CN1898565A - 测量分析物浓度的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包括至少一个功能周质结合蛋白、至少一个标记部分和至少一个荧光蛋白的融合蛋白。一实施方案中，周质结合蛋白是功能葡萄糖－半乳糖结合蛋白(GGBP)。本发明还涉及定量细胞或组织中分析物例如葡萄糖的方法，包括将含有荧光周质结合融合蛋白部分的组合物给予细胞或组织，并测量荧光周质结合融合蛋白的荧光。

Description

测量分析物浓度的组合物和方法
                     发明背景
发明领域
本发明涉及包含至少一个功能周质结合蛋白、至少一个标记部分和至少一个荧光蛋白的融合蛋白。一实施方案中，周质结合蛋白是功能葡萄糖-半乳糖结合蛋白(GGBP)。本发明还涉及定量细胞、组织或生物流体中分析物例如葡萄糖的方法，包括将含有荧光周质结合融合蛋白部分的组合物给予细胞或组织，并测量荧光周质结合融合蛋白的荧光。
发明背景
监控葡萄糖浓度来帮助糖尿病患者适当的代谢控制是所希望的目标并将提高许多个体的生活。通常，大多数糖尿病患者使用“手指棒”方法来监控他们的血糖水平，但由于频繁刺戳(即，每天几次)引起的疼痛，患者的并发症是个问题。因此，已经努力来发展非侵入性或最小侵入性的体内方法和更有效的体外方法来用于频繁和/或连续监控血糖或其他含有葡萄糖的生物流体。这些方法中最有前景的一些涉及生物传感器的使用。生物传感器是使用结合转换(检测)元件的生物识别元件能够提供特定定量或半定量分析信息的装置。
生物传感器的生物识别元件测定特异性，以致只有测量的化合物形成信号。选择可以基于其中配体(例如，葡萄糖)化学结构未改变的配体生化识别，或基于其中元件催化分析物生化反应的生物催化。
然后转换器将生物识别元件的识别转化成半定量或定量信号。可能的转换器技术是光学、电化学、声学/机械或比色。已经采用的光学特性包括吸光度、荧光/磷光、生物/化学发光、反射率、光散射和折射率。可以使用常规报告基团或标记部分如荧光化合物，或者，存在直接光学检测的机会，不需要标记。
特意为葡萄糖检测设计的使用信号转换生物元件的生物传感器通常使用检测葡萄糖氧化酶活性的电化学或比色方式。该方法与以下困难相关，包括氧含量的影响、血液中的抑制剂和电极的问题。此外，检测导致分析物消耗，当测量低葡萄糖浓度时这可能引起困难。
生物传感器发展的快速进展领域是使用荧光标记的周质结合蛋白(PBP)。为了快速测定生物溶液如血液、组织液、眼溶液或汗液等的葡萄糖浓度，理想的是调节生物传感器的感觉分子的结合常数使其与目标生物溶液的生理和/或病理操作范围相匹配。没有合适的结合常数，信号将在特定生理和/或病理浓度的范围之外。此外，使用多于一种蛋白质，每种具有不同的结合常数，来配置生物传感器以提供宽范围葡萄糖浓度的快速测量(参见，例如，Lakowicz的U.S.专利No.6,197,534)。
尽管突变PBP的有用性，但这些蛋白中的没有几个得到设计并测定，用或不用报告基团。位点的特定突变和/或特定报告基团的连接可以用来以不可预测的方式改变结合常数。此外，含有报告基团的生物传感器可能具有理想的结合常数，但在分析物结合时没有形成容易检测的信号。一些决定连接检测特定分析物的特定蛋白的特定报告探针灵敏度的基本因素是选定探针和蛋白质氨基酸残基之间特定相互作用的性质。目前不可能有效地预测怎样使用现有的计算方法合并这些影响蛋白功能的相互作用。还不可能的是使用合理设计方法来最佳化报告探针的选择。实际上，报告基团对结合常数或结合蛋白特异性的影响是不可预测的。
因此，本领域需要设计另外有用的标记突变周质结合蛋白，该蛋白能够产生快速测量的信号来测定样品中分析物的水平，样品包括患者的血液或组织液。
                      发明概述
本发明涉及包括至少一个功能周质结合蛋白、至少一个标记部分和至少一个荧光蛋白的融合蛋白。一实施方案中，周质结合蛋白是功能葡萄糖-半乳糖结合蛋白(GGBP)。本发明还涉及定量细胞、组织或生物流体中分析物例如葡萄糖的方法，包括将含有荧光周质结合融合蛋白部分的组合物给予细胞或组织，并测量荧光周质结合融合蛋白的荧光。
                    附图简述
图1描绘了DsRed2和GGBP融合蛋白构建体的表示和当结合葡萄糖时GGBP发生的构象改变的表示。
图2描绘了DsRed2/GGBP四聚物。
图3描绘了没有标记部分的融合蛋白、具有标记部分的融合蛋白和具有结合葡萄糖的标记部分的融合蛋白的荧光发射光谱。
图4描绘了DsRed2(C119A)GGBP(L238C)-acrylodan和DsRed2(C119A)GGBP(E149C，L238C)-acrylodan与配体葡萄糖的结合曲线。证明每个融合蛋白各自的葡萄糖亲和性为1mM和5.7μM。
图5描绘了DsRed2(C119A)GGBP(L238C)-acrylodan与葡萄糖的结合曲线。该结合曲线是从acrylodan发射对DsRed2发射的比例来作图。证明融合蛋白的葡萄糖亲和性为4μM。
                        发明详述
本发明涉及定量样品中分析物的方法，该方法包括将融合蛋白给予样品并测量荧光的水平。测得的发光强度与样品中分析物的量相关。本发明方法中所用的融合蛋白包含与至少一个荧光蛋白融合的功能周质结合蛋白(PBP)，和至少一个标记部分。
通过功能周质结合蛋白结合分析物时经受的构象改变来进行分析物的检测。该构象改变随后将改变连接功能PBP的荧光蛋白和标记部分相互的相对位置。该相对位置的改变使得能量从供体分子(荧光蛋白或标记部分)转移至受体分子(标记部分或荧光蛋白)，然后通过信号例如荧光来检测。测得的荧光值可以是强度或生存期。因此，荧光测量可以与测量分析物的浓度直接或间接相关。
此外，因为在此所述的本发明使用两个能够产生信号的分子，可以在光谱的两个不同波长检测能量的改变或转移。例如，可以比较两个或多个不同波长的能量发射改变，因此形成“比例计法(ratiometric)”测量，可以用来标准化测量分析物的值，以及说明融合蛋白或分析物的纯度。
如在此所用的，分析物的定量可以是相对量或绝对量。当然，分析物的量可以等于零，表示所探寻分析物的不存在。量可以简单地是测得的荧光值，不需要任何另外的测量和操作。或者，量可以表示为测得的分析物值与另一种化合物测得值的差异、百分比或比例，另一种化合物包括，但不限于，标准。差异可以是负的，表示测得分析物的量的减少。量还可以表示为不同时间点测得的分析物与自身的差异或比例。可以从测得的荧光值直接确定分析物的量，或将测得的荧光值用于算法中，将该算法设计成使测得的荧光值与样品中分析物的量相关。
本发明方法中待测量的分析物包括能够结合本发明方法中所用的融合蛋白的周质结合蛋白部分的任何化合物。分析物与周质结合蛋白部分的结合是或不是可逆的。分析物的实例包括，但不限于，碳水化合物如单糖、双糖、寡糖和多糖，蛋白质、肽和氨基酸，包括，但不限于，寡肽、多肽和成熟蛋白，核酸、寡核苷酸，多核苷酸，脂质，脂肪酸，脂蛋白，蛋白聚糖，糖蛋白，有机化合物，无机化合物，离子，以及合成的和天然的聚合物。一实施方案中，分析物是碳水化合物。特别地，碳水化合物分析物是糖，如葡萄糖、半乳糖或核糖。更特别地，分析物是葡萄糖。
测量样品中的分析物。如在此所用的，样品可以是怀疑含有待测量分析物的任何环境。因此，样品包括，但不限于，溶液、细胞、体液、组织或其部分，以及器官或其部分。当样品包括细胞时，细胞可以是原核细胞或真核细胞，例如，动物细胞。动物细胞的实例包括，但不限于，昆虫、鸟类和哺乳动物，如，例如，牛、马、猪、犬、猫、人和非人灵长类。本发明的范围应当不受测定细胞类型的限制。待测定的生物流体的实例包括，但不限于，血液、尿液、唾液、滑液、组织液、脑脊髓液、淋巴液、胆汁和羊水。本发明方法的范围应当不受测定体液类型的限制。术语“受试者”和“病人”在此可交替使用并用来表示动物，特别是哺乳动物，更特别是人或非人灵长类。
样品可以已经从其天然环境中取出或没有取出。因此，测定的样品部分不需要从样品的剩余部分或从含有样品的受试者中分离或取出。例如，测定受试者血液的葡萄糖不需要从患者取出任何血液。当然，也可以将样品从其天然环境中取出。此外，在测定之前可以将样品进行加工。例如，将样品稀释或浓缩；将样品纯化和/或将至少一种化合物如内标物加入样品中。还可以在本发明方法之前或结合本发明的方法将样品物理改变(例如，离心、亲和分离)或化学改变(例如，加入酸、碱或缓冲剂，加热)。加工还可以包括在测定前将样品冷冻和/或防腐。
本发明的方法依赖于将融合蛋白给予样品。如在此所用的，“给予”用于表示使样品接触或接近本发明融合蛋白的任何方式。因此，例如，通过将融合蛋白加入样品中将融合蛋白给予样品，或通过将样品放置于融合蛋白上或接近来将融合蛋白给予样品。此外，使用各种能更有效地将融合蛋白放置于含有样品的环境中的结构或装置来将融合蛋白给予样品。例如，本发明的一实施方案中，将融合蛋白涂覆于光学纤维之内或之上，然后可以将光学纤维插入含有样品的环境中，包括，但不限于，受试者的身体。另一实施方案中，可以将本发明的融合蛋白可以给予体外装置中。因此，体内或体外环境都可以使用本发明的方法。
