CN1867670A - 降解dsRNA和合成RNA的方法 - Google Patents
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Abstract
一种具有降解dsRNA活性的蛋白质，也就是说，能够作用于长链dsRNA以形成特定长度dsRNA的蛋白质；一种特定长度dsRNA的有效制备方法，所述方法包括在具有与核酸结合活性的蛋白质例如具有RNA结合活性的蛋白质的存在下，用所述具有降解dsRNA活性的蛋白质处理dsRNA；以及使用所述具有与核酸结合活性的蛋白质来提高以dsRNA合成为代表的RNA合成反应的效率的方法。
Description
技术领域
[0001]
本发明涉及具有降解dsRNA的活性并具有产生特定长度dsRNA的活性的蛋白质，涉及使用所述蛋白质和具有与核酸结合活性的蛋白质(例如具有与RNA结合活性的蛋白质)以有效降解dsRNA的方法，还涉及使用具有与核酸结合活性的蛋白质和具有合成RNA活性的蛋白质以有效合成RNA的方法。
背景技术
[0002]
目前，已经报道了使用小dsRNA的基因工程技术。
例如，RNA干扰(RNAi)是dsRNA以序列特异性方式降解mRNA而导致的基因表达受抑制的现象。有关dsRNA可用于基因沉默，首次是在秀丽新小杆线虫(Caenorhabditis elegans)的反义研究中发现的。1995年，Guo和Kemphues进行了一项实验：用反义RNA抑制par-1基因。当添加反义RNA时，正如所预期的一样，par-1的表达受到抑制。令人吃惊的是，用作对照的有义RNA也抑制par-1的表达，导致par-1突变体的表型(参见例如非专利文献1)。
在1998年，Fire等人解决了该矛盾。当使用RNA聚合酶合成反义RNA或有义RNA时，无意中以非特异性方式产生了少量的反向RNA(inverse RNA)。这表明，因污染而形成的dsRNA对基因沉默来说是至关重要的，而反义RNA或有义RNA都不能抑制基因表达；通过将反义RNA退火到有义RNA而形成的dsRNA则能够有效抑制基因表达(例如非专利文献2)。
[0003]
在RNA干扰中，一种称为切酶(Dicer)的酶由dsRNA产生小RNA(短干扰RNA(siRNA))(例如非专利文献3)。
据认为，在所述酶作用下产生的siRNA掺入到某种复合物即RNA诱导性沉默复合物(RISC)中，该复合物识别并降解靶mRNA。然而，在许多情况下，可能参与RNA干扰的有关因子的确切功能尚不清楚(例如非专利文献4)。
[0004]
有效产生dsRNA或siRNA，对于有效进行RNA干扰来说是重要的。切酶(Dicer)的实例是人切酶(例如非专利文献5)。重组切酶(例如非专利文献6)是由Gene Therapy Systems或Stratagene销售的。
然而，尚未从上述重组切酶的固有酶学性质的细节上进行研究，看其是否能满足需要。而且，采用基因工程技术保留切酶在作用于dsRNA时优选产生dsRNA(siRNA)的活性、或者提高其产生效率所含有的最小结构域也未完全弄清楚。
此外，也不清楚有效用于产生dsRNA的具体有效方法。
[0005]
与已报道用于siRNA的方法相同，使用由RNA聚合酶合成长度约为21个核苷酸的dsRNA的方法(例如非专利文献7)。如果合适的话，能有效产生RNA的方法可用于上述方法。
[0006]
非专利文献1：Guo，S.等，Cell，1995，第81卷，第611-620页
非专利文献2：Fire，A.等，Nature，1998，第39卷，第806-811页
非专利文献3：Bernstein，E.等，Nature，2001，第409卷，第363-366页
非专利文献4：Tabara，H.等，Cell，2002，第109卷，第861-871页
非专利文献5：Zhang，H.等，The EMBO Journal，2002，第21卷，第5875-5885页
非专利文献6：Myers，J.W.等，Nature Biotechnology，2003，第21卷，第324-328页
非专利文献7：Donze，O.等，Nucleic Acids Research，2002，第30卷，第10期，e46。
发明内容
本发明所解决的问题
[0007]
本发明所解决的问题是提供具有降解dsRNA的活性并具有产生特定长度dsRNA的活性的蛋白质，也提供有效产生可用于RNA干扰等的特定长度dsRNA的方法，也提供促进RNA合成的方法。
解决问题的方法
[0008]
本发明已经进行了深入研究以便解决上述问题。结果，本发明人通过分析切酶的功能结构域，已经发现具有降解dsRNA的活性并且具有作用于长dsRNA以产生特定长度dsRNA的活性的蛋白质。而且，本发明人已经发现，在具有与核酸结合活性的蛋白质(例如具有与RNA结合活性的蛋白质)的存在下，通过让具有降解dsRNA活性的蛋白质作用于dsRNA，能有效制备特定长度的dsRNA，而且具有与核酸结合活性的蛋白质也能提高RNA合成(以dsRNA合成为例)的反应效率。因此，完成了本发明。
[0009]
本发明的第一方面涉及具有降解dsRNA的活性并且具有作用于dsRNA以产生特定长度dsRNA的活性的蛋白质。
根据第一方面，具有降解dsRNA活性的蛋白质优选具有切酶的功能结构域。例如，优选它由RNA酶IIIa、RNA酶IIIb和dsRNA结合结构域组成。所述蛋白质还可包含PAZ结构域。有可能通过使用第一方面的蛋白质，产生约15-30个碱基对的dsRNA作为特定长度的dsRNA。第一方面的具有降解dsRNA活性的蛋白质的实例是由SEQ ID NO：4或17的氨基酸序列、或者由SEQ ID NO：3或16的核苷酸序列所编码的氨基酸序列组成的蛋白质。或者，所述蛋白质可以是由在SEQ ID NO：4或17的氨基酸序列中一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入或添加的氨基酸序列组成的蛋白质。可以通过将密码子转变成适合于在宿主中表达的密码子，或者增强宿主使用罕用密码子，就能有效产生第一方面的具有降解dsRNA活性的蛋白质。
此外，可以使用冷诱导型载体来表达所述蛋白质。另外，第一方面的蛋白质可以作为一种组分包含在试剂盒中。
[0010]
本发明的第二方面涉及降解dsRNA的方法，所述方法包括在具有与核酸结合活性的蛋白质的存在下，让具有降解dsRNA活性的蛋白质作用于dsRNA，以产生特定长度的dsRNA。
