CN1886514B - 用于增强植物胁迫耐受性的方法 - Google Patents

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Abstract

通过在植物中导入表达冷休克蛋白例如细菌冷休克蛋白的DNA提供了植物中增强的非生物胁迫耐受性。

Description

用于增强植物胁迫耐受性的方法
相关申请交叉参考
依据35USC§119(e)，本申请要求2003年9月29日提交的美国临时申请系列号60/506，717和2003年12月7日提交的系列号60/530453的优先权。
序列表引入
两份序列表拷贝(序列表拷贝1和序列表拷贝2)以该序列表的计算机可读形式在此引入作为参考，这两份拷贝都在CD-ROMs上，分别含有2004年9月28日创建的命名为CSP.ST25.txt的文件，文件大小约为98兆字节(在MS-DOS中测得)。
发明领域
本发明涉及植物中冷、旱、盐、冷发芽(coldgermination)、热和其他非生物胁迫耐受性以及植物中病毒、真菌、细菌和其他非生物胁迫耐受性。具体来说，本发明涉及一种通过在植物细胞内表达冷休克蛋白增强所述植物生物和非生物胁迫耐受性的方法。
发明背景
种子和果实生产是数十亿美元的商品行业，对于美国许多州和世界上许多国家来说是其收入的主要来源。商业上有价值的种子包括，例如，低芥酸菜子(canola)、棉籽和向日葵籽，其备受珍视，因为从种子中可以榨取植物油。诸如豌豆、菜豆和小扁豆的豆科植物的种子由于它们富含蛋白质，因此在商业上也有价值，例如，就大豆来说，其含有40-45％的蛋白质及18％的脂类和油类。此外，咖啡亦是一种有价值的作物，由干燥并烘烤过的阿拉伯咖啡(Coffeaarabica)植物的种子制成，而巧克力则由可可树种子或“豆”制成。同样地，许多果实和种子在商业上也有价值，包括，例如玉米、稻、小麦、大麦和其他谷类、坚果、豆类、西红柿和柑橘类水果。例如，玉米种子可制成多种食品或用于烹饪的物品，如玉米面豆卷壳、玉米油、玉米饼、玉米片、玉米面等。玉米也用作为许多产品生产的原料，包括但不限于，饲料和酒精生产。
由于生物和非生物胁迫，种子和果实生产固有地受之所限。例如，大豆(Glycinemax)是一种在贮藏期间遭受种子发芽损失并当土壤温度降低时无法发芽的作物(Zhang等，PlantSoil188：(1997))。这种现象实际上也存在于玉米和其他重要的农作物中。改善植物的非生物胁迫耐受性在农业上将有利于作物，使得生长增加和/或在冷、旱、洪涝、热、紫外线胁迫、臭氧增加、酸雨、污染、盐胁迫、重金属、矿化土壤和其他非生物胁迫下发芽。生物胁迫，例如真菌和病毒感染，在世界范围内也导致大量作物减产。
几世纪来，传统育种(将一种基因型的特定等位基因与另一种杂交)业已用于增强生物胁迫耐受性、非生物胁迫耐受性和产量。传统育种固有地受限于亲本植物中所存在的有限数量的等位基因。其又限制了以这种方式累积的遗传变异性的数量。分子生物学已容许本发明的发明人能广泛地寻找可改善植物胁迫耐受性的基因。我们的发明人寻求确定其他生物如何对胁迫环境起反应并耐受之。冷休克蛋白是为细菌和其他生物在冷和胁迫环境下生存所使用系统的一部分。本发明人提出将编码冷休克蛋白及其相关蛋白的基因导入植物中并表达，将能增强植物的冷、旱、热、水分和其他非生物胁迫耐受性以及植物的真菌、病毒、和其他生物胁迫耐受性。他们也相信使用与冷休克蛋白同源或具有序列相似性的基因，也将能增强生物和非生物胁迫耐受性。
经营农业者可使用本发明来减少它们因生物和非生物胁迫所造成的损失。
发明概述
本发明提供了一种在植物细胞中表达冷休克蛋白(Csp)的植物。冷休克蛋白的表达在所述植物中产生了更强的非生物胁迫耐受性。在一个实施方案中，编码冷休克蛋白的多核苷酸通过可操纵地连接到在植物中起作用的启动子和终止子而得到表达。
更具体地说，本发明提供了一种重组DNA分子，在5’至3’方向包含：包含在植物中起作用的启动子的第一DNA多核苷酸，可操纵地连接到编码冷休克蛋白的第二DNA多核苷酸，其可操纵地连接到提供多腺苷酸化位点的3’转录终止DNA多核苷酸。所述第一DNA多核苷酸通常优选与第二DNA多核苷酸异源。本发明也提供了一种具有在第一DNA多核苷酸和第二DNA多核苷酸之间插入内含子的重组DNA分子。本发明也提供了一种重组DNA分子，其中所述第二DNA多核苷酸编码一种包含SEQIDNO：3基序的蛋白。在本发明重组DNA的特定实施方案中，所述第二DNA多核苷酸编码一种选自：
(a)具有基本上同一于革兰氏阳性细菌冷休克蛋白氨基酸序列的氨基酸序列的蛋白，
(b)来自枯草杆菌(Bacillussubtilis)的冷休克蛋白，
(c)枯草杆菌冷休克蛋白B(CspB)同系物，
(d)具有基本上同一于SEQIDNO：2的氨基酸序列的蛋白，
(e)具有基本上同一于革兰氏阴性细菌冷休克蛋白氨基酸序列的氨基酸序列的蛋白，
(f)包含来自大肠杆菌(Escherichiacoli)冷休克蛋白的蛋白，
(g)大肠杆菌冷休克蛋白A(CspA)同系物，
(h)具有基本上同一于SEQIDNO：1的氨基酸序列的蛋白，
(i)来自根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的冷休克蛋白，和
(j)具有基本上同一于SEQIDNO：5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63或65任一的氨基酸序列的蛋白。
本发明也提供了一种重组DNA分子，其中所述启动子选自由诱导型启动子、组成型启动子、时序调节型启动子、发育调节型启动子、组织优选型启动子、低温增强型启动子、低温特异性启动子、胁迫增强型启动子、胁迫特异性启动子、干旱诱导型启动子、缺水诱导型启动子和组织特异性启动子组成的组。
本发明也提供了在其基因组中包含上述重组DNA分子的植物细胞和植物以及繁殖体及由其产生的后代。植物包括，但不限于作物植物、单子叶植物和双子叶植物。更具体地说，这些植物可包括大豆、玉米、低芥酸菜子、稻、棉花、大麦、燕麦、草坪草、棉花和小麦。
本发明也提供了非生物胁迫耐受的转基因植物，其已用表达冷休克蛋白的重组DNA分子转化。这样的植物及其细胞和诸如种子的繁殖体在它们的基因组中包含表达冷休克蛋白的重组DNA分子。这样的植物具有一种或多种下列增强的性状：在限制相同种非转化植物生长的低温条件下更高的生长率，
(a)在限制相同种非转化植物生长的高温条件下更高的生长率，
(b)在限制相同种非转化植物生长的水分条件下更高的生长率，
(c)在限制相同种非转化植物生长的土壤和/或水中增加的盐类或离子条件下更高的生长率，
(d)在冷休克后较相同种未转化植物更大百分率的植物存活率，
(e)当与相同种未转化植物相比时增加的产量，或
(f)与相同种未转化植物相比对干旱的抗性。
本发明的一种方法包含繁殖本发明的植物，如，为了产生种子，仅通过将上述种子种植在土壤中并使之生长，如在胁迫环境下。更具体地说，本发明提供了一种生产的植物的方法，所述植物具有诸如非生物胁迫耐受性、增加的产量或增加的根群的增强的性状。所述方法包括步骤：
a)将包含编码冷休克蛋白DNA的重组DNA分子插入到植物细胞的基因组中，
b)获得转化的植物细胞，
c)从所述转化的植物细胞再生植物；和
d)择具有增强的性状的植物。
在本发明的一个方面，植物选自具有增强的非生物胁迫耐受性的植物，所述非生物胁迫耐受性选自：耐热性、耐盐性、耐旱性和冷休克后存活。
本发明也提供了分离的蛋白质，其是至少40％同一于具有选自SEQIDNOS：5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63和65的氨基酸序列的蛋白质。在某些方面，可通过用具有较40％同一性更高的同源性的蛋白质来取代冷休克蛋白以获得类似的性状。如，用与在此具体披露的冷休克蛋白具有至少50％、60％、70％、80％、90％或至少95％同一性的蛋白质来取代。同样地，本发明也提供了一种编码冷休克蛋白基序的分离的核酸，其可与具有选自SEQIDNOs：4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，90和92的DNA序列的核酸杂交。
本发明也具体提供了编码冷休克蛋白的分离的核酸，所述冷休克蛋白具有基本上同一于选自SEQIDNOs：5，7，9，29，31，33，35，37，39，41，43，53，55，57，59，61，63和65序列的DNA序列。
本发明也提供了包含上述重组DNA分子的繁殖体，当它们被种植或以其他方式发芽时，从所述繁殖体发芽的田间作物，如在上述繁殖体所播种的田地上。
本发明也提供了一种生产种子的方法，包括在土壤中种植权利要求59的种子；
b)从所述植物收获种子；因此生产得到种子。
也提供了一种生产转基因植物的方法，所述方法包括步骤：(i)将DNA分子导入植物细胞的基因组中，所述DNA分子包含至少40％同源于具有选自SEQIDNos：5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63和65的氨基酸序列的蛋白的DNA多核苷酸，或其片段、顺式元件，其中所述DNA多核苷酸可操纵地连接到启动子并且可操纵地连接到3’转录终止DNA多核苷酸；和(ii)选择所述转基因植物细胞；和(iii)在转基因植物中再生所述转基因植物细胞；也提供了通过该方法生产的植物。
附图简述
图1显示了pMON57396的质粒图。
图2显示了pMON23450的质粒图。
图3显示了pMON57397的质粒图。
图4显示了pMON57398的质粒图。
图5显示了pMON23450的质粒图。
图6显示了pMON57399的质粒图。
图7显示了pMON48421的质粒图。
图8显示了pMON56609的质粒图。
图9显示了pMON56610的质粒图。
图10显示了pMON73607的质粒图。
图11显示了pMON61322的质粒图。
图12显示了pMON73608的质粒图。
图13显示了pMON65154的质粒图。
图14显示了pMON72472的质粒图。
图15显示了pENTRl的质粒图。
图16显示了表达指示基因植物和对照植物的生长型，显示了所导入的基因提供了非生物胁迫耐受性。
图17显示了pMON42916的质粒图。
图18显示了pMON73983的质粒图。
图19显示了pMON73984的质粒图。
具体实施方案详述
本发明提供了一种对生物和非生物胁迫具有增强的耐受性的植物。由于在所述植物的细胞中表达了冷休克蛋白(csp)，所提供的植物具有增强的胁迫耐受性。本发明提供了几个实施方案的例子，并预计其他实施方案应能在本发明中起作用。
提供了下列定义和方法以便更好地定义本发明并指导本领域普通技术人员实践本发明。除非另作说明，术语将依照本领域普通技术人员之惯例进行理解。例如，分子生物学和分子遗传学的常用术语的定义可见于Lewin，GenesVII，OxfordUniversityPressandCellPress，NewYork，2000；Buchanan，等，BiochemistryandMolecularBiologyofPlants，CourierCompanies，USA，2000；Lodish，等，MolecularCellBiology，W.H.FreemanandCo.，NewYork，2000。遗传学的常用术语可见于在前的参考文献和Lynch，等，GeneticsandAnalysisofQuantitativeTraits，SinauerandAssociates，Sunderland，MA，1998；Hartwell，等，Genetics：FromGenestoGenomes，McOraw-HillCompanies，Boston，MA，2000；Hartl，等，Genetics：AnalysisofGenesandGenomes，JonesandBartlettPublishers，Sudbury，MA；Strachan，等，HumanMolecularGenetics，JohnWileyandSons，NewYork，1999。
使用了37CFR§1.822所示的DNA碱基命名法。使用了标准的单字母和三字母氨基酸残基命名法。
许多农学性状能影响“产量”。例如，这些性状可包括，不限于，株高、英数、植物上英位置、节间数量、英裂倾角、粒度、根瘤和固氮作用效率、营养素同化作用效率、生物和非生物胁迫抗性、碳同化、植物结构、倒伏抗性、种子发芽率、幼苗活力以及幼株性状。例如，这些性状也可包括，不限于，发芽率(包括在胁迫条件下的发芽)、任一或所有植物部位的生长率(包括在胁迫条件下的生长率)、穗数量、每一穗的种子数量、种子粒度、种子成分(淀粉、油、蛋白质)、种子饱满特性。可用多种方法来测定产量，这些方法可包括容重、种子重量、每株植物种子数量、每株植物种子重量、每单位面积种子数量或重量(即每英亩种子数量或种子重量)、每英亩蒲式耳数、每英亩公吨数、每英亩美吨数、每公顷公斤数。在一个实施方案中，本发明植物表现了增强的性状，即为产量之一要素。
“核酸(序列)”或“多核苷酸(序列)”指基因组或合成来源的单链或双链DNA(脱氧核糖核酸)或RNA(核糖核酸)，即分别为脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的多聚体，读码从5’(上游)末端到3’(下游)末端。所述核酸可为正义或互补(反义)链。
“天然的”指天然存在的(“野生型“)核酸序列。
“异源”序列指来源于外源或外来物种的序列，或者如果是相同来源的，则为来自其原型修饰的序列。例如，天然启动子可用来使相同或不同物种中的异源基因发生转录。
植物“部位”包括植物的所有部位或部分，包括，但不限于，根、苗、叶、茎、花粉、种子、花、雄蕊、雌蕊、菌蕾、胚、花瓣、花丝、心皮(包括柱头、子房和花柱)、细胞或上述的任何部分。
“繁殖体”包括减数分裂和有丝分裂的所有产物，包括但不限于，种子和能繁殖为新植物的植物部位。例如，繁殖体包括苗、根或其他能生长为完整植物的植物部位。繁殖体也包括嫁接体，在此植物的一部分嫁接到不同植物(甚至是不同种的植物)的另一部分上以产生活的生物体。繁殖体也包括通过克隆、通过聚集减数分裂产物或使减数分裂产物聚集形成胚或受精卵(天然地或人为干预的)所产生的所有植物和种子。
“分离的”核酸序列是基本上分离或纯化的，不含其天然存在的生物体细胞中通常与之相关的其他核酸序列，即其他的染色体或DNA。该术语包括生物化学纯化的核酸，使得基本上除去污染的核酸和其他细胞组分。该术语也包括重组核酸和化学合成的核酸。
在此使用的“同一性”或“同一的”，当涉及在蛋白质或核酸之间比较时，指98％或更高的同一性。
如果第一核酸或蛋白质序列显示“基本上同一”或“基本上相似”于参照核酸序列或蛋白质，当与其他核酸(或其互补链)或蛋白质进行最优比对(在比较窗口内具有总和小于参照序列的20％的适当的核苷酸或氨基酸插入或缺失)时，在至少20个核苷酸或氨基酸位置、优选至少50个核苷酸或氨基酸位置、更优选至少100个核苷酸或氨基酸位置、以及最优选在全长的第一核酸或蛋白质的比较窗口内有至少约60％核苷酸序列相等，更好为70％，优选至少约80％相等，更优选至少约85％相等，以及最优选至少约90％相等。用于比对比较窗口的最优比对可通过局部同源性算法来执行，优选通过使用计算机执行这些算法(可见于，例如，Wisconsin遗传学软件包7.0版，GeneticsComputerGroup，575ScienceDr.，Madison，WI)。所述参照核酸可以是全长分子或更长分子的一部分。换句话说，如果在严格条件下互相杂交，则两个核酸是基本上同一的。合适的杂交条件可根据经验来确定，或如果已知的话，可基于例如探针相对的G+C含量以及在探针和靶序列之间错配数量来估计。可通过改变例如杂交温度或盐浓度而自由地调整杂交条件(Sambrook等.，MolecularCloning.ALaboratoryManual，第2版，ColdSpringHarborPress，1989)。
当序列是如此排列使得第一核酸序列影响第二核酸序列的功能时，第一核酸序列是与第二核酸序列“可操纵地连接”。优选地，所述两个序列是单个连续核酸分子的一部分，更优选是相邻的。例如，如果在细胞中该启动子调节或介导该基因的转录，则其与该基因是可操纵地连接。例如，当所述终止子导致RNA聚合酶在该终止子处或附近终止含有所述基因的转录产物时，转录终止区域(终止子)与该基因是可操纵地连接。例如，增强子通常并不与其所作用的启动子相毗连，但是一般位于同一个核酸分子中。
通过人工组合两种不同的分离的序列片断制备得到“重组”核酸或DNA、或RNA分子，如，通过化学合成或通过基因工程技术操作分离的核酸片断。用于核酸操作的技术众所周知(参见，如.，Sambrook等.，MolecularCloning：ALaboratoryManual，第2版，ColdSpringHarborPress，1989)。例如，在Beaucage和Carruthers，Tetra.Letts.22：1859-1862，1981，和Matteucci等，J.Am.Chem.Soc.103：3185，1981中讨论了核酸化学合成所使用的方法，例如，可在商用寡核苷酸自动合成仪上进行核酸的化学合成。
基因“表达”指基因转录产生相应的mRNA以及该mRNA翻译生成相应的基因产物，即肽、多肽或蛋白。基因表达受调控元件控制或调节，所述调控元件包括诸如启动子的5’调控元件。
术语“重组DNA构建体”、“重组载体”、“表达载体”或“表达盒”指任何来源的，具有基因组整合或自主复制能力的所有介质，例如质粒、粘粒、病毒、BAC(细菌人工染色体)、自主复制序列、噬菌体、线状或环状单链或双链DNA或RNA核苷酸序列，其包含DNA分子，其中一个或多个DNA序列业以功能上可操作的方式连接。
“互补”指核酸序列通过碱基配对的天然结合。如果仅有一些核酸配对是互补的，则两个单链分子间的互补可以是部分的；或者如果所有的碱基对都是互补的，则上述单链分子间的互补是完全的。互补度影响了杂交和扩增反应的效率和强度。
“同源性”指核酸或氨基酸序列之间相似性水平，用核苷酸或氨基酸同一性或相似性词句，分别为序列相似性或同一性。同源性、同系物以及同源的也指在不同核酸或蛋白质之间具有相似功能性的概念。同系物包括定向进化同源和平行进化同源的基因。同系物可依所使用的基因编码序列来确定，以一种或多种下列方式披露在此或见于合适的数据库(例如NCBI或其他数据库)。对于蛋白质序列而言，序列应当使用算法进行比较(例如参见涉及“同一性”和“基本上同一”部分的内容)。对于核苷酸序列而言，一个DNA分子的序列可与已知或推定同源的序列以大致相同的方式进行比较。在分子(DNA、RNA或蛋白质分子)任何完整的实质(25个核苷酸或氨基酸，更优选50个核苷酸或氨基酸，更优选100个核苷酸或氨基酸，或最优选较短序列的全长)区域上，同系物具有至少20％、更优选30％、更优选40％、更优选50％、更优选60％、更优选70％、更优选80％、更优选88％、更优选92％、最优选95％的同一性。
或者，如果具有相似功能的两条序列，或其中一条或两条序列的互补序列，在严谨条件下互相杂交，则两条序列，或编码或可编码氨基酸序列的DNA或RNA是同源的，或是同系物，或编码同源序列。因此，如果要确定两条蛋白质序列是否是同系物，则这两条序列都要进行在此描述的计算机作业，并创建所有可能的能编码蛋白质的核酸序列的简并密码序列，确定它们是否能在严谨条件下杂交。促使DNA杂交的合适的严谨条件，例如，在约45℃下在6.0×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，接着在50℃下用2.0×SSC洗涤，为本领域技术人员所熟知，或可见于CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。例如，洗涤步骤中的盐浓度可从在50℃下约2.0×SSC的低严谨性到在50℃下约0.2×SSC的高严谨性中选择。此外，洗涤步骤的温度可从在约22℃的室温下的低严谨条件递增到约65℃的高严谨条件。温度和盐浓度都可以改变，或当温度和盐浓度中的一个变量改变时，另一个保持不变。在一个优选的实施方案中，编码本发明所述蛋白的核酸在高严谨条件下可与一个或多个核酸分子或其互补分子或两者的片段特异性杂交，例如在约65℃下在约2.0×SSC中。可通过本领域技术人员所熟知的多种方法检测探针与靶DNA分子的杂交，这些方法包括，但不限于，荧光标记、放射性标记、基于抗体的标记和化学发光标记。
“冷休克蛋白”(Csp(s)或CSP(s))是具有与大肠杆菌CspA蛋白(SEQIDNO：1)或枯草杆菌CspB蛋白(SEQIDNO：2)大于40％同一性的蛋白，或者，冷休克蛋白可通过使用在文献中所确定的保守结构域来发现。例如，在大肠杆菌CspA或枯草杆菌CspB全长范围中，在此使用的冷休克蛋白与大肠杆菌CspA或枯草杆菌CspB具有40％同一性，更优选50％同一性，更优选60％同一性，更优选70％同一性，更优选80％同一性，更优选90％同一性，更优选95％同一性。可利用几个数据库，提供给本领域技术人员来确定是否新的或现有的蛋白包含冷休克结构域或是否为冷休克蛋白，包括从Genbank到用来提供确定蛋白相互关系和/或发现相关蛋白的蛋白质数据库。在此包括于该定义中的是所有已知的冷休克蛋白，包括但不限于来自大肠杆菌的CspA，CspB，CspC，CspD，CspE，CspF，CspG，CspH和CspI(美国专利6,610,533)。
所述保守的冷休克结构域示于SEQNO：3([FY]-G-F-I-x(6，7)-[DER]-LIVM]-F-x-H-x-[STKR]-x-[LIVMFY])(Prosite基序PS00352；Bucher和Bairoch，(In)ISMB-94；Proceedings2ndInternationalConferenceonIntelligentSystemsforMolecularBiology，AltmanR.，BrutlagD.，KarpP.，LathropR.，SearlsD.，编.，MenloPark，1994；Hofmann等，NucleicAcidsRes.27：215，1999)中。或者，可使用Sprint数据库(一种相关的蛋白指纹图谱数据库)(Attwood等.，NucleicAcidsRes.28：2000；Attwood，等.，NucleicAcidsResearch，30(1)，出版中，2002)来发现冷休克蛋白。或者，可使用基于描述的矩阵或Pfam来发现冷休克蛋白。Pfam是一种多重序列比对和包含许多常见蛋白结构域的隐马尔可夫模型的大集合(Bateman等，NucleicAcidsResearch28：263，2000)。在写操作下(2001年11月；Pfam第6版)，有3071个家族。包括冷休克蛋白，为PF00313。物种树显示了在Pfam数据库中所确定的冷休克蛋白的归类。
在此使用的“冷休克蛋白”也包括，但不限于，在使用冷休克蛋白作为使用NCBI的“Blink”(BlastLink)函数的数据库的询问序列的搜索中所发现的任何蛋白。“Blink”是一种快速搜索函数，用于寻找具有相似序列的蛋白质。该“冷休克蛋白”或“冷休克结构域”的定义除用于上述的那些之外，并不能代替所述的定义。冷休克蛋白或含有冷休克结构域的蛋白包括，但不限于，在公用和专用数据库中所有目前已知的蛋白，以及还要去发现的足以相似于所宣称的蛋白(例如，大肠杆菌CspA和枯草杆菌CspB)的那些，其在BlastLink(2001年11月1日)所普遍使用的标准blast搜索设定值下被“命中”。在写操作时，Blast2正运行，且BlastLink(“Blink”)运行缺省参数进行蛋白质-蛋白质blast搜索。在写操作时，我们认为Blink使用的缺省设定值如下：运行BLOSUM62矩阵，使用“nr”数据库，选择CD搜索，作为是基于统计学的组合，具有选作为“低复杂性”的复杂性，期望值为10，具有3的字长，缺口罚分是存在11和延伸1。表I所列的显示了使用这些标准设定值对大肠杆菌CspA最初的200个命中，但我们并不限制我们的权利要求在这最初的200个命中中。本领域技术人员应注意在这些相当严格的标准下，发现了167个细菌来源的蛋白，但也发现了28个多细胞动物蛋白和5个植物蛋白。这些蛋白包括来源广泛的与CspA同源的蛋白，发明人预计其在本发明中将发挥作用。该表决不是包括一切的列表，预计其他蛋白将在本发明中发挥作用。
表20.依据与大肠杆菌CspA相似性所发现的一些冷休克蛋白和含有冷休克结构域的蛋白。该列表是使用NCBI标准的BlastLink设定值所编辑的。显示了每个蛋白的GenbankID和名称。注释：由于蛋白命名的方式，一些蛋白和序列将具有几个登录项，如蛋白、cDNAs、等位基因等。GenbankID可被认为是每一登录项的特定标识符。登录项以与询问序列比较得到的最高到最低同一性的大概次序排列。
GenbankID# 基因名称
576191 大肠杆菌的主要冷休克蛋白7.4(Cspa(Cs 7.4))
349561 DNA-结合蛋白[鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)]
