文并入本文作为参考。类金刚石玻璃为无定形物质，其包括碳、硅、和选自氢、氧、氟、硫、钛、或铜的一种或多种元素。一些类金刚石玻璃材料通过等离子体工艺由四甲基硅烷前体形成。可以生产疏水材料，将其进一步在氧等离子体中处理，以控制表面上的硅烷醇浓度。

类金刚石玻璃可为薄膜形式或为底物中另一层或另一种材料上的涂层形式。在一些应用中，类金刚石玻璃可为薄膜形式，其具有至少30重量％的碳、至少25重量％的硅、和最多45重量％的氧。这种薄膜可为挠性的和透明的。在一些实施方案中，类金刚石玻璃为多层底物的外层。在具体的实施例中，底物的第二层(如载体层)为聚合物材料，第一层为类金刚石玻璃的薄膜。系留基团连接于类金刚石玻璃的表面。

在某些多层底物中，类金刚石玻璃沉积在类金刚石碳层上。例如，第二层(如，载体层)为具有在表面上沉积的类金刚石碳层的聚合物薄膜。在类金刚石碳层上淀积类金刚石玻璃层。在一些实施方案中，类金刚石碳为多层底物中聚合物层与类金刚石玻璃层之间的粘结层或底漆层。例如，多层底物可以包括聚酰亚胺或聚酯层、淀积在聚酰亚胺或聚酯上的类金刚石碳层，和淀积在类金刚石碳上的类金刚石玻璃层。在另一个实施例中，多层底物可以包括按以下顺序布置的层叠体：类金刚玻璃、类金刚石碳、聚酰亚胺或聚酯层、类金刚石碳、和类金刚石玻璃。

类金刚石碳膜可以从例如乙炔在等离子体反应器中制备。制备这种薄膜的其它方法在美国专利5,888,594和5,948,166以及文章M.David等人，AlChE Journal，37(3)，367-376(March 1991)中描述，其公开被并入本文作为参考。

用于底物的适合的金属、金属氧化物、或水合金属氧化物包括例如金、银、铂、钯、铝、铜、铬、铁、钴、镍、锌、等等。含金属的材料可为合金，如不锈钢、氧化铟锡等。在一些实施方案中，含金属的材料为多层底物的表层。例如，底物可具有聚合物型第二层和含金属的第一层。在一个实施例中，第二层为聚合物薄膜层，第一层为金的薄膜。在其它实施例中，多层底物包括涂有含钛层然后涂有含金层的聚合物薄膜。也就是说，钛层可以起用于将金层粘附于聚合物膜的粘结层或底漆层的作用。

在多层底物的其它实施例中，硅载体层覆盖有铬层，然后是金层。铬层可以改善金层对硅层的粘合。

底物的表面通常包括能够与羧基、卤素(如氯)、卤代羰基、卤代羰基氧基、氰基、羟基、巯基、异氰酸根合、卤代甲硅烷基、烷氧基甲硅烷基、酰氧基甲硅烷基、叠氮基、卤代烷基、叔氨基、芳香族伯氨基、芳香族仲氨基、二硫化物、烷基二硫化物、苯并三唑基、磷腈、膦酰基、磷酰胺基、磷酸根合、或烯键不饱和基团反应的基团。也就是说，底物包括能够与式I化合物中的基团X反应的基团“G”(即，底物包括基团X的互补官能团)。底物可以包括经过处理为具有包括互补官能团的外层的载体材料。底物可以从已知具有能够与X反应的基团或具有能够与中间化合物反应的基团的任何固相材料制备，所述中间化合物通过与底物表面上的部分反应和与X反应以将底物和磷腈基团连接在一起可以起到连接基团的作用。

羧基或卤代羰基可与具有羟基的底物反应以形成含羰基氧基的连接基团。具有羟基的底物材料的例子包括但不限于聚乙烯醇、电晕放电处理的聚乙烯、羟基取代的聚甲基丙烯酸酯、羟基取代的聚丙烯酸酯、和载体材料如玻璃或聚合物膜上的聚乙烯醇涂层。

羧基或卤代羰基还可以与具有巯基的底物反应以形成含羰基硫基的连接基团。具有巯基的底物材料的例子包括但不限于巯基取代的聚丙烯酸酯、巯基取代的聚甲基丙烯酸酯、和用巯基烷基硅烷处理的玻璃。

另外，羧基或卤代羰基可与芳香族伯氨基、芳香族仲氨基、或脂肪族仲氨基反应以形成含羰基亚氨基的连接基团。具有芳香族伯或仲氨基的底物材料的例子包括但不限于多胺、胺取代的聚甲基丙烯酸酯、胺取代的聚丙烯酸酯、聚氮丙啶、和用氨基烷基硅烷处理的玻璃。

卤代羰基氧基可与具有羟基的底物反应以形成含氧基羰基氧基的连接基团。具有羟基的底物材料的例子包括但不限于聚乙烯醇、电晕放电处理的聚乙烯、羟基取代的聚甲基丙烯酸酯、羟基取代的聚丙烯酸酯、和载体材料如玻璃或聚合物膜上的聚乙烯醇涂层。