根据第二方面，具有与核酸结合活性的蛋白质和具有降解dsRNA活性的蛋白质可以是融合蛋白。具有与核酸结合活性的蛋白质可以是具有与RNA结合活性的蛋白质。具有与RNA结合活性的蛋白质可以是冷激蛋白。所述冷激蛋白可来源于嗜热菌或耐热菌。尽管认为并不是对本发明的限制，例如，冷激蛋白的实例是来自海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的冷激蛋白B。
根据第二方面的方法，有可能产生约15-30个碱基对的dsRNA作为特定长度的dsRNA。而且，根据第二方面，具有降解dsRNA活性的蛋白质可以是第一方面的蛋白质，或者可以是天然切酶或其功能性等同物。
[0011]
本发明的第三方面涉及合成RNA的方法，所述方法包括在具有与核酸结合活性的蛋白质的存在下，使用具有合成RNA活性的蛋白质，进行RNA的合成反应。
根据第三方面，具有与核酸结合活性的蛋白质和具有合成RNA活性的蛋白质可以是融合蛋白。具有与核酸结合活性的蛋白质可以是冷激蛋白。所述冷激蛋白可来源于嗜热菌或耐热菌。尽管认为并不是对本发明的限制，例如，冷激蛋白的实例是来自海栖热袍菌的冷激蛋白B。具有合成RNA活性的蛋白质可以是依赖DNA的RNA聚合酶。
[0012]
本发明的第四方面涉及用于第二方面的方法的组合物，所述组合物包含具有与核酸结合活性的蛋白质和具有降解dsRNA活性的蛋白质。
[0013]
本发明的第五方面涉及用于第二方面的方法的试剂盒，所述试剂盒包含具有与核酸结合活性的蛋白质和具有降解dsRNA活性的蛋白质。
[0014]
本发明的第六方面涉及用于第三方面的方法的组合物，所述组合物包含具有与核酸结合活性的蛋白质和具有合成RNA活性的蛋白质。
[0015]
本发明的第七方面涉及涉及用于第三方面的方法的试剂盒，所述试剂盒包含具有与核酸结合活性的蛋白质和具有合成RNA活性的蛋白质。
发明效果
[0016]
本发明提供具有降解dsRNA活性的蛋白质，所述蛋白质可用于制备特定长度的dsRNA。而且，可以按照本发明，有效制备用于RNA干扰等的特定长度dsRNA。
实施本发明的最佳方式
[0017]
本文所用的切酶(Dicer)是指在RNAi早期能够将长dsRNA加工成siRNA的蛋白质。天然切酶的实例包括但不限于自N端起由ATP结合结构域、RNA解旋酶结构域、未知功能的PAZ结构域、RNA酶IIIa和RNA酶IIIb及dsRNA结合结构域组成的切酶。
[0018]
本文所用的切酶(Dicer)的功能结构域是指编码区部分，所述编码区涉及作用于长dsRNA以产生特定长度dsRNA的活性。
[0019]
功能结构域的实例包括但不限于由RNA酶IIIa、RNA酶IIIb和dsRNA结合结构域组成的结构域。RNA酶IIIa和RNA酶IIIb结构域可以是编码区部分，所述编码区涉及特异性作用于双链RNA以产生特定长度的、在5’端具有磷酸酯基团的寡核苷酸的活性，如以下文献中所描述的：Zhang，H.等，The EMBO Journal，2002，第21卷，第21期，第5875-5885页。dsRNA结合结构域可以是编码部分，其编码与双链RNA特异性结合的活性。
[0020]
本文所用的dsRNA是指在mRNA受到RNA干扰期间形成双链结构的RNA，以及具有与mRNA互补的核苷酸序列的RNA。
根据本发明，dsRNA降解反应产物的主要的示例性应用是如下所述的siRNA。
[0021]
本文所用的特定长度的dsRNA是指具有特定长度的dsRNA，例如约10-100个碱基对，尽管认为并不是对本发明的限制。它可以是特定长度的dsRNA，其长度约为15-30个碱基对、尤其是20-25个碱基对。所述dsRNA可以用作siRNA。
[0022]
本文所用的具有与核酸结合活性的蛋白质是指具有与单链或双链DNA或RNA结合的活性的蛋白质。所述蛋白质优选具有消除核酸二级结构的功能。其实例包括DNA解旋酶、RNA解旋酶及其功能性等同物。
[0023]
本文所用的冷诱导型载体是指具有在低温时能行使功能的启动子的载体。其实例包括WO 99/27117中描述的pCold系列载体。
[0024]
本文所用的冷激蛋白通常是指与固有的生长条件相比经过低温刺激而表达的蛋白质。
[0025]
本文所用的长dsRNA作为底物完全降解，是指降解到这样的程度：经电泳测定，降解反应后再也没有观察到未切割的作为底物的长dsRNA。
[0026]
本文所用的PAZ结构域是在切酶中RNA解旋酶结构域和RNA酶IIIa和RNA酶IIIb结构域之间的结构域。例如，它是人切酶的SEQID NO：1的氨基酸序列中自氨基酸898至氨基酸1064之间的区域(在SEQ ID NO：2中自核苷酸2692至核苷酸3192)。
[0027]
根据本发明，罕用密码子是指使用率低的密码子。一个氨基酸可以由多个密码子编码。多个密码子的使用可以偏倚，这取决于生物物种。已知对应于低使用率的密码子的转移RNA(tRNA)的数量通常较少，而且如果表达含有罕用密码子的核苷酸序列所编码的氨基酸时，表达效率会降低。因此，对于罕用密码子，可以通过增强(例如通过增加对应于罕用密码子的tRNA的数量)来有效产生蛋白质。
[0028]
在下文，将详细地描述本发明。
(1)具有降解dsRNA活性的本发明蛋白质，产生所述蛋白质的方法，以及包含所述蛋白质的试剂盒
具有降解dsRNA活性的本发明蛋白质能作用于dsRNA，产生特定长度的dsRNA。对于具有降解dsRNA活性的蛋白质并没有具体限制，只要它能够从长dsRNA产生特定长度的dsRNA。其实例是具有切酶功能结构域的蛋白质。切酶的功能结构域可以是由RNA酶IIIa、RNA酶IIIb和dsRNA结合结构域组成的蛋白质。任何蛋白质，无论其来源，只要它能从长dsRNA产生特定长度的dsRNA，均可使用。
对于RNA酶IIIa、RNA酶IIIb和dsRNA结合结构域并没有具体限制。就人切酶而言，一个实例是在SEQ ID NO：1氨基酸序列的N端部分具有氨基酸1271至氨基酸1924(SEQ ID NO：2的核苷酸序列中的核苷酸3811至核苷酸5772)。其实例包括由SEQ ID NO：4氨基酸序列、或者由SEQ ID NO：3核苷酸序列编码的氨基酸序列组成的蛋白质(切酶突变体)，以及由SEQ ID NO：12氨基酸序列或由SEQID NO：13核苷酸序列编码的氨基酸序列组成的蛋白质(切酶突变体)。
因为切酶是大蛋白质，不适于产生重组体。另一方面，具有降解dsRNA活性的本发明蛋白质比天然酶要小而紧结。因此，它可用于产生重组体。通常，如果要作为细菌细胞(例如大肠杆菌(Escherichiacoli))的重组体来产生来自高等生物(例如人)的酶时，在许多情况下，难以产生同时保留等同酶活性的重组体。因此，具有降解dsRNA活性的本发明蛋白质对于在不是其来源的生物的细胞中产生来说，是非常有用的。