3891780 来自大肠杆菌溶解物Nm的主要冷休克蛋白，链A
479003 冷休克蛋白[大肠杆菌]
1778828 主要冷休克蛋白CSPA2[结肠耶氏菌(Yersiniaenterocolitica)]
6073870 主要冷休克蛋白CSPA1[结肠耶氏菌]
1468921 冷休克蛋白CspG[大肠杆菌]
2275140 假定的蛋白[鼠疫耶氏菌(Yersinia pestis)]
12514257 沙门氏菌冷休克蛋白同系物[大肠杆菌O157:H7]
15981565 主要冷休克蛋白Cspa1[鼠疫耶氏菌]
3249024 冷休克蛋白CspB[结肠耶氏菌]
15979692 冷休克蛋白[鼠疫耶氏菌]
1742550 冷休克样蛋白CspB[大肠杆菌]
16419141 RNA蛋白伴侣，cspA转录负调节子[沙门氏菌属(Salmonella)]
10039151 冷休克样蛋白cspE[巴克纳氏菌(Buchnera sp.)APS)]
9957540 冷休克蛋白B[结肠耶氏菌]
1778540 冷休克样蛋白[大肠杆菌]
471099 CspE(MsmC)[大肠杆菌]
2961317 cspB[鼠伤寒沙门氏菌]
16503235 冷休克蛋白[Salmonella enterica subsp.entericaserovar]
9658370 冷休克蛋白家族蛋白[霍乱弧菌(Vibrio cholerae)]
460698 CspC(MsmB)[大肠杆菌]
15980582 推定的冷休克蛋白[鼠疫耶氏菌]
10038996 冷休克样蛋白cspC[巴克纳氏菌(Buchnera sp.)APS]
15979774 冷休克蛋白[鼠疫耶氏菌]
9657556 冷休克转录调节蛋白CspA[霍乱弧菌]
4454361 冷休克蛋白，CSPA[霍乱弧菌]
2970685 冷休克蛋白C[鼠伤寒沙门氏菌]
1402743 主要冷休克蛋白[弗罗因德(氏)枸橼酸杆菌(Citrobacter freundii)]
5869509 CspG[Shewanella violacea]
5869504 CspA[Shewanella violacea]
9968446 冷休克蛋白[胚芽乳杆菌(Lactobacillus plantarum)]
1405474 CspC蛋白[蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)]
3850776 冷休克蛋白D[乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)]
10176234 冷休克蛋白[Bacillus halodurans]
1869948 冷休克蛋白[胚芽乳杆菌]
729220 冷休克蛋白CSPC
7379745 推定的转录调节蛋白[脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)Z2491]
1620431 csp[胚芽乳杆菌]
1405472 CspB蛋白[蜡样芽胞杆菌]
3892590 冷休克蛋白E[乳酸乳球菌]
7226073 冷休克结构域家族蛋白[脑膜炎奈瑟氏球菌MC58]
2493766 冷休克样蛋白CSPLA(CSPL)
1001878 CspA蛋白[单核细胞增多性李司忒(氏)菌(Listeriamonocytogenes)]
13623066 推定的冷休克蛋白[酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)M1GAS]
758663 冷休克蛋白[球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)]
4468119 冷休克蛋白A；CspA蛋白[百日咳杆菌(Bordetellapertussis)]
2370256 冷休克蛋白[乳酸乳球菌]
1405470 CspA蛋白[蜡样芽胞杆菌]
2226349 CspC[金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)]
1405476 CspD蛋白[蜡样芽胞杆菌]
1513079 冷驯化蛋白A[莓实假单胞菌(Pseudomonas fragi)]
7242722 冷休克蛋白[天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)]
2425105 主要冷休克蛋白[藤黄微球菌(Micrococcus luteus)]
2105046 cspA[结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)H37Rv]
15023696 冷休克蛋白[丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)]
12720931 MsmB[多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)]
8101860 主要冷休克蛋白CspA[金黄色葡萄球菌]
1513081 冷驯化蛋白B[莓实假单胞菌]
3097243 小冷休克蛋白[麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)]
9587215 冷休克蛋白CspA[耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)]
9107526 冷休克蛋白[苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)9a5c]
1256629 冷休克蛋白[枯草杆菌]
12054789 冷休克蛋白(CspLB)[单核细胞增多性李司忒(氏)菌]
1864167 主要冷休克蛋白同系物CspB[单核细胞增多性李司忒(氏)菌]
1421212 主要冷休克蛋白(Cspb)
297761 冷休克蛋白(CspB)[枯草杆菌]
13625473 冷驯化蛋白CapB[假单胞菌(Pseudomonas sp.)30/3]
9657576 冷休克DNA-结合域蛋白[霍乱弧菌]
11933043 冷休克样蛋白[结节链霉菌(Streptomyces nodosus)]
11933034 冷休克样蛋白[吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)]
8248794 冷休克蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]
1778825 主要冷休克蛋白CspA[铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)]
740006 冷休克蛋白
2226347 CspB[金黄色葡萄球菌]
1616777 冷休克样蛋白[橙色标桩菌(Stigmatella aurantiaca)]
7210998 冷休克蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]
729217 冷休克蛋白CSPB
1067201 冷休克蛋白[天蓝色链霉菌]
7321274 冷休克蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]
1402789 主要冷休克蛋白[结肠耶氏菌]
1513086 温度驯化蛋白B[莓实假单胞菌]
16411332 类似于冷休克蛋白[单核细胞增多性李司忒(氏)菌]
5732895 F40[天蓝色链霉菌A3(2)]
4193390 CspA[黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)]
4193394 CspC[黄色粘球菌]
1405478 CspE蛋白[蜡样芽胞杆菌]
1402753 主要冷休克蛋白[肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)]
2983729 冷休克蛋白[Aquifex aeolicus]
2815334 冷休克结构域蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]
4193398 CspE[黄色粘球菌]
4193396 CspD[黄色粘球菌]
2894098 冷休克蛋白[海栖热袍菌(Thermotoga maritime)]
15074838 推定的冷休克样转录调节蛋白
1402731 主要冷休克蛋白[嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)]
46789 7kDa冷休克样蛋白[带小棒链霉菌(Streptomycesclavuligerus)]
9946316 可能的冷休克蛋白[铜绿假单胞菌]
1402769 主要冷休克蛋白[普通变形菌(Proteus vulgaris)]
456240 主要冷休克蛋白(CspB)[Sporosarcina globispora]
19743 nsGRp-2[Nicotiana sylvestris]
15026046 冷休克蛋白[丙酮丁醇梭菌]
11493820 冷休克蛋白C[结肠耶氏菌]
4982460 冷休克蛋白[海栖热袍菌]
15979415 冷休克样蛋白[鼠疫耶氏菌]
16419455 类似于CspA但不是冷休克诱导的[鼠伤寒沙门氏菌]
14523127 推定的冷休克蛋白[苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)]
9107847 温度驯化蛋白B[苛养木杆菌9a5c]
3036806 富甘氨酸蛋白[拟南芥(Arabidopsis thaliana)]
2182333 Y4cH[根瘤菌(Rhizobium sp.)NGR234]
1402733 主要冷休克蛋白[杀鲑气单胞菌(Aeromonassalmonicida)]
9655615 冷休克样蛋白CspD[霍乱弧菌]
3831556 主要冷休克蛋白[粪肠球菌(Enterococcus faecalis)]
3821915 主要冷休克蛋白[乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcuslactis subsp.cremoris)]
15160284 AGR_L_3376p[根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)]
6458627 冷休克蛋白，CSD家族[耐放射异常球菌(Deinococcusradiodurans)]
3821923 主要冷休克蛋白[瑞士乳酸杆菌(Lactobacillushelveticus)]
3821911 主要冷休克蛋白[乳酸乳球菌乳脂亚种]
15157349 AGR_C_4003p[根癌农杆菌]
15154976 AGR_C_161p[根癌农杆菌]
3831558 主要冷休克蛋白[戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)]
456238 冷休克蛋白[枯草杆菌]
117574 冷休克样蛋白CSPD(CSP-D)
12620649 ID534[大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)]
13424521 冷休克结构域家族蛋白[新月柄杆菌(Caulobactercrescentus)]
3776223 CspA[苜蓿中华根瘤菌]
15075353 推定的冷休克转录调节蛋白[Sinorhizobium
15075133 可能的冷休克转录调节蛋白[Sinorhizobium
3821913 主要冷休克蛋白[乳酸乳球菌乳脂亚种]
13476765 冷休克蛋白[Mesorhizobium loti]
3821925 主要冷休克蛋白[唾液链球菌嗜热亚种(Streptococcusthermophilus)]
3821921 主要冷休克蛋白[嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)]
729222 冷休克样蛋白CSPJ
15162334 AGR_pAT_762p[根癌农杆菌]
13475232 冷休克蛋白[Mesorhizobium loti]
9947082 可能的冷休克蛋白[铜绿假单胞菌]
13424199 冷休克结构域家族蛋白[新月柄杆菌]
9948689 冷休克蛋白CspD[铜绿假单胞菌]
4193392 CspB[黄色粘球菌]
13488430 冷休克蛋白[Mesorhizobium loti]
12720739 CspD[多杀巴斯德氏菌]
3831560 主要冷休克蛋白[动物双歧杆菌(Bifidobacteriumanimalis)]
1513084 温度驯化蛋白A[莓实假单胞菌]
1169113 冷休克样蛋白CSPD
5714745 冷休克蛋白7.4[红球菌(Rhodococcus sp.)7/1]
1402767 主要冷休克蛋白[明亮发光杆菌(Photobacteriumphosphoreum)]
14523160 可能的CspA5冷休克蛋白转录调节子
15979447 冷休克样蛋白[鼠疫耶氏菌]
13488214 冷休克蛋白[Mesorhizobium loti]
5714743 冷休克蛋白A[红球菌(Rhodococcus sp.)5/14]
3861208 冷休克样蛋白(cspA)[普氏立克次氏体(Rickettsiaprowazekii)]
81624 富甘氨酸蛋白2-拟南芥
15156913 AGR_C_3315p[根癌农杆菌]
15074652 推定的冷休克转录调节蛋白[Sinorhizobium
7295442 CG17334基因产物[黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)]
3850772 冷休克蛋白A[乳酸乳球菌]
14334920 推定的富甘氨酸锌指DNA-结合蛋白[Arabaidopsis
3892588 冷休克蛋白C[乳酸乳球菌]
2708747 推定的富甘氨酸锌指DNA-结合蛋白[Arabaidopsis
2739396 Y-框蛋白[黑腹果蝇]
1402763 主要冷休克蛋白[明亮发光杆菌]
15620137 冷休克样蛋白[康氏立克次氏体(Rickettsia conorii)]
1402755 主要冷休克蛋白[干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)]
409419 Y-框因子[Aplysia californica]
14039811 Y-框结合蛋白[日本裂体吸虫(Schistosomajaponicum)]
9946868 可能的冷休克蛋白[铜绿假单胞菌]
1483311 Y-框蛋白[Dugesia japonica]
1477478 Y-框结合蛋白[曼氏裂体吸虫(Schistosoma mansoni)]
1402759 主要冷休克蛋白[无害利斯特氏菌(Listeria innocua)]
15159048 AGR_L_1288p[根癌农杆菌]
2228815 主要冷休克蛋白CspH[鼠伤寒沙门氏菌]
6911694 冷休克蛋白A[唾液链球菌嗜热亚种]
2970679 Y框蛋白[黑腹果蝇]
14602477 类似于冷休克结构域蛋白A[智人(Homo sapiens)]
10727970 yps基因产物[黑腹果蝇]
1402757 主要冷休克蛋白[格雷氏李斯特氏菌(Listeria grayi)]
1402751 主要冷休克蛋白[粪肠球菌]
1083796 RYB-a蛋白-大鼠
505133 RYB-a[褐鼠(Rattus norvegicus)]
14523481 可能的CspA6冷休克蛋白转录调节子
8100512 Y-框蛋白ZONAB-B[Canis familiaris]
8100510 Y-框蛋白ZONAB-A[Canis familiaris]
15306095 假定的蛋白XP_053028[智人]
10185725 Y-框蛋白3短异构体[小鼠(Mus musculus)]
10185723 Y-框蛋白3长异构体[小鼠]
7385223 RNA结合蛋白MSY4[小鼠]
6166110 DNA-结合蛋白A(冷休克结构域蛋白A)
1402783 主要冷休克蛋白[酿脓链球菌]
1167838 DNA-结合蛋白[智人]
1160331 dbpA鼠同系物[小鼠]
1101884 YB2[Rattus norvegicus]
950340 DNA-结合蛋白A[智人]
532211 Y-框结合蛋白[小鼠]
87332 DNA-结合蛋白A-人(片段)
14742409 假定的蛋白XP_046353[智人]
14270385 冷休克结构域蛋白[Takifugu rubripes]
9653686 TSH受体抑制元件结合蛋白-1；TSEP-1
8249978 冷休克蛋白B[天蓝色链霉菌)A3(2)]
3695368 zfY1[Danio rerio]
枯草杆菌(B.subtilis)CspB是一种在对冷休克响应中累积的蛋白(Willimsky，等，JournalofBacteriology174：6326(1992))。其与来自大肠杆菌的CspA具有同源性(见表I)并含有单链核酸结合域(Lopez，等，TheJournalofBiologicalChemistry276：15511(2001))。在NCBI(Blink)中使用相同的基本Blast搜索，下列蛋白被指定为“命中”。在此所示的命中数量限制在200，但许多其他蛋白预计可在本发明中起作用。
表21.用枯草杆菌CspB搜索所发现的一些冷休克蛋白和含有冷休克结构域的蛋白。该列表是使用NCBI标准的BlastLink(Blink)设定值所编辑的。显示了每个蛋白的GenbankID和名称。注释：由于蛋白命名的方式，一些蛋白和序列将具有几个登录项，如蛋白、cDNAs、等位基因等。GenbankID可被认为是每一登录项的特定标识符。登录项以与询问序列比较得到的最高到最低同一性的大概次序排列。
GenbankID# 基因名称
1421212 主要冷休克蛋白(Cspb)
1405476 CspD蛋白[蜡样芽胞杆菌]
729217 冷休克蛋白CSPB
456240 主要冷休克蛋白(CspB)[Sporosarcina globispora]
1256629 冷休克蛋白[枯草杆菌]
740006 冷休克蛋白
456238 冷休克蛋白[枯草杆菌]
12054789 冷休克蛋白(CspLB)[单核细胞增多性李司忒(氏)菌]
1864167 主要冷休克蛋白同系物CspB[单核细胞增多性李司忒(氏)菌]
1405472 CspB蛋白[蜡样芽胞杆菌]
8101860 主要冷休克蛋白CspA[金黄色葡萄球菌]
16411332 类似于冷休克蛋白[单核细胞增多性李司忒(氏)菌]
10176234 冷休克蛋白[Bacillus halodurans]
2493766 冷休克样蛋白CSPLA(CSPL)
1001878 CspA蛋白[单核细胞增多性李司忒(氏)菌]
1405470 CspA蛋白[蜡样芽胞杆菌]
1405474 CspC蛋白[蜡样芽胞杆菌]
13623066 推定的冷休克蛋白[酿脓链球菌M1GAS]
729220 冷休克蛋白CSPC
2226349 CspC[金黄色葡萄球菌]
9968446 冷休克蛋白[胚芽乳杆菌]
1402739 主要冷休克蛋白[枯草杆菌]
3892590 冷休克蛋白E[乳酸乳球菌]
2226347 CspB[金黄色葡萄球菌]
3850776 冷休克蛋白D[乳酸乳球菌]
1402741 主要冷休克蛋白[枯草杆菌]
15979774 冷休克蛋白[鼠疫耶氏菌]
10039151 冷休克样蛋白cspE[巴克纳氏菌(Buchnera sp.)APS]
8248794 冷休克蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]
460698 CspC(MsmB)[大肠杆菌]
11933043 冷休克样蛋白[结节链霉菌]
11933034 冷休克样蛋白[吸水链霉菌]
1620431 csp[胚芽乳杆菌]
16419141 RNA蛋白伴侣，cspA转录负调节子[鼠伤寒沙门氏菌LT2]
15979692 冷休克蛋白[鼠疫耶氏菌]
2894098 冷休克蛋白[海栖热袍菌]
1869948 冷休克蛋白[胚芽乳杆菌]
2370256 冷休克蛋白[乳酸乳球菌]
2970685 冷休克蛋白C[鼠伤寒沙门氏菌]
1778540 冷休克样蛋白[大肠杆菌]
471099 CspE(MsmC)[大肠杆菌]
10038996 冷休克样蛋白cspC[巴克纳氏菌(Buchnera sp.)APS]
7242722 冷休克蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]
15026046 冷休克蛋白[丙酮丁醇梭菌]
15980582 推定的冷休克蛋白[鼠疫耶氏菌]
9657576 冷休克DNA-结合域蛋白[霍乱弧菌]
349561 DNA-结合蛋白[鼠伤寒沙门氏菌]
4982460 冷休克蛋白[海栖热袍菌]
1405478 CspE蛋白[蜡样芽胞杆菌]
9946316 可能的冷休克蛋白[铜绿假单胞菌]
9658370 冷休克蛋白家族蛋白[霍乱弧菌]
5869509 CspG[Shewanella violacea]
1067201 冷休克蛋白[天蓝色链霉菌]
9948689 冷休克蛋白CspD[铜绿假单胞菌]
3891780 来自大肠杆菌溶液Nm的主要冷休克蛋白，链A
576191 大肠杆菌的主要冷休克蛋白7.4(Cspa(Cs 7.4)
72232 主要冷休克蛋白cspA-大肠杆菌
9657556 冷休克转录调节蛋白CspA[霍乱弧菌]
6458627 冷休克蛋白，CSD家族[耐放射异常球菌]
3831556 主要冷休克蛋白[粪肠球菌]
15023696 冷休克蛋白[丙酮丁醇梭菌]
2425105 主要冷休克蛋白[藤黄微球菌]
1402737 主要冷休克蛋白[蜡样芽胞杆菌]
9587215 冷休克蛋白CspA[耻垢分枝杆菌]
7226073 冷休克结构域家族蛋白[脑膜炎奈瑟氏球菌MC58]
4454361 冷休克蛋白，CSPA[霍乱弧菌]
479003 冷休克蛋白[大肠杆菌]
3097243 小冷休克蛋白[麻风分枝杆菌]
1778828 主要冷休克蛋白CSPA2[结肠耶氏菌]
758663 冷休克蛋白[球形节杆菌]
2105046 cspA[结核分枝杆菌H37Rv]
7379745 推定的转录调节蛋白[脑膜炎奈瑟氏球菌Z2491]
3249024 冷休克蛋白CspB[结肠耶氏菌]
7210998 冷休克蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]
1513081 冷驯化蛋白B[莓实假单胞菌]
5869504 CspA[Shewanella violacea]
1778825 主要冷休克蛋白CspA[铜绿假单胞菌]
1513086 温度驯化蛋白B[莓实假单胞菌]
12514257 沙门氏菌冷休克蛋白同系物[大肠杆菌O157:H7]
5732895 F40[天蓝色链霉菌A3(2)]
3831558 主要冷休克蛋白[戊糖片球菌]
1468921 冷休克蛋白CspG[大肠杆菌]
13625473 冷驯化蛋白CapB[假单胞菌(Pseudomonas sp.)30/3]
6073870 主要冷休克蛋白CSPA1[结肠耶氏菌]
1402771 主要冷休克蛋白[金黄色葡萄球菌]
1402761 主要冷休克蛋白[乳酸乳球菌乳脂亚种]
15981565 主要冷休克蛋白Cspa1[鼠疫耶氏菌]
9107847 温度驯化蛋白B[苛养木杆菌9a5c]
7321274 冷休克蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]
2815334 冷休克结构域蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]
2275140 假定的蛋白[鼠疫耶氏菌]
9947082 可能的冷休克蛋白[铜绿假单胞菌]
2983729 冷休克蛋白[Aquifex aeolicus]
2961317 cspB[鼠伤寒沙门氏菌]
46789 7kDa冷休克样蛋白[带小棒链霉菌]
9107526 冷休克蛋白[苛养木杆菌9a5c]
1513079 冷驯化蛋白A[莓实假单胞菌]
4193394 CspC[黄色粘球菌]
4193392 CspB[黄色粘球菌]
3821911 主要冷休克蛋白[乳酸乳球菌乳脂亚种]
16503235 冷休克蛋白[Salmonella enterica subsp.entericaserovar]
9957540 冷休克蛋白B[结肠耶氏菌]
3821921 主要冷休克蛋白[嗜酸乳杆菌]
1616777 冷休克样蛋白[橙色标桩菌]
