CN1893961B - 通过电刺激获得的生物活性血清 - Google Patents

通过电刺激获得的生物活性血清 Download PDF

Info

Publication number
CN1893961B
CN1893961B CN2004800376828A CN200480037682A CN1893961B CN 1893961 B CN1893961 B CN 1893961B CN 2004800376828 A CN2004800376828 A CN 2004800376828A CN 200480037682 A CN200480037682 A CN 200480037682A CN 1893961 B CN1893961 B CN 1893961B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
serum
electricity irritation
purposes
pharmaceutical composition
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN2004800376828A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1893961A (zh
Inventor
维塔利·A·舍斯塔科夫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Owen Holding Ltd
Original Assignee
Owen Holding Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Owen Holding Ltd filed Critical Owen Holding Ltd
Priority claimed from PCT/EP2004/014510 external-priority patent/WO2005058889A2/en
Publication of CN1893961A publication Critical patent/CN1893961A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1893961B publication Critical patent/CN1893961B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/16—Blood plasma; Blood serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及制备血清产品的方法、血清产品和包含所述血清产品的药物组合物，以及其在治疗包括癫痫发作和中风的多种疾病和病症中的用途。

Description

通过电刺激获得的生物活性血清
技术领域
本发明涉及制备血清产品的方法、血清产品和包含所述血清产品的药物组合物，以及其在治疗包括癫痫发作和中风的多种疾病和病症中的用途。
背景技术
从血清制备活性物质的方法是本领域已知的。一种方法是从人或动物中抽取血液，接着孵育和分离活性物质，最后保存该物质(例如参见JP2123287、EP 0 542 303、RU 2096041、RU 2120301)。现有技术的方法涉及制备改善身体对外源和内源性因子抗性的血清，这些因子如气压、气温、重力、光等，和饥饿、渴、睡眠和性欲等。从预先已被带入某种功能状态的供者中抽取血清，并根据应用功能状态的时间长度和功能状态的类型，例如缺乏睡眠、酒精滥用、尼古丁滥用等，可获得具有不同生物活性的血清，其表现出促有丝分裂、催眠、opthalmogenic、促进听说(audio active)、减肥(thermo active)、促进食欲(diatary active)、增强性功能(sexually active)、抗缺氧、解酒和抗尼古丁活性。
在EP 1 283 047中公开了一种不同方法，其中涉及用γ照射处理动物血清，目的是增加血清产品的生物活性。
目前，大量研究集中于调节不同人类组织的细胞增殖的机理上。在这一方面，研究了包括神经细胞的正常和病理异常体细胞增殖的刺激剂和抑制剂(例如参见Aschmarin，I.P.″Neurochemistry″，Moskwa，Publishers of the Biomedical ChemicalInstitute of the Russian Academy of Science″，1996)。
人们已经注意到肽生长因子除了具有它们正常的活化功能，例如刺激有丝分裂、不同类型正常组织的细胞分化和细胞生长、加快伤口愈合以外，还可导致肿瘤形成和增殖(例如参见Bouneres，P.(1993)，Horm.Res.40：31；Robinson，C.，(1993)Ann.Med.25：535；Dignez，C.and Casanueva F.(1995)Trends Endocrin.Metab.6：55，Menster D.et al.(1995)Clin.Exp.Metastasis 13：67)
这样的肽例如甲状旁腺肽、胃泌素或铃蟾肽有助于肿瘤细胞发生和乳腺癌、骨癌和结肠癌发生(例如参见Kitazawa S.and Maeda S.(1995)Clin Orthop.312：45-50和Kaji et al.(1995)Endocrinology 136：842)。
虽然某些肽促进正常细胞分裂，并且是人类和动物的刺激剂，但是存在着使用这些肽导致肿瘤细胞发生并最终导致癌症发生的危险。
早先的试验已经证明用电刺激动物导致血液中β-内啡肽水平增加(例如参见Litvinova S.V.et al(1990)Biomed，Sci.5：471)。在Udovitschenko，W.I.的参考工作中，提供了与多种原因引起的刺激或休克的结果相关的大量数据。例如，已经表明，电击导致血液内β-内啡肽、甲硫氨酸-(meta-)脑啡肽和亮氨酸-脑啡肽浓度显著增加(参见Udowitschenko，W.I.(1989)“Xenogenic Opioid in Shock”PathiologicalPhysiology and Experimental Therapy”6：72-77)。
发明内容
本发明的一个目的是开发从动物血中制备生物活性血清的新方法。令人惊奇地是，发现根据本发明的方法制备的生物活性血清表现出新的治疗性质。
因此，本发明的一个方面是制备生物活性血清的方法，包括以下步骤：
a)电刺激非人类动物
b)从所述动物抽取血液，
c)从所述血液中分离血清，和
d)γ照射所述血清。.
在一个优选的实施方案中，非人类动物选自哺乳动物和鸟类，优选选自家禽，如鸡、鸭(dug)、鹅、鸵鸟和鹌鹑。
尽管电刺激可施加于身体的任何部位，优选本发明方法的步骤a)施加于动物头、颈、躯干和/或一个或多个肢体。除此之外，优选地电刺激动物的头。在本发明的内容中，术语电刺激和电击(electroshock)可交替使用。
在本发明方法的一个优选的实施方案中，电刺激进行的时间段为1至60秒，优选1至30秒，更优选2至10秒。也优选的是实施电刺激的电压范围为50V至150V，优选80V至120V范围，更优选110V至120V范围。在实施电刺激的过程中，优选一定的电流，优选地实施电刺激的电流为0.01A至0.4A，优选0.02A至0.1A，更优选0.04A至0.06A。
在本发明方法的一个优选的实施方案中，实施电刺激的频率为10至200Hz，优选20至100Hz，更优选45至65Hz。
在本发明方法的另一个优选的实施方案中，其中所述给予的γ照射的吸收照射剂量为10至40kGy，优选15至35kGy，更优选为20至30kGy。γ照射源可以是任意来源，然而，优选的γ照射源选自60Co、137Cs、67Cu、67Ga、111In、192Ir、99mTc和170Tm。
