CN113952339B - 化合物fdefa1在制备革兰氏阳性球菌抑制剂中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属生物技术领域，涉及化合物FDEFA1在制药中新的用途，具体涉及式(1)化合物FDEFA1在制备革兰氏阳性球菌抑制剂中的用途。该化合物FDEFA作为抑制革兰氏阳性球菌YycG组氨酸激酶抑制剂可抑制革兰氏阳性细菌生长和抑制生物膜形成；尤其对粪肠球菌双组分信号转导系统中YycG激酶具有抑制作用，抑制粪肠球菌、屎肠球菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和表皮葡萄球菌浮游菌和生物膜形成，可用于制备革兰氏阳性球菌抑制剂和抗粪肠球菌感染或由革兰氏阳性菌感染所致疾病的治疗药物。
Description
技术领域
本发明属生物技术领域，涉及化合物FDEFA1在制药中新的用途，具体涉及化合物FDEFA1在制备革兰氏阳性球菌抑制剂中的用途。该化合物FDEFA作为小分子抑制物能抑制革兰氏阳性细菌生长和抑制生物膜形成。
背景技术
粪肠球菌、屎肠球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和无乳链球菌等为革兰氏阳性球菌，机会致病菌，为医院感染的主要病原体之一。现有技术公开了正常情况下，上述革兰氏阳性球菌定植于人体肠道、皮肤、口腔和和泌尿道，可引起皮肤软组织感染、尿路感染、感染性心内膜炎和腹腔感染等难治性感染。据报道，近年来，由于抗菌药物的不规范使用以及耐药基因的水平传播，上述革兰氏阳性球菌多重耐药菌株在临床上不断出现，尤其是万古霉素、利奈唑胺耐药菌株的出现，成为临床及治疗实践中的难题。此外，由于该类菌易形成生物膜，其对抗生素的耐药强，目前尚无有效的清除细菌生物膜的药物，因此特异性破坏生物膜和杀伤细菌的新型抗生素在发挥杀菌作用上具有更广泛的前景。
研究报道了双组分信号转导系统主要存在于各种原核生物细胞，调控生物生长、毒力等多种生物学功能，而真核细胞中未能发现有同源蛋白。细菌的双组分信号转导系统包括组氨酸激酶和反应调节蛋白，组氨酸激酶在受到外界刺激后激活，将信号转递给下游蛋白以调控细菌的相关生物学活性。业内研究人员认为，由于某些双组分信号转导系统调控细菌生长、繁殖或细菌生物膜的形成，如果抑制其信号转导系统，可阻断细菌的相关生物学活性；由于YycFG双组分系统仅存在于很多低G+C含量的革兰氏阳性菌中，高度保守，而在哺乳动物(包括人类)不存在，因此将可成为抗菌/抗生物膜药物的潜在靶标。
基于现有技术的现状与基础，本申请的发明人拟提供化合物FDEFA1在制药中新的用途，具体涉及化合物FDEFA1在制备革兰氏阳性球菌抑制剂中的用途。
发明内容
本发明的目的是基于现有技术的现状与基础，提供化合物FDEFA1在制药中新的用途，具体涉及化合物FDEFA1在制备革兰氏阳性球菌抑制剂中的用途。
本发明所述的化合物FDEFA1为式(1)的小分子化合物，结构为：2-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)-1-苯基-5-(甲苯磺酰氧基)-1H-吲哚-3-羧酸乙酯(分子式为C30H33N3O5S，分子量547.67，简称FDEFA1)。
本发明中，所述小分子化合物FDEFA1通过市购(荷兰SPECS公司)获得。
本发明中，经体外生物学实验证实，所述的小分子化合物FDEFA1对革兰氏阳性球菌具有抑制作用；可有效抑制5种临床常见的粪肠球菌、屎肠球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和无乳链球菌等革兰氏阳性球菌浮游菌的生长及生物膜形成，且对哺乳动物细胞无明显毒性。