1402759 主要冷休克蛋白[无害利斯特氏菌]
4468119 冷休克蛋白A；CspA蛋白[百日咳杆菌]
1742550 冷休克样蛋白CspB[大肠杆菌]
12720739 CspD[多杀巴斯德氏菌]
3821915 主要冷休克蛋白[乳酸乳球菌乳脂亚种]
1402765 主要冷休克蛋白[戊糖片球菌]
1513084 温度驯化蛋白A[莓实假单胞菌]
4193396 CspD[黄色粘球菌]
4193398 CspE[黄色粘球菌]
3831560 主要冷休克蛋白[动物双歧杆菌]
4193390 CspA[黄色粘球菌]
3821923 主要冷休克蛋白[瑞士乳酸杆菌]
12720931 MsmB[多杀巴斯德氏菌]
3850772 冷休克蛋白A[黄色粘球菌]
9655615 冷休克样蛋白CspD[霍乱弧菌]
9946888 可能的冷休克蛋白[铜绿假单胞菌]
1402757 主要冷休克蛋白[格雷氏李斯特氏菌]
3821913 主要冷休克蛋白[乳酸乳球菌乳脂亚种]
1402735 主要冷休克蛋白[Bacillus atrophaeus]
1402751 主要冷休克蛋白[粪肠球菌]
3892588 冷休克蛋白C[乳酸乳球菌]
1169113 冷休克样蛋白CSPD
15979415 冷休克样蛋白[鼠疫耶氏菌]
117574 冷休克样蛋白CSPD(CSP-D)
15075133 可能的冷休克转录调节蛋白[Sinorhizobium]
16419455 类似于CspA但不是冷休克诱导的[鼠伤寒沙门氏菌]
11493820 冷休克蛋白C[结肠耶氏菌]
1402783 主要冷休克蛋白[酿脓链球菌]
3821925 主要冷休克蛋白[唾液链球菌嗜热亚种]
1402775 主要冷休克蛋白[停乳链球菌(Streptococcusdysgalactiae)]
8249978 冷休克蛋白B[天蓝色链霉菌A3(2)]
15160284 AGR_L_3376p[根癌农杆菌)]
81624 富甘氨酸蛋白2-拟南芥
19743 nsGRp-2[Nicotiana sylvestris]
2916930 CspB[结核分枝杆菌H37Rv]
13475232 冷休克蛋白[Mesorhizobium loti]
3861208 冷休克样蛋白(cspA)[普氏立克次氏体]
2182333 Y4cH[根瘤菌(Rhizobium sp.)NGR234]
13476765 冷休克蛋白[Mesorhizobium loti]
3776223 CspA[Sinorhizobium meliloti]
1402755 主要冷休克蛋白[干酪乳杆菌]
15620137 冷休克样蛋白[康氏立克次氏体]
15154976 AGR_C_161p[根癌农杆菌]
15074838 推定的冷休克样转录调节蛋白[Sinorhizobium meliloti]
14548150 RNA-结合冷休克蛋白[未能培养的crenarchaeote 4B7]
2440094 小冷休克蛋白[Mycobacterium leprae]
14523127 推定的冷休克蛋白[苜蓿中华根瘤菌]
12620649 ID534[大豆慢生根瘤菌]
1063684 AtGRP2b[拟南芥]
13424521 冷休克结构域家族蛋白[新月柄杆菌]
3036806 富甘氨酸蛋白[拟南芥]
1402731 主要冷休克蛋白[嗜水气单胞菌]
214642 p54[非洲爪蛙(Xenopus laevis)]
15075353 推定的冷休克转录调节蛋白[苜蓿中华根瘤菌]
13424199 冷休克结构域家族蛋白[新月柄杆菌]
14602477 类似于冷休克结构域蛋白A[智人]
1175535 细胞质RNA-结合蛋白P56(Y框结合蛋白-2)(Y-框转录因子)(MRNP4)
104266 Y框结合蛋白2-非洲爪蟾(African clawed frog)
15157349 AGR_C_4003p[根癌农杆菌]
8100512 Y-框蛋白ZONAB-B [Canis familiaris]
8100510 Y-框蛋白ZONAB-A[Canis familiaris]
1483311 Y-框蛋白[Dugesia japonica]
1402767 主要冷休克蛋白[明亮发光杆菌]
1402733 主要冷休克蛋白[杀鲑气单胞菌]
15306095 假定的蛋白XP_053028[智人]
14742409 假定的蛋白XP_046353[智人]
14270385 冷休克结构域蛋白[Takifugu rubripes]
10185725 Y-框蛋白3短异构体[小鼠]
10185723 Y-框蛋白3长异构体[小鼠]
9653686 TSH受体抑制元件结合蛋白-1；TSEP-1
7385223 RNA结合蛋白MSY4[小鼠]
6166110 DNA-结合蛋白A(冷休克结构域蛋白A)(单链DNA结合蛋白NF-GMB)
3695368 zfY1[Danio rerio]
2745892 Y框转录因子[小鼠]
2073109 Y框蛋白1[Carassius auratus]
1353778 Y-框结合蛋白[Columba livia]
1167838 DNA-结合蛋白[智人]
1160331 dbpA鼠同系物[小鼠]
1101884 YB2[褐鼠]
1083796 RYB-a蛋白-大鼠
988283 mYB-1b[小鼠]
988281 mYB-1a[小鼠]
950340 DNA-结合蛋白A[智人]
608518 p50[Oryctolagus cuniculus]
532211 Y-框结合蛋白[小鼠]
516701 类似于小鼠的dbp B/YB[原鸡(Gallus gallus)]
505133 RYB-a[褐鼠]
457262 核酸敏感元件结合蛋白-1[智人]
423015 核酸敏感元件结合蛋白1-人
289797 YB-1蛋白[原鸡]
203398 推定的[褐鼠]
199821 Y框转录因子[小鼠]
189299 DNA-结合蛋白[智人]
162983 转录因子EF1(A)[牛(Bos taurus)]
115848 Y框结合蛋白-1(Y-框转录因子)(YB-1)(CCAAT-结合转录因子I亚基A)(CBF-A)(增强子因子I亚基A)(EFI-A)(DNA-结合蛋白B)(DBPB)
112410 Y框结合蛋白1-大鼠
当温度降低或施加其他胁迫时，CSP是一组在数量上可能或没有增加的蛋白。事实上，就冷休克蛋白而言，在最好的研究生物大肠杆菌中，当其他蛋白为冷所诱导时。一些冷休克蛋白是组成型表达的，还有一些蛋白似乎特异于特定的胁迫和/或生长条件或阶段。该评论见于Yamanaka，等.，MolecularMicrobiology，27：247(1998)。在该评论中，Yamanaka和同事详述了大肠杆菌中9个冷休克蛋白(CspA-CspI)是如何表达的。CspA、CspB和CspG是冷诱导的。CspD在细胞周期静止期和在饥饿期间被诱导。CspC和E涉及细胞分裂。
CspA是来自大肠杆菌(E.coli)的主要冷休克蛋白(SEQIDNO：1)。CspA也称作主要冷休克蛋白7.4。CspA在对冷休克响应中高度诱导(Goldstein，等.，ProceedingsoftheNationalAcademyofScience(USA)87：283(1990))。在某些减慢生长环境中，核糖体不活跃是因为RNA或DNA二级结构形成之故，在其天然生物体中可作为增加CSPs合成的信号。在体外环境中CSPs与ssDNA和RNA结合(Phadtare，等.，MolecularMicrobiology33：1004(1999)).在翻译过程中CSPs被认为以相对非特异性的方式与RNA结合并阻止二级结构形成，稳定了RNA(这种功能有时称为RNA蛋白伴侣)。然后，该核糖体能容易地取代该CSPs并在线状RNA模板上启动翻译。我们相信本发明可涉及这些蛋白质的单链核酸结合功能，该功能能来自任何一种冷休克蛋白或含有冷休克结构域的蛋白，其包括，例如，原核生物冷休克蛋白、含有真核生物Y-框的基因、某些富甘氨酸蛋白(GRP)以及含有冷休克结构域的其他蛋白。这些蛋白包括，但不限于，在图4，TrendsinBiochemicalScience，23(8)：289(1998)(论文包括的，在此引入作为参考)中所示的那些。该图清楚地显示了这些蛋白之间的进化关系。这些蛋白很可能在现代细菌和真核细胞趋异之前起源，且已假定这些蛋白质在单细胞演化出现之时，即35亿年前就已存在了。如实施例我们选择将两种蛋白质转化入植物，如上述引证的图所示，这些蛋白质较许多其真核生物对应物而言，彼此之间更加趋异。我们预计这些蛋白质的异位表达能在各种胁迫条件下，包括冷、旱、盐胁迫、热、冷休克后存活、真菌感染、病毒感染、微生物感染和冷发芽，改善对生物和非生物胁迫的耐受性，包括但不限于植物生长、活力、产量和健康。
在胁迫下植物生长率增加的另一种可能解释是通过CSP表达所激发的病原体相关性分子图式(PAMP)。在该模型中，植物将出现PAMP响应，其将激发植物响应，有些类似于系统性获得抗性(SAR)(更类似于生物胁迫所产生的SAR)，如同植物在胁迫施加前就对之“有所准备”一样。对于该模型运转而言，CSP存在时植物应发出信号，最近业已通过将植物受体与CSP结合提供了该机制(Felix，等，JournalofBiologicalChemistry278(8)：6201-8(2003))。该机制意味着任何与激发PAMP型响应受体结合的基因将在本发明中起作用。PAMP型响应通常用于生物胁迫的研究，一般通过外源给予的试剂激发。在此，我们能激发对CSP转基因所产生的CSP的PAMP型响应。通过基因枪或农杆菌介导的转化，该转基因转化入植物细胞作为重组DNA构建体的一部分。其在植物中又能引起系统性获得抗性型响应，增强了对非生物胁迫的抗性。该响应能引入到单子叶植物和双子叶植物中，包括但不限于玉米、大豆、小麦，稻、拟南芥、低芥酸菜子和棉花。如果上述PAMP法是CSPs为代表的模型，则预计该CSP可以提供生物胁迫和非生物胁迫保护。这些机制并不意在限制，且其中一种或两种，或其他种种，可能与所出现的表型相关。
MF2，一种来自苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringensis)的Csp样蛋白，据称在植物中能提供某些抗病毒感染的保护。美国专利6,528,480显示了通过使用含有该蛋白的提取物摩擦植物叶片并用病毒感染该植物所产生的对生物胁迫的耐受性。在该专利中它们预计能，但并没有产生转基因植物。
“相同种非转化植物”意在包括于与转化植物相同种的所有植物之内。在一个实施方案中，所述非转化植物和转化植物是相同种和品系的。在另一个实施方案中，所述植物与转化植物有可能相同。
“冷休克结构域”(CSD)是一种与冷休克蛋白同源的蛋白序列。对于本发明来说，包含冷休克结构域的蛋白是一种“冷休克蛋白”。在大肠杆菌CspA或枯草杆菌CspB与含有冷休克结构域的蛋白的冷休克结构域之间，观察到大于40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％或98％的氨基酸同一性(Wistow，Nature344：823(1990)；Yamanaka，等.，Mol.Micro.，27：247，具体参见Yamanaka参考文献的图1B；Graumann，等.TIBS23：286)。
在此使用的“酵母”通常指Saccharomycescerevissiae但也包括栗酒裂殖酵母(Schizosacchoramycespombe)和其他品种(例如，来自毕赤酵母属的)。“玉米”指ZeaMays以及可由其培育的所有种和变种。“小麦”指所有的Triticumaestivum品种，包括但不限于春小麦、冬小麦和所有可选择的小麦品种。“小麦”包括任何其他的小麦品种，包括但不限于硬质小麦(Triticumdurum)、斯佩尔特小麦(Triticumspelta)、双粒小麦(Triticumdicoccum)和野生二粒小麦(Triticummonococcum)。“小麦”也包括可由上述任一小麦品种培育的所有种和所述杂交种(包括黑小麦、一种小麦和黑麦的杂种)的后代。“大豆”指Glycinemax或Glycinesoja以及可由其培育的所有种或变种。“稻”指Oryzasativa以及可由其培育的所有种或变种。“大麦”指Hordeumvulgare以及可由其培育的所有种和变种。“燕麦”指Avenasativa以及可由其培育的所有种和变种。“低芥酸菜子”是近来赋予遗传修饰的油菜籽植物、油籽油菜(BrassicanapusL.)和芜箐油菜(B.campestrisL)所产生的种子、油和食品的新创名，在此低芥酸菜子包括所有油菜籽植物以及可用其育种的生物。在此使用的大肠杆菌(E.coli和Escherichiacoli)包括大肠杆菌种生物及其所有菌株；即E.coliK12。在此使用的大肠杆菌(E.coli和Escherichiacoli)也可包括能与任何大肠杆菌菌株接合的所有生物，当一者为F+或Hfr菌株，而另一者不是时。枯草杆菌(B.subtilis和Bacillussubtilis)指所有芽孢杆菌属枯草杆菌种生物。在此使用的根癌农杆菌(Agrobacteriumtumifaciens)包括所有该种的菌株和型。“草坪草”包括所有曾经栽培过或能栽培产生草皮的草种及品系，所述草皮包括但不限于：草坪、用于比赛(即美式足球、棒球或英式足球)的场地、和高尔夫球场的所有区域(即开球区域、球道、果岭、障碍区等)。“棉花”指所Gossypium属植物以及可由其培育的所有植物。
在此所指的“耐热性”作为植物在热环境或较热温度下生长能力的量度，所述热环境或较热温度对相同种植物的生长、活力、产量、大小起不利影响。耐热植物在热胁迫环境下较相同种的非耐热植物生长得更好。
“耐盐性”指某些植物在渗透胁迫或由水和土壤中的盐类或离子所产生的胁迫下生长的能力。例如，当浇水液体或载体的培养基含有对相同种不同植物生长起不利作用的水和离子的混合物时，与相同种和/或变种植物相比，具有增加的生长率的植物据此应有耐盐性。某些转化植物较相同种和品系的非转化植物对于这些类型的情况具有更强的耐受性。
所有在此使用数值应受术语“约”所修饰，约意味着该数值可以改变，在任一方向上，至多10％且仍保持相同的含义。例如，1M溶液应包括所有这种类型的溶液，小于等于1.1M但大于等于0.9M。例如，百分数也可被修饰，10％包括包括从9％至11％的所有百分数。形容词“正好”所限定的术语并不受术语“约”所限定。
“富甘氨酸蛋白”定义为一种真核细胞中的蛋白，即含有冷休克结构域的蛋白，或者与之基本上同一，或是其同系物。
“冷休克后存活”定义为植物在置于低于该种植物生长阶段正常温度的温度之后持续生长一段有效时间的能力。应当指出某些植物，甚至是那些相同种的，经选择在冷环境下能生长。玉米的Wigor纯系能耐受冷环境且当置于那些环境中时，较美国市售的大多数商用品系具有明显更高的成活率。Wigor在波兰作为商品出售。因此，对于转基因植物而言低温耐受性应当在相同的相关阶段的相同品系的植物以及相同种类植物的范围内比较，以获取有意义的科学数据。接着，应马上对植物进行打分，或在休克后几天或几周测定它们的生活力、生长率和其他表型。
“干旱”或“生长水分受限”定义为一段干燥的时期，特别是当其延长时，能损害农作物或妨碍它们顺利生长。此外，相同种的不同植物，以及那些相同种的不同品系，对干旱、干燥和/或缺水可具有不同的耐受性。在实验室中，干旱可通过较对照植物给予植物95％或更少的水分来模拟，并寻找在活力、生长、大小、根长和种种其他生理和物理量度上的差异。干旱也可通过在田地中给某些植物浇水，而不其他植物浇水来模拟，并比较它们的生长速率，特别是水分严重受限地方植物的生长。
非生物胁迫耐受性包括但不限于，增加的产量、生长、生物量、健康或其他指示胁迫耐受性的量度，其包括但不限于热胁迫、盐胁迫、冷胁迫(包括在发芽过程中的冷胁迫)、水分胁迫(包括但不限于旱胁迫)、氮胁迫(包括高氮和低氮)。
生物胁迫耐受性包括，但不限于，增加的产量、生长、生物量、健康、或其他指示胁迫耐受性的量度，其包括但不限于植物的真菌感染、细菌感染、和病毒感染。
某些作为本发明一部分披露的基因序列是细菌来源的，例如，某些原核生物冷休克蛋白。本领域技术人员公知未修饰的细菌基因有时在转基因植物中表达很低。植物密码子用法较诸如细菌的单细胞生物更类似于人类和其他高等生物。一些报告已披露用于改善植物中重组基因表达的方法。这些报告披露了多种方法，基于植物密码子频率表，改善密码子第3位碱基偏爱，使用不含可疑的多腺苷酸化或富含A/T区域或内含子剪接共有序列的重组序列，用于人工改造编码序列以提供能更有效翻译的序列。虽然这些用于合成基因构建的方法值得注意，但是本发明人打算根据Brown等(美国专利号5,689,0521997，其全文在此引入作为参考)和/或上述引用的方法以及其他方法，生产冷休克蛋白或含有冷休克结构域蛋白的合成基因。因此，本发明提供了一种用于制备在植物中表达所需蛋白产物的合成植物基因的方法。简言之，根据Brown等的方法，减少编码所需蛋白多核苷酸序列中稀有或半稀有单子叶植物密码子的频率并用更偏爱的单子叶植物密码子取代。基于在单子叶植物中六单体单元的出现频率，也就是最稀有的284，484和664六单体单元的出现频率，通过分析连续的六核苷酸片断中编码序列并改变该序列修饰的多核苷酸序列编码的所需多肽，在单子叶植物中增加的累积是产生偏爱密码子频率增加的结果。此外，Brown等披露了通过应用减少稀有密码子频率的方法来增加重组基因的表达，使用了减少核苷酸序列中多腺苷酸化信号和内含子剪接位点出现，去除核苷酸序列中自补序列并用非自补核苷酸取代上述序列，且保持编码该多肽的结构基因，并减少核苷酸序列中5’-CG-3’二核苷酸配对出现的频率的方法。对于期望多肽中存在的大多数氨基酸而言，这些步骤顺序执行，所具有的累积效应导致了在核苷酸序列中含有对于单子叶植物优先利用的更偏爱的单子叶植物密码子。特别是所有在此提及的蛋白预计要被制成如上所讨论的合成基因，或使用类似的方法，这些蛋白包括但不限于大肠杆菌CspA和枯草杆菌CspB。
在此描述的工作具有确定的加强植物表达冷休克蛋白和含有冷休克结构域蛋白的方法，当在掺入易感植物细胞核、质体或叶绿体基因组后异位表达时，其可赋予对许多植物胁迫的抗性，可包括但不限于冷、热、旱、盐和其他胁迫，或胁迫相关表型(冷发芽、冷休克后存活和其他非生物胁迫)。美国专利5,500,365(在此特别引入作为参考)描述了一种用于合成植物基因以优化该合成基因编码蛋白表达水平的方法。该方法涉及修饰外源转基因的结构基因序列使得它们更加“类似于植物”并因此更有可能被翻译并通过植物、单子叶植物或双子叶植物来表达。但是，在单子叶植物中更适宜使用美国专利5,689,052中所披露的方法，其用于增强转基因的表达。
在开发本发明的核酸构建体中，该构建体的多种成分或其片断通常被插入到适宜的克隆载体中，如能在诸如大肠杆菌的细菌宿主中复制的质粒。在文献中业已描述了存在的多种载体，其中有许多是市场上可买到的。在每次克隆后，具有所需插入物的克隆载体可被分离并进行进一步的操作，例如限制酶切消化、插入新片断或核苷酸、连接、缺失、突变、切除等，以适合期望序列的成分。一旦完成该构建体，接着根据宿主细胞转化的方法可将其转移到合适载体中用于进一步操作。
本发明的双链DNA分子包括，例如，通过任何适合的方法可插入植物基因组表达盒中的冷休克蛋白。适合的植物转化载体包括来自于根癌农杆菌Ti质粒的那些，以及披露于，如Herrera-Estrella等，(1983)，Bevan(1984)，Klee等，(1985)和EPO公开号120,516的那些。除了来自于农杆菌的Ti或毛根诱导(Ri)质粒的植物转化载体，替代的方法可用于将本发明的DNA构建体插入到植物细胞中。这样的方法可包括，但不限于，例如通过使用脂质体、电穿孔、增加游离DNA摄取的化学药品、通过微粒轰击递送游离DNA以及使用病毒或花粉进行转化。
适合于使用电穿孔将编码冷休克蛋白或含有冷休克结构域蛋白的基因导入单子叶植物的质粒表达载体可由如下所组成：在植物中起作用的启动子；提供剪接位点利于基因表达的内含子，例如Hsp70内含子(PCT公开号WO93/19189)；以及诸如胭脂碱合酶3’序列(NOS3’)的3’多腺苷酸化序列。该表达盒可装配为适合于大量DNA生产的高拷贝复制体。
一种用于植物转化的Ti质粒盒载体是pMON-17227。该载体描述于PCT公开号WO92/04449中并含有编码赋予草甘膦抗性的酶(命名为CP4)的基因，对于许多植物而言，该基因是一种极好的选择标记。如该文所述，该基因被融合到拟南芥EPSPS叶绿体转运肽(CTP2)上并从FMV启动子表达。当获得含有景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶基因或cDNA的足够量细胞(或原生质体)时，该细胞(或原生质体)再生为全植物。用于再生步骤方法的选择并不是关键的，对于来自豆科(苜蓿、大豆、三叶草等)，伞形科(胡萝卜、芹菜、欧洲防风草)，十字花科(甘蓝、萝卜、低芥酸菜子/油菜籽等)，葫芦科(甜瓜和黄瓜)，禾本科(小麦、大麦、稻、玉米等)，茄科(马铃薯、烟草、番茄、胡椒)，各种花作物，例如向日葵，以及产坚果树木，例如杏树、腰果树、胡桃树和美洲山核桃树的宿主具有合适的实验方案可供使用。
可通过本发明实践用于表达冷休克蛋白的植物包括，但不限于，刺槐、紫花苜蓿、小茴香、苹果、杏、朝鲜蓟、芝麻菜、芦笋、鳄梨、香蕉、大麦、豆类植物、甜菜、黑莓、越桔、茎椰菜、抱子甘蓝、卷心菜、低芥酸菜子、罗马甜瓜、胡萝卜、木薯、花椰菜、芹菜、樱桃、芜荽、柑橘类植物、克莱门氏小柑橘、咖啡树、玉米、棉花、黄瓜、花旗松、茄子、菊苣、宽叶莴苣、桉树、茴香、无花果、葫芦、葡萄、葡萄柚、蜜瓜、豆薯、猕猴桃、莴苣、韭、柠檬、酸橙、火炬松、芒果、甜瓜、蘑菇、坚果、燕麦、秋葵、洋葱、橙、观赏植物、番木瓜、欧芹、豌豆、桃、花生、梨、胡椒、柿子、松树、菠萝、车前草、李子、石榴、白杨、马铃薯、南瓜、柏、辐射松、红菊苣、萝卜、悬钩子、稻、黑麦、高粱美国长叶松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、白薯、枫香、红桔、茶树烟草、番茄、草皮、藤本植物、西瓜、小麦、薯蓣、绿皮密生西葫芦、或任何一种其他植物。
“启动子”指结合RNA聚合酶(以及经常是其他转录因子)并启动下游DNA序列转录的DNA序列。当与其他组织相比时，在某些组织中启动子通常提供增强的或减弱的表达。选择启动子，具体来说选择当植物承受非生物胁迫时能增加表达的启动子在本发明中应该特别有用。
在本领域中已观察到某些胁迫响应对植物具有类似的作用，且对一种胁迫的抗性可提供对另一种胁迫的抗性。例如，从对脱水和低温响应之间的关系可以看出这点(Shinozaki，等.，CurrentOpinionsinPlantBiology3(3)：217，2000)。许多其他论文表明了在不同的非生物胁迫之间具有一般的相互关系，并指出对于一种胁迫的耐受性能导致产生对一些其他非生物胁迫更强的耐受性(Pernas，等.，FEBSLett467(2-3)：206，2000；Knight，IhtRevCytol195：269，2000；Didierjean，等.，Planta199：1，1996；Jeong，等.，MolCells12：185，2001)。
在包含于T-DNA的植物表达元件外DNA区段中所含有的表达盒和调节元件通常存在于许多质粒DNA骨架中，并起质粒维持元件之用，这些元件包括，但不限于，具细菌壮观霉素/链霉素抗性的aad(Spc/Str)基因，提供复制起点用于在大肠杆菌中保持的pBR322ori(ori322)，用于接合转移入根癌农杆菌细胞的bom位点，以及含有来自RK2质粒复制起点的0.75kboriVDNA区段。此外，那些为转化植物所设计的质粒通常含有为起插入元件作用的农杆菌蛋白内源性DNA整合所需的元件。这些元件包括边缘区(borders)(右边缘区(RB)和左边缘区(LB))。
在此使用的重组DNA技术实验室规程是那些为本领域熟知且通常使用的。标准技术用于克隆，DNA和RNA分离、扩增和纯化。一般的酶促反应包括根据产品说明书所述使用DNA连接酶、DNA聚合酶、限制性内切酶等。这些技术和多种其他技术通常根据Sambrook等.，MolecularCloning-ALaboratoryManual，第2版.，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NewYork(1989)所述的来执行。
所有在本说明书中引证的出版物和公布的专利文献在此引入作为参考，如同每一篇单独的出版物或专利申请明确且单独地被表明引入作为参考一样。
下列所包括的实施例用于举例说明本发明的实施方案。本领域技术人员应当理解在实施例中所披露的技术随后代表的是本发明人所发现的能在本发明实践中起很好作用的技术。但是，考虑到本发明所公开的内容，本领域技术人员应当意识到可对所披露的具体实施方案进行许多修改，仍能获得同样或相似的结果，而不背离本发明的精神和范围，因此所有在附图和实施例中所列或所示的内容被认为是例证性的，并不意在限制。
实施例
实施例1.
