CN1899313B - 露蜂房在制备治疗子宫内膜异位症药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了露蜂房在制备治疗子宫内膜异位症药物中的应用。动物实验证明，露蜂房对子宫内膜异位症具有明显的治疗作用，更重要的是露蜂房与danazol(丹那唑)相比，具有无可比拟的安全性。露蜂房效果比较好，基本不会造成不良影响，因而具有治疗子宫内膜异位症的前景。

Description

露蜂房在制备治疗子宫内膜异位症药物中的应用

技术领域

本发明涉及露蜂房的新用途，尤其涉及露蜂房在制备治疗子宫内膜异位症药物中的应用。

背景技术

子宫内膜异位症(endometriosis)是指有功能的子宫内膜出现于子宫腔内壁以外的部位。它引起的继发性痛经、不孕、慢性盆腔痛等症状严重影响患者的生活质量。尽管子宫内膜异位症为妇科良性疾病，但它具有侵袭性、广泛种植、易复发的特征，与恶性肿瘤十分相似。子宫内膜异位症是育龄妇女的一个常见病和多发病，发病率高达15％，并且发病率呈逐年上升趋势。虽然子宫内膜异位症的发现已有100多年的历史，并且多年来对子宫内膜异位症的发病机理进行了深入广泛的研究，但其确切的发病机理还不十分清楚。由于病因不明，目前治疗方法有多种，尚无一种药物能达到根治效果。因此，积极探索有效的治疗方法具有十分重要的意义。

临床和实验研究证实，子宫内膜异位症是激素依赖性疾病。子宫内膜异位症患者初潮前无发病，绝经后异位的内膜可逐渐萎缩被吸收，如使用雌激素替代疗法，此病还会复发。而切除卵巢或服用danozol使机体处于低雌激素状态，病灶可明显缩小，疗程结束后随着体内雌激素水平的恢复，有的病人也会复发。可见子宫内膜异位症是雌激素依赖性疾病。异位内膜可随卵巢周期性变化而出现周期性增生、分泌变化，但变化不一定与子宫腔内膜变化同步；卵巢雌/孕激素的周期性分泌，对异位内膜和在位内膜起同样的作用，但雌二醇可能起主导作用，特别是中期的雌二醇峰在刺激子宫内膜增厚的同时，也可刺激异位的内膜生长。因此子宫内膜异位症的激素治疗一般采用假孕疗法和假绝经疗法，能够取得一定的疗效。但由于此二醇水平的降低，导致患者出现类似更年期样的改变，带来了比较明显的副作用。同时此类药物价格昂贵，且长期服用导致肝功能损害，停药后又易复发，这些缺点限制了这些药物的应用。

露蜂房为胡蜂科昆虫大黄蜂Polistes mandarinus Saussure的巢，许多文献及中药大辞典、中华人民共和国药典等对露蜂房的特性均有详细的报道，露蜂房具有攻毒杀虫作用，目前临床上用于乳腺小叶增生，取得了良好的疗效。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是公开露蜂房在制备治疗子宫内膜异位症药物中的应用，拓展露蜂房的应用领域。

发明人发现，露蜂房对子宫内膜异位症具有显著的治疗作用，可以用于制备治疗子宫内膜异位症药物。发明人同时发现，露蜂房对子宫内膜异位症具有明显的治疗作用，动物实验证明，露蜂房在安全使用范围内(3.6g/kg体重天)，动物的行为也没有任何异常；虽连续大量服用，临床上亦未发现任何副作用及毒性反应。

所说的露蜂房，采用市售的露蜂房中药饮片。

可以将露蜂房按照常规的中药煎煮方法制成水煎剂，以水煎剂的形式，施加于需要治疗的对象，一般成人(60kg)的用量为6～12g/次天，具体可根据患者的年龄、病情等进行变化，可以通过口服的形式施加于需要这种治疗的对象。

动物实验证明，露蜂房对子宫内膜异位症具有明显的治疗作用，更重要的是露蜂房与danazol相比，具有无可比拟的安全性。效果比较好，基本不会造成不良影响。因而露蜂房具有治疗子宫内膜异位症的前景。