卤代羰基氧基还可以与具有巯基的底物反应以形成含氧基羰基硫基的连接基团。具有巯基的底物材料的例子包括但不限于巯基取代的聚甲基丙烯酸酯、巯基取代的聚丙烯酸酯、和用巯基烷基硅烷处理的玻璃。

另外，卤代羰基氧基可与具有芳香族伯氨基、芳香族仲氨基、或脂肪族仲氨基的底物反应以形成含氧基羰基亚氨基的连接基团。具有芳香族伯或仲氨基的底物材料的例子包括但不限于多胺、胺取代的聚甲基丙烯酸酯、胺取代的聚丙烯酸酯、聚氮丙啶、和用氨基烷基硅烷处理的玻璃。

羟基可与具有异氰酸酯基的底物反应以形成含氧基羰基亚胺基的连接基团。具有异氰酸酯基的适合的底物包括但不限于载体材料上的2-异氰酸根合乙基甲基丙烯酸酯聚合物涂层。适合的载体材料包括玻璃和聚合物材料如聚酯、聚酰亚胺等。

羟基还可以与具有羧基、羰基氧基羰基、或卤代羰基的底物反应，以形成含羰基氧基的连接基团。适合的底物包括但不限于载体材料上的丙烯酸聚合物或共聚物涂层、或载体材料上的甲基丙烯酸聚合物或共聚物涂层。适合的载体材料包括玻璃和聚合物材料如聚酯、聚酰亚胺等。其它适合的底物包括聚乙烯与聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸的共聚物、或其组合。

巯基可与具有异氰酸酯基的底物反应。巯基与异氰酸酯基之间的反应形成含硫基羰基亚氨基的连接基团。具有异氰酸酯基的适合的底物包括但不限于载体材料上的2-异氰酸根合乙基甲基丙烯酸酯共聚物涂层。适合的载体材料包括玻璃和聚合物材料如聚酯、聚酰亚胺等。

巯基还可以与具有卤代羰基的底物反应以形成含羰基硫基的连接基团。具有卤代羰基的底物包括例如氯代羰基取代的聚乙烯。

巯基还可以与具有卤代羰基氧基的底物反应以形成含氧基羰基硫基的连接基团。具有卤代羰基的底物包括聚乙烯醇的氯甲酰基酯。

另外，巯基可以与具有烯键不饱和基团的底物反应以形成含硫醚的连接基团。具有烯键不饱和基团的适合的底物包括但不限于衍生自丁二烯的聚合物和共聚物。

磷腈部分如PNC可与含亲核体的材料反应，包括具有亲核体官能度的玻璃、类金刚石玻璃、金属、金属氧化物、和聚合物底物。可将DLG表面处理以包括为与PNC部分反应提供必要官能度的亲核体如氨基硅烷(如3-氨基丙基三乙氧基硅烷、3-氨基三甲氧基硅烷)的表面。这种表面也可包括多孔性聚合物涂层(如，本文中所述的TIPS材料)。聚合物底物还可以包括例如氨接枝的烧结聚乙烯、氨化聚酯熔喷纤维膜、羟化聚丙烯、聚酯、和聚乙烯熔喷纤维膜、和氨基甲基化苯乙烯-二乙烯基苯。PNC材料也可与金属或金属氧化物材料反应。

异氰酸酯基可与具有羟基的底物反应以形成含氧基羰基亚氨基的连接基团。具有羟基的底物材料的例子包括但不限于聚乙烯醇、电晕放电处理的聚乙烯、羟基取代的聚甲基丙烯酸酯或聚丙烯酸酯、和玻璃或聚合物膜上的聚乙烯醇涂层。

异氰酸酯基还可与巯基反应以形成含硫基羰基亚氨基的连接基团。具有巯基的底物材料的例子包括但不限于巯基取代的聚甲基丙烯酸酯或聚丙烯酸酯、和用巯基硅烷处理的玻璃。

另外，异氰酸酯基可与芳香族伯氨基、芳香族仲氨基、或脂肪族仲氨基反应以形成含脲的连接基团。具有芳香族伯或仲氨基的适合的底物包括但不限于多胺、聚氮丙啶、和载体材料如玻璃上或聚合物材料如聚酯或聚酰亚胺上的氨基烷基硅烷涂层。

异氰酸酯基还可以与羧基反应以形成含O-酰基氨甲酰基的连接基团。具有羧酸基团的适合的底物包括但不限于玻璃或聚合物载体上的丙烯酸聚合物或共聚物的涂层、或甲基丙烯酸聚合物或共聚物的涂层。共聚物包括但不限于包含聚乙烯和聚丙烯酸或聚甲基丙烯酸的共聚物。适合的聚合物载体材料包括聚酯、聚酰亚胺等。