pMON57396(图1)是一种双元载体，用于农杆菌介导的转化和在拟南芥中类似于大肠杆菌CspA的蛋白(SEQIDNO：56)的组成型表达。为克隆该大肠杆菌CspA基因，基于来自隶属于国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth(NCBI))之国家医学图书馆(NationalLibraryofMedicine)的国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)的CspA序列信息(GenbankM30139，GI：409136)，设计两条基因特异性引物MF1和MF2。MF1序列是AGGTAATACACCATGGCCGGTAA(SEQIDNO：66)，其在CspA翻译起始位点处退火并在5’末端引入NcoI位点，MF2序列是TTAAGCAGAGAATTCAGGCTGGTT(SEQIDNO：67)，其在CspA最后密码子处退火并在该引物末端引入EcoRI位点。进行PCR分离大肠杆菌CspA。具体来说，裂解大肠杆菌DH5α细胞，少量裂解液作为模板扩增CspA基因，使用MF1和MF2引物、Taq聚合酶和来RocheMolecularBiochemicals(Indianapolis，IN)的dNTP。热循环条件如下：94℃，1分钟，接着94℃，16秒；55℃，1分钟和72℃，1分钟的30个循环。用凝胶电泳纯化所扩增的CspADNA，用NcoI和EcoRI消化并连接入双元载体pMON23450(图2)，该载体事先已用NcoI和EcoRI消化而被线性化。使用T4连接酶进行连接，并根据厂商(BRL/LifeTechnologies，Inc.，Gaithersburg，MD)的建议进行之后程序。将连接混合物转化入大肠杆菌细胞中用于质粒增殖(Sambrook等.，MolecularCloning：ALaboratoryManual，第2版，ColdSpringHarborPress，1989)。转化的细胞在合适的选择培养基上进行平板培养(Sambrook等.，MolecularCloning：ALaboratoryManual，第2版，ColdSpringHarborPress，1989)，并在几小时或几天后对菌落划线。质粒制备自单个菌落并测定完整插入序列。
所产生的质粒也通过限制性内切酶谱(例如，参见Griffiths，等，AnIntroductiontoGeneticAnalysis，第6版，pp449-451，ISBN0-7167-2604-1，W.H.FreemanandCo.，NewYork)和测序得到确认。当载体中所选择的NcoI-EcoRI克隆位点在上游(5’)侧接CaMVe35S启动子和在下游(3’)侧接附加表位(Flag，其编码寡肽DYKDDDK(SEQIDNO：68)，SIGMA，StLouis)时，该构建体中的大肠杆菌CspA从而在C-末端加上Flag附加表位，并可通过CaMVe35S启动子启动转录转化拟南芥。上述克隆产生了一种编码类似于SEQIDNO：55的蛋白的质粒。所产生的质粒称为pMON57396。
实施例2.
pMON57397(图2)是一种双元载体，用于农杆菌介导的转化和在拟南芥中类似于大肠杆菌CspA的蛋白(SEQIDNO：57)的组成型表达。为构建pMON57397，用限制性内切酶XhoI和SalI消化其C-末端加有Flag附加表位的含有大肠杆菌CspA基因的双元载体pMON57396(见上述实施例)，以去除载体中这些位点并释放出FLAG附加表位(该FLAG附加表位编码寡肽DYKDDDK，SIGMA，StLouis)。接着纯化并重新连接线性化的质粒。使用T4连接酶进行连接，并根据厂商(BRL/LifeTechnologies，Inc.，Gaithersburg，MD)的建议进行之后程序。将连接混合物转化入大肠杆菌细胞中用于质粒增殖(Sambrook等.，MolecularCloning：ALaboratoryManual，第2版，ColdSpringHarborPress，1989)。转化的细胞在合适的选择培养基上进行平板培养(Sambrook等.，MolecularCloning：ALaboratoryManual，第2版，ColdSpringHarborPress，1989)并在几小时或几天后对菌落划线。质粒制备自单个菌落并测定完整插入序列。上述克隆产生了一种编码类似于SEQIDNO：57的蛋白的质粒。
所产生的质粒也通过限制性内切酶谱以确保XhoI和SalI位点不存在(例如，参见Griffiths，等，AnIntroductiontoGeneticAnalysis，第6版，pp449-451，ISBN0-7167-2604-1，W.H.FreemanandCo.，NewYork)以及测序而得到确认。在该构建体中大肠杆菌CspA基因在C-末端没有标记物，并通过CaMVe35S启动子启动转录。
实施例3.
pMON57398(图4)是一种双元载体，用于农杆菌介导的转化和在拟南芥中类似于枯草杆菌CspB的蛋白(SEQIDNO：59)的组成型表达。为克隆该枯草杆菌CspB基因，基于来自隶属于国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth(NCBI))之国家医学图书馆(NationalLibraryofMedicine)的国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)的CspB序列信息(GenbankU58859，gi：1336655)，设计两条基因特异性引物MF3和MF4。MF3序列是AGGAGGAAATTCCATGGTAGAAG(SEQIDNO：69)，其在CspB翻译起始位点处退火并在5’末端引入NcoI位点，MF4序列TCAATTTATGAATTCGCTTCTTTAGT(SEQIDNO：70)，其在CspB最后密码子处退火并在该引物末端引入EcoRI位点。进行PCR分离枯草杆菌CspB。枯草杆菌细胞获得自CarolinaBiologicalSupply(Burlington，NC)，裂解细胞并将少量裂解液作为模板扩增CspB基因，使用MF3和MF4引物、Taq聚合酶和来自RocheMolecularBiochemicals(Indianapolis，IN)的dNTPs。热循环条件如下：94℃，1分钟，接着94℃，16秒；55℃，1分钟和72℃，1分钟的30个循环。用凝胶电泳纯化所扩增的CspBDNA，用NcoI和EcoRI消化并连接入双元载体pMON23450(图5)，该载体事先已用NcoI和EcoRI消化而被线性化。使用T4连接酶进行连接，并根据厂商(BRL/LifeTechnologies，Inc.，Gaithersburg，MD)的建议进行之后程序。将连接混合物转化入大肠杆菌细胞中用于质粒增殖(Sambrook等.，MolecularCloning：ALaboratoryManual，第2版，ColdSpringHarborPress，1989)。将转化的细胞在合适的选择培养基上进行平板培养(Sambrook等.，MolecularCloning：ALaboratoryManual，第2版，ColdSpringHarborPress，1989)并在一天后对菌落划线。质粒制备自单个菌落并测定完整插入序列。
所产生的质粒也通过限制性内切酶谱(例如，参见Griffiths，等，AnIntroductiontoGeneticAnalysis，第6版，pp449-451，ISBN0-7167-2604-1，W.H.Freeman和Co.，NewYork)和测序得到确认。当载体中所选择的NcoI-EcoRI克隆位点在上游(5’)侧接CaMVe35S启动子和在下游(3’)侧接附加表位(Flag，其编码寡肽DYKDDDK(SEQIDNO：68)，SIGMA，StLouis)时，该构建体中枯草杆菌CspB样基因从而在C-末端加上Flag附加表位，并可通过CaMVe35S启动子启动转录转化拟南芥。该克隆产生了一种质粒，其具有插入所述质粒中的编码类似于SEQIDNO：59的蛋白的序列。
实施例4.
pMON57399(图6)是一种双元载体，用于农杆菌介导的转化和在拟南芥中类似于枯草杆菌CspB的蛋白(SEQIDNO：61)的组成型表达。为构建pMON57399，用限制性内切酶XhoI和SalI消化在其C-末端加有Flag附加表位的含有枯草杆菌CspB基因的双元载体pMON57398(见上述实施例)，以除去载体中这些位点并释放出FLAG附加表位(该FLAG附加表位编码寡肽DYKDDDK，SIGMA，StLouis)。接着纯化并重新连接线性化的质粒。使用T4连接酶进行连接，并根据厂商(BRL/LifeTechnologies，Inc.，Gaithersburg，MD)的建议进行之后程序。将连接混合物转化入大肠杆菌细胞中用于质粒增殖(Sambrook等.，MolecularCloning：ALaboratoryManual，第2版，ColdSpringHarborPress，1989)。将转化的细胞在合适的选择培养基上进行平板培养(Sambrook等.，MolecularCloning：ALaboratoryManual，第2版，ColdSpringHarborPress，1989)并在几小时或几天后对菌落划线。质粒制备自单个菌落并测定完整插入序列。该克隆产生了一种质粒，具有插入到所述质粒中的编码类似于SEQIDNO：61的蛋白的序列。
所产生的质粒也通过限制性内切酶谱以确保XhoI和SalI位点不存在(例如，参见Griffiths，等，AnIntroductiontoGeneticAnalysis，第6版，pp449-451，ISBN0-7167-2604-1，W.H.FreemanandCo.，NewYork)以及测序而得到确认。当载体中所选择的NcoI-EcoRI克隆位点在上游(5’)N-末端侧接CaMVe35S启动子时，该构建体中的枯草杆菌CspB基因在C-末端没有标记物，并通过CaMVe35S启动子启动转录转化拟南芥。所述质粒被转化入根癌农杆菌。
实施例5.
可以用任何一种可获得的方法转化拟南芥植物。例如，可以使用Inplanta转化法通过真空渗入转化拟南芥植物(参见，Bechtold等.，InplantaAgrobacteriummediatedgenetransferbyinfiltrationofadultArabidopsisthalianaplants.CRAcad.Sci.ParisSciencesdelavie/lifesciences316：1194-1199(1993))。该实施例说明了拟南芥植物是怎样被转化的。
亲本株材料和生长条件
准备2.5英寸装有土壤的盆，并用筛网覆盖，确保土壤没有压得太紧以及筛网与土壤表面接触(其保证了发芽的幼苗将能穿过筛孔生长)。播种种子并用发芽罩(germinationdome)覆盖。春化处理种子3-4天。在20-22℃、70％湿度、16小时光照/8小时黑暗条件下培育植物。每周浇水两次，并施予低于1/2X(厂商推荐强度的一半)的Peters20-20-20肥料(来自HummertInternational，EarthCity，MO)。每隔一周(以厂商推荐的全强度)添加微量营养物(Hummert′sDyna-谷物可溶性微量元素)一次。约1-2周后，除去罩并让盆中植物减少到每盆一株或两株。当其发育时，修剪初生芽(primarybolt)，以促进更多再生芽(secondarybolt)产生。在5-7天中，该植物准备就绪可用于渗入。
农杆菌制备(小规模和大规模培养)：
在LB平板上对农杆菌菌株ABI划线，该培养基含有壮观霉素100mg/L、链霉素100mg/L、氯霉素25mg/L和卡那霉素50mg/L(称为SSCK)。在渗入前两天，将一环的农杆菌置于含有10mlLB/SSCK的试管中并放在振荡器上，在黑暗中于28℃下培养过夜。第二天，将农杆菌以1∶50在400mlYEP/SSCK中稀释并放在振荡器上，在28℃下培养16-20小时。(附注：我们发现当LB用于第一次过夜培养及YEP用于大规模过夜培养时，转化率明显更高)。
渗入
将其注入500ml离心瓶并在3500rpm下旋转20-25分钟，收获农杆菌细胞。倒出上清液。干燥沉淀物，然后重悬于25ml渗入培养基(MS基础盐0.5％、Gamborg氏B-5维生素1％、蔗糖5％、MES0.5g/L，pH5.7)中，该培养基含有0.44nM苯甲酸嘌呤(BAP)(10μl的1.0mg/LDMSO母液)和来自LehleSeeds(RoundRock，TX)的0.02％Vac-In-Stuff(SilwetL-77)。BAP和SilwetL-77在渗入日新鲜添加。添加200μlSilwetL-77和20μlBAP(0.5mg/L母液)。使用渗入培养基作为众所周知的空白，获取1∶10稀释的农杆菌悬液的OD600。计算400ml农杆菌悬液/渗入培养基，OD600＝0.6，用于真空渗入所需的体积。
方程式：
Figure S04835385X20060608D000411
将重悬的培养物置于真空水提取器的Rubbermaid容器中。翻转含有植物的盆以渗入溶液中，以致整个植物都浸入，包括莲座丛，但不要让太多的土壤被浸没。在浸入前用水浸泡植物至少30分钟(阻止土壤吸收农杆菌悬液)。
抽真空到约23-27英寸汞柱，持续10分钟。快速进气。在短时间内排出盆中水分，将盆侧放在带衬里的布垫上，用罩子盖住布垫以保持湿度，并放回到生长箱中。第二天，揭开盆上的罩子，使盆直立，并移开布垫。连续5天不给植物浇水。直立5天后，给植物浇水并在如前所述的相同条件下继续生长。(被渗入的叶片可退化，但植物应存活直至开花完成)。
种子收获和灭菌
在渗入约2周后，通过使用LehleAracons(LehleSeeds，RoundRock，TX)使植物一个一个单独地形成锥体。在所有种子成熟结果后(渗入后约4周)，从水中移出植物并将全部种子弄干。约2周后通过收割锥体下的枝条收获种子。使用筛子清洁种子，截留长角果和枝条物，让种子通过。将种子置于信封或15ml试管中。
灭菌前将期望数量的种子转移到15ml锥形试管中。松开锥形试管盖并将试管侧置于真空干燥器中，在干燥器中放有容纳400mlClorox漂白剂(CloroxCompany，Oakland，CA)和4ml盐酸的烧杯(在通风橱中将HCl添加到Clorox中)。抽真空到刚好密封该干燥器，关闭抽气机16小时(即，使得该干燥器仍处于真空但并不总是直接抽真空)。灭菌后，打开真空干燥器将容有种子的试管置于无菌通风橱中(松开盖子使得气体仍能释放)。
将种子撒播(“洒”)在选择平板上，该平板含有MS基础盐4.3g/L、Gamborg氏B-5(500X)2.0g/L、蔗糖10g/L、MES0.5g/L和8g/LPhytagar(LifeTechnologies，Inc.，Rockville，MD)、羧苄青霉素250mg/L、头孢噻肟100mg/L。选择水平为卡那霉素60mg/L、草甘膦60pM或Bialaphos10mg/L。
首先，取出极少量的种子检查污染物。如果有污染物，对种子重新灭菌多于约4小时，再次检查污染物。通常不需要第二次灭菌，但有时种子沾有真菌污染物，需重复灭菌。(灭菌持续时间一般短于16小时，因为灭菌超过24小时会明显降低发芽率)。用石蜡膜封住平板并置于冷藏室中施以春化处理约2-4天。在种子春化处理后，置于装有冷白色灯泡的percival中。
转移到土壤
在约26℃下和16/8光周期5-10天后，可以看见转化体成为绿色植物。再1-2周后，植物将有至少一组真叶。将植物转移到土壤，盖上发芽罩，并移至具有常规拟南芥生长条件的生长箱中。保持覆盖直至出现明显的新生长(通常5-7天)。
实施例6.
为了比较野生型非转基因和CspA或CspB转基因拟南芥植物的生长，使之在无菌培养皿中垂直生长：
野生型或转基因种子使用如下方法进行液体灭菌：
●在70％乙醇中温育5分钟后进行涡旋混合
●在30％Chlorox(6.15％次氯酸钠)+0.01％TritonX-100中温育5分钟后进行涡旋混合
●无菌水连续洗涤5次
种子被置于100×15mm方形的塑料培养皿上(BectonDickinson-Falcon#35-1112)，每一培养皿含有40ml琼脂培养基，制备如下：
用氢氧化铵调节含常量营养元素、微量营养元素和维生素的0.5XMurashige和Skoog培养基(Sigma#M5519)pH至5.8，添加1％Phytagel(Sigma#P8169)，作为固体载体。
在半个培养皿上撒播10粒野生型拟南芥种子，距边缘约1cm并均匀分布。使用管尖消毒的GilsonP-200移液器进行该步骤。10粒CspA或CspB转基因拟南芥种子同样地撒播在培养皿的另一半，均匀分布。用记号笔标记平板以指示哪一半含有转基因种子。
培养皿于4℃下在黑暗中放置3天以层积种子，然后置于Percival恒温箱(AR-36L型)中，于8℃下在24小时120微爱因斯坦/平方米的恒光下持续6周。温育结束时，比较CspA和CspB和野生型莲座型叶丛大小，发现CspA和CspB较大。该结果见图16。见于第一、第二和最后一张平板照片，在此使用了上述测定法。在图16中，第三张照片(CspB+Flag，pMON57399)显示了平板中植物经受了类似于如下所述的冷休克试验。
转基因拟南芥种子冷休克幼苗活力评估：水平平板测定法。
介绍：
这是一种用于评估已发芽转基因拟南芥种子在水平培养皿琼脂培养基上从常温转换到低温时持续生长能力的方法。简而言之，对来自对照植物和试验转基因植物的种子灭菌、层积、并撒播在培养皿上任何一半的6×8网格中。在水平位置处于常温下温育平板一周，然后移至急冷温度下再温育两周，保持平板水平位置。采用数字照相术记录幼苗的株冠面积并用成像软件进行定量。测试幼苗总株冠面积与对照幼苗总株冠面积的比值可作为定量参数来比较转基因测交品系中各种目的基因低温耐受性潜力。
材料：下列所用的主要常规设备可获得自标准生物技术实验室(高压灭菌器、天平、层流罩超净台等)
-拟南芥种子：在本实验方案中使用Arabidopsisthalianacv。
-培养皿：Falcon#35-1112(100mm方形×15mm深)
-培养基：SigmaM5519＝Murashige&Skoog基础培养基
-Phytagel(Sigma#P-8169)
-1-升玻璃瓶，对其中琼脂培养基高压灭菌并用于浇铸平板。我们使用带有橙色螺旋盖的康宁(Corning)玻璃瓶。
-磁力搅拌器和磁性搅拌棒
-可使用50ml塑料移液管的电动移液管管理器。
-用于照晒种子的具有塑料放大镜的小荧光灯盒
-P1000Gilson移液器(或等价物)和消毒管尖
-P200Gilson移液器(或等价物)和消毒管尖
-70％灭菌乙醇
-30％Chlorox漂白剂+0.1％Tween20
-无菌去离子水
-无菌微离心管和试管架
-4℃冷藏室，低温试验箱或电冰箱，优选黑暗的
-具有约150μE/m2/秒光源的22℃Percival植物生长箱或等价物。
-具有约150μE/m2/秒光源的8℃Percival植物生长箱或等价物。
-半透性外科用胶带3M微孔胶带(3M#1530-1)
-黑色(Sharpie)标记笔
-Glassine天平称量纸(VWR#12578-165)
-计算器
-笔记本
-IBM兼容机
-Image-ProPlus软件，4.1.0.0版
-微软Excel软件
实验方案：
1-将贮藏在试管或信封中的种子等分置于灭菌的微量离心管中，
2-用黑色记号笔(sharpie)标记试管以记住种子身份，
3-通过用下列溶液连续洗涤并保持下列时间对试管中种子进行表面灭菌。注意，在洗涤过程中翻转试管至少两次以确保溶液与种子表面良好接触。种子将落到试管底部，形成柔软沉淀：
a.70％灭菌乙醇，持续3-5分钟，
b.30％Chlorox漂白剂+0.1％Tween20，持续3-5分钟，
c.无菌过滤的去离子水，持续30秒，
d.重复c四次以上并在最后一次，留下约0.5ml无菌水覆在种子沉淀上。
1-将微量离心管于4℃下在黑暗中放置3天以层积种子，使得平板培养的种子发芽更加一致。
[或者，可直接将种子撒播在培养皿琼脂培养基上，用胶带密封并在8℃冷温育前将培养皿于4℃下在黑暗中放置3天-见下.]
2-通过在玻璃瓶中制备1升试样量的0.5XMurashige和Skoog培养基，用氢氧化铵调节pH至5.8，然后添加10克Phytagel，来制备平板。当调节pH时使用磁力搅拌器并与phytagel混合均匀，然后对液体高压灭菌，设定(缓慢排气)45分钟。
3-在层流罩超净台中浇铸平板，使用带50ml灭菌移液管的电动移液管管理器将40ml培养基释放到每个平板后，立刻用盖子盖住平板。
4-在层流罩超净台中用鼓风机让平板冷却至少2小时，结束后于4℃下贮藏在带日期的塑料袋中。
5-标记平板并撒播种子：
1-用半透性微孔胶带捆住平板的四边，标记日期并将平板置于Percival培养箱中，设定在22℃和约100μE/m2的16小时白天光周期。将平板水平放置，仅放一层并温育7天。用数码照相机为每个平板拍照并将数据储存在光盘上。
2-将平板转移到Percival培养箱中，设定在8℃和约100μE/m2的24小时白天光周期。将平板水平放置，仅放一层并再温育最多3周。用数码照相机为每个平板拍照并将数据储存在光盘上。
3-每2-3天观察平板一次，观察与对照相比的测试种质生长状况并不时对种质有代表性的常规性状进行数码照相。在8℃下温育时间应小于2周(最多3周)。那些长得较长表现出差异的种质要在较低种子密度下进行平板培养以避免在进行数码照相时过度拥挤。
4-使用数码照相机拍照和Image-ProPlus软件测量莲座型叶子丛株冠面积。计算对照和测试群体的平均幼苗株冠面积，在分析中排除没有发芽的种子。在温度变化后，计算对照幼苗和测试幼苗的平均幼苗株冠面积的比值，对照和测试幼苗组的标准偏差和标准误差。如果在测试幼苗和对照幼苗之间存在统计学差异，则结果就为可靠。在笔记本上记录结果。
5-对于转基因植物材料来说，将平板和幼苗丢弃在合适的处理容器中(带透明塑料垃圾袋的灰色垃圾箱)。
实施例7.
