CN1875956A - 对表皮葡萄球菌信号转导系统YycG蛋白的抑制剂 - Google Patents

Abstract

本发明揭示四个小分子化合物对表皮葡萄球菌信号转导系统中YyCG蛋白具有抑制作用，抑制葡萄球菌生物膜的形成，抑制革兰氏阳性球菌，在制备和治疗由革兰氏阳性球菌引起疾病的药物中应用，可配制成消毒液作为医疗器械消毒包括室内消毒及移植手术中免疫佐剂。

Description

对表皮葡萄球菌信号转导系统YycG蛋白的抑制剂

技术领域

本发明涉及作用于表皮葡萄球菌信号转导系统关键新蛋白YycG的小分子抑制物；YycG小分子抑制物的分子结构；该类小分子抑制物作为药物化合物预防或治疗相关细菌感染性疾病的方法，其特征在于使用该类小分子抑制物作为活性成分的母核结构，筛选预防和/或治疗药物。

背景技术

对全基因组测序的表皮葡萄球菌ATCC12228株进行分析发现其具有16对双组分信号转导系统。双组分调控系统主要存在于各种原核生物细胞，调控生物生长、毒力等多种生物学功能，而真核细胞中未能发现有同源蛋白。细菌的双组分调控系统包括组氨酸蛋白激酶和反应调节蛋白，组氨酸蛋白激酶在受到外界刺激后激活，将信号转递给下游蛋白以调控细菌的相关生物学活性。我们对表皮葡萄球菌双组分信号转导系统中的YycG蛋白(YycG组氨酸蛋白激酶)进行了蛋白质结构三维模拟，并根据此模型，利用对接软件进行虚拟，获得能够抑制表皮葡萄球菌等革兰阳性细菌生长和抑制生物膜形成的小分子抑制物。

S.epidernidis已成为移植手术中发生医源性感染的最主要因素。除此之外，由于抗生素的滥用，出现了更严重的多抗性和抗万古霉素的S.epidernidis。而S.epidernidis产生抗药性的主要原因是附着在医疗器械表面的细菌分泌保护性的生物膜，该生物膜可以阻碍传统的抗生素穿过作用于细菌，发挥杀菌效果。除了医疗器械上的S.epidernidis，感染宿主体内的S.epidernidis分泌的生物膜可以阻碍宿主免疫系统的攻击。因此特异性具有破坏生物膜和杀伤细菌的新型抗生素在发挥杀菌作用上具有更广泛的前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种对细菌YycG组氨酸激酶抑制剂。

本发明的另一目的是提供该种小分子抑制物的医学用途包括破坏生物膜和杀伤细菌的双重功能。

本发明是这样实施的。

本发明提供针对细菌YycG组氨酸激酶抑制剂AG51具有如下结构：

本发明通过蛋白结构分子模建和虚拟高通量筛选技术来筛选表皮葡萄球菌组氨酸蛋白激酶YycG蛋白潜在的小分子抑制物(化合物)，经体外生物学实验证实其中1个小分子化合物能有效抑制几种临床常见的革兰阳性球菌生长和抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成，且对哺乳动物细胞无明显毒性。

本发明实验方法是采用96孔板生物膜形成体外模型，将表皮葡萄球菌生物膜形成阳性株ATCC35984于不同的小分子化合物混合(终浓度200μM)，接种于96孔板上，同时以表皮葡萄球菌生物膜形成阴性株ATCC12228为阴性对照，37℃培养20小时后，细菌在孔内形成生物膜的强弱可用结晶紫染色后在OD₅₇₀读数判断。此外，用美国的NCCLS(the NationalCommittee for Clinical Laboratory Standards)推荐的标准试管稀释法检测小分子化合物的最小抑菌浓度(MIC)，用MTT法检测小分子化合物对哺乳动物细胞的毒性作用，用96孔板法检测小分子化合物对人红细胞的溶血作用。该小分子化合物对表皮葡萄球菌生物膜形成的影响见表1。该小分子化合物对几种临床常见的革兰阳性球菌的生长抑制作用，即最小抑菌浓度见表2。该小分子化合物对哺乳动物细胞的毒性作用见表3。该小分子化合物与目的蛋白表皮葡萄球菌组氨酸激酶YycG保守功能域片段的结合平衡常数以及抑制组氨酸蛋白激酶YycG的自身磷酸化活性的半数抑制率浓度见表4。该小分子化合物对人红细胞的溶血作用见图1。