卤代甲硅烷基、烷氧基甲硅烷基、或酰氧基甲硅烷基可以与具有硅烷醇基的底物反应以形成含二甲硅醚(disiloxane)的连接基团。适合的底物包括从多种玻璃、陶瓷材料、或聚合物材料制备的那些。这些基团还可以与在表面上具有金属氢氧化物基团的多种材料反应以形成含硅烷的连接。适合的金属包括但不限于银、铝、铜、铬、铁、钴、镍、锌、等等。在一些实施方案中，金属为不锈钢或另一种合金。聚合物材料可以制备为具有硅烷醇基。例如，市售的具有硅烷醇基的单体包括得自Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI的3-(三甲氧基硅烷基)丙基甲基丙烯酸酯和3-氨基丙基三甲氧基硅烷。

叠氮基可以与例如具有碳-碳三键的底物反应以形成含三唑二基(triazolediyl)的连接基团。叠氮基还可以与具有腈基团的底物反应以形成含四氮烯二基(tetrazenediyl)的连接基团。具有腈基团的底物包括但不限于载体材料如玻璃或聚合物材料上的聚丙烯腈涂层。适合的聚合物载体材料包括例如聚酯和聚酰亚胺等。具有腈基团的其它适合的底物包括丙烯腈聚合物或共聚物和2-氰基丙烯酸酯聚合物或共聚物。

叠氮基还可以与应变烯基团反应以形成含三唑二基的连接基团。具有应变烯基团的适合的底物包括具有侧基降冰片烯基官能团的涂层。适合的载体材料包括玻璃和聚合物材料如聚酯和聚酰亚胺。

氮丙啶基还可与巯基反应以形成含β-氨基烷基硫醚的连接基团。具有巯基的底物材料的例子包括但不限于巯基取代的聚甲基丙烯酸酯或聚丙烯酸酯、和用巯基烷基硅烷处理的玻璃。

另外，氮丙啶基还可与羧基反应以形成含β-氨基烷基羰基的连接基团。具有羧基的适合的底物包括但不限于玻璃或聚合物载体上的丙烯酸聚合物或共聚物的涂层、或甲基丙烯酸聚合物或共聚物的涂层。共聚物包括但不限于包含聚乙烯和聚丙烯酸或聚甲基丙烯酸的共聚物。适合的聚合物载体材料包括聚酯、聚酰亚胺等。

卤代烷基可以与例如具有叔氨基的底物反应以形成含季铵的连接基团。适合的具有叔氨基的底物包括但不限于聚二甲氨基苯乙烯或聚二甲氨基乙基甲基丙烯酸酯。

同样地，叔氨基可以与例如具有卤代烷基的底物反应以形成含季铵的连接基团。适合的具有卤代烷基的底物包括但不限于载体材料上的卤代烷基硅烷的涂层。载体材料可包括但不限于玻璃和聚合物材料如聚酯和聚酰亚胺。

芳香族伯氨基或芳香族仲氨基可与例如具有异氰酸酯基的底物反应以形成含氧基羰基亚氨基的连接基团。适合的具有异氰酸酯基的底物包括但不限于玻璃或聚合物载体上的2-异氰酸根合乙基甲基丙烯酸酯聚合物或共聚物的涂层。适合的聚合物载体材料包括聚酯、聚酰亚胺等。

芳香族伯氨基或芳香族仲氨基还可与包含羧基或卤代羰基的底物反应以形成含羰基亚氨基的连接基团。适合的底物包括但不限于载体材料上的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物涂层。载体材料可为例如玻璃或聚合物材料如聚酯或聚酰亚胺。其它适合的底物包括聚乙烯和聚甲基丙烯酸或聚丙烯酸的共聚物。

二硫化物或烷基二硫化物基团可以与例如金属表面反应以形成含金属硫化物的连接基团。适合的金属包括但不限于金、铂、钯、镍、铜、和铬。底物还可以为合金如氧化铟锡或介电材料。

苯并三唑基可与例如具有金属或金属氧化物表面的底物反应。适合的金属或金属氧化物包括例如银、铝、铜、铬、铁、钴、镍、锌、等等。金属或金属氧化物可包括合金，如不锈钢、氧化铟锡等。

磷腈可与具有结合于底物表面的氨基官能度的底物反应。用氨基硅烷处理的玻璃表面和类金刚石玻璃表面适合于与磷腈部分反应并且与其连接。在这种DLG底物中，氨基官能度提供能够通过亲核攻击与磷腈部分上的X基团(如氯)反应的互补官能团“G”。在得到的系统中，X基团被氨基官能度代替，从而将磷腈部分系留于底物。

膦酰基、磷酰胺基、或磷酸根合可与例如具有金属或金属氧化物表面的底物反应。适合的金属或金属氧化物包括例如银、铝、铜、铬、铁、钴、镍、锌、等等。金属或金属氧化物可包括合金，如不锈钢、氧化铟锡等。

