CN1900718A

CN1900718A - 高灵敏度检测微量白蛋白的化学发光方法及其装置

Info

Publication number: CN1900718A
Application number: CN 200610036703
Authority: CN
Inventors: 邢达; 徐未; 周静
Original assignee: South China Normal University
Current assignee: South China Normal University
Priority date: 2006-07-27
Filing date: 2006-07-27
Publication date: 2007-01-24
Anticipated expiration: 2026-07-27
Also published as: CN1900718B

Abstract

本发明提供一种高灵敏度检测微量白蛋白的化学发光方法，包括：化学反应产生稳定的单氧源；单态氧和高选择性、高灵敏度的化学发光探针FCLA反应产生高能量的中间产物，迅速退激发发出光子；微量的白蛋白与FCLA结合后很大地增敏化学发光强度，化学发光增敏的大小与白蛋白的浓度成线性关系；通过发光强度的变化对应白蛋白浓度的改变，从而检测出微量白蛋白。一种实现前述方法的装置，包括暗室、样品池、微量进样器、积分球、化学发光接收组件、电脉冲处理组件、计算机等。本发明所需样品少，装置容易实现，耗时短，成本低，操作简单，灵敏度高，有一定的抗干扰性。

Description

高灵敏度检测微量白蛋白的化学发光方法及其装置

技术领域

本发明涉及检测微量白蛋白的技术，特别涉及一种高灵敏度检测微量白蛋白的化学发光方法及其装置。

背景技术

血清白蛋白(HSA)是血清中含量最多的蛋白，大约占血清蛋白总量的40％～60％。它在药物的运输和维持血液正常渗透压发挥着重要的作用。

目前，分析白蛋白常用的方法有：(1)干试纸带检测法；利用指示剂的蛋白质误差原理(即拽示剂离子因与白蛋白携带电荷相反而结合，故使其反应显示的pH颜色变为较高pH颜色变化，这种pH颜色改变的幅度与白蛋白含量成正比)而建立的。(2)加热乙酸法；加热煮沸使蛋白变性、凝固，然后加酸使PH接近蛋白质等电点(pH4.7)有利于已变性蛋白下沉，同时可消除某些磷酸盐因加热析出所致的混浊。(3)磺基水杨酸法；其基本原理为在略低于蛋白质等电点的pH条件下，蛋白质带有正电荷的氨基与带负电荷的磺基水杨酸根相结合，形成不溶性蛋白质盐而沉淀。这些检测方法虽然简单、药品便宜，但是灵敏度不够、检测线性范围窄，误差较大。而在定量分析检测白蛋白方面主要有以下几种方法：(1)考马斯亮蓝G-250法；考马斯亮蓝G-250溶液可呈现两种颜色，即红色和蓝色：酸性考马斯亮蓝为红色试剂，与蛋白质结合后变成蓝色，与标准液相比，即可测出蛋白质含量；(2)电化学法；利用某种物质在特定的pH条件下有及谱还原峰，加入白蛋白后其峰电位不变而峰电流下降。峰电流下降值同白蛋白的浓度在一定范围内有线性关系；(3)分光光度法；利用与白蛋白形成复合物，而这复合物有特征吸收峰；用特定波长的光激发复合物的得到吸收值；复合物浓度一定范围内服从比尔定律，对比标准溶液吸收值可以算出样品中白蛋白的浓度。(4)免疫化学技术；一定波长的光线通过免疫反应样品时被免疫复合物反射、吸收而减弱，在一定范围内，透射光被吸收的量(A值变化)与复合物量呈正相关，而复合物量与抗原和抗体的量呈函数关系。固定某一物量可从标准曲线得知另一物量。这些方法虽然灵敏度比较高，但是操作比较复杂，所用仪器昂贵，检测成本高。

发明内容

本发明的目的在于针对现有检测方法存在的缺点和不足，提供一种快速、高灵敏、低成本、抗干扰性强的检测微量白蛋白的方法；同时将一种高选择性、高灵敏度检测单态氧(¹O₂)的化学发光探针(海萤荧光素类似物，简称FCLA)巧妙运用来测定白蛋白的浓度。

本发明的另一目的在于提供一种实现上述方便的高灵敏、快捷、抗干扰性强的检测白蛋白的装置。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种高灵敏度检测微量白蛋白的化学发光方法，其特征在于包括下述步骤：