本发明的实施例中，采用粪肠球菌为例，对该粪肠球菌双组分信号转导系统中的YycG组氨酸激酶进行蛋白质结构三维模拟，进而利用对接软件进行虚拟筛选所获得小分子化合物FDEFA1，结果表明，所述的小分子化合物FDEFA1能抑制革兰氏阳性球菌双组分信号转导系统YycG组氨酸激酶活性，具有抑制浮游菌和细菌生物膜的作用。
本发明中，所述的小分子化合物FDEFA1具有如下优点：
(1)所述的小分子化合物在体外能明显抑制细菌浮游菌生长；
(2)所述的小分子化合物可抑制革兰氏阳性球菌生物膜形成；
(3)所述的小分子化合物对哺乳动物细胞无毒性，且对人红细胞无明显的溶血作用；
(4)所述的小分子化合物可明显抑制组氨酸激酶YycG的自身磷酸化活性。
本发明所述的小分子化合物FDEFA1可进一步进行化学结构改造，制备抗革兰氏阳性菌感染的新药物；以及作为细菌YycG组氨酸激酶抑制剂用于制备治疗革兰氏阳性菌感染引起的疾病的药物。
本发明中，所述的革兰氏阳性球菌为：粪肠球菌、屎肠球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、无乳链球菌。
附图说明
图1为本发明中化合物FDEFA1对粪肠球菌FB-1，屎肠球菌EF16M64，金黄色葡萄球菌SA113，表皮葡萄球菌RP62A和无乳链球菌NSGC64)浮游菌的生长曲线，其中，对照组为不加药物的阳性菌株，1.56～100μM分别代表加入不同浓度的化合物FDEFA1组；实验中，将过夜培养的5株革兰氏阳性菌株接种后，分别加入不同浓度的化合物FDEFA1(1.56～100μM)，使用Bioscreen(德国)全自动生长曲线仪器在37℃条件下动态记录OD600值，数值以均数±标准差表示，(A),(B),(C),(D)和(F)图分别代表了不同浓度化合物FDEFA对粪肠球菌FB-1、屎肠球菌EF16M64、金黄色葡萄球菌SA113、表皮葡萄球菌RP62A和无乳链球菌NSGC64浮游菌的生长曲线。
图2为本发明中化合物FDEFA1对革兰氏阳性球菌生物膜形成的抑制作用试验，其中，显示了抑菌浓度化合物FDEFA1(不影响细菌生长)对粪肠球菌FB-1，屎肠球菌EF16M64，金黄色葡萄球菌SA113，表皮葡萄球菌RP62A和无乳链球菌NSGC64等细菌的生物膜形成的抑制作用(37℃静置培养24h)，对照组为不加药物的阳性菌株，(生物膜用结晶紫染色，酶标仪上读取570吸光值，OD570数值以均数±标准差表示，***＝P<0.001)
图3显示了本发明中化合物FDEFA1在亚抑菌浓度下(不影响细菌生长)对强阳性生物膜的粪肠球菌、屎肠球菌、无乳链球菌和金黄色葡萄球菌临床株(每种菌各8株)生物膜形成的抑制作用，对照组为不加药物的阳性菌株，其中，将过夜培养的32株菌分别接种至TSBG培养基(含0.25％葡萄糖)，分别加入亚抑菌浓度的化合物FDEFA1，37℃静置培养24h，结晶紫染色，在酶标仪上读取OD570值，数值以均数±标准差表示；***:与不加药的对照株相比，P<0.001)。
具体实施方式
下面结合实验例对本发明进一步详细描述但不限制本发明。
本发明试验所涉及的大肠杆菌DH5α、BL21感受态和pET28(a)载体均为本领域技术人员所熟知的现有公开技术，或可通过市购渠道获得。
实施例1化合物FDEFA1对粪肠球菌组氨酸激酶YycG酶活性的抑制作用