烯键不饱和基团可以与例如具有被巯基取代的烷基的底物反应。反应形成含杂亚烷基的连接基团。适合的底物包括例如巯基取代的聚丙烯酸或聚甲基丙烯酸烷基酯。

烯键不饱和基团还可以与具有硅表面的底物反应，如与使用化学气相淀积法形成的硅底物反应。这种硅表面可以包含可在铂催化剂的存在下与烯键不饱和基团反应的-SiH基团，以形成硅结合于亚烷基的连接基团。

另外，烯键不饱和基团可以与具有碳-碳双键的底物反应以形成含亚烷基的连接基团。这种底物包括例如衍生自丁二烯的聚合物。

本发明的制品通常包括底物和连接于底物的系留基团，所述系留基团包括底物表面上互补的底物官能团与式I的磷腈化合物(PNC)的反应产物，其中连接于底物的官能团为能够与X反应形成离子键、共价键、或其组合的基团。在一些实施方案中，单个的互补的底物官能团可以与单个磷腈化合物反应以形成超过一个的键。连接于底物的官能团上的未反应基团(未反应的氯)可用于进一步与包含亲核体的材料反应。

如果在底物上具有超过一个的反应基团，通常有超过一个的磷腈系留基团连接于底物。另外，底物可在底物表面上具有没有与磷腈系留化合物反应的过量的反应基团。

底物上能够与磷腈系留化合物反应的基团包括但不限于羟基、巯基、芳香族伯氨基、芳香族仲氨基、脂肪族仲氨基、氨基硅烷、叠氮基、羧基、羰基氧基羰基、异氰酸酯、卤代羰基、卤代羰基氧基、硅烷醇、和腈。

系留化合物对底物表面的连接(即，形成)可以使用多种技术检测，诸如例如，在连接磷腈系留化合物之前和之后的底物上液体的接触角测定法(如在系留基团连接于底物表面时接触角改变)、椭圆光度法(如可以测量连接的层的厚度)、飞行时间质谱学(如在系留基团连接于底物时表面浓度改变)、和傅里叶变换红外光谱学(如在系留基团连接于底物时反射率和吸光度改变)。

在本发明的制品的一些实施方案中，磷腈系留基团中的含卤素部分与含胺材料反应，引起含胺材料固定于底物。在一些实施方案中，含胺材料为生物分子，诸如例如氨基酸、肽、DNA、RNA、蛋白质、酶、细胞器、免疫球蛋白、或其片段。在其它实施方案中，含胺材料为非生物胺，如含胺的被分析物。固定化胺的存在可以使用例如质谱学、接触角测定法、红外光谱学、和椭圆光度法测定。另外，如果含胺材料为生物学活性物质，可使用多种免疫测定法和光学显微技术。

可以将其它材料结合于含胺材料。例如，可以将互补RNA或DNA片段与固定化RNA或DNA片段杂交。在另一个例子中，抗原可以结合于固定化抗体，或者抗体可以结合于固定化抗原。在更具体的例子中，可以将细菌如金黄色葡萄球菌结合于固定化生物分子。

本发明的另一个方面提供将包含亲核体的材料固定于底物的方法。该方法涉及通过使底物表面上的互补官能团与磷腈部分(如使式I化合物中至少一个的反应基团X反应)反应制备连接于底物的系留基团；和使磷腈部分的至少一个反应基团(如式I的一个或多个剩余的反应基团X)与包含亲核体的材料反应，在底物和包含亲核体的材料之间形成磷腈连接体基团。在一个实施方案中，包含亲核体的材料为含胺的材料，并且使含胺的材料固定的方法由反应图解A表示：

                        反应图解A

其中U¹是由式I化合物中一个X基团与底物表面上的互补官能团G反应形成的连接基团；T为含胺材料的其余部分(如基团T表示含胺材料除掉胺基之外的所有部分)。H₂N-T为任何适合的含胺材料。在一些实施方案中，H₂N-T为生物分子。

前述反应图解A的变体也在本发明的范围内。在其中将单官能部分结合于磷腈部分的实施方案中，方法涉及通过以下过程制备连接于底物的系留基团：使底物表面上的互补官能团与磷腈基团(如式I化合物中至少一个反应基团X)反应，和使磷腈基团(如式I中剩余的另一个反应基团X)与一个或多个单官能部分反应以形成系留基团，系留基团包括结合于底物的磷腈部分，并且还有单官能部分结合于磷腈部分。含亲核体的材料可结合于磷腈部分，用于使含亲核体的材料系留于底物。

在具有双官能部分的实施方案中，双官能部分结合于已经系留于底物表面的第一磷腈部分。双官能部分也可结合于第二磷腈部分，并且第二磷腈部分可结合于包含亲核体的材料以将包含亲核体的材料系留于底物。在包括多官能部分的实施方案中，多官能部分可结合于已经系留于底物表面的第一磷腈部分，并且多官能部分也可结合于第二、第三、或其它另外的磷腈部分。随后，第一、第二、第三或其它磷腈部分上的反应基团可与包含亲核体的材料反应并结合，以将包含亲核体的材料系留于底物。另外，多官能部分可与单个磷腈基团上的多个反应基团反应。