为了更好地理解本发明的实质，以下将用露蜂房的药理实验及其结果来说明其在制药领域中的新用途。

具体实施方式

实施例1

水煎剂：

取75.6g露蜂房，洗净，放入煎药锅中，加水至高出药5cm，先浸泡半小时，煮沸后，再煎煮半小时，取汁，然后再按上述方法分别煎煮2次，取汁。将3次的药汁混合，装瓶制成成品，此剂量药液为15只大鼠一周的用量。

实施例2

1材料：

1.1实验动物：

健康、性成熟未交配的SD雌性大鼠60只，鼠龄70d-80d，每只大鼠体重160-180g。大鼠由复旦大学医学院动物中心提供，由本院动物实验中心动物房，采用12h明12h暗交替饲养。

1.2主要器材：

Forma725型-80℃低温冰箱(美国)，BCD-248普通冰箱(上冻青岛海尔集团)，Olympus PM-10AD型显微镜(日本OLYMPUS公司)，高速低温离心机(德国Hereaus公司)，Access全自动微粒化学发光分析仪(美国贝克曼库尔特公司)，Array 360特定蛋白分析仪(美国贝克曼库尔特公司)，匀浆器，湿盒，恒温温箱，浸蜡箱，包埋箱，切片机，烘箱等。

1.3主要试剂：

细胞色素芳香化酶P450单克隆抗体(购自北京中山生物工程公司)，雌激素受体α单克隆抗体(购自Santa Cruz公司)，兔二抗(购自日本NICHIREI公司)；danazol(上海华联制药有限公司，100mg/粒)，TES缓冲液，全自动微粒子化学发光免疫分析仪(美国)，DAB，Tris(PH7.6)，1％盐酸，PBS缓冲液，10％福尔马林，甲醇，乙醇，脱钙剂，二甲苯，石蜡，苏木素-伊红(HE)染色剂等。

1.4方法：

1.4.1子宫内膜异位症模型的建立：

子宫内膜异位症模型根据(俞超芹，刘玉环，彭新萍，等.内异方对子宫内膜异位症IL-6、IL-10的调节作用.第二军医大学学报，1999，20(9)：621)文献公开的俞超芹等方法制作：2％戊巴比妥钠0.3ml腹腔麻醉，开腹找到子宫，剪下右侧子宫长约3cm，行两端结扎包埋术，剥离剪下的子宫内膜，切成3块4mm×4mm大小的内膜片段，用4/0肠线分别固定于对侧子宫的中段、Y型分叉处和卵巢附近。另设假手术组，即按上述方法剪下右侧子宫长约3cm，行端端结扎包埋术，将3块4mm×4mm大小的自体脂肪用4/0无损伤缝线分别固定于对侧子宫的中段、Y型分叉处和卵巢附近。4周后麻醉剖腹探查，见移植的内膜组织体积增大，呈透明结节状、囊状，出现澄清液体集聚，被结缔组织覆盖并有血管形成。

1.4.2分组处理：

将模型大鼠随机分为3组：

1)非治疗组：双蒸水灌胃，每日2ml/只；

2)danazol组：灌胃，每日400mg/kg，共4周；

3)露蜂房组：实施例1的水煎剂灌胃，每日3.6g/kg，共4周；

另外，假手术组：双蒸水灌胃，每日2ml/只；

以上4组均在同等条件下饲养4周。在饲养过程中丢失6只大鼠，病死3只，灌胃不当死亡1只，故实验结束时余74只大鼠。

2观察指标与方法：

2.1子宫系数、卵巢系数、异位灶重量以及处理组对异位灶的抑制率：

1)子宫系数＝子宫湿重mg/体重kg

2)卵巢系数＝卵巢湿重mg/体重kg

3)异位灶生长抑制率＝(非治疗组平均异位灶重量-治疗组平均异位灶重量)/非治疗组平均异位灶重量×100％

2.2肝、肾、骨骼以及子宫内膜、卵巢、异位内膜组织的病理形态学：

2.2.1取材和处理：

根据阴道涂片，分别于治疗结束动情前期断头处死。

1)立即取部分肝、肾、卵巢、子宫内膜、异位内膜组织，用10％福尔马林固定。

2)另取部分卵巢、子宫内膜、异位内膜组织立即冻存于-80℃低温冰箱中。

3)用脱钙剂将骨骼脱钙48小时后，自来水冲洗2小时，再次置入10％福尔马林中固定。

2.2.2石蜡标本制备：

将10％福尔马林固定的肝、肾、骨骼、卵巢、子宫内膜、异位内膜组织制成病理切片(第二军医大学附属长海医院病理科协助完成)。

1)第一步：脱水：将组织置于70％乙醇浸泡30分钟，然后置于90％乙醇浸泡30分钟，其次置于95％乙醇浸泡30分钟，再次置于95％乙醇浸泡30分钟，最后置于100％乙醇浸泡30分钟。