此外，使用本发明的方法可以连续测量或监控分析物。例如，融合蛋白可以连续结合分析物，随后连续发射信号，根据检测装置，信号可以是或不是连续检测的。
本发明的融合蛋白必须具有：至少一个功能周质结合蛋白(PBP)、至少一个标记部分和至少一个发光(例如，荧光)蛋白。如在此所用的，功能PBP是通过其三维构型(三级结构)而不是其氨基酸序列(初级结构)来表征的蛋白质，并通过裂片(lobe)-铰链-裂片区域来表征。PBP通常在PBP裂片之间分裂区中特异性地结合分析物。此外，分裂区中分析物的结合然后将引起PBP的构象改变使得可以检测分析物。本发明的周质结合蛋白包括具有在此所述结构特征的任何蛋白；分析蛋白的三维结构来测定PBP的特征性裂片-铰链-裂片结构是本领域技术人员能力范围内的。PBP的实例包括，但不限于，葡萄糖-半乳糖结合蛋白(GGBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、核糖结合蛋白(RBP)、阿拉伯糖结合蛋白(ABP)、二肽结合蛋白(DPBP)、谷氨酸结合蛋白(GluBP)、铁结合蛋白(FeBP)、组氨酸结合蛋白(HBP)、磷酸盐结合蛋白(PhosBP)、谷氨酰胺结合蛋白、寡肽结合蛋白(OppA)，或其衍生物，以及属于称为周质结合蛋白样I(PBP-样I)和周质结合蛋白样II(PBP-样II)蛋白家族的其他蛋白。PBP样-I和PBP样-II蛋白具有两个相似的裂片结构域，由平行的β折叠和邻近的α螺旋构成。葡萄糖-半乳糖结合蛋白(GGBP)属于PBP-样I蛋白家族，而麦芽糖结合蛋白(MBP)属于PBP-样II蛋白家族。核糖结合蛋白(RBP)也属于PBP蛋白家族的成员。周质结合蛋白的其他非限制性实例列于表I中。
表I-编码常见周质结合蛋白的基因
  基因名称   底物   物种
  alsB   阿洛糖   大肠杆菌
  araF   阿拉伯糖   大肠杆菌
  AraS   阿拉伯糖/果糖/木糖   S.solfataricus
  argT   赖氨酸/精氨酸/鸟氨酸   鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)
  artl   精氨酸   大肠杆菌
  artJ   精氨酸   大肠杆菌
  b1310   未知(推定，多种糖)   大肠杆菌
  b1487   未知(推定，寡肽结合)   大肠杆菌
  b1516   未知(糖结合蛋白同系物)   大肠杆菌
  butE   维生素B12   大肠杆菌
  CAC1474   脯氨酸/甘氨酸/甜菜碱   丙酮丁醇梭状芽孢杆菌(Clostridiumacetobutylicum)
  cbt   二羧酸盐(琥珀酸盐，苹果酸盐，富马酸盐)   大肠杆菌
  CbtA   纤维二糖   S.solfataricus
  chvE   糖   A.tumefaciens
  CysP   硫代硫酸盐   大肠杆菌
  dctP   C4-二羧酸盐   荚膜红细菌(Rhodobactercapsulatus)
  dppA   二肽   大肠杆菌
  FbpA   铁   淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoeae)
  fecB   Fe(III)-二柠檬酸盐   大肠杆菌
  fepB   肠杆菌素-Fe   大肠杆菌
  fhuD   Ferrichydroxamate   大肠杆菌
  FliY   胱氯酸   大肠杆菌
  GlcS   葡萄糖/半乳糖/甘露糖   S.solfataricus
  glnH(蛋白：GLNBP)   葡糖酸   大肠杆菌
  gntX   葡糖酸   大肠杆菌
  hemT   氯化血红素   小肠结肠炎耶尔森氏菌
  (Y.enterocolitica)
  HisJ(蛋白：HBP)   组氨酸   大肠杆菌
  hitA   铁   流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)
  livJ   亮氨酸/缬氨酸/异亮氨酸   大肠杆菌
  LivK(蛋白：L-BP)   亮氨酸   大肠杆菌
  malE(蛋白：MBP)   麦芽糖糊精/麦芽糖   大肠杆菌
  mglB(蛋白：GGBP)   葡萄糖/半乳糖   大肠杆菌
  modA   钼酸盐   大肠杆菌
  MppA   L-丙氨酰-γ-D-谷氨酰-内消旋-二氨基庚二酸盐   大肠杆菌
  nasF   硝酸盐/亚硝酸盐   产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)
  nikA   镍   大肠杆菌
  opBC   胆碱   枯草芽孢杆菌(B.Subtilis)
  OppA   寡肽   鼠伤寒沙门氏菌
  PhnD   烷基磷酸盐   大肠杆菌
  PhoS(Psts)   磷酸盐   大肠杆菌
  potD   腐胺/亚精胺   大肠杆菌
  potF   聚胺   大肠杆菌
  proX   甜菜碱   大肠杆菌
  rbsB   核糖   大肠杆菌
  SapA   肽   鼠伤寒沙门氏菌
  sbp   硫酸盐   鼠伤寒沙门氏菌
  TauA   牛磺酸(Taurin)   大肠杆菌
  TbpA   硫胺素   大肠杆菌
  tctC   三羧酸盐   鼠伤寒沙门氏菌
  TreS   海藻糖   S.solfataricus
  tTroA   锌   苍白密螺旋体(Treponema pallidum)
  UgpB   sn-甘油-3-磷酸盐   大肠杆菌
  XylF   木糖   大肠杆菌
  YaeC   未知(推定)   大肠杆菌
  YbeJ(Gltl)   谷氨酸/天冬氨酸(推定：超家族：赖氨酸-精氨酸-鸟氨酸-结合蛋白)   大肠杆菌
  YdcS(b1440)   未知(推定，亚精胺)   大肠杆菌
  YehZ   未知(推定)   大肠杆菌
  YejA   未知(推定，与周质寡肽结合蛋白-幽门螺杆菌同源)   大肠杆菌
  YgiS(b3020)   寡肽(推定)   大肠杆菌
  YhbN   未知   大肠杆菌
  YhdW   未知(推定，氨基酸)   大肠杆菌
  YliB(b0830)   未知(推定，肽)   大肠杆菌
  YphF   未知(推定，糖)   大肠杆菌
  Ytrf   3-羟基丁酮   枯草芽孢杆菌(B.subtilis)
本发明一实施方案中，方法和组合物使用多于一个的功能PBP。例如，两个、三个、四个或更多的功能PBP可以相互连接、交联或遗传改造为融合体(相融合)，或它们可以与另一种具有多个连接位点的分子连接、交联或遗传改造为融合体(融合)。本发明一特定实施方案中，将一个、两个、三个或四个功能GGBP蛋白与DsRed2(荧光蛋白)四聚物融合(通过肽键)，如下所述。DsRed2四聚物具有四个功能GGBP或其他功能PBP可以融合的N-端，使用这样的常规重组DNA技术或化学合成技术。
本发明的功能PBP包括，但不限于，野生型PBP或其片段，只要片段保留至少部分野生型PBP的结合特异性和/或亲和性。功能PBP的其他实例包括野生型PBP的衍生物(突变体)，只要衍生物PBP保留至少部分野生型PBP的结合特异性和/或亲和性。术语“衍生物”、“突变体”和“变体”在此交替使用。
如在此所用的，术语“蛋白”和“多肽”交替使用并用于表示含有两个或更多通过肽键或修饰肽键相互连接的氨基酸的任何肽或蛋白质。“多肽”还用于表示较短的链，通常称为肽、寡肽或寡聚物。如早前所述的，本发明的功能周质结合蛋白包括衍生的PBP，可以含有不同于天然生成氨基酸序列的氨基酸序列，只要野生型氨基酸序列的添加、删除或突变没有完全消除周质结合蛋白的功能。换句话说，本发明还涉及周质结合蛋白的功能衍生物，使得这些衍生物对于相同的分析物仍然具有与野生型蛋白至少一部分相同的特异性亲和性。因此，如在此所用的，功能周质结合蛋白包括野生型及其功能衍生物。通过本领域技术人员公知的技术来形成或制得本发明的功能衍生物。这样技术的实例包括，但不限于，诱变和直接合成。