在本发明方法的另一个优选的实施方案中，所述方法还包括在步骤c)之前孵育所述血液的步骤。
在本发明方法的另一个优选的实施方案中，所述方法还包括在步骤d)之前冷冻干燥所述血清的步骤。
在本发明方法的一个优选的实施方案中，血液是动脉和/或静脉血。
本发明的另一个方面是可根据本发明的方法生产的生物活性血清。
本发明的另一个方面是药物组合物，其包含根据本发明的血清和一种或多种药学上可接受的稀释剂；载体；赋形剂，包括填充剂、粘合剂、润滑剂、助流剂、崩解剂、吸附剂；和/或防腐剂。
在本发明药物组合物的一个优选的实施方案中，该组合物被配制成糖浆、输注液或注射液、片剂、胶囊、囊片、锭剂、脂质体、栓剂、硬膏剂、绷带、缓释胶囊(retardcapsule)、粉剂或缓释制剂。优选地稀释剂为水、缓冲液、缓冲盐溶液或盐溶液，载体优选地选自其中所述载体选自可可脂和vitebesole。
本发明的另一方面是本发明的血清或本发明的药物组合物在制备用于治疗疾病或病症的药物中的用途，所述疾病或病症可受需要治疗的患者的脑部中环腺苷酸单磷酸含量增加影响。
本发明的另一方面是本发明的血清或本发明的药物组合物在制备用于改善认知或学习能力尤其是改善长期记忆的药物中的用途。
本发明的另一方面是本发明的血清或本发明的药物组合物在制备用于治疗发作(seizure)尤其是癫痫发作的药物中的用途。
本发明的另一方面是本发明的血清或本发明的药物组合物在制备用于治疗增殖性疾病和中风的药物中的用途。
在本发明用途的优选的实施方案中，增殖性疾病选自胃肠道或结肠直肠道、肝脏、胰、肾、膀胱、甲状腺、前列腺、子宫内膜、宫颈、卵巢、子宫、睾丸、皮肤、口腔的癌(malignomas)；黑素瘤；口腔粘膜发育异常；侵入性口腔癌；小细胞和非小细胞肺癌；乳房肿瘤，尤其是激素依赖性乳腺癌和非激素依赖性乳腺癌；移行细胞癌和扁平细胞癌；神经恶性肿瘤，包括神经母细胞瘤、神经胶质瘤、星形细胞瘤、骨肉瘤、脑膜瘤；软组织肉瘤；血管瘤和内分泌肿瘤，尤其是垂体腺瘤；嗜铬细胞瘤、副神经节瘤、血液癌变，尤其是淋巴瘤和白血病。
在本发明用途的另一个优选的实施方案中，增殖性疾病包括类似于人T细胞淋巴瘤细胞系Jurkat、人B细胞淋巴瘤细胞系Raji、人黑素瘤细胞系Bro、人宫颈癌细胞系HeLa、人腺癌细胞系MCF-7、骨肉瘤细胞系Mg63、纤维肉瘤细胞系HT1080、神经母细胞瘤细胞系IMR-32和肝癌细胞系HepG2的细胞。
在本发明用途的另一个优选的实施方案中，给予需要治疗的患者的药物量为50至150mg/kg体重，优选90至100mg/kg体重。
具体实施方式
本发明人令人惊奇地发现用电流刺激动物尤其是鸡并进一步用γ-射线处理从血液获取的血清导致血清产品生物活性显著增加。获得的产品能够正向影响患者的多种身体功能、病症和疾病。
用电击和γ-射线处理的血清的有益效果是令人惊奇的，理由有两点。其一，现有技术中已知电击可引起所有生命功能和机体内的系统尤其是中枢神经系统、血液和循环系统以及呼吸系统的严重紊乱(参见例如Orlow，A.N.et al(1977)Medicine)。其二，也发现血液和从血液中制备的血清对照射敏感，并且在电离辐射下不稳定并失活(例如参见Radiomedicine-M.Atomisdat(1972)123-125和Gergely，J.et al.(1967)Radiosterilization of Medical Products 115-124)。
这些研究不能导致本发明的结果，并提示通过电击和γ-射线处理不可能得到生物活性血清。因此，令人惊奇地是从用II级和III级电击并用γ-射线处理的动物尤其是鸡中抽取的动脉和/或静脉血可得到生物活性血清。下文将更详细地描述由此得到的血清的具体活性。
因此，本发明的第一个方面是制备生物活性血清的方法，包括以下步骤：
a)电刺激非人类动物，
b)从所述动物抽取血液，
c)从所述血液中分离血清，和
d)γ照射所述血清。
在本发明的方法中可使用多种动物，然而，优选的非人类动物选自哺乳动物和鸟类。因为它们容易得到，特别优选使用家养动物，例如家禽，例如鸡、鸭、鹅、鸵鸟和鹌鹑。可在本发明的方法中使用的特别优选的动物是鸡。可在本发明的方法中使用的哺乳动物的类型不具体限制，包括但不限于啮齿动物，例如小鼠、仓鼠和大鼠、猫、狗、马、驴、绵羊、牛和山羊。
可以想象电刺激导致某些化合物在动物体内释放，其引起和/或有助于本发明的生物活性血清的令人惊奇的治疗效果。可以在身体的不同区域刺激非人类动物。优选地，实施电刺激是在头、颈、躯干和/或一个或多个肢体。每次电刺激仅仅在一个位置或在多个位置都是可以的。特别优选的用于电刺激的身体部位是各个动物的头部。当刺激鸟类尤其是鸡时，优选电刺激头部。
可以采用任何已知的方法实施电刺激，优选使用金属电极或水浴，例如在屠宰家畜或电死家禽时使用的。优选地，实施电刺激的时间段为1至60秒，优选1至30秒，更优选2至10秒，最优选为3至4秒。时间段的长度在电刺激大动物时将延长，在电刺激小动物时可以缩短。例如刺激鸡的头部时，电刺激的特别优选的时间为2至10秒，更优选为3至4秒。在电刺激动物过程中，可调节的其它变量为电压、电流和电流频率，本发明已经限定了这些变量的某些优选范围。选择的实际参数将部分地取决于动物大小和受刺激的动物部位。通常，较大动物和较大的部位将需要较高的电压和电流。因此，实施电刺激优选采用的电压为50V至150V，优选80V至120V，更优选110V至120V。可施加的电流为0.01A至0.4A，优选0.02A至0.1A，更优选0.04A至0.06A，最优选为约0.05A。优选地，选择电压、电流和应用时间以给予1至1,000W、优选10至200W、更优选15至100W的能量。
对于刺激优选的动物即鸡，优选实施电刺激的电压为80V至120V，更优选110V至120V。而且，在鸟类尤其是鸡的电刺激中，电流为0.04A至0.06A，特别优选0.05A。
在本发明方法的特别优选的实施方案中，以80V至120V、尤其是110V至120V的电压对鸟类尤其是鸡进行3至4秒电刺激。在这个优选的实施方案中，电流优选为0.04A至0.06A，更优选为约0.05A。
电刺激的频率似乎不是特别关键，但是优选为10至200Hz，更优选为45至65Hz，最优选为约50Hz。
本发明方法的步骤d)中血清的γ照射可采用包括X-射线源和放射性核素的任意γ源进行。优选地，γ照射源为具有确定γ照射模式的放射性核素。优选的γ照射源选自60Co、137Cs、67Cu、67Ca、111In、192Ir、99mTc和170Tm。在本发明的方法中，对我们而言，其中60Co、137Cs、192Ir和170Tm是特别优选的，60Co是最优选的γ照射源。被血清吸收的照射剂量为10至40kGy，优选15至35kGy，更优选20至30kGy，即25±5kGy。
从动物中抽取血液可通过任意已知的方法实现，这些方法包括使用注射器和动脉或静脉穿刺，或采用断头术，尤其是在从鸟类抽取血液时。可以抽取动物的一部分血液或完全抽取动物的血液。如果已经给动物施加了致死量的电，优选使用后者。抽取的血液可以是动脉和/或静脉血。
可通过任意已知的方法分离血清，所述方法包括过滤、沉淀和离心分离。然而，优选在低温例如在2至10℃、优选4-8℃下孵育血液4至72小时，以使血液凝集，使另外的因子释放进入血液。因此，在本发明方法的优选的实施方案中，所述方法还包括从动物中抽取血液后和在从血液中分离血清前孵育血液的步骤，例如在低温例如在2至10℃、优选4-8℃下孵育血液4至72小时。
在本发明方法的另一个优选的实施方案中，所述方法包括在照射的步骤d)之前冷冻干燥所述血清的步骤。冷冻干燥使得更容易在照射期间操作血清，并血清成分对照射的吸收。
本发明的另一个方面是生物活性血清自身，其可以根据本发明的方法生产。它与现有技术中没有采用本发明的方法的步骤得到的血清明显不同，这点可通过其特定的治疗效果加以证实，而现有技术血清产品不能表现出这一效果。