依照厂商的实验方案(Invitrogen，Carlsbad，CA)将CspA和CspB基因的PCR产物连接入载体pCR-TOPO2.1。将pCR-TOPO2.1衍生物的NcoI/EcoRI片段亚克隆入pMON48421(图7)，通过相同的限制性内切酶线性化。将含有35S启动子、Csp基因和e9终止子的pMON48421衍生物的NotI片段在NotI位点亚克隆入pMON42916(图17)，用于分别构建含有CspA和CspB基因的pMON56609(图8)和pMON56610(图9)。采用已知方法将所述质粒转化到根癌农杆菌中。预计pMON56609含有编码类似于SEQIDNO：7的蛋白的核苷酸序列。预计pMON56610含有编码类似于SEQIDNO：9的蛋白的核苷酸序列。
实施例8.
农杆菌制备：
在含有卡那霉素50mg/L和潮霉素50mg/L(称为LB/KH)的LB平板上对农杆菌菌株EHA105划线。在共培养前两天，将一环的农杆菌转移到含10mlLB/KH的试管中，并于28℃黑暗中在振荡器上温育24小时。将该培养物在20mlLB/KH中稀释到1∶100，并于28℃黑暗中在振荡器上温育过夜。第二天取1ml1∶2稀释的培养物置于比色杯中，用LB/KH作空白对照测定OD600。计算用于共培养的5mlO.D1.0农杆菌悬液所需体积。
方程式：
Figure S04835385X20060608D000461
取所需体积的农杆菌培养物置于40ml离心管中，在7000rpm下离心7分钟。除去上清液并干燥沉淀物。将沉淀物重悬于5ml含有20mg/L乙酰丁香酮的共培养培养基(CCMEDIA-MS基础盐、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、硫胺素HCl0.5mg/L、L-脯氨酸115mg/L、2，4-D2mg/L)中。
稻胚转化：
收获温室生长的Nipponbare和Taipai309稻品种的穗(panicles)。通过将遂浸在50％商用漂白剂中10分钟接着在无菌蒸馏水中漂洗进行灭菌。用70％乙醇处理穗3分钟。然后从穗上剥离种子并一个一个地脱壳，接着转移到含有0.1％tween20溶液的falcon塑料试管中。接着在层流罩超净台中用70％乙醇处理种子。然后用无菌水漂洗种子。接着用50％漂白剂处理45分钟。在无菌蒸馏水中漂洗种子5分钟。最后用0.1％氯化汞处理种子5分钟。再用无菌蒸馏水洗涤种子8分钟。
在层流罩超净台中，在无菌条件下从无菌种子上切离胚，并放置在固体共培养培养基(含有2g/Lphytagel的CCMEDIA)中。将50μL一滴的农杆菌悬液滴在灭菌的培养皿上。将10个胚转移到每滴悬液中。进行15分钟的感染。用灭菌移液管尖移去农杆菌悬液。转移感染的胚到新鲜的固体CCMEDIA平板上并在黑暗中培养2天。在第3天用500mg/L头孢噻肟洗涤胚。然后在灭菌滤纸上干燥胚并置于延迟(Delay)培养基(MS基础盐、硫胺素HCl1mg/L、谷氨酰胺500mg/L、氯化镁750mg/L、干酪素水解物100mg/L、蔗糖20mg/L、2，4-D2mg/L、Pichloram2.2mg/L、头孢噻肟250mg/L)中。将胚在延迟培养基上于黑暗中培养7天。在该期间形成愈伤组织。转移愈伤组织到选择培养基(含有50mg/L潮霉素的延迟培养基)中并在黑暗中培养10天。之后将该愈伤组织在新鲜的选择培养基中进行继代培养。又10天后，转移愈伤组织到再生培养基(MS基础盐、蔗糖30mg/L、激动素2mg/L、NAA-0.2mg/L、头孢噻肟250mg/L、潮霉素25mg/L)中并在黑暗中培养7天。然后将愈伤组织转移到新鲜的再生培养基中并移至30℃16小时光周期下。转移愈伤组织发育的苗到生根培养基(半强度MS基础盐、蔗糖15g/L、头孢噻肟250mg/L、潮霉素25mg/L)中。将生根的苗转移到含水的测试用试管中并置于雾室中锻炼(hardening)。
挑选阳性植物。例如，可使用类似于实施例12-14和26-29所描述的那些方法来进行。包括所描述的用于产生转基因植物后代的育种方法。
实施例9.
三叶期冷休克响应-CspB和CspA稻转基因植物
植物体制备：
发芽：用0.01％氯化汞处理3分钟对种子灭菌，并在milique水中彻底洗涤10分钟以除去痕量的氯化汞。在milique水中浸泡3小时使灭菌种子吸涨。吸涨的种子在灭菌湿滤纸上于30℃温度和60％RH下发芽，使用了种子发芽器(SerwellInstrumentsInc.)。
三叶期幼苗确定：将发芽3天的幼苗转移到温室中的portrays(52.5mm(长)×26mm(深)×5.2mm(直径))中，该温室具有800微摩/mt2/秒的光强度和60％RH。在含有红砂壤土的portrays中幼苗一直生长到三叶期(约12天)。一周施用肥料溶液(N-75PPM，P-32PPM，K-32PPM，Zn-8PPM，Mo-2PPM，Cu-0.04PPM，B-0.4PPM和Fe-3.00PPM)一次直到试验结束。
CspB-R2植物分析
实验方案：在100微摩/mt2/秒光照和70％RH下，让三叶期稻幼苗(12天的)经受10℃冷胁迫4天(Percival生长室)。在胁迫处理后，在温室中让植物恢复10天并在第10天对存活的植物进行生长观察，记录影像证据。每种品系每次处理具有10次重复且它们是完全随机的。
结果：在用于冷胁迫耐受性测试的8个不同品系中，与野生型相比，6个品系具有明显更高的低温耐受性。与野生型相比，包括R2-226-6-9-3、R2-226-29-1-1、R2-257-20-2-1、R2-238-1-1-3、R2-230-4-4-2和R2-257-3-1-3的品系通过表现高恢复和低缩小率的生长(对于无胁迫的对照)，显示了高的低温耐受性(表-1，平板-1)。品系R2-230-4-42，具有非常好的性能，其具有100％存活率并在恢复过程中保持良好的生长(表1)。
表1.CspBR2转基因品系三叶期冷胁迫恢复生长观察结果
Figure S04835385X20060608D000481
Figure S04835385X20060608D000491
(索引：WT＝野生型)
CspB-R3植物分析
实验方案：在1000微摩/mt2/秒光照下，让三叶期幼苗暴露于8℃冷胁迫1天(Percival生长室)。随后，在28℃温室中让幼苗恢复15天并在恢复结束时记录植物高度。
结果：8个不同品系用于测试冷胁迫耐受性，与野生型(非转基因)植物相比所有8个品系都显示了改善的耐受性。这些结果证实了显示改善低温耐受性的R2分析数据(表2)。
表2：CspBR3转基因品系三叶期冷胁迫恢复生长观察结果
品系 恢复结束时胁迫植物的高度(cm) 恢复结束时无胁迫植物的高度(cm) 与无胁迫的相比植物高度减少％
R2-226-6-9-3 28.8±2.88 29.34±7.20 1.84
R2-226-29-1-3-4 30.18±3.19 32.07±3.79 5.89
R2-230-4-4-2-1 30.42±2.16 35.09±4.19 13.30
R2-230-34-1-2-1 32.14±3.41 37.4±5.68 14.01
R2-238-1-1-3-4 29.54±3.61 32.2±3.56 8.26
R2-257-3-1-3-1 27.12±3.38 30.86±3.82 12.11
R2-257-15-1-1-2 23.84±2.85 26.71±1.92 10.74
R2-257-20-2-1-1 33.8±3.48 38.82±1.97 12.93
WT-Taipei 23.9±3.74 36.65±4.01 34.78
CspA-R2植物分析
实验方案：在1000微摩/mt2/秒光照和70％RH的生长室中，让三叶期稻幼苗(12天的)经受10℃冷胁迫3天。在胁迫处理后，在温室中让植物恢复15天并在第15天记录生长观察。每一数值是12次观察的平均值，且该实验是根据如下完全随机化(CRD)实验设计来实施的。
结果：与野生型相比，在所测试的7个独立CspA转基因品系中有6个品系显示改善的低温耐受性。在该实验中，与无胁迫的植物相比，在冷处理的对照植物(WT)中植物高度减少了约50％。而在冷处理的具有CspA基因的不同独立品系转基因植物中，植物高度减少在4.5％-22.50％之间(除了一种品系生长减少47.09％外)。这些结果表明CspA改善了稻的低温耐受性(表3)。
表3：CspAR2转基因稻品系三叶期冷胁迫恢复生长观察结果
Figure S04835385X20060608D000501
CspA-R3植物分析
实验I
实验方案：在1000微摩光照下，让三叶期幼苗暴露于10℃冷胁迫3天。随后，在28℃温室中让幼苗恢复30天并在恢复结束时记录植物高度和幼苗存活率(在该实验中，每一转基因品系重复8次而野生型重复10次)。
结果：经受了冷胁迫的6个转基因品系在冷胁迫下较野生型表现更好。通过显示改善的低温耐受性，这些结果进一步证实了R2分析数据(表4)。
表4：CspAR3转基因稻品系三叶期冷胁迫恢复生长观察结果
品系 恢复结束时胁迫植物的高度(cm) 恢复结束时元胁迫植物的高度(cm) 与无胁迫的相比植物高度减少％ 幼苗存活率
R2-362-3-1-2-2 25.5±4.46 32.25±5.03 20.93 100
R2-362-3-1-3-2 25.62±3.36 34.43±6.24 25.58 66
R2-365-10-1-2-3 27.35±3.24 33.75±4.58 18.96 100
R2-362-6-1-2-1 28±2.45 34.45±2.29 18.72 100
R2-362-7-1-2-3 27.5±24.17 29.94±5.03 8.1 100
R2-362-7-1-3-3 27.88±4.22 31.92±2.89 12.65 100
WT-Nipponbare 26.25±3.95 36.34±4.06 27.76 40
注释：仅对存活植物记录植物高度，以上给出了它们的平均值。
实验II
实验方案：在1000微摩光照下，让三叶期幼苗暴露于10℃冷胁迫1天。随后，在28℃温室中让幼苗恢复30天并在恢复结束时记录植物高度和幼苗存活率(在该实验中，每一转基因品系重复8次而野生型重复10次)。
结果：经受了冷胁迫的5个转基因品系在冷胁迫下较野生型表现更好。通过显示改善的低温耐受性，这些结果进一步证实了R2分析数据(表5)。
表5：CspAR3转基因稻品系三叶期冷胁迫恢复生长观察值结果
品系 恢复结束时胁迫植物的高度(cm) 恢复结束时无胁迫植物的高度(cm) 与无胁迫的相比植物高度减少％
R2-362-3-1-2-2 32.76±3.49 32.25±5.03 Nil
R2-362-3-1-3-2 36.11±2.04 34.43±6.24 Nil
R2-365-10-1-2-3 35.85±2.94 33.75±4.58 Nil
R2-362-6-1-2-1 21.54±5.84 34.45±2.29 37.4
R2-362-7-1-2-3 32.55±2.73 29.94±5.03 Nil
R2-362-7-1-3-3 32.17±3.27 31.92±2.89 Nil
WT-Nipponbare 31.92±2.66 36.34±4.06 12.16
三叶期热胁迫响应
植物体制备：
发芽：用0.01％氯化汞处理3分钟对种子灭菌，并彻底洗涤(在去离子水中约10分钟)以除去痕量的氯化汞。在milique水中浸泡3小时使灭菌种子吸涨。吸涨的种子在灭菌湿滤纸上于30℃温度和60％RH下发芽，使用了种子发芽器(SerwellInstrumentsInc.)。
三叶期幼苗的确定：将发芽3天的幼苗转移到温室中的portrays(52.5mm(长)×26mm(深)×5.2mm(直径))中，该温室具有800微摩/mt2/秒的光强度和60％RH。在含有红土的portrays中幼苗一直生长到三叶期(约12天)。一周施用肥料溶液(N-75PPM，P-32PPM，K-32PPM，Zn-8PPM，Mo-2PPM，Cu-0.04PPM，B-0.4PPM和Fe-3.00PPM)一次直到试验结束。
CspA-R2植物分析
实验方案：在70％RH下，让三叶期稻幼苗(12天的)经受50℃热胁迫3天。在胁迫处理后，在温室中让植物恢复15天并在第15天记录生长观察值。每一数值是12次观察的平均值。
结果：与野生型相比，在所测试的7个独立CspA转基因品系中有6个品系显示改善的耐热性。在该实验中，与无胁迫的植物相比，在热处理的对照植物(WT)中植物高度减少了超过50％。而在热处理的带有CspA基因的不同独立品系转基因植物中，植物高度减少在9.5％-35％之间。这些结果表明CspA改善了稻的耐热性(表6)。
表6：CspAR2转基因稻品系三叶期植物热胁迫恢复生长观察结果
Figure S04835385X20060608D000531
CspB-R3植物分析
实验方案：将三叶期幼苗暴露于53℃热胁迫2小时，随后在28℃温室中让幼苗恢复15天并在恢复结束时记录植物高度。
结果：与野生型相比，在测试的8个转基因品系中有7个品系在热胁迫测试下表现更好。这些结果表明CspB改善了稻的热耐性(表7)。
表7：CspBR3转基因稻品系三叶期植物热胁迫恢复生长观察结果
品系 恢复结束时胁迫植物的高度(cm) 恢复结束时无胁迫植物的高度(cm) 与无胁迫的相比植物高度减少％
R2-226-6-9-3 34.53±2.14 35.54±2.07 2.84
R2-226-29-1-3-4 32.38±1.47 37.06±2.92 12.62
R2-230-4-4-2-1 28.78±4.16 35.06±2.07 17.41
R2-230-34-1-2-1 33.3±3.94 37.6±3.05 11.43
R2-238-1-1-3-4 33.96±2.06 41.2±3.83 17.57
R2-257-3-1-3-1 33.76±3.74 35.4±2.07 4.63
R2-257-15-1-1-2 25.68±4.27 38.2±3.11 32.77
R2-257-20-2-1-1 34.78±1.7 42.2±2.97 17.5
WT-Taipei 25.5±2.97 36.65±4.8 30.42
CspA-R3植物分析
实验I
实验方案：将三叶期幼苗暴露于53℃热胁迫3小时，随后在28℃温室中让幼苗恢复30天并在恢复结束时记录植物高度。
结果：通过显示改善的耐热性，这些结果证实了R2分析数据(表8)。
表8：CspAR3转基因稻品系三叶期植物热胁迫恢复生长观察结果
品系 恢复结束时胁迫植物的高度(cm) 恢复结束时无胁迫植物的高度(cm) 与无胁迫的相比植物高度减少％
R2-362-3-1-2-2 31.07±7.01 32.25±5.03 3.6
R2-362-3-1-3-2 30.28±4.74 34.43±6.24 12.05
R2-365-10-1-2-3 24.23±7.60 33.75±4.58 28.20
R2-362-6-1-2-1 26.93±2.97 34.45±2.29 21.82
R2-362-7-1-2-3 29.52±2.61 29.94±5.03 1.40
R2-362-7-1-3-3 21.30±6.37 31.92±2.89 33.27
WT-Nipponbare 22.68±2.96 36.34±4.06 37.58
实验II
实验方案：在1000微摩光照下，让三叶期幼苗暴露于50℃热胁迫1小时，随后在28℃温室中让幼苗恢复30天并在恢复结束时记录植物高度。
结果：通过显示改善的耐热性，这些结果证实了R2分析数据(表9)。
表9：CspAR3转基因稻品系三叶期植物热胁迫恢复生长观察结果。
品系 恢复结束时胁迫植物的高度(cm) 恢复结束时无胁迫植物的高度(cm) 与无胁迫的相比植物高度减少％
R2-362-3-1-2-2 31.57±2.39 32.25±5.03 2.10
R2-362-3-1-3-2 34.20±3.87 34.43±6.24 0.6
R2-365-10-1-2-3 31.63±4.32 33.75±4.58 6.28
R2-362-6-1-2-1 19.72±6.76 34.45±2.29 42.75
R2-362-7-1-2-3 32.18±3.25 29.94±5.03 Nil
R2-362-7-1-3-3 32.80±1.51 31.92±2.89 Nil
WT-Nipponbare 28.20±2.79 36.34±4.06 22.39
水分胁迫响应
植物体制备：
发芽：用0.01％氯化汞处理3分钟对种子灭菌，并在milique水中彻底洗涤10分钟以除去痕量的氯化汞。在milique水中浸泡3小时使灭菌种子吸涨。吸涨的种子在灭菌湿滤纸上于30℃温度和60％RH下发芽，使用了种子发芽器(SerwellInstrumentsInc.)。
CspB-R2植物分析
实验方案
将发芽幼苗(3天的)转移到两种不同水平的水分胁迫中，该水分胁迫是在含蛭石的PVC盆中建立的，是依据田间持水量(FC)来测定的。FC-100％是饱和状态(即100g蛭石需要350ml水)(Sharp等.，1988，Plantphysiol.87：50-57)。通过添加所需量的水，在含蛭石的PVC盆中建立不同水平的水分胁迫(即50％FC和25％FC)。在整个实验过程中，通过每天添加由于蒸发所失去的水分量，保持不同胁迫水平中的水分状态不变。在800微摩/mt2/秒光强度和60％RH的温室中，让幼苗在水分胁迫条件下生长15天。在生长的第15天，采用拍照记录根和苗。每一品系每次处理重复10次，且它们是完全随机化的。
通过采用如下公式计算生长减少的百分率。
结果：对4个不同的CspB转基因品系进行水分胁迫耐受性的分析。与野生型植物相比，在胁迫过程中所有测试的CspB转基因品系都显示出明显更高的生长。上述转基因品系包括R2-257-15-1-1、R2-238-1-1-3、R2-257-3-1-6和R2-226-6-9-3，与无胁迫的对照相比在根和苗生长中显示最小的百分数减少(FC-100％)。在这些品系的根和苗生长中减少的范围在11-25％之间。而野生型植物在生长中显示最大的减少，其接近50％。这些结果表明CspA改善了稻的水分胁迫耐受性(表-10和表-11)。
表10：cspB转基因品系和野生型在水分胁迫结束时根和苗生长的比较
Figure S04835385X20060608D000572
(索引：WT＝野生型，R∶S＝根与苗比值)
表11：cspB转基因品系和野生型根和苗生长减少率的比较。
品系 根生长减少％ 苗生长减少％ 根和苗生长减少％
R2-257-15-1-1 11 23.8 20
R2-238-1-1-3 25 31 30
R2-257-3-1-6 6 25.2 21
R2-226-6-9-3 19 30.5 27.5
WT-Taipei 28.4 47.9 42.8
CspA-R2植物分析
a.植物体制备：
发芽：用0.01％氯化汞处理3分钟对种子灭菌，并在milique水中彻底洗涤10分钟以除去痕量的氯化汞。在milique水中浸泡3小时使灭菌种子吸涨。吸涨的种子在灭菌湿滤纸上于30℃温度和60％RH下发芽，使用了种子发芽器(SerwellInstrumentsInc.)。
三叶期幼苗的确定：将发芽3天的幼苗转移到温室中的portrays(52.5mm(长)×26mm(深)×5.2mm(直径))中，该温室具有800微摩/mt2/秒的光强度和60％RH。在含有红砂壤土的portrays中幼苗一直生长到三叶期(约12天)。将肥料溶液(N-75PPM，P-32PPM，K-32PPM，Zn-8PPM，Mo-2PPM，Cu-0.04PPM，B-0.4PPM和Fe-3.00PPM)喷洒到幼苗表面，一周一次直到试验结束。
实验方案：在800微摩/mt2/秒光照和60％RH的温室中，让一个月大的幼苗经受水分胁迫3天。通过停止灌溉强加水分胁迫。在3天结束时，植物开始显示出萎蔫症状。通过用水灌溉植物减轻该胁迫，24小时后记录植物显示萎蔫症状百分率的观察值。在每次处理中每一品系保持最少12株植物。
结果：与野生型相比，在所测试的7个独立的CspA转基因品系中有6个品系显示改善的水分胁迫耐受性。在灌溉后66％的对照植物没有从萎蔫中恢复，而在不同独立品系的CspA转基因植物之间，在灌溉后有5％-43％的植物显示萎蔫症状(除一个品系的植物显示85％的萎蔫之外)。这些结果表明在稻中CspA改善了水分胁迫耐受性(表12)。
表12：CspAR2转基因稻品系的水分胁迫响应。
品系 显示萎蔫的植物％
R2-362-3-1-2 17
R2-328-2-1-1 43
R2-362-7-1-2 85
R2-365-4-5-3 5
R2-362-6-1-6 Nil
R2-362-3-1-10 15
R2-362-7-1-2 8
WT-Nipponbare 66
盐胁迫响应
CspB-R3植物分析
实验方案：通过将发芽的幼苗(48小时的)转移到带有含200mMNaCl蛭石的PVC盆中生长10天，让它们经受盐分胁迫。在胁迫10天后，通过将幼苗转移到含水蛭石的新盆中，让它们恢复15天。在恢复结束时记录诸如植物高度的生长观察值。该实验在完全随机设计(CRD)后在温室中进行，每次处理保持8次重复。
结果：7个CspB转基因品系和野生型植物经受了200mMNaCl胁迫。在该条件下，与野生型相比，5个转基因品系表现更好。这些结果表明CspB改善了稻植物对盐胁迫的耐受性(表13)。
表13：CspAR2转基因稻品系盐胁迫恢复生长观察结果
品系 恢复结束时胁迫植物的高度(cm) 恢复结束时无胁迫植物的高度(cm) 与无胁迫的相比植物高度减少％
R2-226-6-9-3 12.68±2.83 23.48±3.85 45.99
R2-226-29-1-3-4 19.24±3.46 25.54±3.64 24.66
R2-230-4-4-2-1 15.39±3.05 25.2±2.14 38.92
R2-230-34-1-2-1 15.78±3.31 23.26±1.98 32.15
R2-238-1-1-3-4 13.41±2.73 23.63±4.61 43.25
R2-257-3-1-3-1 21.07±3.28 28.95±4.37 27.64
R2-257-20-2-1-1 19.01±3.98 26.35±2.84 27.85
WT-Taipei 14.71±2.28 27.43±2.75 46.37
R3水分胁迫测定
通过将它们转移到含有蛭石的盆中，让来自cspA的4个独立转基因品系(1，2，3，4)和野生型(Nipponbare5号)的发芽的幼苗(3天的)经受水分胁迫。保持3种水平的水分状态，它们是100％田间持水量(FC-100＝3.72毫升水/克蛭石)、25％田间持水量(FC25＝0.93毫升水/克蛭石)、15％田间持水量(FC15＝0.558毫升/克蛭石)。在800微摩./mt2/秒.光强度和60％RH的温室中，幼苗在不同的水分状态中生长30天。在整个实验过程中，通过每天添加由于蒸发所失去的水分量，保持不同胁迫水平中的水分状态不变。在第30天时，通过添加水分使其水平到FC100并保持15天，让植物恢复。在实验过程中，记录诸如在胁迫(ES)结束时植物高度(pl.ht.)和根(R)苗(S)长度以及在恢复结束时干重的生长观察值。
每一品系每次处理重复10次，并且它们是完全随机的。
Figure S04835385X20060608D000611
表15：恢复结束时平均苗和根干重(mg)
品系代号 品系 FC100_根 FC100_苗 FC25_根 FC25_苗 FC15_根 FC15_苗
1 R2-362-3-1-3-4 231±21.8 563.9±60.7 57.6±6.8 189±16.3 44.7±6.3 152.9±22.1
2 R2-362-6-1-2-2 226±14.2 531.8±63 72.1±5.1 179.8±17 53.9±7.9 146.3±21.1
3 R2-363-7-1-3-3 229.5±30.2 533±48.5 66.1±11.9 183±13.9 60.6±5.7 147.4±14.7
4 R2-365-10-1-2-1 219±43.5 557±71.9 56.2±9.3 173.9±27.3 47.3±3.1 133.7±7.7
5 WT-Nipponbare 226±34.5 525±31.3 61.1±4.2 151.1±16.8 45.2±7.5 132.2±11.03
表16：胁迫结束时平均苗长度
品系代号 品系 FC100 FC25 FC15
1 R2-362-3-1-3-4 42±4.6 28.4±1.7 27.4±2.1
2 R2-362-6-1-2-2 40.4±2.1 26.1±1.1 25.2±2.2
3 R2-363-7-1-3-3 40.1±2.7 27±2.0 26.3±1.4
4 R2-365-10-1-2-1 38.9±2.3 26.3±1.6 23.3±2.4
5 WT-Nipponbare 39.5±1.05 24.2±2.0 24.7±1.9
实施例10.
cspA
构建pMON73607(图10)
1.用NcoI和ApaI酶切pMON61322载体以打开主链并切下CspA基因。通过凝胶纯化分离主链片段。
2.从pMON56609(图8)载体PCR扩增大肠杆菌cspA基因。使用PCR引物在基因的5’末端留下NcoI位点并在3’末端创建SwaI和ApaI位点。
3.连接PCR片段和pMON61322(图11)主链。转化入文库效率(libraryefficiency)DH5α细胞。筛选的菌落使用ApaI和NcoIc来鉴定具有插入物的克隆。
4.对载体测序以证实cspA基因和质粒其他选定区域的保真性。
cspB
构建pMON73608(图12)
1.用NcoI和ApaI酶切pMON61322载体以打开主链并切下HVA1基因。通过凝胶纯化分离主链片段。
2.从pMON56610载体PCR扩增枯草杆菌cspB基因。使用PCR引物在基因5’末端留下NcoI位点并在3’末端创建SwaI和ApaI位点。
3.连接PCR片段和pMON61322主链。转化入文库效率DH5细胞。筛选的菌落使用ApaI和NcoIc来鉴定具有插入物的克隆。
4.对载体测序以证实CspB基因和质粒其他选定区域的保真性。
实施例11.玉米植物转化
通过本领域公知方法可转化玉米植物，例如，参见本文中实施例20-25。
实施例12.