表1结果说明该小分子化合物在体外能明显抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成，与不加化合物的对照组相比降低生物膜形成30％以上。

表2结果说明该小分子化合物能明显抑制几种临床常见的革兰阳性球菌生长，通过标准试管稀释法获得的该小分子化合物的最小抑菌浓度列于表2。

表3结果说明该小分子化合物对Vero细胞生长的半数抑制率在200μM以上，在最小抑菌浓度该小分子化合物对Vero细胞的生长抑制率为2％，基本上无毒性。

表4结果说明该小分子化合物与目的蛋白表皮葡萄球菌组氨酸激酶YycG保守功能域片段有很强的结合力(结合平衡常数K_D＜10^-5M＝，且能明显抑制蛋白组氨酸激酶YycG的自身磷酸化活性(半数抑制浓度＜50μM＝。

本发明具有如下优点：

1.发现一个小分子化合物AG51在体外能明显抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成，同时能显著抑制几种临床常见的革兰阳性球菌的生长。

2.该小分子化合物在最小抑菌浓度时对哺乳动物细胞基本无毒性，且对人红细胞无明显的溶血作用。

3.该小分子化合物与目的蛋白表皮葡萄球菌组氨酸激酶YycG保守功能域片段有很强的结合力，且能明显抑制蛋白组氨酸激酶YycG的自身磷酸化活性。

4.该小分子化合物有望通过进一步化学结构的改造，开发为抗革兰阳性球菌感染的新药。

5.该小分子化合物具有破坏生物膜和杀伤细菌的双重功能，因此它可以作为医疗器械消毒液，包括室内的消毒试剂，特别是手术室消毒以及移植手术中免疫佐剂。

附图说明

图1是小分子化合物AG51对人红细胞的溶血作用。1％DMSO+红细胞为阴性对照，1％细胞穿透液Triton-100+细胞为阳性对照。小分子化合物的MIC值为4μg/ml。Tet：四环素，参考文献报道其MIC值取0.3μg/ml；Cip：环丙沙星，参考文献报道其MIC值取0.25μg/ml。

图1结果说明该小分子化合物在最小抑菌浓度(MIC)和4倍MIC浓度时，对人红细胞没有明显的溶血作用。

具体实施方式

下面结合实验例对本发明进一步详细描述但不限制本发明。

实施例

采用96孔板生物膜形成体外模型，将表皮葡萄球菌生物膜形成阳性株ATCC35984与小分子化合物混合(终浓度200μM)，接种于96孔板上，同时以表皮葡萄球菌生物膜形成阴性株ATCC12228为阴性对照，37℃培养20小时后，细菌在孔内形成生物膜的强弱可用结晶紫染色后在OD₅₇₀读数判断。此外，用美国的NCCLS(the National Committee for ClinicalLaboratory Standards)推荐的标准试管稀释法检测小分子化合物的最小抑菌浓度(MIC)，用MTT法检测小分子化合物对哺乳动物细胞的毒性作用，用96孔板法检测小分子化合物对人红细胞的溶血作用。详细实验方法如下：

一.表皮葡萄球菌生物膜形成体外检测实验：

1、将表皮葡萄球菌接种于新鲜的TSB培养基中，37℃培养过夜。

2、将细菌1∶200用新鲜的TSB培养基稀释，和小分子化合物混合(终浓度200μM，溶剂DMSO终浓度为1％)，接种于96孔板，每孔200μl，每个样品采用三复孔上样，37℃静置培养20小时。因小分子化合物溶解于DMSO中，因此设1％DMSO+表皮葡萄球菌生物膜阳性株为阳性对照，设1％DMSO+表皮葡萄球菌生物膜阴性株为阴性对照。