由于令人惊奇地发现本发明的生物活性血清产品提供特定的治疗效果，例如抗增殖活性或抗癫痫活性，本发明的另一方面是药物组合物，其包含可根据本发明的方法生产的生物活性血清。这样的药物组合物可进一步地包含一种或多种药学上可接受的稀释剂；载体；赋形剂，包括填充剂、粘合剂、润滑剂、助流剂、崩解剂、吸附剂；和/或防腐剂。
本发明的药物组合物可通过各种已知的途径给药，包括口服和非胃肠道给药，例如静脉内、肌内、鼻内、皮内、皮下等给药途径。优选非胃肠道给药，特别是静脉给药。根据给药途径，需要各种药物制剂，这些制剂中的某些可能需要给药物制剂应用保护性包衣来防止生物活性血清在例如消化道的降解。
因此，优选地，本发明的药物组合物制成糖浆、输注液或注射液、片剂、胶囊、囊片、锭剂、脂质体、栓剂、硬膏剂、绷带、缓释胶囊、粉剂或缓释制剂。
特别优选的药物形式是适用于注射的形式，包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉剂。在所有的情况下，最终的溶液或分散液形式必须是无菌的和流动的。典型地，这样的溶液或分散液将包括溶剂或分散介质，包含例如水缓冲的水性溶液，例如生物相容性缓冲液、乙醇、多元醇例如甘油、丙二醇、聚乙二醇、其适宜的混合物、表面活性剂或植物油。本发明的生物活性血清也可配制成脂质体，特别是对于非胃肠道给药而言。与游离药物相比，脂质体提供增加的循环中半寿期并延长所包裹药物的更均匀释放。
可通过任意数量的本领域认可的技术实现对输注液和注射液的灭菌，这样的技术包括但不限于添加防腐剂例如抗细菌剂或抗真菌剂，例如尼泊金类(Parabene)、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸或硫柳汞。而且，也可以将等渗剂例如糖类或盐类尤其是氯化钠掺入到输注液或注射液中。
通过将需要量的生物活性血清掺入到含上述列举的各种成分的适宜溶剂中，根据需要，接着进行灭菌，制备含生物活性血清的无菌注射液。为了获得无菌粉剂，根据需要将上述溶液真空干燥或冷冻干燥。本发明优选的稀释剂为水、生理可接受的缓冲液、生理可接受的缓冲盐溶液或盐溶液。本发明优选的载体是可可脂和vitebesole。可与生物活性血清的各种药物形式使用的赋形剂选自以下非限制性列表：
a)粘合剂，例如乳糖、甘露醇、结晶山梨醇、磷酸氢二盐类、磷酸钙、糖类、微晶纤维素、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等；
b)润滑剂，例如硬脂酸镁、滑石、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂酸、氢化植物油、亮氨酸、甘油酯和硬脂酰富马酸钠；
c)崩解剂，例如淀粉、交联羧甲基纤维素钠(croscaramellose)、甲基纤维素钠、琼脂、膨润土、海藻酸、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
其它适宜的赋形剂可参见由the American Pharmaceutical Association出版的Handbook of Pharmaceutical Excipients，本文将其引入作为参考。
本发明的另一个方面是本发明的生物活性血清或药物组合物在制备用于治疗可受需要治疗的患者的脑中环腺苷酸单磷酸含量增加影响的疾病或病症的药物中的用途。
本发明的另一个方面是本发明的生物活性血清或药物组合物在制备用于改善受治疗患者中益智(nootropic)、认知和/或学习能力尤其是改善长期记忆的药物中的用途。用于这个适应症的用途是基于发现了本发明的血清或药物组合物增加受治疗患者的学习能力。
而且，所述血清或药物组合物可用于治疗任意类型的发作，尤其是用于治疗癫痫发作。具体而言，在严重的癫痫形式中和在癫痫大发作期间，给予本发明的生物活性血清或药物组合物可以预防有时与严重发作相关的死亡。与本发明可用于治疗癫痫发作的观察相结合，也已经发现本发明的血液、血清或药物组合物可用于治疗神经疾病，包括但不限于双极性精神障碍、抑郁、焦虑相关病症、癫痫、阿尔茨海默病、帕金森病、外周神经病变、脑淀粉样血管病、神经退行性疾病和脊髓损伤。
本发明的另一方面是本发明的血清或药物组合物在制备用于治疗增殖性疾病和中风的药物中的用途。特别令人惊奇地发现，如果体外测试多种肿瘤细胞系，本发明的生物活性血清或药物组合物表现出明显的抗增殖效果。因此，显然本发明的生物活性血清或药物组合物特别适用于治疗增殖性疾病，可根据本发明的用途治疗的优选的增殖性疾病选自胃肠道或结肠直肠道、肝脏、胰、肾、膀胱、甲状腺、前列腺、子宫内膜、宫颈、卵巢、子宫、睾丸、皮肤、口腔的癌变(malignomas)；黑素瘤；口腔粘膜发育异常；侵入性口腔癌；小细胞和非小细胞肺癌；乳房肿瘤，尤其是激素依赖性乳腺癌和非激素依赖性乳腺癌；移行细胞癌和扁平细胞癌；神经恶性肿瘤，包括神经母细胞瘤、神经胶质瘤、星形细胞瘤、骨肉瘤、脑膜瘤；软组织肉瘤；血管瘤和内分泌肿瘤，尤其是垂体腺瘤；嗜铬细胞瘤、副神经节瘤、血液癌变，尤其是淋巴瘤和白血病。
由于本发明的生物活性血清或本发明的药物组合物的抗增生效果已经对多种肿瘤细胞系首次确立，它特别适用于治疗增殖性疾病，其中包含类似于在那些试验中使用的肿瘤细胞系的细胞和/或包含这些细胞的肿瘤组织。相应地，可以使用所述生物活性血清或包含所述生物活性血清的药物组合物治疗的优选的增殖性疾病包含与以下细胞类似的细胞：人T细胞淋巴瘤细胞系Jurkat、人B细胞淋巴瘤细胞系Raji、人黑素瘤细胞系Bro、人宫颈癌细胞系HeLa、人腺癌细胞系MCF-7、骨肉瘤细胞系Mg63、纤维肉瘤细胞系HT1080、神经母细胞瘤细胞系IMR-32和肝癌细胞系HepG2。在本发明中，术语″类似的细胞″是指这样的细胞，它们与各个细胞系具有相同起源如T细胞、B细胞或神经细胞谱系，它们携带相同或功能等价的基因中的突变，其中这种突变与细胞的增殖活性相关，例如p53、pRb、cdc2、cdk4、细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白B、p2lras、c-fos、c-jun、pl07、pl30等中的突变；它们携带相同或功能类似的外源基因，例如人乳头瘤病毒(HPV)、E6或E7，乙型肝炎病毒等插入细胞周期蛋白B启动子；或者它们具有相同的染色体重排或异常的染色体重排，即缺失、染色体多倍化等。
根据动物和细胞培养物中的结果，优选一定量的生物活性血清用于治疗可应用所述血清和药物组合物的疾病或病症。然而，应当理解根据相应病症和待治疗的相应患者，即根据疾病或病症的严重性、患者的一般健康状况等，需要不同剂量的生物活性血清或药物组合物以实现治疗效果。适宜剂量的确定取决于主治医师的判断。可以考虑本发明方法中的生物活性血清的剂量应当在约0.1mg至约200mg血清每千克体重的范围内。然而，在本发明的优选的用途中，给予需要的患者的生物活性血清的剂量为50至150mg/kg体重，优选为90至100mg/kg体重。用生物活性血清治疗的持续时间将根据待治疗疾病的严重性和每个患者个体的状况和特异体质反应而改变。
包括下述的实施例以举例说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当理解在下述实施例中公开的技术代表本发明人在实施本发明中效果良好的技术，因此，可以认为是优选的实施方式。然而，本领域技术人员应当理解，根据本发明公开的内容，可以在不背离所附权利要求确定的本发明范围和实质的情况下，对已经公开的具体实施方案进行多种改变。本文中引用的所有文献引入本文作为参考。
附图说明
图1：两种药物制剂对Jurkat细胞的细胞毒效应
描述包含本发明生物活性血清的两种不同药物制剂以不同浓度对人T细胞淋巴瘤细胞系Jurkat的细胞毒效应。在y轴上以百分数表示Jurkat细胞的存活率，同时在x轴上以mg/ml标明生物活性血清的量。