功能周质结合蛋白或其功能衍生物，还可以是修饰的，通过天然方法，如翻译后加工，或通过本领域公知的化学修饰技术。这样的修饰在基础教科书和更多详细的专论以及大量研究文献中有充分描述。修饰可以发生在多肽的任何位置，包括肽主链、氨基酸侧链和氨基或羧基端。可以认识到相同类型的修饰可以以相同或不同程度存在于给定多肽的几个位点。以及，给定多肽可以包含多于一个修饰。修饰的实例包括，但不限于，糖基化、乙酰化、酰化、ADP-核糖化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、phosphotidylinositol的共价连接、交联、环化、二硫键形成、脱甲基、共价交联的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸盐的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆寇酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋、selenoylation、硫酸化、转移RNA-介导的氨基酸至蛋白质的添加如精氨酰化和遍在化。甚至作为遍在化的结果多肽可以是分枝的，且它们可以是环状的，具有或不具有分枝，参见，例如，T.E.Creighton，Proteins-Structure And MolecularProperties，第2版，W.H.Freeman and Company，New York(1993)；Wold，F.，“Posttranslational Protein Modifications：Perspectives and Prospects”，Posttranslational CovalentModification Of Proteins，B.C.Johnson编辑，Academic Press，NewYork(1983)；Seifter等，Methods in Enzymol，182：626-646(1990)和Rattan等，Ann NY Acad Sci.，663：48-62(1992)。
本发明一实施方案中，功能突变PBP是GGBP蛋白的衍生物。GGBP蛋白的实例突变包括位置11的赖氨酸取代为半胱氨酸(K11C)、位置14的天冬氨酸取代为半胱氨酸(D14C)、位置16的甲硫氨酸取代为半胱氨酸(M16C)、位置19的缬氨酸取代为半胱氨酸(V19C)、位置43的天冬酰胺取代为半胱氨酸(N43C)、位置74的甘氨酸取代为半胱氨酸(G74C)、位置107的酪氨酸取代为半胱氨酸(Y107C)、位置110的苏氨酸取代为半胱氨酸(T110C)、位置112的丝氨酸取代为半胱氨酸(S112C)、包括位置112的丝氨酸取代为半胱氨酸和位置238的亮氨酸取代为丝氨酸的双突变(S112C/L238S)、位置113的赖氨酸取代为半胱氨酸(K113C)、位置137的赖氨酸取代为半胱氨酸(K137C)、位置149的谷氨酸取代为半胱氨酸(E149C)、包括位置149的谷氨酸取代为半胱氨酸和位置238的亮氨酸取代为丝氨酸的双突变(E149C/L238S)、包括位置149的谷氨酸取代为半胱氨酸和位置238的亮氨酸取代为半胱氨酸的双突变(E149C/L238C)、包括位置149谷氨酸的取代为半胱氨酸和位置213的丙氨酸取代为精氨酸的双突变(E149C/A213R)，包括位置152的组氨酸取代为半胱氨酸和位置182的甲硫氨酸取代为半胱氨酸(H152C/M182C)、包括位置213的丙氨酸取代为丝氨酸和位置152的组氨酸取代为半胱氨酸的双突变(H152C/A213S)、位置182的甲硫氨酸取代为半胱氨酸(M182C)、位置213的丙氨酸取代为半胱氨酸(A213C)、包括位置213的丙氨酸取代为半胱氨酸和位置238的亮氨酸取代为半胱氨酸的双突变(A213C/L238C)、位置216甲硫氨酸的取代为半胱氨酸(M216C)、位置236的天冬氨酸取代为半胱氨酸(D236C)、位置238的亮氨酸取代为半胱氨酸(L238C)、位置287的天冬氨酸取代为半胱氨酸(D287C)、位置292的精氨酸取代为半胱氨酸(R292C)、位置296的缬氨酸取代为半胱氨酸(V296C)、包括位置149的谷氨酸取代为半胱氨酸和位置213的丙氨酸取代为精氨酸和位置238的亮氨酸取代为丝氨酸的三突变(E149C/A213R/L238S)。这些衍生的GGBP描述于U.S.专利申请公开No.2003/0153026、2003/0134346和2003/0130167中，其在此引入作为参考。当GGBP或其功能衍生物是本发明中所用的功能PBP时，待检测的分析物是葡萄糖或半乳糖。
本发明的方法和组合物中使用衍生多肽的一个目的是将标记部分引至融合蛋白之上或之内，使得融合蛋白用标记部分标记。通过将一个或多个半胱氨酸残基添加/取代至功能周质结合蛋白的初级结构中，可以通过化学方法如还原、氧化、缀合和缩合反应来连接本发明方法和组合物中所用的一些标记部分。例如，任何硫醇反应基可以用于将标记部分例如荧光团连接多肽初级结构中天然生成或工程化的半胱氨酸。
本发明的融合蛋白还包括标记部分。如在此所用的，标记部分意思是具有或将要具有可检测非放射性信号的化合物或离子。标记部分的实例包括，但不限于，过渡金属、镧系离子和其他化合物。非放射性信号包括，但不限于，荧光、磷光、生物发光和化学发光。一实施方案中，标记部分是荧光团，选自荧光素、香豆素、罗丹明、5-TMRIA(四甲基罗丹明-5-碘乙酰胺)、Quantum RedTM、Texas RedTM、Cy3、N-((2-碘醋酸基)乙基)-N-甲基)氨基-7-硝基苯并二唑(IANBD)、6-丙烯酰-2-二甲基氨基萘(acrylodan)、芘、Lucifer Yellow、Cy5、Dapoxyl(2-溴乙酰胺乙基)磺酰胺、(N-(4，4-二氟-1，3，5，7-四甲基-4-bora-3a，4a-二氮杂-s-indacene-2-基)碘乙酰胺(Bodipy507/545IA)、N-(4，4-二氟-5，7-二苯基-4-bora-3a，4a-二氮杂-s-indacene-3-丙酰)-N’-碘乙酰乙二胺(BODIPY530/550IA)、5-((((2-碘乙酰)氨基乙基)氨基))萘-1-磺酸(1，5-IAEDANS)，和羧基-X-罗丹明、5/6-碘乙酰胺(XRIA5，6)。其他发光标记部分包括镧系元素如铕(Eu3+)和铽(Tb3+)以及钌[Ru(II)]、铼[Re(I)]或锇[Os(II)]的金属配体复合物，通常与二亚胺配体如菲咯啉形成复合物。
特别地，荧光标记部分可以是荧光素、acryoldan、罗丹明、BODIPY、曙红、芘、吖啶橙、PyMPO、alexa fluor 488、alexa fluor 532、alexa fluor 546、alexa fluor 568、alexa fluor 594、alexa fluor555、alexa fluor 633、alexa fluor 647、alexa fluor 660或alexafluor 680。更特别地，标记部分是acrylodan。另一实施方案中，标记部分是电化学部分，使得该标记部分环境的改变将改变部分的氧化还原状态。
本发明一实施方案中，融合蛋白的可测量信号实际上是从供体分子到受体分子的激发能量转移(共振能量转移)。特别地，共振能量转移是荧光共振能量转移的形式(FRET)。当FRET用于定量本发明方法中的分析物时，标记部分可以是供体或受体。当关于FRET使用时，术语“供体”和“受体”是本领域容易理解的。特别地，供体是吸收光的光子并随后启动能量转移至受体分子的分子。受体分子是接受由供体启动的能量转移并随后激发光的光子的分子。FRET的效率取决于两个荧光配偶体之间的距离并可以由：E＝R0 6/(R0 6+r6)来数学表达，其中E是能量转移的效率，r是荧光供体/受体对之间的距离(埃)和R0是福斯特距离(frster distance)(埃)。福斯特距离，可以通过本领域容易获得的技术来实验测定，是对于给定的供体/受体对FRET处于最大可能FRET值一半时的距离。
本发明的融合蛋白还包含至少一个荧光蛋白。融合蛋白还可以包含两个、三个、四个或多个荧光蛋白。如果本发明的融合蛋白含有多于一个荧光蛋白，荧光蛋白可以是或不是化学上相同的。荧光蛋白是本领域容易识别的。是本发明融合蛋白一部分的荧光蛋白的实例包括，但不限于，绿色荧光蛋白(GFP、AcGFP、ZsGreen)、红色移位GFP(rs-GFP)、红色荧光蛋白(RFP，包括DsRed2、HcRed1、dsRed-Express)、黄色荧光蛋白(YFP，Zsyellow)、青色荧光蛋白(CFP，AmCyan)和蓝色荧光蛋白(BFP)，以及这些蛋白加强的形式和突变。对于一些荧光蛋白加强表示通过提高蛋白的亮度或通过形成具有较快发色团突变的蛋白质来最佳化发射。可以通过工程化突变荧光蛋白来获得这些加强。