2)第二步：透明：将脱水后的标本置于二甲苯浸泡30分钟，重复两次，直至肉眼观察组织呈透明状，完成透明。

3)第三步：浸蜡：将透明后的标本放入石蜡，再置于浸蜡箱，温度调至56～58℃进行浸蜡处理30分钟，重复三次，完成浸蜡。

4)第四步：包埋：将浸蜡处理过的组织取出放入充满熔融石蜡的包埋框，使其冷却从而形成铸块，完成包埋。

5)第五步：切片：用AO切片机将铸块切成5微米的切片。

2.2.3苏木素-伊红染色：

1)将切片脱蜡至水。

2)甲醇固定15分钟。

3)95％乙醇处理30秒。

4)自来水30秒。

5)苏木素染液染色5分钟。

6)自来水2分钟。

7)75％盐酸乙醇溶液分化30秒。

8)自来水2分钟。

9)温热水(50℃)5分钟。

10)单蒸水1分钟。

11)95％乙醇溶液1分钟。

12)酸化伊红乙醇2分钟。

13)95％酒精和纯酒精脱水各2次，每次2分钟。

14)二甲苯透明10秒。

15)中性树胶封片，完成封固。

16)干燥后镜下观察，随机挑选视野，拍照。

2.3血清磷、钙含量测定：

2.3.1取材：

断头后立即用不抗凝试管收集血液，室温静置2小时后，3000r/分钟离心15分钟，取血清。

2.3.2实验方法

用偶氮砷III比色自动生化分析仪测定血清钙的含量，用紫外分光光度自动生化分析仪测定血清磷的含量(长海医院检验科协助完成)。

2.4卵巢、子宫内膜、异位子宫内膜与血清雌二醇水平测定：

2.4.1取材：

取卵巢、子宫内膜与异位内膜组织标本，称重，将组织剪碎，加入冰TES缓冲液1ml，4℃冰浴45s，4℃条件下105000g/分钟离心60分钟，分别吸取上清液，置低温下待侧。

2.4.2实验方法：

用全自动微粒子化学发光免疫分析法检测血清、子宫、卵巢和异位灶中雌二醇的水平(中国科学院上海药物研究所协助完成)。

2.6统计学处理：用SPSS11.0统计软件进行统计。

计量资料采用单因素方差分析。

结果

1子宫系数、卵巢系数、异位灶重量以及处理组对异位灶的抑制率：

表1各组子宫系数、卵巢系数及异位灶湿重

(x±s)

                      子宫系数         卵巢系数        异位灶质量

组别        动物数n

                      mg/g体重         mg/g体重         g

非治疗组    11        1.204±0.490     0.401±0.069     0.061±0.049

假手术组    10        1.255±0.219     0.395±0.129     /

Danazol组   11        1.472±0.473     0.411±0.130     0.022±0.020^＊

露蜂房组    14        1.174±0.354     0.356±0.108     0.024±0.023^＊

与非治疗组相比，＊P＜0.05

检验结果提示：露蜂房治疗组、丹那唑治疗组异位内膜组织质量分别显著低于非治疗组(P＜0.001)，露蜂房治疗组与丹那唑治疗组之间无显著差异。露蜂房治疗组、丹那唑治疗组、假手术组及非治疗组子宫系数和卵巢系数之间的差异均无统计学意义。

2血清、子宫、卵巢及异位症中雌二醇的含量：

表2各组血清、子宫内膜、卵巢和异位灶中雌二醇(E₂)水平

(x±s，pg/ml)

组别        动物数n    血清              子宫内膜         卵巢              异位灶

非治疗组    6          31.167±7.834     7.862±3.628*    7.729±3.557      29.345±14.615