图2：两种药物制剂对Raji细胞的细胞毒效应
描述包含本发明生物活性血清的两种不同药物制剂以不同浓度对人B细胞淋巴瘤细胞系Raji的细胞毒效应。在y轴上以百分数表示Raji细胞的存活率，同时在x轴上以mg/ml标明生物活性血清的量。
图3：两种药物制剂对Bro B-19细胞的细胞毒效应
描述包含本发明生物活性血清的两种不同药物制剂以不同浓度对人T细胞淋巴瘤细胞系Bro B-19的细胞毒效应。在y轴上以百分数表示Bro B-19细胞的存活率，同时在x轴上以mg/ml标明生物活性血清的量。
图4：两种药物制剂对HeLa细胞的细胞毒效应
描述包含本发明生物活性血清的两种不同药物制剂以不同浓度对人T细胞淋巴瘤细胞系HeLa的细胞毒效应。在y轴上以百分数表示HeLa细胞的存活率，同时在x轴上以mg/ml标明生物活性血清的量。
图5：两种药物制剂对MCF-7细胞的细胞毒效应
描述包含本发明生物活性血清的两种不同药物制剂以不同浓度对人T细胞淋巴瘤细胞系MCF-7的细胞毒效应。在y轴上以百分数表示MCF-7细胞的存活率，同时在x轴上以mg/ml标明生物活性血清的量。
图6：两种药物制剂对IMR-32细胞的细胞毒效应
描述包含本发明生物活性血清的两种不同药物制剂以不同浓度对人T细胞淋巴瘤细胞系IMR-32的细胞毒效应。在y轴上以百分数表示IMR-32细胞的存活率，同时在x轴上以mg/ml标明生物活性血清的量。
图7：两种药物制剂对HT1080细胞的细胞毒效应
描述包含本发明生物活性血清的两种不同药物制剂以不同浓度对人T细胞淋巴瘤细胞系HT1080的细胞毒效应。在y轴上以百分数表示HT1080细胞的存活率，同时在x轴上以mg/ml标明生物活性血清的量。
图8：两种药物制剂对HepG2细胞的细胞毒效应
描述包含本发明生物活性血清的两种不同药物制剂以不同浓度对人T细胞淋巴瘤细胞系HepG2的细胞毒效应。在y轴上以百分数表示HepG2细胞的存活率，同时在x轴上以mg/ml标明生物活性血清的量。
图9：用丝裂原处理的细胞的增殖活性的″钟形″曲线
基于相对于丝裂原浓度的DNA生物合成量测定淋巴细胞的曲线。通过掺入放射性的量和每分钟酸不溶性计数来测定DNA生物合成的活性。
图10：药物组合物的促有丝分裂活性
描述0.1至100.0mg/ml的物质浓度范围内药物组合物对DNA生物合成量的促有丝分裂效应。DNA合成的量以掺入DNA中的放射性量为基准评价。
图11：药物组合物对MCF-7细胞的影响
描述人乳腺癌细胞系MCF-7中DNA合成的量与药物组合物中含有的生物活性血清的量的关系。
实施例
实施例1
获得电击处理的鸡血的方法
为了制备鸡血清，用II级至III级的电击(电压为80-120V，电流0.05A，频率50Hz，施加时间：3至4秒，在头部)处理鸡。然后从颈动脉抽取血液，进一步在聚乙烯烧瓶中于4-8℃下孵育18-24小时。在血凝块完全收缩以后，以3,000rpm旋转烧瓶20-30分钟。将血凝块与血清分离，于本领域已知的条件下冷冻干燥。在RZ-100-M装置上用60Co作为γ辐射源以20-30kGy、优选约25kGy处理含有冻干血清的烧瓶。将处理的血清在4-8℃的温度下储存备用。
用电击处理的鸡血清的刺激效应的证据
使用平均体重为280-300g的雄性Wistar大鼠进行下面的实验。将动物随机分配为4组，每组10只。第一组给予1.0ml的生理盐水溶液。第二组以1.0ml溶液的形式给予100±5.0mg/kg体重的本发明血清。注射30分钟后，将大鼠断头。给予第三组大鼠1ml的生理盐水溶液，第四组大鼠以1.0ml溶液形式接受含生理活性血清(100±5mg/kg体重)。注射30分钟后，将在尾部负重的动物(大鼠体重的10％)放置在水盆中(25℃)。在剧痛的第一次征兆后，从水中取出大鼠，断头。
取脑、心脏、肝脏(全是极端适应过程中处于高度紧张状态的器官)以及骨骼肌(作为主要的效应器官)作为样品用于进一步的分析。称重每只大鼠的组织样品，用等渗NaCl溶液冷却，在液氮中快速冷冻。在施加“胁迫”和最终处理样品之间的全部时间最多为5至6分钟。
确定大鼠骨骼肌中三磷酸腺苷、二磷酸腺苷和单磷酸腺苷的量。通过用AnionitDowex 1的离子交换柱色谱法分离核苷酸。在256nm的范围(分光光度计Hitachi-557)进行光度分析确定三磷酸腺苷、二磷酸腺苷和单磷酸腺苷的量。根据下述公式确定能量势：
(ATP-0.5ADP)/(ATP+ADP+AMP)
使用已知的放射免疫学分析法用Amersham(Great Britain)检测装置测定脑、心脏和肝脏中的环单磷酸腺苷含量。
使用本领域已知的方法应用闪烁计数器GS-8进行标记的单磷酸腺苷的测定。结果
当第三组与对照组1或第二组(p＜0.05)比较时，第四组与对照组1或第二组(p＜0.05)比较时，还有当第三组与第四组互相比较时(p＜0.05)时，都可明显看出三磷酸腺苷、二磷酸腺苷和单磷酸腺苷的不同含量和能量势的增加(也参见表1)。
表1
给予或不给予生物活性血清的骨骼肌组织内三磷酸腺苷、二磷酸腺苷和单磷酸腺苷的量和能量势
在活动期或由注射导致的轻度胁迫后30分钟(对照组I)测定腺苷磷酸的含量证实，在血清影响下，三磷酸腺苷和二磷酸腺苷量的混合出现在肌肉组织中的上限范围值，而同时单磷酸腺苷的量降低。
这些结果可以解释为生物活性血清促进了肌肉组织内能量势的增加。计算能量势证实了这种倾向。
在第三组(生理盐溶液+游泳)中在极端游泳胁迫影响下，测得相对于对照组而言，三磷酸腺苷降低，二磷酸腺苷和单磷酸腺苷增加。
在极端胁迫下，在第四组(血清+游泳)的大鼠中，观察到三磷酸腺苷、二磷酸腺苷和单磷酸腺苷的含量改变的大致趋势与第三组中的类似，然而，三磷酸腺苷的含量显著更高，当计算能量势时，观察到与第三组相比能量势增加43％(p＜0.05)。
在第一和第二组大鼠的心脏和肝脏组织以及脑组织中的环单磷酸腺苷的比较分析证实，在血清的影响下，与对照组相比，可检测出脑组织中的环单磷酸腺苷量的增加(p＜0.01)，而心脏和肝脏组织中环单磷酸腺苷的含量没有显著差异(参见表2)
表2
给予生物活性血清后，脑、心脏和肝脏中环单磷酸腺苷的量
Figure S04837682820060622D000141
在第三组(生理盐溶液+游泳)和第四组(血清+游泳)大鼠的所有组织中可观察到在极端胁迫的影响下，环单磷酸腺苷的量显著减少(p＜0.05)。然而，在生物活性血清的影响下，这种减少减弱。因此，脑组织中单磷酸腺苷的量比第三组的各自的量高92％(p＜0.05)，心脏组织中高96％，肝脏组织中高25.7％。
所以，在静止期和在极端胁迫下，用电击和γ射线处理的本发明的血清增加了大鼠骨骼肌中的能量势，增加了脑组织中环单磷酸腺苷的量，并在物理胁迫大鼠后促进心脏和肝脏组织中环单磷酸腺苷的增加。
实施例2
长期记忆
在这个实验中，使用150只雄性Wistar大鼠。起先用经典的“开场”试验测试所有的大鼠，再根据活动分为三组：活动(active)组、中等活动组和被动组。
为了建立条件反射，将大鼠置于恒温控制盆内的圆筒中。将圆筒放置在三个支撑体上，并允许动物从圆筒下沿潜至圆筒外的平台。
确定第一次实验的潜伏时间和最后解决从封闭空间和从水中“逃出”的任务的潜伏时间。
当建立条件反射时，将大鼠分为三组：
-″快速潜水者″：指那些能在第一分钟发现出口的大鼠；
-″慢速潜水者″：指那些在2至3分钟后才开始寻找出口的大鼠
-在10分钟内没有意愿去解决问题的大鼠。
在进行实验的30分钟前，以100mg/kg体重将生物活性血清注射入腹膜腔。向对照组动物给予1ml生理盐溶液。第二天，测试条件反射行为，之后给大鼠40天间歇。
根据该方法，120只大鼠-60只对照大鼠和60只接受生物活性血清的大鼠-接受“训练”。如上将大鼠预先另外分为三组，即活动组、中等活动组和被动组(每组20只动物)，而且，根据“快速”和“慢速”潜水者的分析将它们再进行分组。
结果