通过Pubmed数据库获取粪肠球菌组氨酸激酶YycG基因序列(NC_017316)：在正义链引物5'端设计NcoⅠ酶切位点，反义链引物5'端设计XhoⅠ酶切位点：sense：5'-CATGCCATG GTCGAAAGACGGGAATTTGTTTCCAAT-3'，下划线部分为NcoⅠ酶切位点；antisense：5'-CCGCTCG AGAGGTTCATATGGTAGTGAAATATAG-3'，下划线部分为XhoⅠ酶切位点；用上述引物经PCR扩增出粪肠球菌组氨酸激酶YycG的目的片段，通过限制性内切酶(NcoⅠ和XhoⅠ)的酶切反应和T4DNA连接酶的连接反应，将上述目的片段与pET28(a)载体连接、转化DH5α细菌，挑选阳性菌落，测序证实成功构建YycG表达质粒克隆；YycG重组表达蛋白用镍柱亲和层析的方法纯化；用Thermo scientific的BCA蛋白定量分析试剂盒对蛋白质进行定量；利用Kinase-GloTMLuminescent Kinase Assay Kit(美国Promega公司)检测底物ATP的减少量反映化合物对激酶的抑制作用；
将纯化的3μg粪肠球菌YycG重组蛋白分别与不同浓度的化合物FDEFA1(1.56-200μM)在25℃作用30分钟，然后加入4μMATP(反应总体积50μL)，将反应混合物加入96孔酶标板，在25℃作用30分钟后，加入Kinase-GloTM Reagent每孔50μL室温避光静置10分钟，借助酶标仪上读取化学发光值，通过化学发光原理检测反应中ATP的剩余量，实验设不加化合物组为对照组；按下式计算化合物对目的蛋白活性的抑制率(Rp)的公式，并借助于GraphPadPrism v7.0软件计算FDEFA1化合物抑制50％YycG激酶磷酸化的浓度(IC50)。
HK’：YycG重组蛋白；compounds：FDEFA1
结果表明：FDEFA1可抑制粪肠球菌重组组氨酸激酶YycG的活性，其IC50值为42.9μM)。
实施例2化合物FDEFA1对革兰氏阳性浮游菌生长的抑制实验
抑菌试验所用菌株：粪肠球菌FB-1，屎肠球菌EF16M64，金黄色葡萄球菌SA113，表皮葡萄球菌RP62A和无乳链球菌NSGC64。
菌株过夜培养，按1:200接种到4mL新鲜TSB培养基，用TSB培养基对化合物FDEFA1进行连续倍比稀释，(从200μM至3.13μM)，稀释后各加入150μL至Bioscreen仪器配套检测孔板；再分别加入上述菌液150μL，三复孔，以不加入化合物的菌液为阳性对照；设置参数，每半小时读取一次OD600值，连续监测24h，所得到的数值绘制生长曲线，实验重复三次；
结果显示，化合物FDEFA1在50μM下可抑制粪肠球菌浮游菌FB-1生长，在25μM下可抑制屎肠球菌浮游菌EF16M64生长，在12.5μM下可抑制金黄色葡萄球SA113、表皮葡萄球菌RP62A和无乳链球菌NSGC64浮游菌生长(如图1所示)。
实施例3化合物FDEFA1对477株肠球菌和无乳链球菌临床菌株的抑菌活性试验
本实施例使用美国Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)推荐的微量肉汤稀释法检测化合物FDEFA1对477株临床菌株(其中粪肠球菌257株；屎肠球菌102株；无乳链球菌118株)的MIC值。
将细菌复苏，接种于5mL新鲜的TSB液体培养基，37℃，220rpm振荡培养过夜；将上述菌液用TSB培养基稀释到OD＝0.1，置于37℃摇床振荡培养至对数生长期，取生长期菌液1mL于1.5mLEP管中离心，菌体经无菌生理盐水稀释调节浊度至0.5麦氏浊度(即相当于1.0×108cfu/mL)，再用CAMHB液体培养基按1：100稀释，向每只试管中加入50μL CAMHB培养基和50μL不同浓度梯度的化合物，37℃培养18小时；观察各孔的细菌生长完全被抑制的最小浓度即为MIC，因化合物溶于DMSO中，以0.1％DMSO+细菌作为对照，以无菌培养基为空白对照；以粪肠球菌ATCC29212作为质控株对照；