3、弃去菌液，用PBS洗板3次，晾干，每孔加200μl 2％结晶紫室温染色5分钟。

4、弃去多余染液，将板晾干，酶标仪OD₅₇₀读数，每个样品读数取三复孔的均值。

5、计算小分子化合物对表皮葡萄球菌生物膜的抑制率：

二、细菌生长抑制实验(试管稀释法)：

1、将细菌接种于新鲜的MH培养基，37℃培养过夜。

2、将菌液1∶100接种于新鲜的MH培养基，37℃培养至对数生长早期，用新鲜的MH培养基稀释至OD₆₀₀＝，每管1ml，加入不同浓度梯度的小分子化合物(溶剂DMSO终浓度保持1％)，37℃培养18小时。因小分子化合物溶解于DMSO中，因此设1％DMSO+细菌为对照，以无菌培养基为空白对照。

3、取出与空白对照比较，细菌不生长的浓度最低的一管即为该小分子化合物的最小抑菌浓度。

三、MTT法检测细胞毒性：

1、将新鲜培养的Vero细胞接种于96孔板，每孔100ul细胞(约5×10⁴细胞)，37℃，5％CO₂条件下培养24小时，使细胞长成单层。

2、弃去培养基，加入100ul/每孔新鲜的MEM培养基，其中含有不同浓度的小分子化合物(溶剂DMSO终浓度保持1％)，每个样品采用四复孔上样，37℃，5％CO₂条件下继续培养24小时。因小分子化合物溶解于DMSO中，因此设1％DMSO+细胞为对照。

3、每孔加入10ul MTT标记物，37℃，5％CO₂条件下培养4小时。

4、将96孔板取出读取OD₅₇₀值，每个样品读数取四复孔的均值，计算不同浓度的小分子化合物对Vero细胞生长的抑制率：

半数抑制量IC₅₀值采用Logit法计算。

四、小分子化合物与目的蛋白结合及抑制磷酸化实验：

1、将重组表达、纯化的目的蛋白表皮葡萄球菌组氨酸激酶YycG保守功能域片段偶联在能量共振生物传感芯片(Biacore CM5型芯片)上，将待测的小分子化合物按一定的梯度稀释，让其流过芯片与蛋白相互作用，观察小分子化合物与蛋白结合的情况，计算出结合平衡常数K_D。

2、小分子化合物抑制组氨酸激酶YycG自身磷酸化的实验用美国PROMEGA公司的Kinase-Glo^TM Luminescent Kinase Assay Kit(Cat.No.V6711，Promega，Madison，USA)完成。将4μg重组表达、纯化的目的蛋白组氨酸激酶YycG保守功能域片段与梯度稀释的小分子化合物在25℃作用20分钟，然后加入100μM ATP(反应总体积50ul)在25℃作用20分钟后将反应混合物加入96孔酶标板，每孔50ul，加入Kinase-Glo^TM Reagent每孔50ul室温静置10分钟，读取化学发光值表示反应剩余的ATP的量，实验设不加小分子化合物组为对照组。最后计算小分子化合物对目的蛋白磷酸化的抑制率：

半数抑制浓度IC₅₀值采用Logit法计算。

五、红细胞溶血实验：

1、将分离的健康人红细胞用无菌生理盐水洗3遍，并稀释至5％。

2、加入不同浓度的小分子化合物(溶剂DMSO终浓度保持1％)于5％红细胞悬液中，每孔200ul接种于96孔板上，每个样品采用三复孔。因小分子化合物溶解于DMSO中，因此设1％DMSO+细胞为阴性对照，设1％细胞穿透液Triton-100+细胞为阳性对照，并设两种常用抗生素四环素和环丙沙星作对照。