因此，本发明提供将包含亲核体的材料固定于底物的方法，该方法涉及：

提供磷腈系留化合物(如，式I的化合物)；

提供具有能够与磷腈系留化合物反应的互补官能团的底物；

通过磷腈系留化合物与底物上的互补官能团反应产生离子键、共价键、或其组合制备连接于底物的磷腈系留基团；和

使连接于底物的磷腈系留基团与包含亲核体的材料反应，从而固定包含亲核体的材料。

本发明的化合物可用于例如固定包含亲核体的材料如含胺的材料。在一些实施方案中，含胺的材料为含胺的被分析物。在其它实施方案中，含胺材料为生物分子，诸如例如氨基酸、肽、DNA、RNA、蛋白质、酶、细胞器、免疫球蛋白、或其片段。固定化的含生物胺的材料可用于疾病或遗传缺陷的医疗诊断。固定化的含胺材料还可用于生物学分离或用于检测多种生物分子的存在。另外，固定化的含胺材料可用于生物反应器或作为制备其它材料的生物催化剂。连接于底物的系留基团可用于检测含胺的被分析物。

含生物胺的材料经常可在连接于底物之后保持活性，使得固定化抗体可以与抗原结合或使得固定化抗原可以与抗体结合。含胺的材料可以结合于细菌。在更具体的例子中，固定化的含胺材料可以结合于金黄色葡萄球菌(如固定化的含胺材料可以是具有可以特异性地结合于细菌的部分的生物分子)。

本发明的实施方案在以下非限制性实施例中进一步描述。

实施例

实施例1：

制备涂有类金刚石玻璃(DLG)的官能化多孔膜。使用EP 1 266 045B1(David等人)中所述的等离子体工艺，用类金刚石玻璃(DLG)涂布5cm²高密度聚乙烯热致相分离(HDPE TIPS)膜(孔径大小约0.09μm，厚度约23微米，得自3M Company，St.Paul，MN)，使得DLG涂层延伸进入TIPS膜的孔中。将涂有DLG的TIPS膜置于包含2体积％的3-氨基丙基三乙氧基硅烷(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、1ml水和几滴0.1N乙酸的50ml乙醇中。在10分钟后，将膜从溶液中取出，用乙醇洗并干燥。

通过将膜置于包含0.2g经过升华纯化的PNC(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)的20ml甲苯溶液中在官能化膜上系留连接PNC三聚物。氨基硅烷的氨基通过置换氯与磷腈环反应，剩余的氯用于连接到生物学活性分子如蛋白质分子。将膜置于包含10mg葡萄糖氧化酶的葡萄糖氧化酶在PBS缓冲溶液中的溶液中3小时。将膜取出并用水和缓冲溶液洗，随后用十二烷基硫酸钠洗，以除去任何离子性结合的蛋白质。

使用市售的试验试剂盒和操作规程(Pierce Chemicals，Rockford，IL)在得自实施例1的膜上进行Bicinchonic acid analysis(BCA)以测定已经固定在表面上的蛋白质总量。测定固定在1cm² TIPS多孔膜中的蛋白质总量为212μg/1.5mg膜。

进行葡萄糖氧化酶试验以测定在膜中具有活性的酶的量。试验使用葡萄糖氧化酶试验试剂盒，使用得自Sigma-Aldrich的操作规程。最初测定的活性酶的量为25.5μg/1.5mg膜。在五(5)天之后，活性酶的量为23.3μg/1.5mg膜。

进行实验以证明酶活性是由于酶对膜表面上的系留基团的共价连接而不是来自于溶液中的未连接的酶。将如上所述制备的1cm²底物置于葡萄糖氧化酶试验溶液中30秒，并测量在450nm的吸光度。然后将膜从溶液中取出，保持约30秒并再次检查吸光度。在将膜从溶液取出之后，吸光度没有增加，从而表明不含自由漂浮的酶。将膜放回到溶液中以允许溶液中的酶与底物表面上的系留基团之间发生进一步的反应。收集另外的吸光度测量数据，持续60分钟，数据总结在表1中。

表1

在450nm的吸光度

时间(分钟)	吸光度(450nm)
		0	0
10	0.31979
		20	0.36018
30	0.47089
		40	0.49865
50	0.62823
		60	0.64694

实施例2：

使用以下条件用DLG处理载玻片。将每个载玻片在氧等离子体中蚀刻10秒并暴露于四甲基硅烷和氧等离子体的混合物中20秒，随后暴露于氧等离子体中另外10秒。然后将涂有DLG的载玻片置于3-氨基丙基三乙氧基硅烷的1％乙醇溶液中10分钟。其后，将载玻片取出并用乙醇洗，在氮气流下干燥。将干燥的载玻片与氯化磷腈在甲苯(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)中反应。反应时间从几分钟到最多一小时不等。进行接触角测定法以监控和证实PNC对连接于DLG底物的氨基丙基三乙氧基硅烷的连接。胺具有20度的低接触角，其在与PNC反应后增加到45度，并且在约10分钟内稳定。PNC连接的接触角数据在表2中提供。