可采用下列方法分析转基因植物的拷贝数。
从嫩叶中收集叶组织，尽可能从靠近底部和叶的一侧收集。将试样置于96孔板中冻干过夜。通过在每个孔中放置3个3mm金属球并使用Mega研磨机在1200rpm下振动2分钟均质组织。使用含有β-巯基乙醇、缓冲到pH8的Tris、EDTA、NaCl和十二烷基硫酸钠的标准缓冲液提取DNA。先用乙酸钾再用氯仿进行提取，并用异丙醇进行沉淀。接着离心，用乙醇溶液洗涤并干燥，在进一步分析前将DNA重悬于Tris-EDTA缓冲液中。
用多种限制性内切酶消化DNA并通过非变性琼脂糖凝胶电泳分离片段。用NaOH溶液变性DNA。在含NaCl的Tris缓冲液中中和凝胶并通过毛细管作用转印在尼龙滤膜上。在添加合适的探针前，将尼龙滤膜在含鲑鱼精子DNA缓冲溶液中预杂交，该探针可以是放射性或DIG标记的。杂交后，洗涤印迹并通过对放射自显影胶片曝光或用抗DIG抗体缀合物和合适的底物检测DIG来检测。
实施例13.
我们使用cspA和cspB的全长开放阅读框在大肠杆菌中表达，使用了容许合成并纯化His-标记的抗原的载体(Novagen，MerckKgaA，Darmstadt，Germany的分支机构)。使用了供应商，例如StrategicBiosolutions的产品，纯化的抗原可用于产生多克隆抗体。所产生的抗体可用来测试表达CSP蛋白的植物。
实施例14.
转基因玉米品系改良。在诸如玉米种质A(CORNOFGERMPLASMA)、玉米种质C(CORNOFGERMPLASMC)和玉米种质D(CORNOFGERMPLASMD)的种质中产原代转化体生。原代转化体自交并与相同的近交基因型非转基因植物回交。将来自自交植物的种子在田地里种植并通过Taqman接合性测定法测定以鉴定推定的纯合选择物，推定的杂合选择物和负选择物。将推定的杂合选择物与多种合适的测交植物杂交，如玉米种质B(CORNOFGERMPLASMB)和玉米种质D(CORNOFGERMPLASMD)。收获杂交的种子，手工脱壳，并通过选择进行分组。其他育种方法也可采用，例如，参见本文实施例29。
实施例15.
对幼苗进行处理，限制可获得水分至最适度以下水平使得处理产生可测的表型响应。例如，该处理可采取在若干天内限制水分量导致进行性水分亏缺的形式，或采取通过溶液培养渗透胁迫幼苗产生急性缺水的形式，或采用盐处理。对该处理具有改善的表型响应的转基因阳性植物可被筛选。测定的表型响应可包括在处理期间或在处理后恢复期间苗生长率或干重累积、萎蔫或萎蔫恢复、以及根生长率和干重累积。对于田间有效性试验那些具有改善的响应将得到提升。筛选将需要许多在小盆中生长的转基因阳性和转基因阴性植物，这些植物在诸如生长室或温室的可控环境中生长。被筛选的植物数量受与所应用的处理和所测表型相关的变量支配。
实施例16.
田间生长的植物可经限制可获得水分至最适度以下水平的处理，使得可处理产生可测的表型响应。例如，该处理可采取在植物的后期生长和早期生殖发育期间，在若干天内限制植物可获得水分量导致进行性水分亏缺的形式。在该处理中相对于转基因阴性植物，筛选具有改善表型响应的转基因阳性植物。测定的表型响应可包括在处理期间苗生长率、叶萎蔫、谷物产量以及诸如谷粒数量和千粒重的穗产量组分。对于第一年产量试验那些具有改善响应的事件将得到提升。筛选可在具有可控灌溉的两块旱地区域的标准种植密度下进行。被筛选的植物数量受与所应用的处理和所测表型相关的变量支配。
实施例17.
一些所描述的基因将被克隆转化入植物中，并以一种类似于如下的方法(实施例17-30)产生表型。例如，核苷酸和编码SEQIDNOS：4-53的核苷酸。
构建目的载体
使用本领域技术人员公知的方法构建GATEWAYTM目的(InvitrogenLifeTechnologies，Carlsbad，CA)植物表达载体(pMON65154，图13)。表达载体的元件概述于表17中。包含细菌复制功能的质粒pMON65154主链和来自于质粒pSK-的在大肠杆菌中表达的氨苄青霉素抗性基因。pMON64154中植物表达元件是本领域技术人员可以获得的，表17中提供了每一元件的参考文献。所有在表17中引用的位置指每一元件在图13所披露的质粒图中的碱基对坐标。一般来说，pMON65154包含含有可操纵地连接编码新霉素磷酸转移酶II(nptII)基因的花椰菜花叶病毒35S启动子的选择标记表达盒。该选择标记表达盒3’区包含根癌农杆菌胭脂碱合酶基因(nos)3’区和在其之后的马铃薯蛋白酶抑制因子II(pinII)基因3’区。质粒pMON65154还包含一个植物表达盒，使用GATEWAYTM克隆方法可以插入目的基因。该GATEWAYTM克隆盒5’侧接有稻肌动蛋白1启动子、外显子和内含子的，3’侧接有马铃薯pinII基因3’区。使用GATEWAYTM方法，用目的基因取代该克隆盒。包含目的基因的载体pMON65154及其衍生物在通过诸如微粒轰击的直接DNA递送的植物转化方法中是特别有用的。本领域技术人员使用本领域公知方法可以构建具有相似特征的表达载体。此外，本领域技术人员应当理解其他启动子和3’区可用于表达目的基因，并可以使用其他选择标记。
表17.
质粒pMON65154的元件
盒 功能 元件 位置 参考文献
植物目的基因表达 启动子 稻肌动蛋白1 1796-2638 Wang等，1992
增强子 稻肌动蛋白1外显子1，内含子1 2639-3170 Wang等，1992
GATEWAYTM克隆 重组 AttR1 3188-3312 GATEWAYTM克隆技术使用说明书(InvitrogenLife Technologies，Carlsbad，CA)
细菌氯霉素抗性基因 CmR基因 3421-4080 GATEWAYTM克隆技术使用说明书(InvitrogenLife Technologies，Carlsbad，CA)
细菌负选择标记 ccdA，ccdB基因 4200-4727 GATEWAYTM克隆技术使用说明书(InvitrogenLife Technologies，Carlsbad，CA)
GATEWAYTM重组位点 attR2 4768-4892 GATEWAYTM克隆技术使用说明书(InvitrogenLife Technologies，Carlsbad，CA)
植物目的基因表达盒 3’区 马铃薯pinII 4907-5846 An等，1989
植物选择标记基因表达盒 启动子 花椰菜花叶病毒35S 5895-6218 美国专利号5352605
选择标记基因 nptII 6252-7046 美国专利号6174724
3’区 nos 7072-7327 Bevan等，1983
3’区 pinII 7339-8085 An等，1989
大肠杆菌中保有的 复制起点 ColE1 858-1267 Oka等，1979
大肠杆菌中保有的 复制起点 F1 8273-3673 Ravetch等，1977
大肠杆菌中保有的 氨苄青霉素抗性 bla 8909-551 Heffron等，1979
构建一种用于农杆菌介导的植物转化方法的分离的质粒载体(pMON72472，图14)。该质粒pRG76包括pMON65154中的目的基因植物表达盒、GATEWAYTM克隆盒和植物选择标记表达盒。此外来自农杆菌的左和右T-DNA边缘区被添加到该质粒上。右边缘区位于稻肌动蛋白1启动子的5’，左边缘区位于pinII3’序列的3’，该pinII3’序列位于nptII基因的3’。此外，pMON65164的pSK-主链被质粒主链所取代以便于该质粒在大肠杆菌和农杆菌中复制。该主链包含多种宿主来源的在农杆菌中起DNA复制作用的oriV、pBR322来源的在大肠杆菌中起DNA复制作用的rop序列和用于在大肠杆菌和农杆菌中选择所存在质粒的壮观霉素/链霉素抗性基因。
表18中描述了存在于质粒载体pRG81中的元件。
表18.质粒载体pRG81的遗传元件
盒 功能 元件 位置 参考文献
植物目的基因表达 启动子 稻肌动蛋白1 5610-6452 Wang等，1992
增强子 稻肌动蛋白1外显子1，内含子1 6453-6984 Wang等，1992
GATEWAYTM克隆 重组 AttR1 7002-7126 GATEWAYTM克隆技术使用说明书(InvitrogenLife Technologies，Carlsbad，CA)
细菌氯霉素抗性基因 CmR基因 7235-7894 GATEWAYTM克隆技术使用说明书(InvitrogenLife Technologies，Carlsbad，CA)
细菌负选择标记 ccdA，ccdB基因 8014-8541 GATEWAYTM克隆技术使用说明书(InvitrogenLife Technologies，Carlsbad，CA)
GATEWAYTM重组位点 attR2 8582-8706 GATEWAYTM克隆技术使用说明书(InvitrogenLife Technologies，Carlsbad，CA)
植物目的基因表达盒 3’区 马铃薯pinII 8721-9660 An等，1989
植物选择标记基因表达盒 启动子 花椰菜花叶病毒35S 1-324 美国专利号5352605
选择标记基因 nptII 358-1152 美国专利号6174724
3’区 nos 1178-1433 Bevan等，1983
3’区 pinII 1445-2191 An等，1989
农杆菌介导的转化 DNA转移 左边缘区 2493-2516 Zambryski等，1982；GenBank 登录号AJ237588
大肠杆菌或农杆菌中质粒保有的 复制起点 Ori-V 2755-3147 Honda等，1988
大肠杆菌中质粒保有的 复制起点 ColE1 3545-4199 Oka等，1979
大肠杆菌或农杆菌中质粒保有的 壮观霉素/链霉素抗性 Spc/Str 4242-5030 Fling等，1985
农杆菌介导的转化 DNA转移 右边缘区 5314-5538 Zambryski等，1982；GenBank 登录号AJ237588
实施例18.
编码序列在插入诸如pMON65154(图13)的GATEWAYTM目的植物表达载体之前通过PCR进行扩增。所有编码序列皆可获得自克隆的全长序列或DNA序列信息，使来自cDNA文库期望序列的扩增得以进行。为了除去大部分的5’和3’非翻译区，根据起始和终止密码子处或其附近序列，设计PCR扩增引物。为了能通过重组入GATEWAYTM载体(InvitrogenLifeTechnologies，Carlsbad，CA)进行克隆，PCR产物末尾带有attB1和attB2序列。
两种方法用于产生attB侧翼的PCR扩增的目的序列。这两种方法详述于GATEWAYTM克隆技术使用说明书中(InvitrogenLifeTechnologies，Carlsbad，CA)。在第一种方法中，使用包含attB和模板特异性序列的一组引物。引物序列如下：
attB1正向引物：
5’GGGCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTN模板特异性序列3’(SEQIDNO：71)
attB2反向引物
5’GGGGCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTN模板特异性序列3’(SEQIDNO：72)
或者，attB接头PCR用于制备attB侧翼PCR产物。attB1接头PCR使用两组引物，即基因特异性引物和装配attB序列的引物。设计所需DNA序列引物，包括attB1或attB2序列5’末端的12个碱基对。使用的引物如下：
attB1基因特异性正向引物
5’CCTGCAGGACCATG正向基因特异性引物3’(SEQIDNO：73)
attB2基因特异性反向引物
5’CCTGCAGGCTCGAGCTA反向基因特异性引物3’(SEQIDNO：74)
第二组引物是attB接头引物，具有如下序列：
attB1头正向引物5’GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCTGCAGGACCATG3’(SEQIDNO：75)
attB2接头反向引物5’GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCCTGCAGGCTCGAGCTA3’(SEQIDNO：76)
依照InvitrogenLifeTechnologies(Carlsbad，CA)所描述的方法，通过PCR扩增attB1和attB2侧翼序列。如上所述从凝胶中纯化并回收attB侧翼PCR产物。
在某些情况下，使用GATEWAYTM技术，自PCR回收attB侧翼序列，但不插入到供体载体(DonorVector)中。当GATEWAYTM重组入供体载体失败时，使用连接酶的常规克隆方法用于将DNA序列插入到中间载体(EntryVector)(InvitrogenLifeTechnologies，Carlsbad，CA)中。中间载体的选择取决于该载体中限制性内切酶位点和所需插入序列的相容性。用经选择的限制性内切酶消化中间载体以除去ccdB基因，脱磷酸并通过凝胶纯化。所选择的限制性内切酶取决于所使用的中间载体和期望插入的序列。例如，使用EcoRI或其他诸如EcoRV和XmaI或NcoI和XhoI的限制性内切酶组合从pENTR11(图15)中除去ccdB基因。其他限制性内切酶可与其他中间载体一起使用，用于GATEWAYTM方法中。为使用限制性内切酶消化中间载体，在期望PCR产物上产生合适的粘性末端是必需的。可通过多种本领域技术人员公知的方法产生粘性末端，例如限制性内切酶消化、接头连接或在PCR过程中添加限制酶切位点。
在某些情况下，在PCR片段和中间载体上不可能产生合适的粘性末端。或者，要通过限制性内切酶消化cDNA克隆指导产生合适的粘性末端。但是，有可能产生平末端连接的PCR片段和中间载体。使用该方法，用限制性内切酶酶切中间载体以除去ccdB基因。用T4DNA聚合酶使得凝胶纯化的线性中间载体平末端化。本领域技术人员知道其他制备平末端的DNA分子的方法，例如使用KlenowDNA聚合酶的方法。通过与T4DNA聚合酶或其他合适的聚合酶、T4多核苷酸激酶以及磷酸酶温育，PCR产物平末端化且较好地脱磷酸化。使用本领域公知方法进行中间载体和PCR产物的平末端连接。将连接产物转化入大肠杆菌和质粒，分析单个菌落中插入DNA的存在和在中间载体中相对于attL位点的期望方向。选择带有紧接于开放阅读框氨基末端的attL1序列的克隆。
更适宜地，当使用GATEWAYTM方法，attB侧翼PCR产物不能插入质粒中时，使用克隆PCR产物的TA法(Marchuk等.，1991)。该TA法利用了Taq聚合酶末端转移酶活性。使用在此所述的方法，用限制性内切酶酶切中间载体并产生平末端化。该平末端化线性中间载体与dTTP和Taq聚合酶温育，在每条DNA链的3’末端添加一个胸腺嘧啶残基。由于Taq聚合酶嗜好dATP，因此大多数产生的PCR产物通常在3’末端添加有一个腺苷。因此，中间载体和PCR产物具有互补的单碱基3’突出物。在本领域技术人员公知的条件下连接后，将质粒转化入大肠杆菌。从单个菌落中分离质粒并进行分析以鉴定在正确方向上具有期望插入物的质粒。或者，将末尾带有attB位点的PCR产物TA克隆入商用TA克隆载体中，例如pGEM-TEASY(PromegaCorporation，Madison，WI)。
在导入植物前，对所有PCR扩增产物测序。对通过GATEWAYTM法产生的目的表达载体中的PCR插入物测序，以证实所插入的序列编码期望的氨基酸序列。如果使用连接法产生中间载体，则在使用GATEWAYTM技术产生目的表达载体前对中间载体中插入序列进行测序。点突变并不影响氨基酸编码序列，即沉默突变是可接受的。
实施例19.构建表达载体
GATEWAYTM克隆法(InvitrogenLifeTechnologies，Carlsbad，CA)用于构建玉米转化中使用的表达载体。该GATEWAYTM法详尽描述于GATEWAYTM克隆技术使用说明书(InvitrogenLifeTechnologies，Carlsbad，CA)中。使用GATEWAYTM系统有利于编码基因在植物表达载体中的高通量克隆。如上所述，通过PCR产生带attB1和attB2侧翼序列的基因序列。取决于所重组的序列，将attB1和attB2置于编码序列的5’和3’，产生正义或反义表达载体。一种植物表达载体，pMON65154(图13)，其中任一编码序列都可在正义或反义方向插入，如实施例1所述得到构建，并在GATEWAYTM克隆方法中用作为目的载体。
两种任取其一的方法用于在植物表达载体中插入PCR扩增的编码序列。在第一种方法中，包含5’和3’末端attB1和attB2侧翼序列的目的编码序列的PCR产物与供体载体(pDONR201TM，InvitrogenLifeTechnologies，Carlsbad，CA)在BPCLONASETM存在下温育。GATEWAYTM中间克隆物产生自该反应并转化入大肠杆菌。从中间克隆物分离质粒DNA。为证实PCR反应的保真性，可对来自中间载体的插入编码序列进行测序。将分离自大肠杆菌菌落中间克隆物的质粒DNA与线性化的目的载体温育，优选pMON65154，在LRCLONASETM存在下产生包含目的编码序列的植物表达载体。将来自LRCLONASETM反应的DNA转化入大肠杆菌。分离来自目的表达载体的质粒DNA并测序以确定正确方向和该植物表达载体中的序列。在第二种产生植物表达载体的方法中，如上所述，将带attB1和attB2侧翼序列的PCR产物与供体载体(pDONR201TM，InvitrogenLifeTechnologies，Carlsbad，CA)及BPCLONASETM温育。温育后，等分量的反应混合物进一步与线性化的目的载体及LRCLONASETM温育。将所产生的DNA转化入大肠杆菌，并使用本领域公知的PCR或DNA印迹分析技术选择含有目的编码序列的植物表达载体。InvitrogenLifeTechnologies(GATEWAYTM克隆技术使用说明书)描述了这两种产生包含目的编码序列的植物表达载体的方法。
或者，使用限制性内切酶和连接酶产生中间载体。中间载体可获得自EInvitrogenLifeTechnlogies(Carlsbad，CA)。每种中间载体，如pENTR1A、pENTR2B、pENTR3C、pENTR4和pENTR11，具有独特的克隆和表达特性。pENTR11优先用于本发明的实践中。本领域技术人员应当意识到其他中间载体也能使用。在使用限制性内切酶和连接酶将期望序列插入一种中间载体之前，在ccdB基因的每一侧上需要对中间载体进行限制酶切消化。取决于在要被插入中间载体的DNA序列上所存在的限制酶切位点，使用多种不同组合的限制性内切酶。优选的中间载体是脱磷酸化的，以及在限制酶切消化后通过凝胶纯化的。使用本领域技术人员公知的分子生物学常规方法将期望DNA序列插入中间载体。TA克隆(美国专利号5,827,657)是一种将PCR片段克隆入中间载体的优选方法。
载体(称为pMON和5数字编号)以及其中包含使用GATEWAYTM克隆方法产生的编码序列是，例如，SEQIDNOS：4-28。预计使用本文所述的方法，本发明的某些编码序列可以克隆入植物表达载体。
实施例20.
在温室中种植玉米种质A(CORNOFGERMPLASMA)植物。当胚长1.5-2.0mm时，从植物上收获穗，通常在授粉后10-15天，最经常在授粉后11-12天。通过喷洒或将穗浸泡在80％乙醇中对穗进行表面灭菌，随后风干。或者，通过浸没在含10％SDS的50％CLOROXTM中20分钟对穗进行表面灭菌，然后用无菌水漂洗3次。
使用本领域技术人员公知的方法分离每粒种子的未成熟胚。在含有16.9mg/LAgNO3的培养基211(N6盐、2％蔗糖、1mg/L2，4-D、0.5mg/L烟酸、1.0mg/L硫胺素-HCl、0.91g/LL-天冬酰胺、100mg/L肌醇、0.5g/LMES、100mg/L干酪素水解物、1.6g/LMgCl2、0.69g/LL-脯氨酸、2g/LGELGROTM，pH5.8)(称为培养基211V)上培养未成熟胚3-6天，优选在微粒轰击前培养3-4天。
实施例21.