突变荧光蛋白可以使其免受标记部分的标记。实际上，标记部分可以缀合半胱氨酸残基，包括DsRed2荧光蛋白或PBP中的任何半胱氨酸残基；然而，DsRed2蛋白中的标记部分的存在干扰葡萄糖的检测。DsRed2(C119A)突变体的形成(即，位置119的半胱氨酸突变为丙氨酸)可以防止这潜在的干扰，通过使融合蛋白的PBP部分例如GGBP与标记部分而不是与荧光蛋白部分位点特异性地缀合。一实施方案中，本发明融合蛋白中所用的荧光蛋白是RFP，特别是，discosoma红色荧光蛋白(DsRed2)。一特定实施方案中，本发明方法和组合物中所用的DsRed2荧光蛋白是突变DsRed2(C119A)，其中“(C119A)”表示DsRed2野生型氨基酸序列中氨基酸位置119的半胱氨酸突变为丙氨酸的突变。DsRed2蛋白或其突变体，可以作为四聚物存在，因此，一实施方案中，融合蛋白包含四个荧光蛋白，如DsRed2，或其突变体，例如，DsRed2(C119A)。与本发明标记部分相似，本发明融合蛋白的荧光蛋白，当用于FRET系统中时，可以是供体或受体分子。因此，本发明的方法和组合物提供了利用FRET的通用系统，使得荧光能量转移可以从标记部分至荧光蛋白，或从蛋白至标记部分。
使用检测能量转移的任何手段来检测或测量信号，如荧光计，其可以检测荧光强度。还可以肉眼测量或检测信号，不借助设备。
本发明一实施方案中，其中可以固定功能GGBP的装置是连接光纤集合的传感器。该实施方案中所用的纤维是双叉光导纤维束(bifurcated fiber optic bundle)。一特定实施方案中，光纤含有六个围绕中心纤维的外层纤维。这六个纤维可以用作激发导管和中心纤维用作检测导管。这些集合的光学部件还可以包括另外的纤维和/或透镜。纤维可以是抛光的，然后使用医用胶水，或任何其他合适的粘着剂，例如，Loctite 4011，来将传感元件粘在光纤的一端。纤维束的另一端连接光纤分光光度计。然后使用合适波长的LED(例如，LS-450)和荧光分光光度计用作检测仪。激发源可以包括，但不限于，例如弧光灯、激光二极管或LED。检测仪可以包括，但不限于，例如，光电二极管、CCD芯片或光电倍增管。也可以使用计算机程序，如OceanOptic OOIBase 32，来追踪荧光发射。
本发明还涉及包含融合蛋白部分和至少一个标记部分的组合物。在此已经描述了本发明组合物的融合蛋白部分。
本发明还涉及编码之前所述组合物的这些融合蛋白部分的分离核酸。
如在此所用的，“分离的核酸分子”用来表示已经从其天然环境中取出的核酸分子、DNA或RNA。例如，对于本发明的目的，认为载体中所含的重组DNA分子是分离的。分离DNA分子的更多实例包括异种宿主细胞中维持的重组DNA分子或溶液中纯化(部分或基本上)的DNA分子。分离的RNA分子包括本发明DNA分子的体内或体外RNA转录物。根据本发明分离的核酸分子进一步包括合成产生的这样的分子。
核酸分子或多核苷酸的“核苷酸序列”用来表示DNA分子或多核苷酸，脱氧核糖核苷酸的序列，和对于RNA分子或多核苷酸，相应的核糖核苷酸序列(A、G、C和U)，其中特定脱氧核苷酸序列中的每个胸苷脱氧核糖核苷酸(T)由核糖核苷酸尿苷(U)替代。
本发明的核酸分子可以是RNA的形式，如mRNA，或DNA的形式，包括，例如，通过克隆获得或合成产生的cDNA和基因组DNA。DNA可以是双链或单链。单链DNA或RNA可以是编码链，也称为有义链，或可以是非编码链，也称为反义链。
本发明进一步涉及在此所述分离核酸分子的片段。具有编码本发明融合蛋白核苷酸序列的分离核酸分子的“片段”用来表示至少约15个核苷酸(nt)长的片段，更优选至少约20nt，再更优选至少约30nt，再更优选，至少约40nt，其可用作在此所述的诊断探针和引物。当然，根据本发明50、100、150、200、250、300、350、400或425nt长的较大DNA也是有用的，作为对应于编码本发明融合蛋白的大部分要不全部核苷酸序列的片段。理解至少20nt长的片段意思是包括来自编码本发明融合核苷酸序列的20个或更多连续碱基的片段。产生这样的DNA片段对本领域技术人员而言是常规的。例如，限制性内切酶分裂或超声波剪切可以容易地用于产生各种大小的片段。或者，可以合成产生这样的片段。
另一方面，本发明提供了分离的核酸分子，包括在严谨杂交条件下与上述本发明核酸分子中多核苷酸部分杂交的多核苷酸。“严谨杂交条件”是本领域理解的并用于表示在含有以下的溶液中42℃孵育过夜：50％甲酰胺，5X SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH 7.6)，5X Denhardt’s溶液，10％葡聚糖硫酸酯，和20g/ml变性的、剪切的鲑鱼精子DNA，接着在约65℃的0.1XSSC中洗涤滤膜。
理解与多核苷酸“部分”杂交的多核苷酸表示与至少15nt，更优选至少约20nt，再更优选至少约30nt，再更优选约30-70nt的参照多核苷酸杂交的多核苷酸(DNA或RNA)。与参照多核苷酸杂交的这样的片段可以用作片段。
当然，根据本发明与参照多核苷酸较大部分例如50-300nt长的部分杂交的或甚至与全长参照多核苷酸杂交的多核苷酸作为探针也是有用的，作为对应于大部分要不全部参照核苷酸序列的多核苷酸。例如，理解“至少20nt长”的多核苷酸部分意思是来自参照多核苷酸的核苷酸序列的20个或更多连续的核苷酸。如所示的，这样的部分在诊断上是有用的，作为根据常规DNA杂交技术的探针或作为引物用于通过聚合酶链式反应(PCR)的靶序列扩增，如所述的，例如，MolecularCloning，A Laboratory Manual，第3版，Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，编辑，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2001)，其全部公开内容在此引入作为参考。
本发明进一步涉及本发明核酸分子的变体，其编码融合蛋白的一部分、类似物或衍生物。变体可以天然产生，如天然等位基因变体。理解“等位基因变体”意思是占据生物体染色体上给定基因座的几个可替换形式之一。参见，例如，Gene II，Lewin，B编辑，John Wiley& Sons，New York(1985)。可以使用本领域已知的诱变技术来产生非天然产生的变体。
这样的变体包括通过核苷酸取代、缺失或添加产生的那些。取代、缺失或添加可以涉及一个或多个核苷酸。可以在编码区、非编码区或两者中改变变体。编码区中的改变可以产生保守或非保守氨基酸取代、缺失或添加。
因此，本发明涉及分离的核酸分子，包含具有与编码本发明融合蛋白的多核苷酸至少约95％和更特别地，至少约96％、约97％、约98％或约99％相同的多核苷酸序列的多核苷酸。
如在此所用的，“同一性”是与参照核苷酸或氨基酸序列相比较，通常是野生型序列，核苷酸序列或氨基酸序列同一性的测量。通常，将序列进行比对，以致获得最高次序的匹配。“同一性”本身具有本领域已知的意思并可以使用公开的技术来计算。(参见，例如，Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，编辑，OxfordUniversity Press，New York(1988)；Biocomputing：InformaticsAnd Genome Projects，Smith，D.W.编辑，Academic Press，New York(1993)；Computer Analysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.，和Griffin，H.G.，编辑，Humana Press，New Jersey(1994)；von Heinje，G.，Sequence Analysis In Molecular Biology，Academic Press(1987)；和Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.，编辑，M Stockton Press，New York(1991))。尽管存在几种方法来测量两个多核苷酸或多肽序列之间的同一性，术语“同一性”是本领域技术人员公知的(Carillo，H.&Lipton，D.，SiamJ Applied Math 48：1073(1988))。通常用于测定两个序列之间的同一性或相似性的方法包括，但不限于，Guide to Huge ComputersMartin J.Bishop编辑，Academic Press，San Diego(1994)和Carillo，H.&Lipton，D.，Siam J Applied Math 48：1073(1988)中所述的那些。计算机程序也可以包含计算同一性和相似性的方法和算法。测定两个序列之间同一性或相似性的计算机程序方法的实例包括，但不限于，GCS程序包(Devereux，J.，等，Nucleic Acids Research12(i)：387(1984))，BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul，S.F.，等，J Molec Biol 215：403(1990))。