[0029]
本发明的蛋白质可含有PAZ结构域。其实例包括但不限于在SEQID NO：1氨基酸序列中具有氨基酸898至氨基酸1924(在SEQ ID NO：2中的核苷酸2692至核苷酸5772)的蛋白质，由SEQ ID NO：17的氨基酸序列或由SEQ ID NO：16的核苷酸序列所编码的氨基酸序列组成的蛋白质(切酶突变体)以及由SEQ ID NO：18氨基酸序列或由SEQ IDNO：19核苷酸序列编码的氨基酸序列组成的蛋白质(切酶突变体)。
[0030]
此外，可以得到酶学上更稳定的突变体。尽管认为并不是对本发明的限制，例如，就PAZ结构域+RNA酶III结构域而言，与仅由RNA酶III结构域组成的突变蛋白相比，可以观察到稳定性增加。甚至在更多冻融循环后，活性仍可保留，并且在液态下，使用某种贮存缓冲液，活性可以保留更长时间。
[0031]
尽管认为并不是对本发明的限制，例如，本发明蛋白质能降解长dsRNA，产生有效用于RNA干扰的siRNA。
具有降解dsRNA活性的本发明蛋白质包括在氨基酸序列(或核苷酸序列)中一个或多个氨基酸(或核苷酸)被取代、缺失、插入或添加的蛋白质，只要它具有上述功能。
尽管认为并不是对本发明的限制，具有降解dsRNA活性的本发明蛋白质可以是所述蛋白质中添加了以下序列的蛋白质：来自表达载体的序列例如表达或翻译增强序列(例如Perfect DB序列)，或者用于纯化表达蛋白质的氨基酸序列例如标记序列(例如His标记序列)，或者用于去除表达蛋白质的N-端附加序列的序列(例如因子Xa序列)。所述蛋白质的实例包括但不限于具有降解dsRNA活性的蛋白质，其具有SEQ ID NO：12或18的氨基酸序列。
具有降解dsRNA活性的本发明蛋白质可将长dsRNA转化成特定长度的dsRNA。因此，可以根据本发明，通过适当选择所用的具有降解dsRNA活性的蛋白质，来制备所需长度的dsRNA。尽管认为并不是对本发明的限制，特定长度dsRNA的实例是长度约10-100个碱基对、优选约15-30个碱基对、更优选约20-25个碱基对的dsRNA。
用常规市售酶不能完全降解用作底物的dsRNA。另一方面，用作底物的长dsRNA基本上可以被具有降解dsRNA活性的本发明蛋白质完全降解。因为作为底物的dsRNA可以被完全降解而且降解产物的RNA干扰活性相同，减少了作为底物的长dsRNA，因此，省略去除未降解dsRNA的步骤是可行的。
此外，在氯化镁存在下，在4℃或在-20℃，贮存于tris-HCl缓冲液(pH8.5以上)中，可以长时间稳定保留具有降解dsRNA活性的本发明蛋白质(例如但不限于切酶突变体)的活性。
具有降解dsRNA活性的本发明蛋白质可以与如下(2)所述的具有与核酸结合活性的蛋白质(例如但不限于具有与RNA结合活性的蛋白质)一起呈融合蛋白形式。尽管认为并不是对本发明的限制，其实例包括上述切酶突变体和具有与核酸结合活性的蛋白质(例如具有与RNA结合活性的蛋白质)的融合蛋白。
[0032]
本发明用于产生具有降解dsRNA活性的蛋白质的方法可包括将密码子转变成适合在宿主中表达的密码子，或者对于罕用密码子进行增强。尽管认为并不是对本发明的限制，例如，它可以是这样的制备方法：所述方法包括修饰待表达基因中的密码子。可以使用其状态处于蛋白质的氨基酸序列的密码子部分或全部转变成蛋白质表达的优化密码子的基因，或者使用其状态符合优化密码子的宿主，进行表达。尽管认为并不是对本发明的限制，其状态符合优化密码子状态的宿主的实例是其中识别特异性密码子的tRNA的数量要比用基因工程技术在细胞中正常产生的数量大几倍的宿主。所述宿主的实例包括大肠杆菌细胞，例如用精氨酸密码子(AGA，AGG)的tRNA强化的大肠杆菌细胞，以及用异亮氨酸密码子(AUA)、脯氨酸密码子(CCC)和亮氨酸密码子(CUA)的tRNA强化的大肠杆菌细胞。
可以采用通过修饰密码子来增加宿主中目标蛋白质的表达的方法。在这种情况下，可以考虑mRNA的二级结构。
对于所述方法并没有具体限制，只要按照所述方法将待表达基因中密码子进行转换、增强等，从而增加蛋白质表达。
[0033]
对于用于产生具有降解dsRNA活性的本发明蛋白质的载体来说并没有具体限制。可使用任何市售载体或表达系统。具体地讲，可以使用例如pET系统(Novagen)，尽管认为并不是对本发明的限制。另外，优选使用具有能在低温条件下行使功能的启动子的载体。其实例包括WO 99/27117中描述的pCold系列载体。
在本发明制备方法的一个实施方案中，按照示例性方法，使用具有在低温时能行使功能的启动子的载体(例如包括WO 99/27117中描述的pCold系列载体)，制备上述切酶突变体。
根据本发明的制备方法，可以优选使用任何载体，只要该载体可用于表达保留其产生特定长度dsRNA的功能的蛋白质。
此外，可以包括这样的载体：所述载体在蛋白质表达时，能表达呈包涵体形式的蛋白质，但其功能可以通过随后的重折叠过程而恢复；只要能得到最终保留可产生特定长度的dsRNA功能的蛋白质。
在本发明方法的一个实施方案中，例如，当产生上述切酶突变体时，与表达全长常规人切酶相比，呈保留活性形式的所述蛋白质的产量和产率都有所增加。
具有降解dsRNA活性的本发明蛋白质的制备方法包括这样的方法：其中所述蛋白质以与如下(2)所述的具有与核酸结合活性的蛋白质(例如但不限于具有与RNA结合活性的蛋白质)融合蛋白形式来表达。
[0034]
(2)用具有与核酸结合活性的本发明蛋白质来促进dsRNA降解的方法，以及用所述蛋白质促进RNA合成的方法
促进dsRNA降解并产生特定长度dsRNA的本发明方法的特征在于：在具有与核酸结合活性的蛋白质的存在下实施。对于具有与核酸结合活性的蛋白质并没有具体限制，只要能提高dsRNA降解活性。例如，可优选使用具有与RNA结合活性的上述蛋白质。
具有与RNA结合活性的蛋白质的实例包括但不限于冷激蛋白(Csp)。具体地讲，优选使用在正常温度范围内能行使功能的冷激蛋白。优选来源于嗜热菌或耐热菌的冷激蛋白。尽管认为并不是对本发明的限制，例如，优选使用来源于海栖热袍菌的CspB蛋白，所述蛋白质具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列(由SEQ ID NO：10的核苷酸序列所编码的氨基酸序列)。例如，可以使用基因工程技术，按照以下文献中描述的方法，用购自德意志微生物和细胞保藏中心(DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)的海栖热袍菌菌株MSB8(DSM3109)，制备来源于海栖热袍菌的CspB蛋白重组体：Protein Science，8：394-403(1999)。可优选使用具有在低温时能行使功能的启动子的载体。其实例包括WO 99/27117中描述的pCold系列载体。