3、37℃培养箱培养1小时，离心后取100ul上清移入另一块干净的96孔板，OD₅₇₀读数，每个样品读数取三复孔的均值。

[结果]：

一.小分子化合物AG51对表皮葡萄球菌生物膜形成的影响见表1

表1结果说明该小分子化合物在体外能明显抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成，与不加化合物的阳性对照相比，能降低生物膜形成30％以上。

二.小分子化合物AG51对几种临床常见的革兰阳性球菌生长的抑制作用见表2

表2结果说明该小分子化合物对几种临床常见的革兰阳性球菌(表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌及化脓性链球菌)生长有明显的抑制作用，其最小抑菌浓度列于表2。

三.小分子化合物AG51对Vero细胞的毒性作用见表3

表3结果说明在细胞水平，该小分子化合物的半数抑制率在200μM以上，在最小抑菌浓度时对Vero细胞的生长抑制率为2％，基本没有毒性。

四.小分子化合物AG51与目的蛋白结合力及抑制蛋白磷酸化的作用见表4

表4结果说明该小分子化合物与目的蛋白表皮葡萄球菌组氨酸激酶YycG保守功能域片段有很强的结合力(结合平衡常数K_D＜10^-5M)，且能明显抑制蛋白组氨酸激酶YycG的自身磷酸化活性(半数抑制浓度＜50μM)。

五.小分子化合物AG51对人红细胞的溶血作用见图1

图1结果说明与阴性对照、阳性对照及两种常用抗生素对照相比，该小分子化合物在最小抑菌浓度(MIC)和4倍MIC浓度时，对人红细胞没有明显溶血作用。

表1小分子化合物AG51对表皮葡萄球菌生物膜形成的影响(X±S)

小分子化合物	OD570值
		AG51	0.062±0.004
阳性对照a	1.702±0.069
		阴性对照b	0.200±0.022

^a阳性对照指1％DMSO+表皮葡萄球菌生物膜形成阳性株

^b阴性对照指1％DMSO+表皮葡萄球菌生物膜形成阴性株

表2小分子化合物AG51对几种临床常见的革兰阳性球菌生长的抑制作用

小分子化合物	最小抑菌浓度Minimal inhibitory concentrations(μg/ml)
				表皮葡萄球菌ATCC 12228	金黄色葡萄球菌ATCC 29213	化脓性链球菌144
	AG51	4	128				16

表3小分子化合物AG51对Vero细胞的毒性作用

小分子化合物	半数抑制率(IC50，μM)	最小抑菌浓度时的抑制率
			AG51	＞200	2％(4μg/ml)a

^a括号中为小分子化合物AG51对表皮葡萄球菌的最小抑菌浓度

表4小分子化合物AG51与目的蛋白表皮葡萄球菌组氨酸激酶YycG保守功能域片段结合力及抑制蛋白磷酸化的作用

小分子化合物	KD值(μM)a	IC50值(μM)b
			AG51	2.8	13.5

^aK_D值为结合平衡常数，代表小分子化合物与目的蛋白表皮葡萄球菌组氨酸激酶YycG保守功能域片段结合力，其值越小表示结合力越强

^bIC₅₀值即半数抑制浓度，代表小分子化合物抑制反应体系中半数组氨酸激酶YycG保守功能域片段自身磷酸化时的浓度。

Claims (5)

1、一种结构式如下的化合物的用途对表皮葡萄球菌信号转导系统中YyCG蛋白具有抑制作用

2、根据权利要求1所述化合物的用途，其特征在于对革兰氏阳性球菌具有抑制作用。

3、根据权利要求1所述的化合物的用途，其特征在于在制备和治疗由革兰氏阳性球菌引起的疾病的药物中应用。

4、根据权利要求1所述的化合物的用途，其特征在于抑制葡萄球菌生物膜的形成。

5、根据权利要求1所述的化合物的用途，其特征在于配制成消毒液作为医疗器械消毒包括室内消毒及移植手术中免疫佐剂。