已知农杆菌介导的玉米细胞和其他单子叶植物转化的方法(Hiei等.，1997；美国专利号5,591,616；美国专利号5,981,840；公开的欧洲专利申请EP0672752)。虽然多种农杆菌菌株可以使用(见上述参考文献)，本发明人优先使用菌株ABI。该农杆菌ABI菌株来自菌株A208，一种C58胭脂碱型菌株，通过在37℃下培养除去其中的Ti质粒，还含有修饰的Ti质粒pMP90RK(Koncz和Schell，1986)。一种根癌农杆菌双元载体系统(An等.，1998)优选用于转化玉米。业已描述了可替换的共整合Ti质粒(Rogers等，1988)，可用于转化玉米。使用电穿孔(Wen-jun和Forde，1989)或三亲株杂交(Ditta等.，1980)可将一种包含一或多个目的基因的双元载体导入无害的(disarmed)农杆菌菌株中。双元载体可含有选择标记基因、可筛选的标记基因和/或一种或多种赋予转化的植物所需表型性状的基因。一种例证的双元载体，pMON30113，示于图4中。其他双元载体可使用且为本领域技术人员公知。
在玉米细胞共培养前，农杆菌细胞可在28℃下LB(DIFCO)液体培养基中培养，该培养基含有合适的抗生素进行选择用于修饰的Ti质粒和双元载体的保持。例如，ABI/pMON30113，可在含50μg/ml卡那霉素的LB培养基中培养进行选择用于pMP90RK修饰的Ti质粒的保持，以及100μg/ml壮观霉素进行选择用于双元载体pMON30113的保持。在农杆菌菌株宿主中使用合适的选择试剂来保持质粒，对于本领域技术人员而言是显而易见的。在玉米细胞接种前，在室温下于AB培养基(Chilton等.，1974)中培养农杆菌细胞过夜，该培养基含有用于质粒保持的合适的抗生素和200μM乙酰丁香酮。在玉米细胞接种之前即刻，优选通过离心沉淀农杆菌，在含有200μM乙酰丁香酮的1/2MSVI培养基(2.2g/LGIBCO(Carlsbad，CA)MS盐、2mg/L甘氨酸、0.5g/L烟酸、0.5g/LL-吡哆醇-HCl、0.1mg/L硫胺素、115g/LL-脯氨酸、10g/LD-葡萄糖和10g/L蔗糖，pH5.4)中洗涤，以0.1-1.0×109个细胞/毫升重悬于含200μM乙酰丁香酮的1/2MSPL培养基(2.2g/LGIBCO(Carlsbad，CA)MS盐、2mg/L甘氨酸、0.5g/L烟酸、0.5g/LL-吡哆醇-HCl、0.1mg/L硫胺素、115g/LL-脯氨酸、26g/LD-葡萄糖、68.5g/L蔗糖，pH5.4)中。本领域技术人员可用其他培养基替换1/2MSVI和1/2MSPL。
如前所述分离未成熟玉米胚。在切除后0-7天内用农杆菌接种胚，优选在切除后马上接种。或者，未成熟胚可培养超过7天。例如，如上所述，胚形成的愈伤组织可被诱发并与农杆菌共培养。优选地，切除未成熟玉米胚，浸没在农杆菌悬液中，如上所述该悬液在1/2MSPL培养基中制备并在室温下与农杆菌温育5-20分钟。
在接种胚被转移到半强度的含3.0mg/L2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、1％D-葡萄糖、2％蔗糖、0.115g/LL-脯氨酸、0.5mg/L硫胺素-HCl、200μM乙酰丁香酮和20μM硝酸银或硫代硫酸银的MS培养基(Murashige和Skoog，1962)中后。在黑暗中于23℃下将未成熟胚与农杆菌共培养1-3天。本领域技术人员可用其他培养基替换所述的培养基。
将共培养的胚转移到培养基15AA(462mg/L(NH4)SO4、400mg/LKH2PO4、186mg/LMgSO4-7H2O、166mg/LCaCl2-2H2O、10mg/LMnSO4-H2O、3mg/LH3BO3、2mg/LZnSO4-7H2O、0.25mg/LNaMoO4-2H2O、0.025mg/LCuSO4-5H2O、0.025mg/LCoCl2-6H2O、0.75mg/LKI、2.83g/LKNO3、0.2mg/L烟酸、0.1mg/L硫胺素-HCl、0.2mg/L吡哆醇-HCl、0.1mg/LD-生物素、0.1mg/L氯化胆碱、0.1mg/L泛酸钙、0.05mg/L叶酸、0.05mg/L对氨基苯甲酸、0.05mg/L核黄素、0.015mg/L维生素B12、0.5g/L水解酪蛋白氨基酸、33.5mg/LNa2EDTA、1.38g/LL-脯氨酸、20g/L蔗糖、10g/LD-葡萄糖)或含有1.5mg/L2，4-D、500mg/L羧苄青霉素、3％蔗糖、1.38g/LL-脯氨酸和20μM硝酸银或硫代硫酸银的MS培养基中，并在黑暗中于27℃下无选择培养0-8天。用于选择转化体和植物再生的培养基优选含有500mg/L羧苄青霉素。本领域技术人员可用其他抗生素替换其他控制农杆菌生长的抗生素。其他支持细胞培养的培养基可用作为选择。在没有选择延迟(0天培养)情况下，选择可以开始于25mg/L巴龙霉素。选择培养基可包含培养基211(上述的)或培养基211的变体，其中N6盐置换为MS盐。两周后，将胚形成的愈伤组织转移到含100mg/L巴龙霉素的培养基中，约两周间隔传代培养一次。当共培养后选择延迟时，开始将胚在含50mg/L巴龙霉素的培养基中培养，然后在含100-200mg/L巴龙霉素的培养基中继续培养胚形成的愈伤组织。本领域技术人员可以在抑制缺少选择标记基因的细胞生长的巴龙霉素浓度下培养组织，但转化的愈伤组织所在的浓度是可以增殖的。或者，可以使用其他的选择标记来鉴定转化的细胞。相信在25-50mg/L巴龙霉素下初始培养约两周，接着在50-200mg/L巴龙霉素下培养可导致转化的愈伤组织恢复。选择开始6-8周后恢复转化体。植物再生自如上所述的转化的胚形成愈伤组织，该愈伤组织在微粒轰击后用于转化体恢复。
实施例22.农杆菌介导的玉米愈伤组织转化
该实施例描述了使用农杆菌转化玉米愈伤组织的方法。该方法作为例证使用了一种nptII选择标记基因和巴龙霉素选择剂。本领域技术人员应当意识到其他选择标记和选择剂组合可替换使用。
使用本领域技术人员公知的方法从未成熟胚诱导愈伤组织。例如，从诸如玉米种质A(CORNOFGERMPLASMA)基因型的发育的玉米种子上切除下1.5mm-2.0mm未成熟胚，并将胚轴侧面朝下在培养基211V上培养，一般在切除后培养8-21天。或者，确定通过本领域技术人员公知的方法可以开始并维持确定的愈伤组织的培养。
依照描述于实施例21的方法制备用于植物组织接种的农杆菌。将50-100块愈伤组织转移到含约0.1-1.0×109cfu/ml的15ml农杆菌悬液的60mm×20mm的培养皿中。一块愈伤组织通常是在培养第21天产生自未成熟胚的整个愈伤组织或一块2mm-8mm直径确定的愈伤组织。愈伤组织在室温下与农杆菌悬液温育约30分钟，接着通过抽吸除去液体。
添加约50μL无菌蒸馏水到60mm×20mm培养皿中的Whatman#1滤纸上。1-5分钟后，将15-20块愈伤组织转移到每张滤纸上，用例如
Figure S04835385X20060608D000761
密封培养皿。愈伤组织和农杆菌在黑暗中于23℃下共培养约3天。
从滤纸上将愈伤组织转移到含20μM硝酸银和500mg/L羧苄青霉素的培养基211上，在黑暗中于27℃-28℃下培养2-5天C，优选3天。通过将愈伤组织转移到含20μM硝酸银、500mg/L羧苄青霉素和25mg/L巴龙霉素的培养基211上起动选择。在黑暗中于27℃-28℃下培养培养2周后，将愈伤组织转移到含20μM硝酸银、500mg/L羧苄青霉素和50mg/L巴龙霉素的培养基211(培养基211QRG)中。两周后愈伤组织在新鲜的培养基211QRG上传代培养，并在黑暗中于27℃-28℃下进一步培养两周。然后，将愈伤组织转移到含20μM硝酸银、500mg/L羧苄青霉素和75mg/L巴龙霉素的培养基211上。在黑暗中于27℃-28℃下培养2-3周后，鉴定巴龙霉素抗性愈伤组织。本领域技术人员应意识到愈伤组织传代培养时间间隔是大约的，以更短的时间间隔转移组织能加速选择过程，如每周一次胜于两周一次。
从转化的愈伤组织再生的植物，转移到土壤中并如实施例所描述在温室中生长。在农杆菌介导的转化后，培养基217(见实施例9)进一步添加500mg/L羧苄青霉素以及培养基127T(见实施例9)进一步添加250mg/L羧苄青霉素。使用表Y中概述的农杆菌介导的转化来产生包含本发明基因的转化的玉米植物。
实施例23.微粒轰击的方法
在微粒轰击前约4小时，将未成熟的胚转移到培养基211SV(增加蔗糖至12％的培养基211V)上。优选将25个未成熟的胚置于60×15mm培养皿中，排成5×5网格，将胚鳞的胚芽鞘末端以20度角轻轻地压到培养基中。在轰击前组织保存在黑暗中。
在微粒轰击前，制备其上沉淀有所需DNA的金粒悬浮液。将10毫克0.6μrn金粒(BioRad)悬浮在50μL缓冲液(150mMNaCl，10mMTris-HCl，pH8.0)中，添加25μL2.4nM期望DNA溶液到金粒悬浮液中，并轻轻地涡旋约5秒。添加75μL0.1M亚精胺并轻轻地涡旋溶液约5秒。添加75μL25％聚乙二醇(3000-4000分子量，AmericanTypeCultureCollection)溶液并轻轻地涡旋溶液约5秒。添加75μL2.5MCaCl2并涡旋溶液5秒。添加CaCl2后，将溶液在室温下温育10-15分钟。随后将悬浮液在12,000rpm下离心20秒(SorvalMC-12V离心机)，移除上清液。用100％乙醇洗涤金粒/DNA沉淀两次并重悬在10mL100％乙醇中。将金粒/DNA制备物贮藏在-20℃下最多两周。
使用放电粒子加速基因递送装置(美国专利号5,015,580)将DNA导入玉米细胞中。通过在薄片上分散310-320μL的金粒/DNA悬浮液，将金粒/DNA悬浮液包覆在Mylar薄片(DuPontMylar聚酯软片，型号SMMC2，一面涂有铝层，之上两面都涂有PVDC共聚物，切成18mm的正方形)上。在金粒悬浮液固定1-3分钟后，除去过量乙醇并风干薄片。如美国专利号5,015,580所述进行玉米组织的微粒轰击。在放电粒子递送装置中交流电电压可以改变。对于玉米种质A(CORNOFGERMPLASMA)预培养的未成熟胚的微粒轰击，优选使用35％-45％的最大电压。微粒轰击后，在黑暗中于27℃下培养组织。
实施例24.转化细胞的选择
基于转基因新霉素磷酸转移酶(nptII)基因的表达，在包含巴龙霉素的培养基上选择转化体。DNA递送24小时后，将组织转移到含25mg/L巴龙霉素的211V培养基上(培养基211HV)。在黑暗中于27℃下温育3周后，将组织转移到含50mg/L巴龙霉素的培养基211上(培养基211G)。3周后，将组织转移到含75mg/L巴龙霉素的培养基211(培养基211XX)上。在9周的选择后分离转化体。表Y披露了使用在此披露的微粒轰击方法进行转化体实验的结果。
实施例25.能育转基因植物的再生
能育转基因植物产生自转化的玉米细胞。将转化的愈伤组织转移到培养基217(N6盐、1mg/L硫胺素-HCl、0.5mg/L烟酸、3.52mg/L苯甲酸嘌呤、0.91mg/LL-天冬酰胺一水化物、100mg/L肌醇、0.5g/LMES、1.6g/LMgCl2-6H2O、100mg/L干酪素水解物、0.69g/LL-脯氨酸、20g/L蔗糖、2g/LGELGROTM，pH5.8)中在黑暗中于27℃下培养5-7天。体细胞胚成熟和苗再生开始于培养基217上。将组织转移到培养基127T(MS盐、0.65mg/L烟酸、0.125mg/L吡哆醇-HCl、0.125mg/L硫胺素-HCl、0.125mg/L泛酸钙、150mg/LL-天冬酰胺、100mg/L肌醇、10g/L葡萄糖、20g/LL-麦芽糖、100mg/L巴龙霉素、5.5gPHYTAGARTM，pH5.8)中用于苗发育。培养基127T上的组织在400-600lux光照下于26℃下培养。在转移到127T培养基后约4-6周，当苗约3英寸高并有根时，将苗转移到土壤中，优选在3英寸盆中。在生长室中植物于26℃下培养2周，接着在移栽到用于温室生长的5加仑盆前，在温室中的雾台(mistbench)上培养2周。植物在温室中生长至成熟期并用近交的玉米种质A(CORNOFGERMPLASMA)进行反交授粉。从植物中收集种子并用于进一步的繁殖活动。
实施例26.从植物中分离核酸
在幼苗移栽到土壤中后0-2周，从R0植物的叶组织中分离核酸，收集并在96孔收集盒中速冻，从每一植株上收集了大约100毫克的组织并在分析前贮藏在-80℃下。
使用改良的QiagenRneasy96TM试剂盒(QiagenInc.，Valencia，CA)从单个组织样品中分离DNA和RNA。在700μLRneasyTMRTL缓冲液(QiagenInc.，Valencia，CA)中使用Bead搅拌器(BiospecProducts，Bartlesville，OK)均质100毫克的冷冻组织。样品在3200rpm下离心15分钟，并将全部上清液转移到PromegaWIZARDTM透明平板(PromegaCorporation，Madison，WI)的孔中。通过真空过滤透明平板澄清样品溶液。澄清的上清液用于核酸提取。
对于DNA提取，将70μL澄清的样品转移到v-孔PCR平板上，用粘合箔覆盖，并加热至95℃，持续8分钟。在0℃下温育样品5分钟，接着离心3分钟以除去不溶物。SephadexG-50凝胶过滤盒(EdgeBiosystems，Gaithersburg，MO)在2000rpm下离心2分钟作为准备。将50μL热处理的上清液加载到每个孔中，并将盒在2500rpm下离心2分钟。将额外的20μLTE缓冲液添加到柱流出液中，并在分析前将样品平板贮藏在-20℃下。
对于RNA提取，将500微升的澄清溶液转移到清洁的96孔样品盒中。在每个孔中添加250微升的100％乙醇，并与样品充分混合。然后将全部约750微升的溶液加载到PromegaWIZARDTM过滤单元中QiagenRneasyTM结合平板的孔中。将500毫升的RW1缓冲液(QiagenInc.，Valencia，CA)添加到每个孔中，并通过真空过滤除去缓冲液。将80微升不舍RNA酶的DNA酶(QiagenInc.，Valencia，CA)添加到每个孔中，在室温下温育15分钟，通过真空过滤将DNA酶溶液从孔中抽出。将额外的500微升RW1缓冲液(QiagenInc.，Valencia，CA)添加到孔中，并通过真空过滤除去该缓冲液。使用500微升的RPE缓冲液2X(Qiagen，Valencia，CA)通过真空过滤对样品进行进一步的洗涤。将提取平板置于微量滴定板上并在3000rpm下离心3分钟以除去所有残留于过滤器中的RPE缓冲液溶液。添加80微升的RNA级水(不舍DNA酶)到每个孔中，然后在室温下温育2分钟。将提取平板和微量滴定板在3000rpm下离心3分钟，并将RNA制备物于-80℃下冷冻贮藏在收集平板中。
实施例27.拷贝数测定
使用
Figure S04835385X20060608D000791
法测定R0植物中转基因拷贝数。用来自马铃薯pinII基因3’区的序列构建的pMON65154和pRG76GATEWAYTM目的载体，可用于转基因插入物拷贝数的测定。pinII正向和反向引物如下：
正向引物5’ccccaccctgcaatgtga3’(SEQIDNO：77)
反向引物5’tgtgcatccttttatttcatacattaattaa3’(SEQIDNO：78)pinII
Figure S04835385X20060608D000792
探针序列是5’cctagacttgtccatcttctggattggcca3’(SEQIDNO：79)。
该探针在5’末端标记有荧光染料FAM(6-羧基荧光素)，淬灭剂染料TAMRA(6-羧基-N，N，N′，N′-四甲基若丹明)通过接头连接在谊探针的3’末端。
Figure S04835385X20060608D000793
探针获得自AppliedBiosystems(FosterCity，CA)。在
Figure S04835385X20060608D000794
拷贝数测定中，_SAT，一种单拷贝玉米基因用作为内标。SAT引物如下：
正向引物5’gcctgccgcagaccaa3’(SEQIDNO：80)
反向引物5’atgcagagctcagcttcatc3’(SEQIDNO：81)
SAT
Figure S04835385X20060608D000795
探针序列是5’tccagtacgtgcagtccctcctcc3’(SEQIDNO：82)
该探针在其5’末端标记有荧光染料VICTM(AppliedBiosystems，FosterCity，CA)，在其3’末端具有淬灭剂染料TAMRA。
依照厂商说明书(AppliedBiosystems，FosterCity，CA)，进行
Figure S04835385X20060608D000801
PCR。在每次测定中使用5-100ngDNA。PCR扩增和
Figure S04835385X20060608D000802
探针检测在1X
Figure S04835385X20060608D000803
UniversalPCRMasterMix(AppliedBiosystems，FosterCity，CA)中进行，其含有AmpliTaq
Figure S04835385X20060608D000804
DNA聚合酶、UNG、含有dUTP的dNTPs、PassiveReference1和优化的缓冲液。800nM的每种正向和反向pinII引物以及150nM的pinII
Figure S04835385X20060608D000806
探针用于
Figure S04835385X20060608D000807
测定。200nM的每种Sat正向和反向引物以及150nM的Sat探针用于
Figure S04835385X20060608D000809
拷贝数测定。
Figure S04835385X20060608D0008010
PCR在50℃下进行2分钟，在95℃下进行10分钟，接着进行在95℃下15秒和在60℃下1分钟的40个循环。使用ABIPrism7700序列检测系统或ABI7900HT序列检测系统(AppliedBiosystems，FosterCity，CA)测定实时
Figure S04835385X20060608D0008011
探针荧光。依照EZRT-PCR试剂盒使用说明书(AppliedBiosystems，FosterCity，CA)计算Cγ值。ΔΔCγ值计算为：Cγ(内标基因(Sat))-Cγ(转基因)-Cγ(非转基因植物中内标基因(Sat))。依照表12中标准拷贝数赋值如下。
表19.用于
Figure S04835385X20060608D0008013
测定拷贝数的标准
拷贝数 标准
1 -0.5＜ΔΔC γ＜0.50
2 0.5＜ΔΔC γ＜1.50
＞2 ΔΔC γ＞1.50
含有本发明基因的植物可以通过
Figure S04835385X20060608D0008014
法分析拷贝数。通过将
Figure S04835385X20060608D0008015
和DNA印迹杂交，用DNA印迹分析证实在被分析的约80％的植物中拷贝数测定结果。
实施例28.基因表达测定
通过
Figure S04835385X20060608D0008017
RT-PCR测定本发明转基因的表达，其使用了来自AppliedBiosystems(FosterCity，CA)的
Figure S04835385X20060608D0008018
EZRT-PCR试剂盒。测定相对于转基因标准表达的RNA表述，该转基因标准是称为DBT418的转基因玉米事件，包含可操纵地连接pinII3’非翻译区的苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)cryIAI基因。该DBT418事件以可赋予对诸如玉米螟(EuropeanCornBorer)的鳞翅类昆虫商用水平抗性的水平表达cryIAI基因，并为DEICALBGeneticsCorporation以
Figure S04835385X20060608D000811
商标名作为商品出售。用来自马铃薯pinII基因3’区的序列构建pMON65154和pRG76GATEWAyTM目的载体，可用于任何插入目的载体的编码序列转基因转录物水平的测定。之前描述的pinII引物和探针用于RT-PCR。泛素融合蛋白(UBI)RNA用作为所有
Figure S04835385X20060608D000813
RT-PCR测定中的内标。
使用的UBI引物如下：
正向引物5’cgtctacaatcagaaggcgtaatc3’(SEQIDNO：83)
反向引物5’ccaacaggtgaatgettgatagg3’(SEQIDNO：84)
UBI探针序列是
5’catgcgccgctttgcttc3’(SEQIDNO：85)
该UBI探针在其5’末端标记有荧光染料VICTM(AppliedBiosystems，FosterCity，CA)，在其3’末端具有淬灭剂染料TAMRA。
依照描述于
Figure S04835385X20060608D000816
EZRT-PCR试剂盒(AppliedBiosystems，FosterCity，CA)中的一步法，进行逆转录、PCR扩增和
Figure S04835385X20060608D000817
探查。在每次测定中使用5-100ng的总RNA。来自DBT418事件体外转录的对照RNA被包括作为每个平板上的对照，运转浓度范围为0.0lpg-10pg。来自DBT418叶和来自非转基因近交玉米种质A(CORNOFGERMPLASMA)的总RNA分别作为正对照和负对照。在含有3mM乙酸锰，300μM每种dATP，dCTP，dGTP和dUTP，100单位rTthTM(AppliedBiosystems，FosterCity，CA)DNA聚合酶和25单位AmpEraseUNG(AppliedBiosytems，FosterCity，CA)的
Figure S04835385X20060608D000818
EZ缓冲液(50mMN-二羟乙基甘氨酸、115mM乙酸钾、0.01mMEDTA、60mMPassiveReference1、8％甘油，pH8.2，AppliedBiosystems，FosterCity，CA)中进行RT-PCR。RT-PCR进行如下：在50℃下2分钟，在60℃下30分钟，在95℃下5分钟，接着进行在95℃下20秒和在60℃下1分钟的40个循环，400nM的每种正向和反向引物用来扩增pinII序列，200nM
Figure S04835385X20060608D000819
pinII探针用来检测。使用400nM每种正向和反向引物扩增UBIRNA，200nMUBI
Figure S04835385X20060608D000821
用来检测。使用ABIPrism7700序列检测系统或ABI7900HT序列检测系统(AppliedBiosystems，FosterCity，CA)测定
Figure S04835385X20060608D000822
荧光。相对于DBT418中转基因表达，对本发明转基因表达定量，并记录转基因表达对DBT418表达的比值，即2-(ΔΔC) γ(转基因)/2-(ΔΔC) γ(DBT418)。
实施例29.植物育种
回交可用来改良源植物(startingplant)。回交将来自源植物的特定期望性状转移到缺少该性状的近交种和其他植物中。其可进行如下，例如，通过将优良的近交种(A)(回交亲本)与供体近交种(非回交亲本)进行第一次杂交，该供体近交种携带有对于所讨论性状合适的基因，例如，依照本发明所制备的构建体。在所产生的后代中选择期望性状从非回交亲本转移的第一次杂交的后代，然后将所选择的后代与所述优良的回交亲本(A)回交。在5次或更多次回交后产生了对期望性状的选择，对于控制要被转移性状的基因座而言，该后代是半合子，但对于大多数或几乎所有的其他基因来说，与类似于所述优良的亲本。最后一次回交应当自花授粉以产生对于被转移基因，即一个或更多个转化事件，而言是纯系繁育的后代。