可通过使用CspB蛋白和具有降解dsRNA活性的蛋白质，来提高降解dsRNA的活性。根据本发明的方法，对于任何具有降解dsRNA活性的蛋白质，可提高产生特定长度dsRNA的活性，产生以上(1)所述的特定长度的dsRNA(例如功能性等同物，例如切酶突变体、天然切酶或市售重组切酶)。
根据本发明的方法，可使用具有与核酸结合活性的蛋白质和具有降解dsRNA活性的蛋白质，来提高降解dsRNA的活性。所得降解产物的RNA干扰活性(每单位重量)等同于不使用具有与核酸结合活性的蛋白质所得到的降解产物的。因此，使用具有与核酸结合活性的蛋白质，对于RNA干扰来说是非常有用的。
按照常规方法，不能完全降解用作底物的dsRNA。另一方面，用作底物的长dsRNA基本上可以按照本发明的方法完全降解。因为作为底物的dsRNA可以被完全降解，降解产物的RNA干扰活性相同，减少了作为底物的长dsRNA，因此，省略去除未降解dsRNA的步骤是可行的。
此外，根据本发明的方法，具有与核酸结合活性的蛋白质(例如具有合成RNA活性的蛋白质)可以与具有降解dsRNA活性的蛋白质一起呈融合蛋白形式。
[0035]
提高本发明的RNA合成的方法的特征在于：在具有与核酸结合活性的蛋白质的存在下实施。对于具有与核酸结合活性的蛋白质并没有具体限制，只要能导致提高具有所述活性的蛋白质的RNA合成活性。可优选使用具有与核酸结合活性的蛋白质——冷激蛋白(Csp)。尽管认为并不是对本发明的限制，可优选使用来源于嗜热菌或耐热菌的冷激蛋白。冷激蛋白的实例包括但不限于来源于海栖热袍菌的CspB蛋白，其具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列(SEQ ID NO：10的核苷酸序列)。
例如，可以通过将CspB蛋白纳入RNA合成系统，提高RNA聚合酶的RNA合成活性。所述蛋白质都可以提高合成活性，无论所述产物是单链RNA还是双链RNA。
[0036]
用于促进RNA合成的本发明方法，既可用于合成长dsRNA又可用于合成短dsRNA(例如siRNA)。所述方法可使用T7 RNA聚合酶等，用于合成优选约15-30个碱基对、更优选约20-25个碱基对的siRNA，尽管认为并不是对本发明的限制。
[0037]
根据本发明的方法，具有与核酸结合活性的蛋白质促进两类反应，即与具有RNA合成活性的蛋白质一起促进dsRNA合成；与具有dsRNA降解活性的蛋白质一起促进dsRNA降解。因此，所述方法可用于合成对RNA干扰尤其重要的dsRNA的系统，或者用于产生siRNA的系统。在这种情况下，所述各蛋白质可以是各自独立的或者它们可呈融合蛋白形式。
[0038]
(3)用于本发明方法的组合物
本发明的组合物是有效用于降解反应以产生特定长度dsRNA和/或RNA合成反应的组合物。
所述组合物包含如上(2)所述的具有与核酸结合活性的蛋白质。可优选使用冷激蛋白作为具有与核酸结合活性的蛋白质，尽管认为并不是对本发明的限制。例如，可优选使用来源于嗜热菌或耐热菌的冷激蛋白(Csp)。优选来源于海栖热袍菌的CspB蛋白，所述蛋白质具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列(由SEQ ID NO：10的核苷酸序列所编码的氨基酸序列)。
[0039]
本发明的组合物可包含具有降解dsRNA活性的蛋白质和/或具有合成RNA活性的蛋白质。具有切酶功能结构域的蛋白质优选用作具有降解dsRNA活性的蛋白质，其能够产生特定长度的dsRNA。例如，可优选使用由RNA酶IIIa、RNA酶IIIb和dsRNA结合结构域组成的蛋白质。尽管认为并不是对本发明的限制，例如，可以使用任何功能性等同物，例如，如上(1)所述的切酶突变体、天然切酶或市售重组切酶。含有切酶突变体的组合物可以是这样的组合物：其含有由SEQ ID NO：4或17的氨基酸序列或由SEQ ID NO：3或16的核苷酸序列所编码的氨基酸序列组成的蛋白质。它可以是含有这样的蛋白质的组合物：其由在SEQ ID NO：4或17的氨基酸序列中一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入或添加的氨基酸序列组成。
具有降解dsRNA活性的蛋白质可以是所述蛋白质中添加了以下序列的蛋白质：来自表达载体的序列例如表达或翻译增强序列(例如Perfect DB序列)，或者用于纯化表达蛋白质的氨基酸序列例如标记序列(例如His标记序列)，或者用于去除表达蛋白质的N-端附加序列的序列(例如因子Xa序列)。所述蛋白质的实例包括但不限于具有降解dsRNA活性的蛋白质，其具有SEQ ID NO：12或18的氨基酸序列。此外，本发明的组合物可包含缓冲液，用于稳定如上(1)所述的切酶突变体。
[0040]
例如，T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶等可优选用作具有合成RNA活性的蛋白质。
在本发明组合物的另一个实施方案中，所述组合物可包含如上(2)所述的具有与核酸结合活性的蛋白质(例如具有与RNA结合活性的蛋白质)和具有降解dsRNA活性并能产生特定长度dsRNA的蛋白质的融合蛋白，和/或具有与核酸结合活性的蛋白质和具有合成RNA活性的蛋白质的融合蛋白。
使用本发明的组合物，可常规进行有效降解成特定长度dsRNA的反应和/或合成单链或双链RNA的反应。
[0041]
本发明组合物的一个实施方案是既可用于合成长dsRNA又可用于合成短dsRNA(siRNA)的组合物。所述组合物有效用于合成约10-100个碱基对、优选约15-30个碱基对、更优选约20-25个碱基对的dsRNA。
[0042]
(4)用于本发明方法的试剂盒
用于本发明方法的试剂盒是有效进行降解成特定长度dsRNA的反应和/或RNA合成反应的试剂盒。
所述试剂盒包含如上(2)所述的具有与核酸结合活性的蛋白质。可优选使用冷激蛋白作为具有与核酸结合活性的蛋白质，尽管认为并不是对本发明的限制。例如，可优选使用来源于嗜热菌或耐热菌的冷激蛋白(Csp)。可优选使用来源于海栖热袍菌的CspB蛋白，其具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列。