具有与编码周质结合蛋白例如GGBP的参照核苷酸序列至少例如约95％“同一性”的核苷酸序列的多核苷酸，理解为意思是多核苷酸的核苷酸序列与参照序列相同，除了编码用作参照序列的野生型GGBP的参照核苷酸序列的每100个核苷酸多核苷酸序列可以包括高达约五个点突变。换句话说，为了获得具有与参照核苷酸序列至少约95％相同的核苷酸序列的多核苷酸，参照序列中高达约5％的核苷酸可以删除或由另一核苷酸替代，或参照序列中高达总核苷酸约5％的核苷酸序列可以插入参照序列中。参照序列的这些突变可以发生在参照核苷酸序列的5’或3’端位置或这些末端位置之间的任何位置，单个插入参照序列中的核苷酸之间或参照序列中的一个或多个连接基团。
本发明还涉及包括本发明DNA分子的载体，用本发明的载体基因工程化的宿主细胞和通过重组技术产生本发明蛋白。
可以将宿主细胞基因工程化来引入细胞核内游离的核酸分子(瞬时转染)或引入细胞的染色体内(稳定转染)并表达本发明的蛋白。可以单独或和其他多核苷酸一起引入多核苷酸。这样的其他的多核苷酸可以独立引入、共同引入或结合本发明的多核苷酸引入。
根据本发明的这个方面，载体可以是，例如，质粒载体，单链或双链噬菌体载体，或单链或双链RNA或DNA病毒载体。这样的载体可以作为多核苷酸，优选DNA引入细胞中，通过将DNA和RNA引入细胞中的公知技术。病毒载体可以是有复制能力的或复制缺陷的。后者中，通常只在互补宿主细胞中发生所述病毒增殖。
特定方面中，载体中优选的是用于表达本发明的多核苷酸和蛋白的那些。通常，这样的载体包含可操作连接待表达多核苷酸的用于在宿主中有效表达的顺式-作用控制区。合适的反式-作用因子通过宿主提供，通过互补载体提供或在引入宿主时通过载体自身来提供。
多种表达载体可以用于表达本发明的蛋白。这样的载体包括源自染色体、游离基因和病毒的载体，例如，源自细菌质粒、噬菌体、酵母游离基因、酵母染色体元件、病毒如腺相关病毒、慢病毒属、杆状病毒、乳多空病毒如SV40、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病病毒和逆转录病毒的载体，和源自其组合的载体，如源自质粒和噬菌体基因组元件的那些，如粘粒和噬菌粒。根据本发明的这个方面，所有都可用于表达。通常在这方面，任何适于在宿主中维持、增殖或表达多核苷酸或蛋白的载体可以用于表达。
表达载体中的DNA序列可操作地连接合适的表达控制序列，包括，例如，指导mRNA转录的启动子。这样启动子的代表包括，但不限于，噬菌体λPL启动子，大肠杆菌lac、trp和tac启动子，HIV启动子，SV40早期和晚期启动子和逆转录病毒LTR的启动子，所述的只是公知启动子中的几个。通常，表达构建体含有用于转录、启动和终止的位点，和在转录区中，含有用于翻译的核糖体结合位点。通过构建体表达的成熟转录物的编码部分包括合适地放置于待翻译多肽末端的处于开头的翻译启动AUG和终止密码(UAA、UGA或UAG)。
此外，构建体可以包括调节以及引起表达的控制区。通常，这样的区域通过控制转录来操作，尤其如阻遏物结合位点和增强子。
用于增殖和表达的载体通常包括选择标记。这样的标记也适于扩增或为了该目的载体含有另外的标记。在这方面，表达载体优选含有一个或多个选择标记基因来提供用于选择转化宿主细胞的表型特征。优选的标记包括用于真核细胞培养物的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，和用于培养大肠杆菌和其他细菌的四环素、卡那霉素或氨苄青霉素抗性基因。
使用各种适于在合适的宿主中表达所需多肽的公知技术将含有合适DNA序列以及合适启动子和其他合适控制序列的载体引入合适的宿主中。合适宿主的代表性实例包括细菌细胞，如大肠杆菌，链球菌属和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)细胞；真菌细胞，如酵母细胞；昆虫细胞如果蝇S2和夜蛾Sf9细胞；动物细胞如CHO、COS和Bowes黑素瘤细胞；和植物细胞。用于各种表达构建体的宿主是公知的，且本领域技术人员通过本发明的公开内容能够来选择合适的宿主用于表达本发明的蛋白之一。
用于细菌中的载体实例包括，但不限于，pQE70、pQE60和pQE-9，从Qiagen获得(Valencia，CA)；pBS载体、Phagescript载体、Bluescript载体、pNHSA、pNH16a、pNH18A、pNH46A，从Stratagenen获得(La Jolla，CA)；ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5，从Amersham-Pharmacia Biotech获得(Piscataway，NJ)；以及pEGFP-C1、pEYFP-C1、pDsRed2-C1，pDsRed2-Express-C1和pAcGFP1、pAcGFP-C1、pZsYellow-C1，从Clontech获得(Palo Alto，CA)。真核载体的实例包括，但不限于，从Stratagene获得的pW-LNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG；从Pharmacia获得的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL；以及从Clontech获得的pCMVDsRed2-express，pIRES2-DsRed2、pDsRed2-Mito、pCMV-EGFP。许多其他可购得的和公知的载体是本领域技术人员可获得的。合适载体和用于宿主细胞中表达的启动子的选择是公知方法，且表达载体构建、将载体引入宿主中和在宿主中表达需要的技术是本领域的常规技术。
本发明还涉及含有上述构建体的宿主细胞。宿主细胞可以是高等真核细胞，如哺乳动物细胞，或低等真核细胞，如酵母细胞，或宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞。宿主细胞可以用构建体稳定或瞬时转染。
通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其他方法来实现将构建体引入宿主细胞中。这样的方法描述于许多标准实验室手册中，如Davis等，Basic Methodsin Molecular Biology(1986)。
本发明的蛋白可以以修饰的形式得到表达并且可以不仅包含另外的融合，而且还包括分泌信号和其他的异种功能区。因此，例如，可以将另外的氨基酸片段，尤其是带电荷的氨基酸，添加至蛋白的N-端来提高在纯化过程中或随后的操作和存储过程中宿主细胞中的稳定性和持久性。此外，还可以将区域添加至蛋白来帮助纯化。可以在蛋白的最终制备之前将这样的区域除去。其中将肽部分添加至蛋白质来引起分泌或排泄、来提高稳定性和帮助纯化，是本领域中熟悉的和常规技术。优选的融合蛋白包含来自免疫球蛋白的异源区来用于溶解蛋白。例如，EP A0464533(对应于加拿大的2045869)公开了一种融合蛋白，包含免疫球蛋白分子恒定区的多个部分和另一种人蛋白或其片段。许多情况中，融合蛋白中的Fc部分是非常有利地用于治疗和诊断中，例如并因此形成提高的药物动力学特性(EP A0232 262)。另一方面，对于一些用途，希望融合蛋白以所述的有利方式表达、检测和纯化后能够检测Fc部分。
可以通过公知方法从重组细胞培养物中分离和纯化本发明的融合蛋白，这些方法包括，但不限于，硫酸铵或乙醇沉淀，酸提取，阴离子或阳离子交换层析，磷酸纤维素层析，疏水性相互作用层析，亲和层析，羟磷灰石层析和凝集素层析。也可以使用高效液相层析(“HPLC”)来纯化。当融合蛋白在分离和/或纯化过程中变性时，可以使用再折叠蛋白的公知技术来再生活性构象。
本发明的融合蛋白包括，但不限于，化学合成方法的产物和从原核或真核宿主重组技术产生的产物，宿主包括，例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞。根据重组生产方法中所用的宿主，本发明的融合蛋白可以是糖基化的或非糖基化的。此外，一些情况中作为宿主介导方法的结果，本发明的融合蛋白还可以包括初始修饰的甲硫氨酸残基。
根据本发明融合蛋白可以用于多种应用中，尤其是用于检测或监测分析物中。另外的应用涉及细胞、组织和生物体疾病的诊断和治疗。
本发明还涉及产生蛋白的方法，包括在使得所述蛋白表达的条件下培养本发明的宿主细胞，并收集所述蛋白。表达本发明蛋白需要的培养条件取决于带有本发明多核苷酸的宿主细胞。每种细胞类型的培养条件是本领域公知的并且如果需要可以容易地最佳化。
本发明还涉及用于监测样品中分析物的试剂盒。本发明的试剂盒包含至少一种本发明的组合物(具有标记部分的融合蛋白)。试剂盒还可以包含帮助使用者的说明书或书写材料。