表2

时间(分钟)	接触角
		0	19.3
1	22.3
		5	45.3
20	44.3
		30	47.3
60	46.6

通过将样品暴露于1mM的赖氨酸(Sigma Aldrich)溶液中使反应时间为10分钟的样品进一步与赖氨酸反应。赖氨酸的氨基与PNC的反应使接触角降低，其在涂有DLG的载玻片与赖氨酸接触之后的约10分钟内稳定。接触角数据在表3中表示。

表3

时间(分钟)	接触角
		0	55.2
1	27
		5	15.5
20	15.3
		30	19.3
60	15.7

实施例3

首先将约20cm×30cm的聚酰亚胺薄膜(得自E.I.du Pont deNemours & Co.，Wilmington，DE，商业名称“KAPTON E”)用类金刚石碳(DLC)涂布，随后用类金刚石玻璃(DLG)涂布。使用3M 811胶带(3M Company，St.Paul，MN)将聚酰亚胺薄膜固定于2480型平行板电容偶合活性离子刻蚀机(PlasmaTherm，St.Petersburg，FL)的动力电极。使用乙炔等离子体将DLC淀积在聚酰亚胺膜上。将离子刻蚀机室关闭并将室泵送到0.67Pa(0.005Torr)的压力。将氧气以每分钟500标准cm³的流速引入到室中，并维持室的压力在6.7Pa(0.050Torr)。将等离子体点火并在2000W的功率维持15秒。然后终止氧气流并将室泵送到0.67Pa(0.005Torr)的压力。将乙炔气以每分钟200标准cm³的流速引入到室中，并维持室的压力在2Pa(0.015Torr)。将等离子体点火并在1600W的功率维持10秒。然后终止乙炔气流并将室泵送到0.67Pa(0.005Torr)的压力。

然后使用四甲基硅烷等离子体将类金刚石玻璃(DLG)淀积在DLC/聚酰亚胺底物上，首先将氧气以每分钟500标准cm³的流速引入到室中。维持室的压力在20Pa(0.15Torr)。将等离子体点火并在300W的功率维持10秒。维持氧气流速在每分钟500标准cm³，将四甲基硅烷气体以每分钟150标准cm³的流速引入到室中。维持室的压力在20Pa(0.15Torr)。将等离子体点火并在300W的功率维持12秒。终止四甲基硅烷气流。在1分钟后，维持氧气流和20Pa(0.15Torr)的室压力，将等离子体点火并在300W的功率维持20秒。然后终止氧气流并将室压力泵送到0.67Pa(0.005Torr)的压力。然后将室对环境开放并将聚酰亚胺/DLC/DLG底物重新定位，使得DLG涂层面对电极。重复前述等离子体处理顺序，以提供在两侧具有DLC/DLG涂层的具有聚酰亚胺的底物。

从根据前述工艺制备的20cm×30cm的聚酰亚胺/DLC/DLG底物切取每个约1cm²的两个试验底物。将一个底物指定为对照。另一个底物指定为实验底物，并将实验底物进一步如实施例1中所述用3-氨基丙基三乙氧基硅烷(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)和PNC三聚体处理。对照底物不经处理并保持不含硅烷以及PNC。

通过将每个底物置于无菌培养管中并使底物暴露于1ml的pH被调节到9并且包含50μg的mIgG(购自Jackson Immuno Researchlaboratories Inc West Grove，PA，目录编号#209-005-082)的100mMCHES 2-{N-环己基氨基乙烷}磺酸缓冲剂(购自Sigma，St.Louis，MO，目录编号C-2885)而使抗人类的小鼠IgG(mIgG)固定在对照底物的DLG表面上和实验底物的用PNC处理的表面上。对于一般试验的固定时间设置为两(2)小时同时置于在室温下以120动作/分钟的振动器(IKA HS260 basic)中。通过Pasteur移液管将溶液从培养管中取出并将如此处理的对照和实验底物用包含0.05％Tween 20的磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲剂洗涤三次。将两个底物再次置于无菌培养管中并向每个培养管加入1.5ml的封闭缓冲液、包含2％脱脂奶粉的PBS缓冲剂，并使其在振动器上反应一(1)小时。使用Pasteur移液管将溶液从管取出并将每个底物再次用前述的洗涤缓冲剂洗涤三次。

mIgG抗体与生物素结合的人IgG(hIgG-BT)反应。hIgG-BT在PBS缓冲剂中的浓度为4μg/ml(得自Jackson Immuno Research laboratoriesInc West Grove，PA，目录编号#009-060-003)。将1ml的溶液置于包含底物的培养管中并在振动器中培养一小时，然后如前所述将底物用缓冲剂洗涤3次。在这个反应之后是与链霉亲和素辣根过氧化物(SA-HRP)(该物质是特异性结合于生物素的检测酶)的反应。将1ml的0.5μg/ml SA-HRP(购自Jackson Immuno Research laboratories Inc WestGrove，PA，目录编号#023-060-021，在pH 7.4的缓冲剂中)加入到培养管中并使其在振动器上反应30分钟。将样品再次用洗涤缓冲剂洗涤3次，并将1ml的浓度为0.3mg/ml的着色剂2，2-连氮基-二(3-乙基苯并噻唑啉)磺酸(ABTS)加入到培养管中以促进可在分光光度计上在405nm测量的酶促变色。在暴露于ABTS下5分钟之后，加入1ml的1％十二烷基硫酸钠(SDS)溶液以终止反应。