[0043]
本发明的试剂盒可包含具有降解dsRNA活性并具有产生特定长度dsRNA活性的蛋白质和/或具有合成RNA活性的蛋白质。可优选使用如上(3)所述的蛋白质作为具有降解dsRNA活性的蛋白质和/或具有合成RNA活性的蛋白质。此外，本发明的试剂盒可包含用于稳定如上(1)所述的切酶突变体的缓冲液。
在本发明试剂盒的另一个实施方案中，所述试剂盒可包含如上(2)所述的具有与核酸结合活性的蛋白质(例如具有与RNA结合活性的蛋白质)和具有降解dsRNA活性并能产生特定长度dsRNA的蛋白质的融合蛋白；和/或具有与核酸结合活性的蛋白质和具有合成RNA活性的蛋白质的融合蛋白。
本发明的试剂盒除包含以上所述组分之外，还可包含其它的组分，例如用于纯化反应所产生的特定长度dsRNA的试剂，或者用于将其转移到生物样品的试剂。尽管认为并不是对本发明的限制，例如，它可包含用于纯化约21个碱基对的siRNA的试剂、用于将其转移给生物样品的试剂等等。
使用本发明的试剂盒，可常规进行有效降解成特定长度的dsRNA的反应和/或合成RNA的反应。
[0044]
本发明试剂盒的一个实施方案是既可用于合成长dsRNA又可用于合成短dsRNA(例如siRNA)的试剂盒。所述试剂盒有效用于合成约10-100个碱基对、优选约15-30个碱基对、更优选约20-25个碱基对的dsRNA。
实施例
[0045]
以下实施例对本发明作出更详细说明，但不得解释为是对本发明范围的限制。
在本文所述的步骤中，基本步骤包括以下文献中描述的质粒制备、限制酶消化：T.Maniatis等(编著)，Molecular Cloning：A LaboratoryManual第3版，Cold Spring Haror Laboratory(2001)。
[0046]
实施例1：人切酶的RNA酶III结构域的表达
(1)表达载体的构建
为了表达由SEQ ID NO：1所示的人切酶氨基酸序列的N端部分的氨基酸1271至氨基酸1924(核苷酸3811至核苷酸5772)构成的多肽，如下构建表达载体。
首先，根据公众可用的GenBank检索号AB028449的核苷酸序列，使用DNA合成仪，合成合成引物1和2(SEQ ID NO：5和6)，并用常规方法进行纯化。合成引物1是合成DNA，所述DNA在核苷酸9至核苷酸14间具有限制酶KpnI的识别序列，而且在核苷酸16至核苷酸36间具有对应于人切酶氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的氨基酸1271至氨基酸1277的核苷酸序列。合成引物2在核苷酸9至核苷酸14间具有限制酶HindIII的识别序列，而且在核苷酸18至核苷酸36间具有对应于人切酶氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的氨基酸1919至氨基酸1924的核苷酸序列。
[0047]
使用合成引物进行PCR。PCR的反应条件如下。
简而言之，加入2μl模板DNA(人cDNA文库，人胰腺，TakaraBio)、5μl 10x LA PCR缓冲液(Takara Bio)、5μl dNTP(Takara Bio)、10pmol合成引物1、10pmol合成引物2、0.5U Takara LA Taq(TakaraBio)和无菌水，制备总体积为50μl的反应混合物。将反应混合物放置在TaKaRa PCR Thermal Cycler SP(Takara Bio)中，进行如下反应：94℃1分钟、55℃1分钟和72℃3分钟，进行30个循环。
[0048]
反应后，将5μl反应混合物在1.0％琼脂糖凝胶上进行电泳。回收所观察到的约2kbp的目标DNA片段，在电泳凝胶上进行纯化，然后用乙醇沉淀。乙醇沉淀后，将回收的DNA悬浮在5μl无菌水中，用限制酶KpnI(Takara Bio)和HindIII(Takara Bio)双重消化。提取KpnI-HindIII消化物，在1.0％琼脂糖凝胶上进行电泳纯化，得到KpnI-HindIII消化的DNA片段。
[0049]
然后，按照WO 99/27117实施例1-6中描述的方法，制备载体pCold08NC2。
采用与制备KpnI-HindIII消化的DNA片段相同的限制酶，切割载体pCold08，并且在末端脱磷酸化。将如此制备的载体和KpnI-HindIII消化的DNA片段混合在一起，用DNA连接试剂盒(Takara Bio)将其彼此连接。用20μl连接混合物转化大肠杆菌JM109。让转化子在含有浓度为1.5％(w/v)琼脂的LB培养基(含50μg/ml氨苄青霉素)上生长。
[0050]
具有目标DNA插入片段的质粒经测序证实。该重组质粒命名为pCold08 hDi-R。该质粒命名为pCold08 hDi-R并且自2003年8月11日(原始保藏日)保藏于国际专利生物材料保藏单位——独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，日本国茨城县筑波市东1丁目1番1中央第6，邮政编码305-8566(International Patent OrganismDepositary，National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，Japan)，保藏号为FERM BP-10074。pCold08 hDi-R是含有这样的核苷酸序列的质粒：所述核苷酸序列编码人切酶氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的氨基酸1271至氨基酸1924的氨基酸序列。该质粒表达的蛋白质具有Perfect DB序列、His标记序列和因子Xa序列。所述蛋白质的氨基酸序列示于SEQ ID NO：12，其核苷酸序列示于SEQ ID NO：13。
[0051]
(2)在不同缓冲液条件下表达、纯化和制备样品
使用以上(1)中制备的pCold08 hDi-R，转化大肠杆菌BL21。让转化子在含有浓度为1.5％(w/v)琼脂的LB培养基(含50μg/ml氨苄青霉素)上生长。将生长菌落接种到2.5ml LB液体培养基(含50μg/ml氨苄青霉素)中，37℃培养过夜。将部分培养物接种到100ml LB培养基中，在37℃培养至对数生长期。培养后，将培养物在15℃培养箱中振荡10分钟，向其中加入IPTG，终浓度为1.0mM，在15℃继续培养24小时，用于诱导表达。离心收集细胞，重悬于5ml细胞破碎液(50mM tris-HCl缓冲液(pH7.5)、100mM氯化钠、0.5mM EDTA、1％Triton X-100、1mM二硫苏糖醇、2mM苯甲基磺酰氟)中。对超声破碎的细胞进行离心(11,000rpm，20分钟)，使上清提取液与沉淀分离。