因此，通过一系列育种操作，所选择的转基因可从一种品系转移到全部不同的品系中，无需进行进一步的重组操作。由于它们具有与任何其他基因相同的典型遗传学行为且可以一种与其他玉米基因相同的方法通过育种技术进行操作，因此转基因是有价值。因此，可以产生对于一种或更多种转基因而言是纯合的近交植物。通过杂交不同的近交植物，可以产生大量具有不同转基因组合的不同杂种。这样，可以产生具有与杂种密切相关的期望农学性状(“杂种优势”)以及通过一种或多种转基因赋予期望性状的植物。
期望将本发明的基因渗入到玉米杂种中用于鉴定转化植物中每种基因所赋予的表型。导入转基因的宿主基因型，优选玉米种质A(CORNOFGERMPLASMA)，是一种优良的近交种，所以仅需有限次数的育种就可产生高产量的玉米杂种。将再生自愈伤组织的转化植物与诸如玉米种质A(CORNOFGERMPLASMA)的相同基因型的植物进行杂交。后代自花授粉两次并鉴定对于转基因纯合的植物。为了产生杂种，将纯合的转基因植物与测交亲本杂交。该测交亲本是一种属于与转基因亲本不同的杂种优势群的近交种，已知其能产生高产量的杂种，例如产生自玉米种质A(CORNOFGERMPLASMA)和玉米种质E(CORNOFGERMPLASME)或玉米种质B(CORNOFGERMPLASMB)杂交的杂种。
实施例30.评估表现型的方法
本发明基因的表达在转化细胞和植物中产生了各种表型，如在此中所披露的。在愈伤组织转化和植物再生过程以及在植物和后代中，收集表型数据。收集在转化的愈伤组织中与外现形态以及愈伤组织生长相关的表型数据，例如，苗、根、淀粉、类粘蛋白、无胚胎发生、增加的生长率、减少的生长率、死亡。应当预计本领域技术人员可以意识到转化愈伤组织中的其他表型性状。
在植物再生和再生植物转移到土壤的过程中也收集表型数据。表型数据包括诸如正常植物、丛生植物、狭叶、具条纹叶、有结表型、缺绿症、白化体、花色素苷产生、buggywhipped(一种本领域公知的现象，其中大多数新生叶伸长且互相卷绕)或改变的雄花穗、穗或根的性状。预计本领域技术员能识别转化植物中其他的表型性状。
多种表型在植物育种和近交种及杂种植物测定过程中被监测。例如，在R0和R1植物(直接再生自愈伤组织的植物及其直系后代)中，记录株型(常规形态性状，例如上述对于幼苗所描述的那些)和产生自上述植物的谷粒的营养组成。营养组成分析可以包括氨基酸组成，蛋白、淀粉和油类的量，蛋白、淀粉和油类的特性，纤维、灰分、矿物质含量可都被测定。预计本领域技术人员可以进行包括谷粒其他组分在内的分析。在R2和R3植物中，观察花粉释放日、抽穗日和株型。此外，作R2植物代谢物分布图。使用本领域技术人员可获得的方法，可分析植物中50-100种或更多种的代谢物，由此建立了该植物的代谢物指纹图谱。另外，在田间条件下测定R3植物中叶伸长速度。在包含本发明转基因的杂种中可以测定多种表型。例如，可以记录产量、水分、容重、营养组成、叶绿素含量、叶温、林分、幼苗活力、株高、叶数目、分蘖、支柱根、持绿性(staygreen)、茎部倒伏、根部倒伏、植物健康、不结实/增殖力、greensnap、有害物抗性(包括疾病、病毒和昆虫)以及代谢物分布图。此外，可记录杂种收获的谷物的表型性状，包括穗上每行种子的数量、穗上种子的行数、种子败育、种子重量、种子大小、种子密度和谷物物理属性。此外，在杂种或近交种中可以测定诸如光合作用、叶面积、外壳结构、种子干燥率和节间长的特性。预计可以对表达本发明基因的转基因植物作出转录分布图。
为测定表达本发明基因的转基因植物的杂种产量，应当意识到杂种必须在玉米常规种植的地理位置中的多个位置处进行测试，如，爱荷华州、伊利诺斯州或在美国中西部的其他位置。为了鉴定转基因对于玉米杂种改良的贡献，预计多于一年的产量测试是需要的。因此，可以在第一年在足够数量的位置处评估转基因杂种，以鉴定与非转基因杂种对应物至少约10％的产量差异。第二年在足够的位置处进行产量测试，为了能在两种杂种之间鉴定出4-5％的产量差异，需要足够多的重复。此外，在第二年的产量测试中，可以在正常的田间条件和胁迫条件下评估杂种，如，在水分或种群密度胁迫条件下。本领域技术人员知道如何去设计产量试验使得在两种杂种之间可以检测到期望精度级别的统计学显著的产量差异。
实施例31.玉米种子的表面灭菌和吸涨
对于每批转基因而言，通过将约50粒种子放在装有50ml含0.01％TritonX-100的30％漂白剂(次氯酸钠溶液＝Chlorox或等价物)溶液的灭菌的500mlErlenmyer烧瓶中并在定轨摇床上旋转该烧瓶5分钟对它们进行表面灭菌。然后，倒掉漂白剂溶液并用约100ml的灭菌去离子水洗涤，再倒掉洗涤用水。重复多于4次的灭菌水洗涤，在种子上留下最后一次洗涤用水。在该水中于室温下温育种子24小时，用于在起泡条件下的吸涨(通过0.2μm滤纸)。
I.制备Phytotrays中的培养基
制备用于一些Phytotrays的水-琼脂培养基。我们使用PhytotrayIT(或塑料盒：60×30×15cm)，翻转位置让该容器中间大的一面在底部，并将较小的一面作为盖子。通过在45分钟的液体循环周期中，在去离子水中高压灭菌0.3％BactoAgar，制备足够的水-琼脂培养基，每个Phytotray100ml。冷却培养基至其易于操作为止，当其还熔化时，向每个Phytotray中倒入约100ml。
II.玉米冷幼苗活力测定
●当培养基凝固时，将其和灭菌的种子放到层流罩超净台中。
●使用灭菌镊子，挑选20粒健康的，极其一致的种子并将种子放在一个Phytotray中用于该测定，均匀间隔种子使得任一个体稍后能容易地拔除。
●放置种子使得胚一侧斜向下插入，且种子正好在琼脂表面下。在该位置，出现的苗和根能直接伸长而不受限。
●于22℃下在培养基中温育种子一周，或直到大部分的种子生根并开始从琼脂显露出来为止。
●除保留10株生长极其一致的幼苗外，在层流罩超净台中拔除所有的幼苗。
●将Phytotrays转移到低温植物生长室中，设定在10℃和16小时昼周期并在此温育2周。
●将Phytotrays移回到22℃下保持一周。
●拔除幼苗，测量每株幼苗的根长和苗长，并测量每3株幼苗的鲜重g，记录在笔记本上。
适应冷发芽和出苗测定。
与上述相同，但具有如下例外：
●在I中最后一次水洗涤后，在过夜吸涨步骤中将烧瓶置于10℃。在10℃下也预冷含有凝固培养基的Phytotrays。
●在冷却的Phytotrays中播种冷吸涨的种子后，将它们直接置于10℃冷室中。
●约5天后，除保留10株胚根具有大约相同长度的生长极其一致的种子外，拔除其他所有的种子。将Phytotrays送回10℃冷室中保持1-2周。拔除幼苗，测量每株幼苗的根长和苗长，并测量每3株幼苗的鲜重，记录在笔记本上。
●将第二组的Phytotrays转移到22℃下保持1周。
拔除幼苗，测量每株幼苗的根长和苗长，记录在笔记本上。
实施例31.构建用于大豆转化的质粒
实施例(用于CspA和B构建体-pMON73983和73984)
pMON73983(图18)是一种双元载体，用于农杆菌介导的转化和在大豆中类似于枯草杆菌CspA的蛋白(SEQIDNO：1)的组成型表达。为克隆该枯草杆菌CspA基因，基于来自隶属于国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth(NCBI))之国家医学图书馆(NationalLibraryofMedicine)的国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)的CspA序列信息(Genbank#M30139)，设计两条基因特异性引物MSA452和MSA453。MSA452的序列是GCGCAGGCCTAGATGTACCATGTCCGGTAAAATGACTGGTATCGTAAAATGG(SEQIDNO：86)，其在CspA翻译起始位点处退火并在5’末端导入StuI和BgIII位点，MSA453序列是CGCGAATTCGGATCCTTATTACAGGCTGGTTACGTTACCAGCTGCC(SEQIDNO：87)，其在CspA最后密码子处退火并在该引物末端导入BamHI和EcoRI位点。反向引物MSA453被设计用来匹配Genbank基因序列的3’末端。
使用引物MSA452和MSA453、高保真Taq聚合酶(BRL)和pMON57397(图3)作为模板进行PCR反应。该模板与GenBank序列CspA基因的3’末端不同。扩增的CspBDNA通过凝胶电泳纯化并连接到pCR-XL-TOPO载体(Invitrogen)上。按照厂商的实验方案，将连接反应物转化到大肠杆菌Top10细胞(Invitrogen)中。挑选出四个转化体菌落并使用QiagenMiniprep试剂盒小量制备DNA。使用M13-特异性正向和反向引物对插入物进行测序。将含有正确序列的克隆命名为pMON73981并用于进一步的亚克隆。
用StuI和BamHI消化PMON73881DNA以分离CspA基因片段。继续用StuI和BamHI消化pMON73980DNA，然后通过GeneCleanII试剂盒纯化。连接该CspB片段和纯化的载体pMON73980并将连接反应物电转化入大肠杆菌DH10B细胞中。在含壮观霉素的培养基上挑选转化体。由转化体小量制备DNA，使用CaMV35S-启动子特异性正向引物检测DNA中插入物的存在。含有该插入物的克隆命名为pMON73983。大量制备DNA并进行一系列的经证实的消化，包括BgIII、EcoRI、PstI、EcoRI+BamHI、StuI+XhoI。这些证实了正确的克隆。
pMON73984是一种双元载体，用于农杆菌介导的转化和在拟南芥中类似于枯草杆菌CspB的蛋白(SEQIDNO：2)的组成型表达。为克隆该枯草杆菌CspB基因，基于来自隶属于国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth(NCBI))之国家医学图书馆(NationalLibraryofMedicine)的国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)的CspB序列信息(Genbank#X59715)，设计两条基因特异性引物MSA454和MSA455。MSA454的序列是GCGCAGGCCTAGATGTACCATGTTAGAAGGTAAAGTAAAATGGTTCAACTCTG(SEQIDNO：88)，其在CspB翻译起始位点处退火并在5’末端导入StuI和BgIII位点，MSA455序列是CGCGAATTCGGATCCTTATTACGCTTCTTTAGTAACGTTAGCAGCTTGTGG(SEQIDNO：89)，其在CspB最后密码子处退火并在该引物末端导入BamHI和EcoRI位点。反向引物MSA455被设计用来匹配Genbank基因序列的3’末端。使用引物MSA454和MSA455、高保真Taq聚合酶(BRL)和pMON57399作为模板进行PCR反应。该模板与GenBank序列CspB基因的3’末端不同。扩增的CspBDNA通过凝胶电泳纯化并连接到pCR-XL-TOPO载体(Invitrogen)上。按照厂商的实验方案，将连接反应物转化到大肠杆菌Top10细胞(Invitrogen)中。挑选出四个转化体菌落并使用QiagenMiniprep试剂盒小量制备DNA。使用M13-特异性正向和反向引物对插入物进行测序。将含有正确序列的克隆命名为pMON73982并用于进一步的亚克隆。
用StuI和BamHI消化PMON73882DNA以分离CspB基因片段。继续用StuI和BamHI消化pMON73980DNA，然后通过GeneCleanII试剂盒纯化。连接该CspB片段和纯化的载体pMON73980并将连接反应物电转化入大肠杆菌DH10B细胞中。在含壮观霉素的培养基上挑选转化体。由转化体小量制备DNA，并使用CaMV35S-启动子-特异性正向引物检测DNA中插入物的存在。含有该插入物的克隆命名为pMON73984。大量制备DNA并进行一系列的经证实的消化，包括BgIII，EcoRI，PstI，EcoRI+BamHI，StuI+XhoI。这些证实了正确的克隆。大豆植物通过用上述稳定地整合入其基因组中的pMON构建体通过转化产生。
实施例32.
用来自上述被研究的实施例10和11的DNA构建体转化玉米植物
温室
●对耐旱性进行两次试验，一次测试10个cspA事件，另一次测试10个cspB事件。
●对来自每一事件的24株转基因阳性和24株转基因阴性杂种幼苗进行测试(所有的种子来自分离的杂种穗)。
●该测试在温室工作台上进行。
●该处理包括限制给水和监测每一容有植物盆的总盆重量。每个充满水的盆重约1000g，限制给水直至每个盆重量到达400g位置，接着在其余的实验过程中让盆维持在该重量。
●在整个试验过程中，通过测量从盆土壤表面到“最高”叶片的顶端的距离确定株高。从这些测量中，通过比较两次测量之间的高度来确定LER(叶伸长速度)。
●在一个事件中，在干旱过程中进行转基因阴性和转基因阳性植物之间LER的比较。
●对于所测试的3/10的事件，在试验过程中对于LER，cspA转基因植物得到明显(p＜0.10)改善。
●对于所测试的3/10的事件，在试验过程中对于LER，cspB转基因植物得到明显(p＜0.10)改善。
田间效率
●对于在生长的营养阶段后期耐旱性使用杂种种子进行3次试验，一次测试16个cspB事件(CA)，另一次测试21个cspB事件(KS)，还一次测试14个cspA事件(HI)。
●对于CA和HI试验，苗行(rows)含有约34株植物，分离所存在的转基因，分别出现6和4次重复。分离的苗行来自于分离的穗。
●对于KS试验，苗行含有约34株植物；作为转基因和非转基因配对的作物行，具有6次重复。
●该处理包括在生长的营养阶段后期限制给水约10天(给予少量维持植物生存所必需的水)。10天后，对植物进行良好灌溉直至收获。
●在整个试验过程中，测定许多种表型，包括LER、叶绿素(用SPAD仪)和光合作用率。在试验后，测定的额外表型包括：花粉释放日和抽穗日、以及诸如种子/穗、具有种子的穗、种子重量和产量的穗特征。
●在一个事件中以及在所有的构建体中，进行转基因阳性和阴性植物之间的表型比较。
●在CA试验中，在干旱处理过程中或之后，cspB作为构建体(在营养性状的所有事件和重复性状的“最佳”6个事件中)转基因阳性植物显著地(p＜0.10)改善了LER、叶温和种子/穗。
●在CA试验中，在干旱处理过程中或之后，个别事件显著地(p＜0.10)改善了LER、平均穗长、种子质量/穗、气孔导度和抽穗日。
●在KS试验中，cspB作为构建体(在营养性状的所有事件和重复性状的“最佳”6个事件中)转基因阳性植物显著地(p＜0.10)改善了LER、穗上承载的种子/行、种子/穗、种子/植物、英重和产量。
●在KS试验中，个别事件显著地(p＜0.10)改善了LER、光合作用率、气孔导度、穗/行和种子/植物。
●在HI试验中，3个事件显著地(p＜0.10)改善了LER(在HI中叶绿素含量是唯一测定的其他表型).
CA和KS结果概述：
cspB-KS生境(site)田间效率结果概述
1.田间设计、位置均匀性和种植及取样的执行都符合能产生信息数据集合的高质量的试验。
2.限水处理以一种对所有测定表型，特别是LER、叶绿素和光合作用率，产生处理影响的方式执行。
3.影响营养和再生的表型的处理在统计学满足是实数的且满足观察到统计显著水平的转基因介导的改良之用。
4.在包含转基因的植物中，一个或多个事件在统计学上改善了LER、叶绿素、光合作用率、气孔导度、叶温、花粉释放日、抽穗日、开花期抽丝间隔、穗/盆、种子/穗、种子/植物、英重和估计产量。
5.在干处理中，对于LER、穗/盆、种子/植物、英重和估计产量，在湿处理中，对于LER观察到构建体水平统计学改善p＜0.10。
表20.
事件处理改善的表型P值
构建体干LER(T1-T0)0.009
干LER(T2-T0)0.009
干LER(T2-T1)0.096
干气孔导度0.150
干光合作用0.141
干穗/盆0.012
干种子/穗0.062
干种子/植物0.006
干英重0.009
干估计产量0.008
湿LER(T2-T1)0.025
湿叶绿素(-)0.062
湿穗/盆(-)0.185
湿种子/穗(-)0.121
湿种子/植物(-)0.083
湿英重(-)0.132
湿估计产量(-)0.101
ZM_M38835干LER(T1-T0)0.008
干光合作用0.066
干气孔导度0.064
干蒸腾作用0.126
干种子/植物0.160
干英重0.149
干产量0.153
湿LER(T1-T0)0.099
湿LER(T2-T1)(-)0.026
ZM_M38737干光合作用0.108
cspB-CS生境田间效率结果概述(字形变化)
1.田间设计、位置均匀性和种植及取样的执行都符合能产生信息数据集合的高质量的试验。
2.限水处理以一种对所有测定的营养表型，特别是LER、叶绿素和光合作用率，产生处理影响，但不对所有的再生表型产生处理影响的方式执行。
3.影响目的表型(营养)的处理在统计学上满足是实数的且满足观察到统计显著水平的转基因介导的改良之用。
4.在包含转基因的植物中，一个或多个事件在统计学上改善了LER、叶绿素、光合作用率、气孔导度、叶温、花粉释放日、抽穗日、开花期抽丝间隔、穗/盆、种子/穗、平均穗长和种子质量/穗。
5.在干处理中，对于LER、叶温和花粉释放日，在湿处理中，对于ASI观察到构建体水平统计学改善。
表21.
事件处理改善的表型P值
构建体干LER0.009
干叶温0.027
干花粉释放日0.192
干种子/穗0.080
干种子质量/穗0.197
干测试Wt(lb/bu)Neg0.084
湿LER0.157
湿花粉释放日0.098
湿平均穗长0.091
湿种子质量/穗0.010
湿测试Wt(lb/bu)Neg0.188
ZM_M39583干LER0.051
干种子/穗0.200
湿平均穗长0.058
湿种子质量/穗0.070
ZM_M39872干LER0.159
湿抽穗日0.024
湿ASI0.064
ZM_M40946干LER0.201
ZM_M38238干抽穗日0.176
干种子/穗0.192
湿LER0.151
湿种子质量/穗0.034
ZM_M38244干气孔导度0.092
干光合作用0.132
干叶温0.155
ZM_M38230干抽穗日0.176
ZM_M38721干抽穗日0.066
干ASI0.109
湿抽穗日0.117
ZM_M38714湿抽穗日0.010
湿ASI0.025
ZM_M40939干ASI0.109
这些事件中的许多业已随后被测试用于改善冷发芽效率和幼苗在冷环境下生长，但不被证实是有效的。因此，这些由启动子驱动的基因不太可能在玉米中起改善冷发芽或幼苗在冷环境下生长的作用，但不同的启动子(propomters)驱动相同的基因，或不同的冷休克蛋白可以在玉米中起改善这些表型的作用。
Figure IYZ000001463673100011
Figure IYZ000001463673100021
Figure IYZ000001463673100031
Figure IYZ000001463673100051
Figure IYZ000001463673100061
Figure IYZ000001463673100071
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Figure IYZ000001463673100091
Figure IYZ000001463673100111
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Figure IYZ000001463673100201
Figure IYZ000001463673100211
Figure IYZ000001463673100231
Figure IYZ000001463673100241
Figure IYZ000001463673100251
Figure IYZ000001463673100261
Figure IYZ000001463673100271
Figure IYZ000001463673100281
Figure IYZ000001463673100291
Figure IYZ000001463673100301
Figure IYZ000001463673100311
Figure IYZ000001463673100321
Figure IYZ000001463673100331
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Figure IYZ000001463673100361
Figure IYZ000001463673100371
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Figure IYZ000001463673100411
Figure IYZ000001463673100431
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Figure IYZ000001463673100711
Figure IYZ000001463673100721

Claims (10)

1.一种生产耐旱植物的方法，其包含步骤：
a)将编码SEQIDNO：1或SEQIDNO：2所示的冷休克蛋白(Csp)的重组DNA插入到植物细胞的基因组中，其中所述冷休克蛋白(Csp)的表达赋予所述植物对旱胁迫的抗性；
b)获得转化的植物细胞；
c)从所述转化的植物细胞再生植物；和
d)选择显示耐旱性的植物。
2.一种用于制备包含编码冷休克蛋白(Csp)的重组DNA的转基因种子的方法，所述种子可用来生产具有增强的耐旱性的转基因植物作物，所述方法包括：
(a)选择包含编码SEQIDNO：1或SEQIDNO：2所示的冷休克蛋白(Csp)的重组DNA的第一种耐旱植物品系，其中所述冷休克蛋白(Csp)的表达赋予所述第一种植物系的植物对旱胁迫的抗性；并且
(b)将所述重组DNA基因渗入完全不同的植物品系。
3.一种在生长水分受限的条件下生产农作物的方法，所述方法包括培育其基因组具有编码SEQIDNO：1或SEQIDNO：2所示的冷休克蛋白(Csp)的重组DNA插入的转基因植物，其中所述冷休克蛋白(Csp)的表达赋予所述植物对旱胁迫的抗性。
4.根据权利要求2的方法，其中所述植物是玉米植物、大豆植物、棉花植物、小麦植物、大麦植物、低芥酸菜子植物或稻植物。
5.根据权利要求3的方法，其中所述植物是玉米植物、大豆植物、棉花植物、小麦植物、大麦植物、低芥酸菜子植物或稻植物。
6.一种生产耐旱植物的方法，其包含步骤：
a)将编码SEQIDNO：63或SEQIDNO：65所示的冷休克蛋白(Csp)的重组DNA插入到植物细胞的基因组中，其中所述冷休克蛋白(Csp)的表达赋予所述植物对旱胁迫的抗性；
b)获得转化的植物细胞；
c)从所述转化的植物细胞再生植物；和
d)选择显示耐旱性的植物。
7.一种用于制备包含编码冷休克蛋白(Csp)的重组DNA的转基因种子的方法，所述种子可用来生产具有增强的耐旱性的转基因植物作物，所述方法包括：
(a)选择包含编码SEQIDNO：63或SEQIDNO：65所示的冷休克蛋白(Csp)的重组DNA的第一种耐旱植物品系，其中所述冷休克蛋白(Csp)的表达赋予所述第一种植物系的植物对旱胁迫的抗性；并且
(b)将所述重组DNA基因渗入完全不同的植物品系。
8.一种在生长水分受限的条件下生产农作物的方法，所述方法包括培育其基因组具有编码SEQIDNO：63或SEQIDNO：65所示的冷休克蛋白(Csp)的重组DNA插入的转基因植物，其中所述冷休克蛋白(Csp)的表达赋予所述植物对旱胁迫的抗性。
9.根据权利要求7的方法，其中所述植物是玉米植物、大豆植物、棉花植物、小麦植物、大麦植物、低芥酸菜子植物或稻植物。
10.根据权利要求8的方法，其中所述植物是玉米植物、大豆植物、棉花植物、小麦植物、大麦植物、低芥酸菜子植物或稻植物。
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