使用UV-Vis分光光度计在405nm测量处理的对照底物和对处理的实验底物的吸光度。对照样品的吸光度为0.1。实验底物上样品的吸光度为0.2。

实施例4

制备1cm²的底物(聚酰亚胺/DLC/DLG)样品并如实施例3所述用硅烷和PNC官能化。使用未经硅烷或PNC处理的聚酰亚胺/DLC/DLG底物作为“对照”底物。将对金黄色葡萄球菌特异性的兔IgG(购自Accurate Chemical and Scientific，Westbury，New York)的4.52mg/ml溶液固定在底物的表面上，包括对照底物的表面上。然后将底物固定(通过轻敲)在玻璃板上并通过移液管加入包含浓度为5×10⁸cfu/ml的金黄色葡萄球菌的50μl PBS缓冲剂，使其静置约30分钟。将样品洗涤，然后通过将每个样品暴露于吖啶橙下10分钟进行染色。在使用之前将浓度10mg/ml的吖啶橙(得自Molecular probes，名称A3568)用蒸馏水稀释到0.1mg/ml。

将每个经如此染色的底物通过Olympus Model FV-300共焦显微镜(Leeds Precision，Inc，Minnesota)观察。观察到PNC官能化的底物包括与未官能化的对照底物相比更高水平的被染色细菌，表明PNC官能化的底物与未官能化的对照样品相比结合更多的金黄色葡萄球菌。

Claims (51)

1.制品，其包括：

具有第一表面和第二表面的底物；

连接于底物第一表面的磷腈系留基团，磷腈系留基团包括底物第一表面上的官能团与磷腈系留化合物的反应产物。

2.权利要求1的制品，其中底物的第一表面包括类金刚石玻璃。

3.权利要求2的制品，其中类金刚石玻璃包括至少30重量％的碳、至少25重量％的硅、和最多45重量％的氧。

4.权利要求1的制品，其中底物为包括第一层和第二层的多层结构，第一层包括聚合物，第二层包括类金刚石玻璃。

5.权利要求4的制品，其中聚合物包括微孔结构，该微孔结构包括孔径为约80纳米到约0.5微米的孔。

6.权利要求4的制品，其中聚合物包括热致相分离膜，该热致相分离膜包括选自以下的材料：高密度聚乙烯、聚丙烯、聚偏氟乙烯、聚乙烯-乙烯醇共聚物、以及前述两种或多种的组合。

7.权利要求6的制品，其中热致相分离膜包括高密度聚乙烯，该高密度聚乙烯包括多个孔径大小为约0.5微米到0.0229毫米的孔。

8.权利要求7的制品，其中类金刚石玻璃被涂布到热致相分离膜上，类金刚石玻璃延伸进入热致相分离膜的孔中。

9.权利要求1的制品，其中底物为包括第一层、第二层和第三层的多层结构，第一层包括聚合物，第二层包括类金刚石碳，第三层包括固定于类金刚石碳的类金刚石玻璃。

10.权利要求9的制品，其中聚合物为聚酰亚胺。

11.权利要求1的制品，其中底物为包括第一层和第二层的多层结构，第一层包括玻璃，第二层包括固定于玻璃的类金刚石玻璃。

12.权利要求1的制品，其中底物包括金属或金属氧化物。

13.权利要求1的制品，其中底物包括选自以下的金属或金属氧化物：金、银、钛、铂、钯、铝、铜、铬、铁、钴、镍、锌、不锈钢、氧化铟锡、以及前述两种或多种的组合。

14.权利要求12的制品，其中底物另外包括支持金属的载体层。

15.权利要求14的制品，其中载体层包括聚合物。

16.权利要求1的制品，其中磷腈系留化合物包括下式I的结构，

其中每个X可相同或不同，并且包括易受亲核攻击而与包含亲核体的材料结合的反应基团。

17.权利要求16的制品，其中底物的第一表面包括具有能够与式I的X基团反应的互补官能团的类金刚石玻璃。

18.权利要求17的制品，其中互补官能团为式-Si(OR¹)_3-n[(R²)NH₂]_n的氨基硅烷，其中n为0到2的整数，R¹为碳链长度小于5的烷基，R²为碳链长度至少为2的另一个烷基。