实施例
实施例1-突变体GGBP和融合构建体的制备
质粒pTZ18R含有来自大肠杆菌菌株JM109的MgLB基因。从pTZ18R扩增GGBP基因。将GGBP基因连接进入pQE 70质粒来形成带组氨酸标记的蛋白，其是野生型序列，除了在C-末端六个组氨酸之前氨基酸位置309的赖氨酸至精氨酸的改变，和氨基酸位置310的丝氨酸添加。从(pDsRed2)扩增DsRed2基因并连接至GGBP基因的N-末端。将短的三丙氨酸-接头工程化至构建体中的荧光蛋白和组氨酸标记GGBP之间。通过标准方法在构建体中产生GGBP和/或荧光蛋白的突变。例如，使用在或接近初级葡萄糖接触位点取代密码子的引物来进行PCR。这从融合体的DsRed2部分除去了半胱氨酸残基使得当融合体是荧光团标记的时候标记将位点特异性地只缀合GGBP。所有蛋白是组氨酸融合体并通过测序来证实序列。DsRed2/GGBP融合蛋白四聚物的表示显示于图2中。其使用两个单个蛋白的晶体结构的配位(coordinates)来形成(PDB ID’s：分别为1GGX和2GBP)。
实施例2-含有突变GGBP和DsRed2的融合蛋白的纯化
从大肠杆菌菌株Sg13009表达GGBP。大肠杆菌诱导72小时后，将细菌裂解。通过离心将裂解物澄清并使用来自Clontech的Talon(基于钴)树脂通过固定金属亲和层析(IMAC)来纯化DsRed2(C119A)GGBP(E149C，L238C)融合蛋白。使用100kDa截留滤器将融合蛋白浓缩。然后将蛋白在4℃透析进含有1M NaCl、10mMTris-HCl和50mM NaPO4(pH8)的溶液中并保存于20℃。
实施例3-融合蛋白的标记
通过半胱氨酸残基的共价键通过位点特异性连接染料来进行荧光团与硫醇反应性染料的连接。首先用二硫苏糖醇处理融合体，随后加入二甲基亚砜中10倍摩尔过量的新鲜制备荧光团(这种情况中为acrylodan)。将混合物温育四小时并通过大小排阻柱层析和/或透析除去任何未反应的染料。通过吸光度来确定染料和蛋白的连接效率。
实施例4-测量本发明各种组合物的荧光强度和葡萄糖亲和性
使用荧光测试来测定融合蛋白和葡萄糖的亲和性并测定荧光响应的强度。为了测定葡萄糖亲和性，用递增含量的葡萄糖温育acrylodan标记的融合蛋白。为了DsRed2(C119A)GGBP(E149C，L238C)-acrylodan的葡萄糖亲和性测定，将0.5μM标记的融合蛋白放入含或不含葡萄糖的盐溶液中。一式三份测定样品并含有0、0.1、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0、30.0或100.0mM葡萄糖。使用分光光度计，在390nm处激发样品和扫描约430至700nm的发射。分别在520nm和583nm处阅读acrylodan和DsRed2的发射。测试融合蛋白的非染料标记的阴性对照来证实荧光能量共振转移(图3)。为了测定融合体对分析物(该实施例中为葡萄糖)的亲和性，根据等式将DsRed2的发射作图(图4)：
f＝F∞+Fot/(1+(x/Kd))
其中Kd等于最大响应一半时的葡萄糖浓度。对于DsRed2(C119A)GGBP(E149C，L238C)-acrylodan，证明了葡萄糖亲和性约为1mM。
通过之前实施例中相似的方法用另一GGBP位点的氨基酸取代来构建其他的DsRed2(C119A)-GGBP融合体，然后纯化并用acrylodan标记。acrylodan标记蛋白的对葡萄糖饱和浓度的滴定给出了以下的数据。根据公式测定比率计法(ratiometric)测量的蛋白性能：
QR＝[[(Iac/IR)]-(Ioac/IoR)]/(Ioac/IoR)]*100
该公式中，QR＝比率计法的商(％)；Iac＝acrylodan荧光发射强度(+葡萄糖)；IR＝DsRed2荧光发射强度(+葡萄糖)；Ioac＝acrylodan荧光发射强度(无葡萄糖)；IoR＝DsRed2荧光发射强度(无葡萄糖)。表II中给出了原始数据和QR的计算。一般地说，QR的绝对值越高，伴随配体结合的比率计法的改变越大(这些特定实施例中配体是葡萄糖)。
表II-DsRed2(C119A)-GGBP-acrylodan变体的性能
  融合蛋白   Ioac   Iac   IoR   IR   QR   Kd
  N43C   30330   34,500   15000   17100   -0.2％   ND*
  E149C   27500   33000   55900   62200   +7.8％   0.04uM
  E149C/L238C   14600   18300   12000   16000   -6.0％   1mM
  A213C   63750   60500   40800   39200   -1.2％   ND
  M216C   45250   44750   22250   23125   -4.8％   ND
  L238C   69400   96950   63000   72200   +21.9％   5.7uM
*ND＝未检测数据
通常在495nm测量acrylodan发射和在582nm测量DsRed发射。不存在acrylodan时没有校正390nm激发的DsRed2数据(通常只有10-15％的IoR值)。所有蛋白用每个GGBP约一个染料来标记，除了第三个实例，E149C/L238C突变，每个GGBP用约2个染料来标记。
实施例5-使用本发明的组合物和方法来测量样品中的葡萄糖浓度
为了测量样品中未知的葡萄糖含量，将融合蛋白加入样品中并在激发波长激发(对于acrylodan为390nm)。然后记录荧光发射。为了定量分析物，将样品的荧光与标准葡萄糖溶液的已知荧光响应相比较。从描述标准曲线产生的公式来测定样品中未知的葡萄糖浓度。另外，可以在荧光分析之前，在样品或细胞中表达PBP。
对于DsRed2(C119A)-GGBP(L238C)-acrylodan，对0-8μM的葡萄糖溶液产生标准曲线。为了未知的测定，最简单的计算使用线性回归方程(y＝mx+b)。在绝对荧光数据(图4)以及acrylodan发射和DsRed2发射比例的数据(表III和图5)的结合曲线的线性部分上进行线性回归。为了测定未知的葡萄糖浓度，将DsRed2(C119A)-GGBP(L238C)-acrylodan加入样品中并读取荧光。表IV列出了样品中葡萄糖测定的结果。
表III DsRed2(C119A)-GGBP(L238C)-Acrylodan标准曲线
  DsRed2 582nm   y＝7513.8x+654023   R2＝0.8879
  比例(495nm/582nm)   y＝0.0115x+1.1218   R2＝0.9705
表IV未知样品的葡萄糖浓度的测定
  未知[葡萄糖]实际的(μM)   582nm测定的DsRed2   测定的比例(495nm/582nm)
  4   4   5
  8   9   9
  16   16   16
实施例-6融合蛋白可逆性的实例和分析物的连续监测
在样品环境中分析物浓度随着时间波动的过程中连续监测样品的能力是PBP的独特特征。通过PBP的连续监测可能是由于受体的可逆配体-结合能力。为了证明单个样品中葡萄糖是怎样得到连续监测的，将DsRed2(C119A)-GGBP(L238C)放入不存在葡萄糖的溶液中并测定荧光比例。然后将葡萄糖添加至64μM的浓度并记录荧光读数。然后将样品放入透析室中并进行透析来除去葡萄糖。透析后，再次测试样品的荧光发射。这证明发射比例已经回归至接近葡萄糖不存在时的初始读数。最终，将葡萄糖浓度提高至71μM，也提高了发射比例，表示葡萄糖的存在(表V)。
表V-葡萄糖的连续监测
  时间(小时)   葡萄糖(μM)   比例(495nm/582nm)
  0   0   0.95
  0.25   64   1.33
  3.25   0   0.89
  3.5   71   1.27

Claims (39)

1.定量样品中分析物的方法，所述方法包括：
a)将融合蛋白给予所述样品，所述融合蛋白包含功能周质结合蛋白(PBP)、至少一个标记部分和至少一个荧光蛋白；和
b)测量所述荧光融合蛋白的发光，
其中所述发光是所述样品中分析物含量的表示。
2.权利要求1的方法，其中在多于一个时间点对相同样品进行所述的测量。
3.权利要求1的方法，其中连续进行所述的测量。
4.权利要求1的方法，其中所述融合蛋白可逆地结合所述分析物。
5.权利要求1的方法，其中所述样品是生物流体。
6.权利要求1的方法，其中所述定量包括计算所述至少一个荧光蛋白的荧光与所述至少一个标记部分的荧光的比例。
7.权利要求1的方法，其中所述融合蛋白包含至少两个荧光蛋白。
8.权利要求7的方法，其中所述定量包括计算所述至少两个荧光蛋白的荧光比例。