有些大鼠根本不表现″潜水反射″(表3)。在对照组中，6只活动大鼠和中等活动大鼠和12只被动组动物完全不表现″潜水反射″(表3)。第二天，对于活动大鼠和中等活动大鼠，该数目依旧保持相同，然而被动组动物该数下降为7。42天后，相同的11只被动组大鼠拒绝在圆筒边缘下潜水(在实验中1只大鼠死亡)。
对于接受生物活性血清大鼠的活动大鼠，在第二天没有一只大鼠拒绝解决该问题。对于所有的中等活动大鼠，在第一天有三只拒绝解决该问题，但是在第二天解决了该问题，并且即使在42天后仍继续具有这个能力。在接受血清大鼠的被动大鼠中，4只大鼠没有意愿去解决该问题，然而，在第二天该数降低至2只，并一直保持至42天后。
表3
没有表现出″潜水反射″的大鼠数量
＊在实验中一只大鼠死亡
在″快速潜水″组内，在试验的40天时间内，单次血清注射没有表现出条件反射的明显改变。
对于″慢速潜水″组，存在统计学显著的维持快速发现从极端条件下逃险路线的能力(表4)。因此，对于对照组和试验组而言，与第一天相比，第二天形成反射的时间减少。在对照组中，42天后这种反射完全消失，然而对于接受生物活性血清注射的动物而言，该反射全部保持。此外，在反射需要的时间上存在差异，对照组要高2-3倍(p＜0.01)。
表4
血清对“慢速潜水”组中条件反射的形成和保持的影响(以秒计)
Figure S04837682820060622D000171
在信息的形成和长期保持期间，显著作用归因于H-胆碱能感受机理。教育如何在″钟″下潜水持续5天的30只动物分为3组。
在第一组(10只大鼠)动物测试前30分钟，以1mg/kg体重向腹腔注射zytisin(脑的H-胆碱能感受拮抗剂)的生理溶液。
以100mg/kg体重的剂量向第二组动物(10只大鼠)给予生理活性血清，30分钟后，以1mg/kg体重给予zytisin溶液。
第三组动物(对照组-10只大鼠)接受1ml的生理盐溶液注射液。
根据上述指出的方法，在注射指定的物质48小时后，测试动物的复杂行为。生物测试显示应用zytisin 48小时后，从封闭空间的“逃险反应”与对照动物相比减慢了3倍。
与对照组相比，在zytisin注射前给药血清不仅减轻了拮抗效果，而且导致“逃险”反应增加20％，生物血清的总体效果超过拮抗剂效果的5倍。
表5
大鼠对给予zytisin和生物活性血清的刺激反应的潜伏期(秒)
  时间参数   对照组(第三组)   给予zytisin  (第一组)   给予血清+zytisin  (第二组)
  48小时后   13.33±0.58   40.0±14  ＜0.05   8.3±5.5  ＞0.05  ＜0.05
根据所述结果，确定了脑H-胆碱能受体在与动物的复杂行为建模相关的“逃险反应”的恢复中起重要作用，并且生物活性血清防止了学习衰减的建立。
因此，生物活性血清刺激了长期记忆的形成，尤其在从封闭空间中和从水中逃险反应减慢的动物中表现出这种效果。而且，很明显，H-胆碱能感受的脑部机理在长期记忆的保持中起重要的作用，并且消极地影响H-胆碱能感受的脑部机理的物质的效果受到本发明的生物活性血清的拮抗。
实施例3
癫痫
现有技术中已知，中毒剂量的樟脑可导致中枢神经系统的运动区域活动过强，接着引起强直性痛性痉挛的发生。因为这点，樟脑被用于除了戊四唑以外的产生痛性痉挛的动物模型中。根据给予樟脑的剂量，可以引起所有类型的小或大的癫痫发作，包括癫痫大发作。
在该试验中，观察生物活性血清对癫痫症活动的影响，所述癫痫症通过将樟脑注射入大鼠的腹腔引起。在该实验中使用体重为190-210g的40只雄性Wistar大鼠。将樟脑油溶液(20％)以0.25和0.5ml的量注射入腹腔(使用20只大鼠)。以100±5.0mg/kg体重的剂量注射血清(使用20只大鼠)。
由专家观察和评价发作。评定下述的参数。反应的潜伏时间、痛性痉挛反应类型(强直阵挛性发作、大发作和小发作)、癫痫发作的时间长短和它们之间的时间间隔、正常运动的降低和最终结果(动物的死亡或从病理性状态的恢复)。结果在表6中概述。
表6
生物活性血清对试验诱导的癫痫的影响
  樟脑剂量   癫痫发作   对照组(樟脑)   测试组(樟脑+血清，剂  量为100mg/kg)
  0.25   发生强直性痉挛  之后发生癫痫大发作形式  的阵挛性痛性痉挛  中等量的发作  发作时间长度  48小时后动物健康情况   7’20”±10”   12’30”±32”  一只，6’-7’  70’-80’  全部活着   5’30”±15”   8’45”±28”  一只，8’-9’  15”-20”  全部活着
  0.5ml   发生强直性痉挛  之后发生癫痫大发作形式  的阵挛性痛性痉挛  中等量的发作  发作的时间长度  48小时后的动物健康情况   5’40”±30”   8’30”±27”  一只，5’  90”-120”  60％死亡   5’00”-32”   8’40”  一只，7’  25”-30”  全部活着
在经注射樟脑引起的癫痫发作的潜伏期中以100mg/kg给予生物活性血清降低了发作活动的所有病征：发作活动的潜伏时间增加、阵挛性痛性痉挛严重性减轻并且不丧失正常运动性，另外用电击处理的血清可预防严重癫痫模型中动物的死亡(给药0.5ml 20％的樟脑溶液，所有的动物都活着)。
实施例4
本发明的血清对人细胞增殖的影响
本发明的血清为真空干燥的用II级和III级电击和γ射线处理的鸡血清。使用的生物活性血清为两种制剂类型：(i)以100mg/ml浓度重悬在水中的血清(试验组分1)，和(ii)将悬浮液以10.000×g离心3分钟后的100mg/ml生物活性血清的水悬液的上清(试验组分2)。
细胞培养
在塑料组织培养板(Nunc或Falcon)中于含10％胎牛血清(FCS，Gibco)、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的1640-RPMI培养基(Sigma)中，在37℃和5％CO2含量和95％湿度下培养Jurkat和Raji细胞系细胞以及人外周血的细胞。如上培养细胞系Bro、HeLa、MCF-7、Mg63、HT1080、IMR-32和HepG2，然而，使用DMEM培养基(Sigma)代替1640-RPMI培养基。
根据Boyum的方法分离单核白细胞(ML)
根据Boyum A描述的方法分离单核白细胞(Isolation of mononuclear cells andgranulocytes from human blood，1968，Cand.J.Lab.Clin.Invest.，120(97)：9-18)。
将15ml Ficoll-pack-solution放置在两个圆锥形试管(Falcon)的每个中，接着将25ml两倍稀释于磷酸盐缓冲液(PBS)中的血液加到Ficoll上。之后在Baket-Rotor中将试管以400×g于20℃离心30分钟。不使用含血浆的上相。
小心地用移液管吸取浓缩于血浆和分离介质之间界面的单核白细胞(ML)，并收集在离心管中。随后，通过以250×g离心10分钟用PBS洗涤细胞两次，最后将它们悬浮在培养基中，该组分包含10-30％的单核细胞和80-90％的淋巴细胞，将其在下文中称为“淋巴细胞”。淋巴细胞的一部分用于研究本发明的生物活性血清的促有丝分裂活性，另一部分用于研究增殖。为了该目的，将植物血凝素(Phytohemaglutinine)以20mg/ml的浓度加入到细胞悬液中。
细胞中脱氧核糖核酸合成(DNA)量的评价
为了评价DNA的合成，将3H-胸腺嘧啶加入到细胞中，评价酸不溶性组分掺入的计数。简而言之，在96孔细胞板中用包含200至800×103个细胞的200μl培养基培养淋巴细胞，向每孔中加入不同浓度的本发明的生物活性血清。在培养结束前两小时，加入3H-胸腺嘧啶(1μCi/孔，40mCi/mmol/1)。为了放射性分析试验，用自动收集细胞的装置将细胞收集在过滤器上。用5％三氟乙酸(H2O)洗除酸溶性产物，用闪烁测量仪测定保留物质的放射性。以计数/分钟测量DNA生物合成的量。