[0052]
约5ml上清提取液用镍柱如下进一步纯化。
加入10ml缓冲液A(20mM tris-HCl缓冲液(pH7.5)、100mM氯化钠、1mM二硫苏糖醇、0.1％Triton X-100)，与相当于1ml体积树脂的Ni-NTA琼脂糖(Qiagen)混合在一起。混合物以1,500rpm离心几分钟。弃去上清液，收集约1ml树脂。将从破碎细胞中制备的约5ml上清液加入到树脂中，用旋转式摇床在4℃轻轻混合约1小时。然后，将已经吸附目标蛋白质的树脂装填在15mm柱中，用5ml缓冲液A洗涤2次。树脂再用5ml缓冲液B(20mM tris-HCl缓冲液(pH7.5)、100mM氯化钠、1mM二硫苏糖醇、0.1％Triton X-100、40mM咪唑)洗涤。树脂进一步用5ml缓冲液C(20mM tris-HCl缓冲液(pH7.5)、800mM氯化钠、1mM二硫苏糖醇、0.1％Triton X-100、40mM咪唑)洗涤，接着再用5ml缓冲液B洗涤，以除去除目标蛋白质外的不必要蛋白。
[0053]
洗涤后，用3ml缓冲液D(20mM tris-HCl缓冲液(pH7.5)、100mM氯化钠、1mM二硫苏糖醇、0.1％Triton X-100、100mM咪唑)进行洗脱。洗脱液对500ml缓冲液E(50mM tris-HCl缓冲液(pH8.0)、100mM氯化钠、0.5mM EDTA、0.1％Triton X-100、1mM二硫苏糖醇)透析，再用Centricon(Amicon)浓缩约10倍。当纯化浓缩样品部分在10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳时，可以观察到目标蛋白质条带，其位置相当于分子量约为76,800。当按照所附方案，采用抗His HRP缀合物(Qiagen)，对样品进行抗His标记抗体的免疫印迹检测时，显色后可检测到目标蛋白质条带。在下文中，人切酶RNA酶III结构域蛋白被称为hDiR。
[0054]
根据上述方法，含有缓冲液D的洗脱液对缓冲液E透析。该样品命名为蛋白质样品I。也使用具有以下组成的缓冲液进行透析，以便确定蛋白质形状缓冲液(shape buffer)的条件。
1.用缓冲液F(50mM tris-HCl缓冲液(pH8.0)、100mM氯化钠、1mM氯化镁、0.1％Triton X-100、1mM二硫苏糖醇)进行透析→蛋白质样品II。
2.用缓冲液G(50mM tris-HCl缓冲液(pH8.5)、100mM氯化钠、1mM氯化镁、0.1％Triton X-100、1mM二硫苏糖醇)进行透析→蛋白质样品III。
3.用缓冲液H(50mM tris-HCl缓冲液(pH8.8)、100mM氯化钠、1mM氯化镁、0.1％Triton X-100、1mM二硫苏糖醇)进行透析→蛋白质样品IV。
[0055]
实施例2：降解dsRNA活性的测定
(1)反应混合物的制备
测定了实施例1-(2)制备的蛋白质样品I-IV的切酶活性。如下测定活性。
按照所附方案，使用TurboScript T7转录试剂盒(GTS)，合成用于活性测定的、作为底物的dsRNA。
具体地讲，通过将质粒pQBI125(Wako Pure Chemical Industries)中编码红移绿色荧光蛋白(在下文中称为GFP)的基因(SEQ ID NO：11)插入到质粒pDON-AI(Takara Bio)中，构建pDON-rsGFP。用pDON-rsGFP作为模板，使用具有T7启动子序列的合成引物3(SEQ ID NO：7)和合成引物4(SEQ ID NO：8)，进行PCR，得到扩增产物。通过RNA合成反应，使用所得的双链DNA作为模板，使用T7 RNA聚合酶，制备约700bp dsRNA。
[0056]
通过加入1μg以上制备的dsRNA、1μl以上(2)制备的hDiR、1μl10mM ATP溶液、1μl 50mM氯化镁溶液、2μl 5x反应缓冲液(用于最终透析的缓冲液的5倍浓缩物)和无核酸酶的水，制备总体积为10μl的反应混合物。
[0057]
在市售切酶(GTS)情况下，通过加入2μl切酶酶液、1μg dsRNA(作为底物)、1μl 10mM ATP溶液、0.5μl 50mM氯化镁溶液、4μl附带的反应缓冲液和无核酸酶的水，制备总体积为10μl的反应混合物。
[0058]
制备上述反应混合物并在37℃反应17小时后，将5μl各反应混合物分别在15％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，用溴化乙锭染色，观察切割产物。在电泳后用溴化乙锭染色的凝胶中，测得反应混合物中的观察到约21个核苷酸的降解产物具有活性。
[0059]
(2)活性测定
测定以上(1)中制备的反应混合物的活性，以检查其对RNA酶III结构域蛋白(hDiR)的影响。而且，使用刚经过纯化的样品或者在4℃或-20℃贮存5天的样品，来检测在缓冲液中的稳定性。结果，在4℃或-20℃中贮存的蛋白质样品III和蛋白质样品IV中都观察到了约21个核苷酸的降解产物(与用市售切酶所观察的一样大小)，证明仍然稳定保留了活性。
[0060]
根据上述结果，表明人切酶的RNA酶III结构域蛋白(hDiR)的活性可以在tris-HCl缓冲液(pH8.5以上)中、在氯化镁存在下贮存时保持稳定。
[0061]
实施例3：导致dsRNA产生和降解的因素的检测
(1)在正常温度范围内，检测具有与核酸结合活性的蛋白质，以便检测导致dsRNA产生和降解的因素。
要想得到具有与核酸结合活性的蛋白质是困难的。所以可以使用来自海栖热袍菌的CspB蛋白作为模型蛋白，其具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列。按照以下文献中介绍的方法来制备所述蛋白：ProteinScience，8：394-403(1999)。
[0062]
(2)来自海栖热袍菌的CspB对dsRNA降解的影响
加入CspB后对降解dsRNA活性的测定如下。