(1)制备稳定单态氧源。

(2)将单态氧迅速与一种对单态氧高选择、高灵敏度的海萤荧光素类似物(FCLA)反应，经过脱羧和质子化形成激发态羰基化合物，随后退激发辐射出特定波长的光子，形成化学发光。

(3)加入白蛋白(HSA)增敏化学发光光强；经过内涂纯硫酸钡(BaSO₄)的积分球将发散到各个方向的化学发光收集起来并均匀化处理；积分球可大大提高化学发光的收集效率。

(4)安放在检测窗的透镜扩大收集角，将积分球均匀化化学发光聚焦到高灵敏度的光电倍增管(PMT)的阴极感光板上，将光信号转换成电信号。

(5)将电信号通过前置放大后将电信号转化成数字信号，由计算机软件处理得出化学发光随时间衰减信号图。

(6)将数字信号输入计算机后由软件统计出化学发光积累量。

所述步骤(1)中稳定单态氧的制备方法可为以下几种：(1)光敏反应；(2)化学反应(过氧化氢与次氯酸盐反应)；(3)生物体系的氧化(超氧阴离子自由基的氧化、过氧化物酶催化H₂O₂的反应、臭氧低温分解、内氧化物的热分解作用、唾液过氧化物产生¹O₂等)。其中化学反应体系相比其它方式具有如下的优点：无需激发光源，避免激发光干扰，能提高信噪比，并且¹O₂的产率高；其中过氧化氢与次氯酸钠生产单态氧的效率几乎为100％。

所述化学反应制备单态氧源中次氯酸钠的浓度优选为5～50mmol/L；所述过氧化氢的浓度优选为1～5mmol/L。

所述海萤荧光素类似物(FCLA)能特异性地检测单态氧(¹O₂)和超氧阴离子，所述海萤荧光素类似物的浓度优选为1～10umol/L；化学发光的波长是522nm。

所述步骤(3)中积分球在可见光区(400～760nm)反射率为0.98～0.99，由积分球原理，散射光在球面上经历无数次反射，不断衰减最终均匀化，也就是说球面上的每点光强是相等的。由公式

E = \frac{Φ}{4 π R^{2}} \cdot \frac{ρ}{1 - ρ}

知道检测窗的光强可以推算出整个反应的发光强度。

所述步骤(5)中处理数据反应光强时只需求5秒内的化学发光积累量；因为反应速度相当快，单态氧相当快就衰减完。

一种实现上述方法的高灵敏度检测微量白蛋白化学发光装置，包括暗室、样品池、微量进样器、积分球、化学发光接收组件、电脉冲处理组件、计算机，所述样品池、微量进样器、积分球、化学发光接收组件设置于暗室内，化学发光接收组件、电脉冲处理组件依次与计算机连接；微量进样器悬在样品池上；样品池固定在积分球球壁上。

所述化学发光接收组件包括透镜、光电倍增管，所述透镜通过光纤与光电倍增管相连接；透镜增大化学发光的收集角，将光会聚后由光纤输入光电倍增管。因为化学发光比较弱并且时间短，所以所用的接收组件必须是高灵敏、低噪音、能快速响应的。

所述电脉冲处理组件包括前置放大器、计数卡，前置放大器与计数卡相连接。

所述计算机处理软件可采用National Instruments公司开发的Labview软件。

本发明的作用原理是：化学反应体系产生稳定的单态氧，单态氧寿命极短(十几微秒)；单态氧迅速被选择性的与高灵敏度发光探针捕获，化学反应通过脱羧和质子化形成激发态羰基化合物、随后退激发辐射出特定波长的光子；光子经超微弱高灵敏度的光电倍增管转换成数字信号反映到计算机上；控制温度、pH值等条件加入一定量的白蛋白，从计算机软件统计上可以明显知道白蛋白提高化学发光；化学发光增敏的程度在一定范围内与白蛋白的浓度成线性关系。