9.权利要求8的方法，其中所述至少两个荧光蛋白是不同的。
10.权利要求1的方法，其中所述功能PBP选自葡萄糖-半乳糖结合蛋白(GGBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、核糖结合蛋白(RBP)、阿拉伯糖结合蛋白(ABP)、二肽结合蛋白(DPBP)、谷氨酸结合蛋白(GluBP)、铁结合蛋白(FeBP)、组氨酸结合蛋白(HBP)、磷酸盐结合蛋白(PhosBP)、谷氨酰胺结合蛋白(GBP)、寡肽结合蛋白(OppA)及其衍生物。
11.权利要求10的方法，其中所述功能PBP是GGBP或其衍生物。
12.权利要求10的方法，其中所述分析物是葡萄糖。
13.权利要求1的方法，其中所述至少一个荧光蛋白选自绿色荧光蛋白(GFP)、红色移位GFP(rs-GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)，其增强的形式及其突变体。
14.权利要求13的方法，其中所述至少一个荧光蛋白是RFP。
15.权利要求14的方法，其中所述RFP选自DsRed2、HcRed1、DsRed-Express及其突变体。
16.权利要求15的方法，其中所述RFP是DsRed2突变体DsRed2(C119A)。
17.权利要求1的方法，其中所述标记部分是荧光团。
18.权利要求17的方法，其中所述荧光团选自荧光素、acryoldan、罗丹明、BODIPY、曙红、芘、吖啶橙、PyMPO、alexa fluor 488、alexafluor 532、alexa fluor 546、alexa fluor 568、alexa fluor 594、alexa fluor 555、alexa fluor 633、alexa fluor 647、alexa fluor660和alexa fluor 680。
19.包含融合蛋白部分和至少一个标记部分的组合物，所述融合蛋白部分包含功能周质结合蛋白和至少一个荧光蛋白。
20.权利要求19的组合物，其中所述功能周质结合蛋白选自葡萄糖-半乳糖结合蛋白(GGBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、核糖结合蛋白(RBP)、阿拉伯糖结合蛋白(ABP)、二肽结合蛋白(DPBP)、谷氨酸结合蛋白(GluBP)、铁结合蛋白(FeBP)、组氨酸结合蛋白(HBP)、磷酸盐结合蛋白(PhosBP)、谷氨酰胺结合蛋白(GBP)、寡肽结合蛋白(OppA)及其衍生物。
21.权利要求20的组合物，其中所述功能PBP是GGBP或其衍生物。
22.权利要求21的组合物，进一步包含至少一个另外的荧光蛋白。
23.权利要求22的组合物，其中所述至少两个荧光蛋白是不同的。
24.权利要求19的组合物，其中所述至少一个荧光蛋白选自绿色荧光蛋白(GFP)、红色移位GFP(rs-GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)，其增强的形式及其突变体。
25.权利要求24的组合物，其中所述至少一个荧光蛋白是RFP。
26.权利要求25的组合物，其中所述RFP选自DsRed2、HcRed1、DsRed-Express及其突变体。
27.权利要求26的组合物，其中所述RFP是DsRed2突变体DsRed2(C119A)。
28.权利要求27的组合物，其中所述标记部分是荧光团。
29.权利要求28的组合物，其中所述荧光团选自荧光素、acryoldan、罗丹明、BODIPY、曙红、芘、吖啶橙、PyMPO、alexa fluor488、alexa fluor 532、alexa fluor 546、alexa fluor 568、alexa fluor594、alexa fluor 555、alexa fluor 633、alexa fluor 647、alexa fluor660和alexa fluor 680。
30.一种载体，包括编码权利要求19的组合物的融合蛋白部分的核酸序列。
31.含有权利要求30载体的宿主细胞。
32.生产蛋白的方法，包括在使得所述蛋白表达的条件下培养权利要求31的宿主细胞，并收集所述蛋白。
33.检测样品中分析物浓度的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求19的组合物。
34.权利要求33的试剂盒，其中所述功能周质结合蛋白选自葡萄糖-半乳糖结合蛋白(GGBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、核糖结合蛋白(RBP)、阿拉伯糖结合蛋白(ABP)、二肽结合蛋白(DPBP)、谷氨酸结合蛋白(GluBP)、铁结合蛋白(FeBP)、组氨酸结合蛋白(HBP)、磷酸盐结合蛋白(PhosBP)、谷氨酰胺结合蛋白(GBP)、寡肽结合蛋白(OppA)及其衍生物。
35.权利要求34的试剂盒，其中所述功能周质结合蛋白是葡萄糖-半乳糖结合蛋白(GGBP)或其衍生物。
36.权利要求35的试剂盒，其中所述分析物是葡萄糖。
37.权利要求36的试剂盒，其中所述至少一个荧光蛋白选自绿色荧光蛋白(GFP)、红色移位GFP(rs-GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)及其增强的形式。
38.权利要求37的试剂盒，其中所述至少一个荧光蛋白是RFP。
39.权利要求38的试剂盒，其中所述RFP是discosoma红色荧光蛋白(DsRed2)。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105051536A (zh) * 2013-02-25 2015-11-11 维尔斯塔特诊断公司 用于测定酶活性的电化学发光(ecl)检测试剂和相关方法

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030153026A1 (en) * 2002-01-04 2003-08-14 Javier Alarcon Entrapped binding protein as biosensors
US20050239155A1 (en) * 2002-01-04 2005-10-27 Javier Alarcon Entrapped binding protein as biosensors
JP4799557B2 (ja) * 2004-06-09 2011-10-26 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー 多検体センサー
US20060040327A1 (en) * 2004-08-18 2006-02-23 Terry Amiss Methods of screening proteins
WO2006044612A2 (en) * 2004-10-14 2006-04-27 Carnegie Institution Of Washington Development of sensitive fret sensors and methods of using the same
AU2005295655A1 (en) 2004-10-14 2006-04-27 Carnegie Institution Of Washington Neurotransmitter sensors and methods of using the same
WO2006096213A1 (en) * 2005-03-03 2006-09-14 Carnegie Institution Of Washington Polyamine sensors and methods of using the same
EP1856138A4 (en) * 2005-03-04 2008-12-10 Carnegie Inst Of Washington ENVIRONMENTALLY STABLE SENSORS AND METHODS OF USE THEREOF
EP2041164B1 (en) 2005-09-01 2011-02-23 The Medical Research Council Improved inorganic phosphate assays
WO2007044014A1 (en) * 2005-10-14 2007-04-19 Carnegie Institution Of Washington Phosphate biosensors and methods of using the same
ATE489397T1 (de) 2005-10-14 2010-12-15 Carnegie Inst Of Washington Saccharose-biosensoren und verwendungsverfahren dafür