19.权利要求17的制品，其中互补官能团为选自3-氨基丙基三乙氧基硅烷、3-氨基三甲氧基硅烷、及其组合的氨基硅烷。

20.权利要求16的制品，其中每个X为氯。

21.权利要求1的制品，其另外包括固定于磷腈系留基团的单官能、双官能、或多官能部分。

22.将包含亲核体的材料固定于底物的方法，该方法包括：

提供磷腈系留化合物；

提供具有能够与磷腈系留化合物反应的官能团的底物；

通过磷腈系留化合物与底物上的官能团反应产生离子键、共价键、或其组合制备连接于底物的磷腈系留基团；和

使连接于底物的磷腈系留基团与包含亲核体的材料反应从而固定包含亲核体的材料。

23.权利要求22的方法，其中提供磷腈系留化合物包括提供下式I的化合物，

其中每个X可相同或不同，并且包括易受亲核攻击而与包含亲核体的材料结合的反应基团。

24.权利要求23的方法，其中每个X为氯。

25.权利要求22的方法，其中提供具有能够与磷腈系留化合物反应的官能团的底物包括提供具有第一表面和第二表面的底物，第一表面由类金刚石玻璃组成。

26.权利要求25的方法，其中类金刚石玻璃包括至少30重量％的碳、至少25重量％的硅、和最多45重量％的氧。

27.权利要求22的方法，其中底物为包括第一层和第二层的多层结构，第一层包括聚合物，第二层包括固定于聚合物的类金刚石玻璃。

28.权利要求27的方法，其中聚合物包括热致相分离膜，该热致相分离膜包括选自以下的材料：高密度聚乙烯、聚丙烯、聚偏氟乙烯、聚乙烯-乙烯醇共聚物、以及前述两种或多种的组合。

29.权利要求28的方法，其中热致相分离膜包括高密度聚乙烯，该高密度聚乙烯具有大量孔径大小为约0.5微米到0.0229毫米的孔。

30.权利要求22的方法，其中底物为包括第一层、第二层和第三层的多层结构，第一层包括聚合物，第二层包括类金刚石碳，第三层包括类金刚石玻璃。

31.权利要求30的方法，其中聚合物为聚酰亚胺。

32.权利要求22的方法，其中底物为包括第一层和第二层的多层结构，第一层包括玻璃，第二层包括固定于玻璃的类金刚石玻璃。

33.权利要求22的方法，其中提供具有能够与磷腈系留化合物反应的互补官能团的底物包括提供具有第一表面和第二表面的底物，第一表面由金属或金属氧化物组成。

34.权利要求22的方法，其中底物包括选自以下的金属或金属氧化物：金、银、钛、铂、钯、铝、铜、铬、铁、钴、镍、锌、不锈钢、氧化铟锡、以及前述两种或多种的组合。

35.权利要求34的方法，其中底物另外包括支持金属的载体层。

36.权利要求35的方法，其中载体层包括聚合物。

37.权利要求22的方法，其中使连接于底物的磷腈系留基团与包含亲核体的材料反应从而固定包含亲核体的材料包括使磷腈系留基团与选自以下的包含亲核体的材料反应：含胺的被分析物、氨基酸、肽、DNA、RNA、蛋白质、酶、细胞器、免疫球蛋白、其片段，以及前述两种或多种的组合。

38.权利要求22的方法，其中使连接于底物的磷腈系留基团与包含亲核体的材料反应从而固定包含亲核体的材料包括使磷腈系留基团与含胺材料反应。

39.权利要求38的方法，其中含胺材料为抗原，并且抗原另外结合于抗体。

40.权利要求39的方法，其中含胺材料为免疫球蛋白。

41.权利要求38的方法，其中含胺材料另外结合于细菌。

42.权利要求41的方法，其中细菌为金黄色葡萄球菌。

43.权利要求22的方法，其中连接于底物的磷腈系留基团另外包括固定于磷腈系留基团的单官能、双官能、或多官能部分。

44.权利要求22的方法，其中连接于底物的磷腈系留基团另外包括固定于底物的第一磷腈，固定于第一磷腈基团的双官能团或多官能团以及固定于双官能团或多官能团的第二磷腈基团，双官能团或多官能团在第一和第二磷腈基团之间形成连接基团。

45.权利要求44的方法，其中使连接于底物的磷腈系留基团与包含亲核体的材料反应从而固定包含亲核体的材料包括使第二磷腈系留基团与包含亲核体的材料反应。

46.权利要求45的方法，其中包含亲核体的材料选自：含胺的被分析物、氨基酸、肽、DNA、RNA、蛋白质、酶、细胞器、免疫球蛋白、其片段、以及前述两种或多种的组合。

47.权利要求45的方法，其中使连接于底物的磷腈系留基团与包含亲核体的材料反应从而固定包含亲核体的材料包括使磷腈系留基团与含胺材料反应。

48.权利要求47的方法，其中含胺材料为抗原，并且抗原另外结合于抗体。

49.权利要求47的方法，其中含胺材料为免疫球蛋白。

50.权利要求47的方法，其中含胺材料另外结合于细菌。

51.权利要求49的方法，其中细菌为金黄色葡萄球菌。