分析FCLA与HSA的吸收光谱发现，当两者混合后FCLA的吸收峰有5nm的红移；HSA在279nm光激发下337nm处出现荧光峰，加入FCLA后荧光强度下降，并且随着FCLA浓度的增加HSA荧光强度不断下降。我们分析了FCLA淬灭HSA的机制是属于静态淬灭，利用Forster能量转移理论，可以计算出FCLA与HSA的结合距离以及结合位点的数目。这些都说明FCLA与HSA存在分子间的缔合。缔合后存在分子内的能量转移。HSA与单态氧反应后生成蛋白羰基，其激发态能在分子内转移给FCLA。这样就有两个FCLA介入的化学发光过程。一个是FCLA与单态氧反应的化学发光过程。FCLA+¹O₂.FCLA＝O^*.FCLA＝O+h.′，FCLA与单态氧反应后化学结构会发生改变。另一个发光过程是激发态FCLA退激发的过程，可以不断的产生光子。两个反应累加大大增强了化学发光。

本发明与现有技术相比具有如下的优点及有益效果：

(1)灵敏度高、检测速度快：本发明运用一种高灵敏度的化学发光探针FCLA与单态氧反应化学发光，极微量的白蛋白都能够提高发光强度，从数值信号的统计上可以明显检测出。这比观测颜色变化、吸收值变化以及电流变化都要灵敏多；同时，控制实验处于最适条件下(温度、pH值、反应浓度等)，反应物混合均匀迅速化学反应生成单态氧，而FCLA能高灵敏地检测单态氧，但单态氧寿命极短，检测时间也就5秒左右；白蛋白增敏化学发光也处于FCLA检测单态氧的过程，故检测白蛋白速度快，时间为5秒左右，这与其他方法(荧光光谱法、甲苯酚蓝等需要十几分钟)相比迅速得多。

(2)低成本：本发明所采用的装置结构简单，生产装配较为容易，造价相对较低；在操作过程中使用的药品用量少，操作使用方便，整体成本较为低廉。

(3)利用本发明检测微量白蛋白具有一定的抗干扰性，为以后生产实践中高灵敏地检测白蛋白提供一种有益的借鉴。

附图说明

图1是本发明高灵敏度检测微量白蛋白化学发光装置的结构示意图。

图2是FCLA-HSA体系中由Labview统计的实时化学发光信号衰减图。

图3是有无白蛋白条件下化学发光强度比较图。

图4是微量白蛋白浓度与增敏化学发光强度柱状关系图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例

图1示出了本发明装置的具体结构，由图1可见，本高灵敏度检测微量白蛋白化学发光装置包括：暗室1、透明超薄样品池2、微量进样器3、积分球4、化学发光接收组件、电脉冲处理组件、计算机10、电源11、光电倍增管的稳压器12；所述透明超薄样品池2、微量进样器3、积分球4、化学发光接收组件设置于暗室内，化学发光接收组件、电脉冲处理组件依次与计算机10连接；微量进样器3悬在样品池2上；样品池2固定在积分球4球壁上；化学发光接收组件、计算机10与电源11连接。所述化学发光接收组件包括透镜5、光电倍增管6、光纤7，所述透镜5通过光纤7与光电倍增管6相连接；所述透镜5可选用8mm凸透镜，所述光纤7可选用8mm光纤；所述电脉冲处理组件包括前置放大器8、计数卡9，前置放大器8与计数卡9相连接；所述计数卡9选用ADVANTECH PCL-836；积分球4是向上海亿奥光学科技有限公司定做的；球体直径150mm，球壁开2个窗口(两个窗口呈直角，一个窗口为放置样品池的，另外一个为检测窗口)，样品窗开口直径8mm，检测窗直径为8.5mm。计算机10选用Intel公司的Pentium III型微机。

利用上述装置实现的高灵敏度检测微量白蛋白的化学发光方法具体操作如下：在室温(25℃)条件下，并在黑暗环境中将pH7.4的磷酸缓冲液(PBS)660uL、50umol/LHSA 10uL、100umol/L FCLA 30uL、浓度为100umol/L的NaClO 100uL按顺序加入透明超薄样品池2中，用微量进样器注射浓度为10umol/L的H₂O₂ 200uL，迅速打开PMT模块检测化学发光，计算机的软件程序开始计数化学发光强度，得到如图2所示的实时化学发光信号衰减图。

将pH7.4的磷酸缓冲液体积660uL、浓度为100umol/L的NaClO 100uL、，100umol/L FCLA 30uL、10umol/L的H₂O₂ 200uL，其它实验条件不变，分别不加入白蛋白和加入50umol/L白蛋白10uL，每次实验重复3次统计的化学发光强度(选取前5秒计数值的积累量)，取平均值，得出存在白蛋白和不存在白蛋白条件下化学发光强度的积累量如图3。