结果如表1所示，显示化合物FDEFA1在粪肠球菌、屎肠球菌和无乳链球菌的MIC值分别是：粪肠球菌：25-100μM；屎肠球菌：12.5-100μM；无乳链球菌：6.25-100μM；MIC50/MIC90分别为，粪肠球菌：50/100μM；屎肠球菌：25/50μM；无乳链球菌：12.5/25μM。
表1化合物FDEFA1对临床菌株的抑菌活性
实施例4化合物FDEFA1对革兰氏阳性球菌生物膜抑制作用试验
生物膜抑制试验所用菌株：粪肠球菌FB-1、屎肠球菌EF16M64，金黄色葡萄球菌SA113，表皮葡萄球菌RP62A和无乳链球菌NSGC64。
将细菌复苏，接种于5mL新鲜的TSB液体培养基，37℃，220rpm振荡培养过夜。将上述菌液用TSB培养基稀释到OD＝0.1，置于37℃摇床振荡培养至对数生长期，取生长期菌液1mL于1.5mLEP管中离心，菌体经无菌生理盐水稀释调节浊度至0.5麦氏浊度(即相当于1.0×108cfu/mL)，用TSBG培养基(TSB培养基+0.25％葡萄糖)将菌液1:200稀释，将上述菌液加入96孔板，100μL/孔，同时加入不同稀释浓度(1.56-200μM)的化合物100μL到上述96孔板内，均匀混匀，37℃静置培养24h；弃去菌液，用无菌ddH2O洗去黏附细菌，重复洗涤三次；室温下干燥后加入甲醇固定15min(200μL/孔)，弃去甲醇室温下干燥后每孔加入1％结晶紫染液100μL，室温下染色20min，清水下轻柔洗脱结晶紫染液直至流水无色，室温下干燥后在酶标仪上读取OD570值并拍照；
结果显示，化合物FDEFA1在亚抑菌浓度下可抑制粪肠球菌FB-1(25μM，1/2×MIC)、屎肠球菌EF16M64(6.25μM，1/4×MIC)、金黄色葡萄球SA113(6.25μM，1/2×MIC)、表皮葡萄球菌RP62A(6.25μM，1/2×MIC)和无乳链球菌NSGC64(6.25μM，1/2×MIC)菌株24h生物膜的形成(如图2所示)。
实施例5化合物FDEFA1对强阳性生物膜临床菌株生物膜形成的抑制作用
生物膜抑制实验所用菌株(32株)：粪肠球菌(8株)：16C166、16C271、16C350、16C353、FB-1、16C102、16C109、16C152；屎肠球菌(8株)：EF16M44、EF16M45、EF16M64、EF16M5、EF16M10、HAFM24、HAFM77、NEFM8；无乳链球菌(8株)：SG8、SG9、SG106、SG116、SG64、SG78、SG104、SG136；金黄色葡萄球菌(8株)：S350、S655、S684、S692、S767、Y139、Y128、H118。
将细菌复苏，接种于5mL新鲜的TSB液体培养基，37℃，220rpm振荡培养过夜。将上述菌液用TSB培养基稀释到OD＝0.1，置于37℃摇床振荡培养至对数生长期，取生长期菌液1mL于1.5mLEP管中离心，菌体经无菌生理盐水稀释调节浊度至0.5麦氏浊度(即相当于1.0×108cfu/mL)，用TSBG培养基(TSB培养基+0.25％葡萄糖)将菌液1:200稀释，将上述菌液加入96孔板，100μL/孔，同时加入亚抑菌浓度的化合物100μL到上述96孔板内，均匀混匀，37℃静置培养24h；弃去菌液，用无菌ddH2O洗去黏附细菌，重复洗涤三次。室温下干燥后加入甲醇固定15min(200μL/孔)，弃去甲醇室温下干燥后每孔加入1％结晶紫染液100μL，室温下染色20min，清水下轻柔洗脱结晶紫染液直至流水无色，室温下干燥后在酶标仪上读取OD570值并拍照；
结果显示，化合物FDEFA1在亚抑菌浓度下可分别抑制粪肠球菌(1/2×MIC)、屎肠球菌(1/4×MIC)、金黄色葡萄球(1/2×MIC)和无乳链球菌(6.25μM，1/2×MIC)临床菌株24h生物膜的形成(如图3所示)。