简而言之，当hDi-R用作酶时，通过加入1μl实施例1-(2)中制备的hDiR(酶液)、1μl以上(1)中制备的CspB溶液、1μg在实施例2-(1)中用作底物的dsRNA、1μl 10mM ATP溶液、1μl 50mM氯化镁溶液、2μl 5x反应缓冲液(250mM tris-HCl缓冲液(pH8.5)、500mM氯化钠、0.5％Triton X-100、5mM DTT)和无核酸酶的水，制备总体积为10μl的反应混合物。就市售切酶而言，通过向所附使用说明书中描述的组合物中加入1μg作为底物的dsRNA和无核酸酶的水，制备总体积为10μl的反应混合物。用来自GTS(Stratagene或Invitrogen)的酶作为市售切酶。
[0063]
加入CspB蛋白，终浓度为4.6ng/μl、9.2ng/μl、18.4ng/μl或92ng/μl。将1μl 10mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)作为CspB的形状缓冲液，加入到对照(未加入)中。
[0064]
制备上述反应混合物并在37℃反应18小时后，5μl的各反应混合物在15％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，用溴化乙锭染色，观察降解产物。此外，使用Total Lab第1.11版(Nonlinear Dynamics)，对凝胶进行图像分析，以定量测定约21个核苷酸的dsRNA降解产物。结果，用各种数量的市售切酶或RNA酶III结构域蛋白(hDiR)，都观察到因添加CspB而造成的降解dsRNA量的增加。具体地讲，在9.2ng/μl的浓度上下观察到降解增加。
[0065]
由此表明，可以通过将CspB加入到反应混合物中，使用任何市售切酶和RNA酶III结构域蛋白，来得到更多dsRNA降解产物。
[0066]
(3)来自海栖热袍菌的CspB对于RNA合成的影响
在RNA干扰中，提高RNA合成系统活性以合成dsRNA，也是重要的。根据这一观点，测定来自海栖热袍菌的CspB对RNA合成的影响。选择T7 RNA聚合酶系统，作为模型系统。如下测定对RNA合成系统的影响。简而言之，用T7 RNA聚合酶并加入CspB所得到的转录物的数量作为指标。通过将具有SEQ ID NO：11核苷酸序列的rsGFP基因掺入到具有T7启动子的pET16b(Novagen)中，构建质粒；其中pET16b是按照常规方法制备的。通过加入1μg构建质粒(作为模板DNA)、2μl 10x T7 RNA聚合酶缓冲液(Takara Bio)、2μl 50mMDTT、0.4μl RNA酶抑制剂(Takara Bio)、2μl 25mM NTP、1μl T7 RNA聚合酶(Takara Bio)、1μl CspB溶液和无核酸酶的水，制备总体积为20μl的反应混合物。该反应混合物在37℃反应4小时。在该实施例中，加入CspB蛋白，终浓度为90ng/μl、180ng/μl、460ng/μl或920ng/μl。将1μl 10mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)作为CspB的形状缓冲液，加入到对照(未加入)中。
将2μl 10x MOPS缓冲液(200mM、50mM乙酸钠、10mM EDTA、10mM EGTA)、2μl甲醛、9μl去离子甲酰胺和3μl无核酸酶的水加入到2μl反应样品中。将所得混合物于70℃保温10分钟，然后在冰上放置1分钟。向其中加入2μl 10x加样缓冲液，使用含有溴化乙锭的1.25％琼脂糖凝胶，在1x MOPS缓冲液中，对所得混合物进行电泳分析。使用Total Lab第1.11版(Nonlinear Dynamics)，对凝胶进行图像分析，以定量测定用T7 RNA聚合酶合成的mRNA。结果，对于各浓度都观察到转录物量的增加。具体地讲，证实了在加入CspB为460ng/μl或更高浓度的情况下，转录物量是未加入情况下的约2倍以上；在加入CspB为920ng/μl的情况下其量达到大约3倍。
[0067]
(4)来自海栖热袍菌的CspB对于dsRNA合成的影响
测定来自海栖热袍菌的CspB对dsRNA合成的影响。在该实施例中使用了实施例2-(1)中制备的用于dsRNA合成的模板。使用市售产物TurboScript T7转录试剂盒(Gene Therapy Systems)，按照所附的方案，转录成RNA。加入CspB蛋白，终浓度为90ng/μl、180ng/μl、460ng/μl或920ng/μl。将1μl 10mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)作为CspB的形状缓冲液，加入到对照(未加入)中。在37℃反应4小时后，向其中加入1μl DNA酶I，再在37℃继续反应15分钟。让1μl 40倍稀释的反应混合物在含有溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶上进行电泳。按照以上(3)中介绍的方法，用T7 RNA聚合酶，对凝胶定量测定dsRNA合成。结果，对于各浓度都观察到转录物量的增加。具体地讲，证实了在加入CspB为920ng/μl或更高浓度的情况下，转录物量是未加入情况下的约2倍以上。
[0068]
按照与上述实施例类似的方法，也测定了T7 RNA聚合酶转录系统的另一个实施方案。具体地讲，通过加入1μg实施例2-(1)中制备的用于dsRNA合成的模板、1μl 10x T7 RNA聚合酶缓冲液(TakaraBio)、1μl 50mM DTT、0.2μl RNA酶抑制剂(Takara Bio)、1μl 25mMNTP、0.5μl T7 RNA聚合酶(Takara Bio)、1μl CspB溶液和无核酸酶的水，制备总体积为10μl的反应混合物。该反应混合物在37℃反应4小时。加入CspB蛋白，终浓度为90ng/μl、180ng/μl、460ng/μl或920ng/μl。将1μl 10mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)作为CspB的形状缓冲液，加入到对照(未加入)中。反应后，向样品中加入0.5μl DNA酶I(Takara Bio)，再在37℃继续反应15分钟。让1μl 40倍稀释的反应混合物在含有溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶上进行电泳。对凝胶也定量测定dsRNA。结果，对于各浓度都观察到转录物量的增加。具体地讲，证实了在加入CspB为920ng/μl或更高浓度的情况下，转录物量是未加入情况下的约3倍以上。
[0069]
如上所述，显示出通过将CspB加入到反应混合物中，使得用T7RNA聚合酶能得到更多的转录物量。对于单链RNA和双链RNA的合成都观察到该结果。