改变HSA的浓度分别选用0umol/L、0.01umol/L、0.03umol/L、0.05umol/L，0.08umol/L，其它实验条件不变，每个实验样重复3次取实验结果(选取统计结果前100个点的数据积累)的平均值，测得化学发光强度减去无HSA发光强度与白蛋白浓度的柱状关系图4。

操作结果分析：

(1)由图2所示FCLA-HSA体系中检测到实时化学发光信号衰减图可看出：次氯酸钠和过氧化氢的化学反应非常迅速，单态氧寿命极短，但FCLA能灵敏探测到单态氧。从图2中看出，化学发光收集的有效数据也就是前100个点，其后化学发光迅速衰减到本底。

(2)图3是有无白蛋白条件下化学发光强度比较图；可以看出加入0.05umol/L的白蛋白能够明显提高化学发光强度。

(3)图4是微量白蛋白浓度与增敏化学发光强度柱状关系图。根据图4可明显知道在一定范围随着白蛋白浓度的增加，化学发光强度不断增加；并且0.01umol/L白蛋白与无白蛋白化学发光相比一定的差别，这暗示提高灵敏度还有大的空间，将数据作线性拟合线性关系良好，相关系数为0.978。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1、一种高灵敏度检测微量白蛋白的化学发光方法，其特征在于包括下述步骤：

(1)制备稳定单态氧源；

(2)将单态氧迅速与海萤荧光素类似物反应，经过脱羧和质子化形成激发态羰基化合物，随后退激发辐射出特定波长的光子，形成化学发光；

(3)加入白蛋白增敏化学发光光强；经过内涂纯硫酸钡(BaSO₄)的积分球将发散到各个方向的化学发光收集起来并均匀化处理；

(4)安放在检测窗的透镜扩大收集角，将积分球均匀化化学发光聚焦到高灵敏度的光电倍增管(PMT)的阴极感光板上，将光信号转换成电信号；

(5)将电信号通过前置放大后将电信号转化成数字信号，由计算机软件处理得出化学发光随时间衰减信号图；

(6)将数字信号输入计算机后由软件统计出化学发光积累量。

2、根据权利要求1所述的高灵敏度检测微量白蛋白的化学发光方法，其特征在于：所述步骤(1)中稳定单态氧的制备方法为以下几种：(1)光敏反应；(2)化学反应；(3)生物体系的氧化。

3、根据权利要求2所述的高灵敏度检测微量白蛋白的化学发光方法，其特征在于：所述化学反应为过氧化氢与次氯酸盐反应或过氧化氢与腈反应。

4、根据权利要求3所述的高灵敏度检测微量白蛋白的化学发光方法，其特征在于：所述次氯酸钠的浓度为5～50mmol/L；所述过氧化氢的浓度为1～5mmol/L。

5、根据权利要求1所述的高灵敏度检测微量白蛋白的化学发光方法，其特征在于：所述海萤荧光素类似物检测单态氧和超氧阴离子，所述海萤荧光素类似物的浓度为1～10umol/L；化学发光的波长是522nm。

6、根据权利要求1所述的高灵敏度检测微量白蛋白的化学发光方法，其特征在于：所述步骤(3)中积分球在可见光区反射率为0.98～0.99，收集所有的散射光子并将其均匀化。

7、根据权利要求1所述的高灵敏度检测微量白蛋白的化学发光方法，其特征在于：所述步骤(5)中处理数据反应光强时只求5秒内的化学发光积累量。

8、一种实现权利要求1～7任一项所述方法的高灵敏度检测微量白蛋白化学发光装置，其特征在于：包括暗室、样品池、微量进样器、积分球、化学发光接收组件、电脉冲处理组件、计算机，所述样品池、微量进样器、积分球、化学发光接收组件设置于暗室内，化学发光接收组件、电脉冲处理组件依次与计算机连接；微量进样器悬在样品池上；样品池固定在积分球球壁上。

9、根据权利要求8所述的高灵敏度检测微量白蛋白化学发光装置，其特征在于：所述化学发光接收组件包括透镜、光电倍增管，所述透镜通过光纤与光电倍增管相连接；透镜增大化学发光的收集角，将光会聚后由光纤输入光电倍增管。

10、根据权利要求8所述的高灵敏度检测微量白蛋白化学发光装置，其特征在于：所述电脉冲处理组件包括前置放大器、计数卡，前置放大器与计数卡相连接。