假手术组    6          20.833±4.916     8.764±9.017     7.737±5.915      /

Danazol组   6          19.167±3.971

                                         6.273±3.705     1.325±1.531^▲    11.282±5.100^△

                        ^△

露蜂房组    6          16.50...0±1.643

                                         5.639±2.053     0.775±1.222^#▲   15.160±6.252^△

                       ^△

与非治疗组相比，△P＜0.05  与非治疗组相比，#P＜0.001；与假手术组相比，▲P＜0.01；与非治疗组子宫内膜相比，*P＜0.01

检验结果提示：从表2中可以看出，非治疗组血清中E₂含量显著高于假手术组(P＜0.001)；露蜂房治疗组的血清E₂水平下降，且与假手术组相比无统计学意义；非治疗组、假手术组、露蜂房治疗组与丹那唑治疗组子宫内膜中E₂水平之间差异无统计学意义，非治疗组中异位灶E₂水平明显高于子宫内膜E₂水平；非治疗组与假手术组之间卵巢E₂水平无明显差异，露蜂房治疗组的卵巢E₂水平显著下降(P＜0.001)，也明显低于丹那唑组；露蜂房治疗组、丹那唑治疗组异位灶中E₂水平明显低于非治疗组(P＜0.05)。

3各组子宫内膜及卵巢组织形态学：

3.1卵巢组织形态：

1)假手术组：镜下见多个黄体及不同发育阶段的卵泡，颗粒细胞呈多层(多为6~8层)，形态完整、排列整齐，卵泡膜细胞呈梭形排列。

2)露蜂房组：卵巢形态均无明显改变，与假手术组基本相似。

3)非治疗组：卵巢形态均无明显改变，与假手术组基本相似。

4)danazol组：卵巢形态均无明显改变，与假手术组基本相似。

3.2在位子宫内膜组织形态：

1)假手术组：在位内膜上皮细胞形态规则，呈正常高柱状，内膜腺体数量较多，腺上皮细胞和间质细胞形态规则。

2)露蜂房组：子宫内膜腺上皮出现空泡与细胞残迹；。

3)非治疗组：内膜上皮细胞层次较乱，上皮增生，内膜腺体、腺上皮细胞以及间质细胞基本没改变。

4)danazol组：在位内膜上皮细胞呈扁平立方形，并且出现了较多的上皮细胞残迹，内膜腺体数量少，间质细胞少，内膜上皮较薄。

3.3异位子宫内膜组织形态：

1)非治疗组：异位内膜上皮细胞形态规则，呈正常高柱状，内膜腺体较多，但直径较小，间质细胞较多。

2)露蜂房组：异位内膜上皮细胞萎缩，出现了较多的上皮细胞残迹，空泡较多，内膜腺体非常少，间质细胞也较少。

3)danazol组：异位内膜上皮细胞呈扁平立方形，并且出现了较多的上皮细胞残迹，内膜腺体少，间质细胞较少，并出现了许多空泡。

4肝、肾和骨骼病理形态学：

4.1肝脏：

1)假手术组：小叶结构完好，肝窦清晰，肝细胞呈放射性排列，大小均匀，单核，核浆比例正常，胆管上皮细胞呈立方型。

2)露蜂房组：与假手术组基本相似。

3)非治疗组：与假手术组基本相似。

4)danazol组：肝细胞脂肪样变性，胞浆透明度增加，细胞胞浆不清，部分细胞核崩解，肝板破坏，汇管区增粗。

4.2肾脏：

1)假手术组：肾盂上皮细胞呈假复层(适合功能要求)，上皮完整。

2)露蜂房组、非治疗组以及danazol组与假手术组肾脏形态无明显改变。

4.3骨骼：

1)假手术组：骨小梁粗壮，排列整齐并连接成网，间隙较小，形态结构完整，骨小梁密度、面积正常，无减少。

2)露蜂房组：与假手术组基本相似。

3)非治疗组：与假手术组基本相似。

6)danazol组：骨小梁稍细，排列尚整齐并连接成网，部分区域骨小梁间隙略增大，骨小梁密度、面积无明显减少。

5血清磷、钙含量：

表3血清磷、钙含量

(x±s，n＝6，mmol/ml)