US20080311047A1 (en) * 2005-11-16 2008-12-18 Thijs Kaper Multimetric Biosensors and Methods of Using Same
US20120122115A1 (en) * 2006-04-25 2012-05-17 Sayre Richard T Bacterial quorum sensing biosensor
WO2008112008A2 (en) * 2006-08-11 2008-09-18 Invitrogen Corporation Sensor proteins and assay methods
WO2009021026A1 (en) * 2007-08-06 2009-02-12 University Of Kentucky Research Foundation Semi-synthetic antibodies as recognition elements
US20090061519A1 (en) * 2007-08-29 2009-03-05 Plant Sensory Systems, Llc Metabolic regulators
US8742204B2 (en) * 2007-08-29 2014-06-03 Plant Sensory Systems, Llc Metabolic regulators
US8741591B2 (en) * 2009-10-09 2014-06-03 The Research Foundation For The State University Of New York pH-insensitive glucose indicator protein
EP3362468A4 (en) 2015-10-13 2018-08-22 The Research Foundation for the State University of New York Cleavable fusion tag for protein overexpression and purification
US11156615B2 (en) * 2015-11-20 2021-10-26 Duke University Glucose biosensors and uses thereof
DE102019132525B3 (de) * 2019-11-29 2021-03-18 ICHORtec GmbH Verfahren und Optode zur Bestimmung der Konzentration eines Analyten in einer Probenflüssigkeit
CN113484525A (zh) * 2021-07-05 2021-10-08 海南医学院 一种肝素结合蛋白(hbp)时间分辨荧光免疫层析半定量检测试纸条

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030064480A1 (en) * 1990-06-28 2003-04-03 Leander Lauffer Fusion proteins with immunoglobulin portions, the preparation and use thereof
US7253264B1 (en) * 1990-06-28 2007-08-07 Sanofi-Arentideutschland GmbH Immunoglobulin fusion proteins, their production and use
US5998204A (en) * 1997-03-14 1999-12-07 The Regents Of The University Of California Fluorescent protein sensors for detection of analytes
WO1999034212A1 (en) * 1997-12-31 1999-07-08 Duke University Biosensor
US6197534B1 (en) * 1998-07-17 2001-03-06 Joseph R. Lakowicz Engineered proteins for analyte sensing
US6432723B1 (en) * 1999-01-22 2002-08-13 Clinical Micro Sensors, Inc. Biosensors utilizing ligand induced conformation changes
US7060793B2 (en) * 1999-05-21 2006-06-13 The Regents Of The University Of California Circularly permuted fluorescent protein indicators
US7109315B2 (en) * 2000-03-15 2006-09-19 Bruce J. Bryan Renilla reniformis fluorescent proteins, nucleic acids encoding the fluorescent proteins and the use thereof in diagnostics, high throughput screening and novelty items
US6969597B2 (en) * 2001-02-21 2005-11-29 Clontech Laboratories, Inc. Nucleic acids encoding non aggregating fluorescent proteins and methods for using the same
EP1372418A4 (en) * 2001-02-26 2006-01-25 Univ NON-OLIGOMERIZING TANDEM FLUORESCENT PROTEINS
ATE509120T1 (de) * 2001-09-18 2011-05-15 Carnegie Inst Of Washington Fusionsproteine zur detektion von analyten
DE60233347D1 (de) * 2001-12-19 2009-09-24 Univ Chicago Schnellreifende fluoreszierende proteine und verfahren zu deren anwendung
US7064103B2 (en) * 2002-01-04 2006-06-20 Becton, Dickinson And Company Binding protein as biosensors
US6855556B2 (en) * 2002-01-04 2005-02-15 Becton, Dickinson And Company Binding protein as biosensors
US20030153026A1 (en) * 2002-01-04 2003-08-14 Javier Alarcon Entrapped binding protein as biosensors
US9625458B2 (en) * 2002-10-16 2017-04-18 Duke University Biosensor

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105051536A (zh) * 2013-02-25 2015-11-11 维尔斯塔特诊断公司 用于测定酶活性的电化学发光(ecl)检测试剂和相关方法

Also Published As

Publication number Publication date
AU2004295683A1 (en) 2005-06-16
US20050112685A1 (en) 2005-05-26
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NO20062973L (no) 2006-08-23
CA2546949A1 (en) 2005-06-16
JP2007513331A (ja) 2007-05-24
US20080032312A1 (en) 2008-02-07
WO2005054855A1 (en) 2005-06-16

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