使用MTT试验确定与不同物质一起培养后的细胞存活率。
如Mosmann T.描述的方法进行MTT试验(Rapid colorimetric assay forcellular growth and survival：application to proliferation and cytotoxicity assays(1983)J Immunol.Meth.65：55-63)。
收集对数期的细胞(当它们充满了约一半的细胞培养板时，收集贴壁的细胞)进行试验。将它们放置在Gorjaew-chamber中的生长培养基中，计数并以50-100×106/ml的浓度重新悬浮于培养基中。在加入总量为100μl的多种浓度的试验组分后，将细胞溶液置入96孔板中。为了计数活细胞，在培养结束后，将3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)的培养基溶液加入到每个不同的96孔板中。为了制备MTT溶液，将1ml MTT贮液与4ml培养基混合。MTT贮液的制备是将MTT以5mg MTT/ml的浓度溶于PBS(PBS含0.01mmol/1磷酸钠缓冲溶液，pH7.4，和0.15mmol/l NaCl)中，之后用孔径为0.45μm的过滤器过滤。该贮液可储存在+4℃下长达1月。在加入MTT溶液后，在恒温箱中于相同条件下进一步培养组织培养板4小时。下一步是用泵吸取移除培养基，向每孔中加入150μl二甲基亚砜(DMSO)以溶解已经形成的蓝色甲臜(formazan)晶体，用微板阅读仪用多通道分光光度计在540nm波长下(Labsystem)检测每孔中溶液的光密度。与加入的试验组分1和2的浓度分别相关的细胞存活率以对照细胞的存活百分率标出。用计算机软件″Origin″处理数据。
结果和讨论
结果描述于图1-8。根据这些结果，可得出以下内容：高浓度(2.5-20mg/ml)的本发明的生物活性血清对所有细胞系具有抑制作用，然而，来自不同组织类型的细胞对试验组分1和2的反应分别是不同的。在细胞系之间IC50剂量(导致50％的细胞抑制的物质浓度)基本上不同，试验物质1为2.2(Jurkat)至＞20mg/ml(Mg63)，本发明的血清的可溶性组分(试验组分2)为3.6(外周血淋巴细胞)至＞20mg/ml(Mg63和HeLa)。对于所有的细胞系，起始物质(试验组分1)的毒性都高于可溶性物质(试验物质2)的毒性。然而，应当提及的是对于两种试验组分在各细胞系中观察到的毒性几乎相同(Mg63、Rajii、外周血淋巴细胞)，而对于另一些(Jurkat、MCG-7、IMR-32)IC50值却存在2-3倍的差别。相对于常规的癌症药多柔比星而言，细胞对试验组分的敏感度描述于表7中。
表7
受试细胞系对多柔比星的敏感度
  细胞系   IC<sub>50</sub>，mmol/ml
  Jurkat  Raji  Bro B-19  Hela  MCF-7  Mg63  HT1080  IMR-32  HepG2  外周血淋巴细胞   100  20  _<sup>＊＊</sup>  400  150  _<sup>＊＊</sup>  _<sup>＊＊</sup>  4  100  40
备注：
＊-mmol/l＝0.58mg/ml
＊＊-没有检测对多柔比星的敏感度。
此外，观察到在0.3至3mg/ml浓度范围内根据细胞系和物质形式(即试验组分1或试验组分2)所述药剂对一些细胞有刺激效应。已观察到本发明的血清对Jurkat、Raji、Bro B-19、Mg63、HT1080和HepG2细胞的刺激效应。对于两种形式的试验物质，该刺激效应不显著(10，20，40％)，但都存在。对于细胞系HeLa、MCF-7、JMR-32的细胞和对于外周血淋巴细胞没有观察到刺激。与可溶性组分(试验组分2)相比，在更低的浓度下观察到第一种形式的受试物质的刺激效应。这种刺激的可能原因并不是刺激增殖，而是增加了细胞呼吸，这也可用评价细胞存活率的MTT方法检测到。观察得到的刺激效果是由于刺激增殖还是由于呼吸增加的问题还需要进一步的研究。
当研究不同的物质与免疫活性细胞之间相互作用时，通常至少必须讨论两个问题：
1.受试物质是否具有促有丝分裂活性，即其是否具有刺激淋巴细胞增殖的能力(在这种情况下，所述物质量的增加通常导致淋巴细胞DNA生物合成的增加，这可通过掺入3H-胸腺嘧啶来评价)？
2.受试物质是否具有毒性(这个问题通常通过淋巴细胞增殖抑制来确定，如通过掺入3H-胸腺嘧啶的量或使用MTT类型的活体染料对预先用丝裂原刺激的淋巴细胞来测试)？
而且，必须提及未活化的淋巴细胞在培养中不增殖，增殖量仅随着加入到培养基中丝裂原的增加量而增加。这反映为放射性标记DNA的增加。
与给药剂量相关的丝裂原对淋巴细胞的这种效应可通过所谓的″钟形曲线″来描述(参见图9)。钟形曲线的第一部分反映出丝裂原浓度的范围，其中丝裂原增加导致增殖增加(通过DNA生物合成测定)，因而存在丝裂原浓度和增殖之间的直接相关性。曲线的第二部分(2)显示饱和效应，其中丝裂原浓度的进一步增加不导致增殖的进一步增加，即丝裂原已经表现出了最大作用。没有观察到细胞毒活性。第3部分显示丝裂原浓度的范围，其中丝裂原对淋巴细胞产生逐渐增加的毒性作用。
在两个实验中评价试验组分1和2的促有丝分裂活性：
1.本实验的主题是确定试验组分对人外周血未活化的淋巴细胞的影响。就此来说确定增殖活性(即作用)与给药剂量之间的关系。
2.本实验的主题是确定第二阶段中试验物质对由植物血凝素(FHA 20g/ml)活化的淋巴细胞的DNA合成量的影响。
当检查物质时，没有观察到促有丝分裂活性，即在物质浓度范围为0.1-100mg/ml内，没有观察到对外周血淋巴细胞DNA生物合成的刺激(图10)。
当试验组分的剂量增加时，外周血淋巴细胞的数量没有显著改变。当评价试验组分对随后已经用20mg/ml FHA活化的淋巴细胞的影响时，观察到试验组分对活化淋巴细胞的抑制。
在实验中确定0.3mg/ml浓度的试验组分抑制受刺激的淋巴细胞的DNA生物合成(图11)。然而，仍旧需要确定作用机理。因此，阐明细胞生长抑制和细胞毒效应的进一步试验是重要的。
为了确定在细胞培养中得到的结果与治疗人对象的相关性如何，在动物实验中确定在不同的器官或组织中物质的浓度是重要的。在本文中，重要的是研究本发明的生物活性血清的哪些不同浓度能影响参与淋巴生成的器官的DNA合成。因此，重要的是确定生物活性血清的浓度，尤其是在小鼠的骨髓、脾脏和胸腺中的浓度。
除了淋巴细胞外，也使用铺展成单细胞层的人乳腺癌细胞系MCF-7细胞来研究本发明血清的细胞毒活性。因为接触抑制，没有观察到这些细胞增殖。在这样的模型中，物质的毒性效应可以确定，可以区分细胞毒效应和细胞生长抑制效应。当使用该模型时，确定2.5mg/ml的本发明血清具有细胞毒效应，而不依赖于本发明血清的不溶性组分是否除去，即不依赖于是使用试验组分1还是使用试验组分2。
应当注意，当本发明血清与增殖细胞一起培养时，毒性作用显著降低，这可能与以下事实相关：对于增殖细胞而言在给药后24小时而非在给药后72小时测定这种效应(延长培养单层细胞可导致对照细胞死亡)。
上述结果表明本发明的生物活性血清具有细胞生长抑制效应和细胞毒活性。虽然在相同浓度下观察到细胞毒和细胞生长抑制活性，然而细胞毒活性没有那么明显。
总体来说，与对照组相比，来自用II-III级电击处理的动物的血清和随后制备的生物活性物质导致人细胞系Jurkat、Raji、Bro B-19、Mg63、HT1080和HepG2的增殖增加10-40％。在HeLa、MCF-7、JMR-32和外周血淋巴细胞中，本发明生物活性血清在更高剂量(2.5-20mg/ml)下表现出对所有测试的人癌细胞系增殖的显著抑制。这些细胞对本发明的生物活性血清的敏感度远远强于对广泛使用的抗癌药多柔比星的敏感度。而且，当使用通过3H-胸腺嘧啶掺入评价的DNA生物合成作为标记物时，本发明的物质具有细胞生长抑制和细胞毒效应。