组别        血清磷          血清钙

非治疗组    2.157±0.196    2.198±0.190

假手术组    2.183±0.140    2.282±0.175

danazol组   2.075±0.135    2.127±0.287

露蜂房组    2.178±0.580    2.212±0.150

检验结果提示：露蜂房组与其它各组之间的血清磷含量均无显著差异(P＞0.05)。露蜂房组、danazol组、假手术组以及非治疗组之间血清钙含量均无显著差异(P＞0.05)。

讨论

1异位灶的E2水平

据研究发现，子宫内膜异位症异位灶的E2水平明显增高，其增高途径有以下几种：(1)异位内膜的基质细胞经cAMP类似物孵育后，可表现出相当高的芳香酶的活性，睾酮向E₂的转化增强；(2)子宫内膜异位灶中存在17β-HSDHI型，缺乏17β-HSDHII型，使E₂的转化增加，灭活减少，导致局部E₂水平明显增高；(3)雌激素激活环氧化酶-2，促进花生四烯酸向PCE₂的转化，子宫内膜异位症高浓度的E₂和PCE₂形成了一个正反馈环，使增殖期和分泌期均有细胞色素芳香化酶P450的强表达，促进异位病灶的种植生长。本实验中的非治疗组异位灶E₂水平明显增高，从侧面验证了以上观点。

2露蜂房治疗子宫内膜异位症的疗效及机理：

子宫内膜异位症大鼠用露蜂房治疗4周后，移植物体积缩小，内膜呈萎缩状态。有部分移植物甚至消失。

露蜂房治疗组的血清和卵巢E2的水平显著下降，远远低于非治疗组；而露蜂房组异位灶E₂水平也明显低于非治疗组E₂水平，提示了露蜂房对卵巢功能可能具有抑制作用，降低了血清E₂的水平，从而抑制了雌激素对雌激素受体、孕激素受体合成的正向调节作用；同时，露蜂房也有可能通过降低芳香酶的活性，抑制睾酮转化为E₂，或者抑制雄烯二酮转化为雌酮，从而减少了异位灶局部的E₂的水平，使异位灶逐渐地萎缩。再者，露蜂房也有可能通过抑制异位灶的自分泌作用，抑制了17β-HSDHI型的活性，减少了雌酮向E₂的转变，从而降低了异位灶的E₂水平，造成低性激素状态，使异位内膜失去激素的支持，导致异位内膜萎缩。

但是露蜂房通过何种途径抑制异位灶的种植生长，是否还存在其它的抑制途径，仍有待于我们进一步的研究。

5露蜂房治疗子宫内膜异位症的副作用：

露蜂房能够有效地治疗子宫内膜异位症，但它是否有一定的副作用呢？对此，我们做了以下的研究：(1)卵巢。组织病理学观察：卵巢形态学基本无改变；而卵巢系数也与假手术组没有明显差别，提示了露蜂房对卵巢没有明显毒性作用。(2)子宫及子宫内膜。与假手术组相比，虽然露蜂房组子宫系数无明显改变，但是子宫内膜粘膜上皮出现空泡、残迹，这种粘膜状态表明激素水平比较低。这些现象与经丹那唑治疗后子宫内膜的改变基本相似。提示了露蜂房对子宫内膜具有一定的不良影响。(3)肝肾。组织形态学观察：未发现露蜂房对肝肾有不良影响。(4)骨骼：临床与实验研究均已证实，内源性雌激素水平的降低可导致骨质疏松的发生，而本实验结果提示，未发现中露蜂房对骨骼产生不良的影响：骨小梁粗壮，排列整齐并连接成网，间隙较小，形态结构完整，骨小梁密度，面积正常，无减少。为了进一步了解露蜂房对骨骼的影响情况，我们又对血清磷和血清钙的测定，发现露蜂房组血清钙、磷的含量与danazol组、假手术组以及非治疗组相比无明显变化。而danazol是一种17α乙炔睾丸酮的衍生物，它通过对垂体促性腺激素的抑制，使FSH、LH水平下降，或直接抑制产生卵巢类固醇的酶，抑制卵巢类固醇的产生，造成持续性卵巢功能低落，也会导致内源性雌激素水平的降低，进一步引发血清钙的减少。

总之，露蜂房虽然对正常的子宫内膜产生了一定的影响，但其能够有效地治疗子宫内膜异位症。

Claims (1)

1.露蜂房作为唯一活性成分在制备治疗子宫内膜异位症药物中的应用。