实施例6 MTT法检测化合物FDEFA1的细胞毒性
将新鲜培养的Vero细胞接种于96孔板，每孔100μL细胞(约5×104细胞)，37℃，5％CO2条件下培养24小时，使细胞长成单层。弃去培养基，加入100μL/每孔新鲜的MEM培养基，其中含有不同浓度的化合物FDEFA1(溶剂DMSO终浓度保持0.1％)，每个样品采用3复孔上样，37℃，5％CO2条件下继续培养24小时，因化合物溶解于DMSO中，因此设0.1％DMSO+细胞为对照组；每孔加入10μLMTT标记物，37℃、5％CO2条件下培养4小时；每孔加入100μL溶解液，37℃、5％CO2条件下培养过夜；将96孔板取出读取OD570值，每个样品读数取3复孔的均值，计算不同浓度的化合物对Vero细胞生长的抑制率：
通过GraphPadPrism v7.0软件计算获得分别计算抑制50％的Vero细胞毒性所需的化合物的浓度(CC50)，结果表明，化合物FDEFA1的CC50>200μM，在Vero细胞未观察到明显的细胞毒性作用。
实施例7红细胞溶血实验：
将分离的健康人血红细胞用无菌生理盐水洗涤三次，并稀释至5％浓度。将含有200μM和50μM的小分子化合物FDEFA1(溶剂DMSO终浓度保持1％)的红细胞悬液加入96孔板，每孔200μL，37℃静置1小时，设三复孔，同时以不含小分子化合物处理的红细胞悬液和1％Triton X-100处理的红细胞悬液作为阴性(0溶血)和阳性(100％溶血)对照，将处理过的红细胞悬液在1000×g离心10分钟，100μL上清转移到96孔板于570nm处读数，结果显示：在50μM和200μM浓度下，该小分子化合物FDEFA1对人红细胞溶血性较低(如表2所示)。
表2化合物FDEFA1对人血红细胞的溶血作用
溶血性即为化合物FDEFA1在50μM和200μM时对健康人血红细胞的溶血性百分比。
Claims (5)
1.化合物FDEFA1在制备革兰氏阳性球菌抑制剂中的用途，所述化合物FDEFA1为式(Ⅰ)结构的小分子化合物，结构为：2-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)-1-苯基-5-(甲苯磺酰氧基)-1H-吲哚-3-羧酸乙酯，分子式为C30H33N3O5S，
所述的革兰氏阳性球菌为粪肠球菌、屎肠球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌或无乳链球菌。
2.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的式(Ⅰ)结构的小分子化合物为粪肠球菌YycG组氨酸激酶抑制剂。
3.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的小分子化合物FDEFA1抑制革兰阳性球菌浮游菌的生长。
4.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的小分子化合物FDEFA1抑制革兰阳性球菌生物膜的形成。
5.按权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的粪肠球菌YycG组氨酸激酶抑制剂在用于制备由革兰氏阳性球菌感染的疾病治疗药物中的用途，所述的革兰氏阳性球菌为粪肠球菌、屎肠球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌或无乳链球菌。
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