Claims (44)

1.制备生物活性血清的方法，包括下列步骤：
a)电刺激非人类动物，其中所述非人类动物选自哺乳动物和鸟类，
b)从所述动物抽取血液，
c)从所述血液中分离血清，和
d)γ照射所述血清。
2.权利要求1的方法，其中非人类动物是鸟类。
3.权利要求2的方法，其中所述鸟类选自鸡、鸭、鹅、鸵鸟和鹌鹑。
4.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中在步骤a)中电刺激的是头、颈、躯干和/或一个或多个肢体。
5.根据权利要求4的方法，其中在步骤a)中电刺激的是头。
6.根据权利要求2至5中任一项的方法，其中实施电刺激的时间段为1至60秒。
7.根据权利要求6的方法，其中实施电刺激的时间段为1至30秒。
8.根据权利要求6的方法，其中实施电刺激的时间段为2至10秒。
9.根据权利要求2至8中任一项的方法，其中实施电刺激的电压为50V至150V。
10.根据权利要求9的方法，其中实施电刺激的电压为80V至120V。
11.根据权利要求9的方法，其中实施电刺激的电压为110V至120V。
12.根据权利要2至11中任一项的方法，其中实施电刺激的电流为0.01A至0.4A。
13.根据权利要求12的方法，其中实施电刺激的电流为0.02A至0.1A。
14.根据权利要求12的方法，其中实施电刺激的电流为0.04A至0.06A。
15.根据权利要求2至14中任一项的方法，其中实施电刺激的频率为10至200Hz。
16.根据权利要求15的方法，其中实施电刺激的频率为20至100Hz。
17.根据权利要求15的方法，其中实施电刺激的频率为45至55Hz。
18.根据权利要求2至17中任一项的方法，其中给予所述γ照射的吸收照射剂量为15至35kGy。
19.根据权利要求18的方法，其中给予所述γ照射的吸收照射剂量为20至30kGy。
20.根据权利要求2至19中任一项的方法，其中γ照射源选自60Co、137Cs、67Cu、67Ga、111In、192Ir、99mTc和170Tm。
21.根据权利要求1至20中任一项的方法，其中该方法还包括在步骤c)之前孵育所述血液的步骤。
22.根据权利要求1至21中任一项的方法，其中所述方法还包括在步骤d)之前冷冻干燥所述血清的步骤。
23.根据权利要求1至21中任一项的方法，其中所述血液为动脉和/或静脉血。
24.根据权利要求1至23中任一项的方法生产的血清。
25.药物组合物，包含根据权利要求24的血清和一种或多种药学上可接受的稀释剂；载体；赋形剂，包括填充剂、粘合剂、润滑剂、助流剂、崩解剂、吸附剂；和/或防腐剂。
26.根据权利要求25的药物组合物，其中该组合物配制成糖浆、输注液或注射液、片剂、胶囊、囊片、锭剂、脂质体、栓剂、硬膏剂、绷带或粉剂。
27.根据权利要求25的药物组合物，其中该组合物配制成缓释制剂。
28.根据权利要求27的药物组合物，其中该组合物配制成缓释胶囊。
29.根据权利要求25至28中任一项的药物组合物，其中稀释剂为水、缓冲液、缓冲盐溶液或盐溶液。
30.根据权利要求25至29中任一项的药物组合物，其中所述载体选自可可脂。
31.根据权利要求24的血清或根据权利要求25至30中任一项的药物组合物在制备用于治疗疾病或病症的药物中的用途，所述疾病或病症可受需要治疗的患者脑中环单磷酸腺苷含量增加的影响。
32.根据权利要求24的血清或根据权利要求25至30中任一项的药物组合物在制备用于改善认知和/或学习能力的药物中的用途。
33.根据权利要求32的用途，其中所述药物用于改善长期记忆。
34.根据权利要求24的血清或根据权利要求25至30中任一项的药物组合物在制备用于治疗发作的药物中的用途。
35.根据权利要求34的用途，其中所述药物用于治疗癫痫发作。
36.根据权利要求24的血清或根据权利要求25至30中任一项的药物组合物在制备用于治疗神经疾病的药物中的用途。
37.根据权利要求24的血清或根据权利要求25至30中任一项的药物组合物在制备用于治疗增殖性疾病和中风的药物中的用途。
38.根据权利要求37的用途，其中所述增殖性疾病选自胃肠道或结肠直肠道、肝脏、胰、肾、膀胱、甲状腺、前列腺、子宫内膜、宫颈、卵巢、子宫、睾丸、皮肤、口腔的癌变；黑素瘤；口腔粘膜发育异常；侵入性口腔癌；小细胞和非小细胞肺癌；乳房肿瘤；移行细胞癌和扁平细胞癌；神经恶性肿瘤，包括神经母细胞瘤、神经胶质瘤、星形细胞瘤、骨肉瘤、脑膜瘤；软组织肉瘤；血管瘤和内分泌肿瘤；嗜铬细胞瘤、副神经节瘤、血液癌变。
39.根据权利要求38的用途，其中所述乳房肿瘤选自激素依赖性乳腺癌和非激素依赖性乳腺癌。
40.根据权利要求38的用途，其中所述内分泌肿瘤是垂体腺瘤。
41.根据权利要求38的用途，其中所述血液癌变选自淋巴瘤和白血病。
42.根据权利要求37的用途，其中增殖性疾病包括与以下细胞系具有相同起源并携带相同基因中的突变的细胞，其中这种突变与细胞的增殖活性相关；与以下细胞系携带相同外源基因的细胞；或者与以下细胞系具有相同的染色体重排或异常的染色体重排的细胞：人T细胞淋巴瘤细胞系Jurkat、人B细胞淋巴瘤细胞系Raj、人黑素瘤细胞系Bro、人宫颈癌细胞系HeLa、人腺癌细胞系MCF-7、骨肉瘤细胞系Mg63、纤维肉瘤细胞系HT1080、神经母细胞瘤细胞系IMR-32和肝癌细胞系HepG2。
43.根据权利要求31至42中任一项的用途，其中给予需要治疗的患者的药物量为50至150mg/kg体重。
44.根据权利要求43的用途，其中给予需要治疗的患者的药物量为90至100mg/kg体重。
CN2004800376828A 2003-12-18 2004-12-20 通过电刺激获得的生物活性血清 Expired - Fee Related CN1893961B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EPPCT/EP03/14578 2003-12-18
PCT/EP2003/014578 WO2005058333A1 (de) 2003-12-18 2003-12-18 Methode zur gewinnung eines biologisch aktiven mit elektroschock behandelten blutserums und seine verwendung
US61973804P 2004-10-18 2004-10-18
US60/619,738 2004-10-18
PCT/EP2004/014510 WO2005058889A2 (en) 2003-12-18 2004-12-20 Biological active blood serum obtained by electrostimulation

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1893961A CN1893961A (zh) 2007-01-10
CN1893961B true CN1893961B (zh) 2010-09-22

Family

ID=34684505

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2004800376828A Expired - Fee Related CN1893961B (zh) 2003-12-18 2004-12-20 通过电刺激获得的生物活性血清

Country Status (3)

Country Link
CN (1) CN1893961B (zh)
AU (1) AU2003298215A1 (zh)
WO (1) WO2005058333A1 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1797890A1 (en) * 2005-12-09 2007-06-20 OWEN Holding LTD A method for obtaining a biologically active fraction of blood serum treated with gamma irradiation and the use thereof
JP6824960B2 (ja) * 2015-08-04 2021-02-03 バキシオン セラピューティクス，リミテッド ライアビリティ カンパニー 細菌由来ミニ細胞型バイオ医薬品の電離放射線照射滅菌およびその使用方法
CN115261321B (zh) * 2022-09-27 2022-12-27 北京大学口腔医学院 增强t淋巴细胞抗肿瘤功能的方法及用途

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2000251167A1 (en) * 2000-02-29 2001-09-12 Vitaly Alexandrovich Shestakov Method for producing a bioactive substance from blood serum

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
.用于制药的动物血清及其衍生物和代用品.国外医学.预防.诊断.治疗用生物制品分册23 1.2000,23(1),23-25.
.电刺激与神经再生.中华显微外科杂志19 4.1996,19(4),122-125.
于钟毓
仓尧卿
仓尧卿;史久华;.用于制药的动物血清及其衍生物和代用品.国外医学.预防.诊断.治疗用生物制品分册23 1.2000,23(1),23-25. *
史久华
张信英
杨群
杨群;于钟毓;张信英;.电刺激与神经再生.中华显微外科杂志19 4.1996,19(4),122-125. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN1893961A (zh) 2007-01-10
AU2003298215A1 (en) 2005-07-05
WO2005058333A1 (de) 2005-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11179322B2 (en) Methods and compositions for treating tumors with TTFields and sorafenib
Addolorato et al. Deep transcranial magnetic stimulation of the dorsolateral prefrontal cortex in alcohol use disorder patients: effects on dopamine transporter availability and alcohol intake
Lydic et al. Suprachiasmatic region of the human hypothalamus: homolog to the primate circadian pacemaker?
Zorman et al. Naloxone-reversible analgesia produced by microstimulation in the rat medulla
Wong et al. Peripheral nerve regeneration following crush injury to rat peroneal nerve by aqueous extract of medicinal mushroom Hericium erinaceus (Bull.: Fr) Pers.(Aphyllophoromycetideae)
AU2008292407B2 (en) Prophylactic or alleviating agent for peripheral nerve disorder induced by anti-cancer agent
Scheving et al. Survival and cure of leukemic mice after circadian optimization of treatment with cyclophosphamide and 1-β-D-arabinofuranosylcytosine
Li et al. c-Fos expression in the medulla induced by static muscle contraction in cats
Petrosyan et al. Effects of bacterial melanin on motor recovery and regeneration after unilateral destruction of substantia nigra pars compacta in rats
Museo et al. Microinjections of a nicotinic agonist into dopamine terminal fields: effects on locomotion
Péczely et al. Role of D1 dopamine receptors of the ventral pallidum in inhibitory avoidance learning
CN1893961B (zh) 通过电刺激获得的生物活性血清
RU2426548C2 (ru) Фармацевтическая композиция и способ получения антионкологических фракций сыворотки крови (аофс)
RU2551937C1 (ru) Способ восстановления селезенки после лучевой нагрузки
RU2364404C2 (ru) Биологически активная сыворотка крови, способы ее получения и ее применение
US20070110817A1 (en) Biological active blood serum obtained by electrostimulation
CN109675037B (zh) Atp及其受体在制备治疗自闭症药物中的应用
CN101448514A (zh) 黑素瘤的治疗
WO2009115429A1 (en) Food preparation and pharmaceutical composition containing an embryonic extract
AU2011285703A1 (en) Methods and pharmaceutical compositions for treating adverse or deleterious sequellae of traumatic brain injury
CN104922106B (zh) 青蒿琥酯在制备抗破骨细胞分化类药物中的应用
Duan et al. Brain targeting efficacy of novel drug delivery system in the treatment of Alzheimer's disease
JP2011511769A (ja) 大網及びその用途
CN101642465A (zh) 广东海风藤多糖在制备预防和/或治疗老年性痴呆症药物中的应用
RU2368378C1 (ru) Способ коррекции функциональных нарушений организма, вызванных повреждением нервных клеток мозга

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20100922

Termination date: 20101220