[0070]
实施例4：人切酶的PAZ+RNA酶III结构域的表达
(1)表达载体的构建
为了表达由SEQ ID NO：1所示的人切酶氨基酸序列的N端部分的氨基酸679至氨基酸1924(核苷酸2035至核苷酸5772)构成的多肽，如下构建表达载体。
首先，根据公众可用的GenBank检索号AB028449的核苷酸序列，使用DNA合成仪，合成合成引物5和6(SEQ ID NO：14和15)，并用常规方法进行纯化。合成引物5是合成DNA，所述DNA在核苷酸9至核苷酸14间具有限制酶KpnI的识别序列，而且在核苷酸16至核苷酸36间具有对应于人切酶氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的氨基酸679至氨基酸685的核苷酸序列。合成引物6在核苷酸9至核苷酸14间具有限制酶HindIII的识别序列，而且在核苷酸18至核苷酸35间具有对应于人切酶氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的氨基酸1919至氨基酸1924的核苷酸序列。
[0071]
使用合成引物进行PCR。PCR的反应条件如下。
简而言之，加入2μl模板DNA(人cDNA文库，人胰腺，TakaraBio)、5μl 10x LA PCR缓冲液(Takara Bio)、5μl dNTP(Takara Bio)、10pmol合成引物5、10pmol合成引物6、0.5U Takara LA Taq(TakaraBio)和无菌水，制备总体积为50μl的反应混合物。将反应混合物放置在TaKaRa PCR Thermal Cycler SP(Takara Bio)中，进行如下反应：94℃1分钟、55℃1分钟和72℃3分钟，进行30个循环。
[0072]
反应后，5μl反应混合物在1.0％琼脂糖凝胶上进行电泳。回收所观察到的约2.7kbp的目标DNA片段，从电泳凝胶上纯化，然后进行乙醇沉淀。乙醇沉淀后，将回收的DNA悬浮在5μl无菌水中，用限制酶KpnI(Takara Bio)和HindIII(Takara Bio)双重消化。提取KpnI-HindIII消化物，在1.0％琼脂糖凝胶上电泳后进行纯化，得到KpnI-HindIII消化的DNA片段。
[0073]
然后，采用与制备KpnI-HindIII消化的DNA片段相同的限制酶，切割实施例1-(1)制备的载体pCold08NC2，并且在末端脱磷酸化。将如此制备的载体和KpnI-HindIII消化的DNA片段混合在一起，用DNA连接试剂盒(Takara Bio)将其彼此连接。用20μl连接混合物转化大肠杆菌JM109。让转化子在含有浓度为1.5％(w/v)琼脂的LB培养基(含50μg/ml氨苄青霉素)上生长。
[0074]
测序证实具有目标DNA插入片段的质粒。该重组质粒命名为pCold08 hDi-ASI。该质粒命名为pCold08 hDi-ASI并且自2003年9月26日(原始保藏日)保藏于国际专利生物材料保藏单位——独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，日本国茨城县筑波市东1丁目1番1中央第6，邮政编码305-8566(International PatentOrganism Depositary，National Institute of Advanced Industrial Scienceand Technology，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，Japan)，保藏号为FERM BP-10076。pCold08 hDi-ASI是含有这样的核苷酸序列的质粒：其编码人切酶氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的氨基酸679至氨基酸1924的氨基酸序列(SEQ ID NO：16的核苷酸序列，SEQ ID NO：17的氨基酸序列)。该质粒表达的蛋白质具有Perfect DB序列、His标记序列和因子Xa序列。所述蛋白质的氨基酸序列示于SEQ ID NO：18，其核苷酸序列示于SEQ ID NO：19。
[0075]
(2)表达与纯化
使用以上(1)中制备的pCold08 hDi-ASI，转化大肠杆菌BL21-CodonPlus-RIL菌株(Stratagene)。让转化子在含有浓度为1.5％(w/v)琼脂的LB培养基(含50μg/ml氨苄青霉素)上生长。将生长菌落接种到2.5ml LB液体培养基(含50μg/ml氨苄青霉素)中，37℃培养过夜。将部分培养物接种到100ml LB培养基中，在37℃培养至对数生长期。培养后，将培养物在15℃培养箱中振荡培养10分钟，向其中加入IPTG，终浓度为1.0mM，在15℃继续培养24小时，用于诱导表达。离心收集细胞，重悬于5ml细胞破碎液(50mM tris-HCl缓冲液(pH8.5)、100mM氯化钠、1mM氯化镁、0.1％Triton X-100、1mM二硫苏糖醇、1mM苯甲基磺酰氟)中。对超声破碎的细胞进行离心(11,000rpm，20分钟)，使上清提取液与沉淀分离。
[0076]
约5ml上清提取液用镍柱如下进一步纯化。
加入10ml缓冲液A(20mM tris-HCl缓冲液(pH8.5)、100mM氯化钠、1mM二硫苏糖醇、1mM氯化镁、0.1％Triton X-100)，与相当于1ml体积树脂的Ni-NTA琼脂糖(Qiagen)混合在一起。混合物以1,500rpm离心几分钟。弃去上清液，收集约1ml树脂。将从破碎细胞中制备的约5ml上清液加入到树脂中，用旋转式摇床在4℃轻轻混合约1小时。然后，将已经吸附目标蛋白质的树脂装填在15mm柱中，用5ml缓冲液A洗涤2次。树脂再用5ml缓冲液B(20mM tris-HCl缓冲液(pH8.5)、100mM氯化钠、1mM氯化镁、1mM二硫苏糖醇、0.1％Triton X-100、40mM咪唑)洗涤。树脂用5ml缓冲液C(20mMtris-HCl缓冲液(pH8.5)、800mM氯化钠、1mM氯化镁、1mM二硫苏糖醇、0.1％Triton X-100、40mM咪唑)进一步洗涤，接着再用5ml缓冲液B洗涤，以除去除目标蛋白质外的不必要蛋白。
[0077]
洗涤后，用3ml缓冲液D(20mM tris-HCl缓冲液(pH8.5)、100mM氯化钠、1mM氯化镁、1mM二硫苏糖醇、0.1％Triton X-100、100mM咪唑)进行洗脱。洗脱液对500ml缓冲液E(50mM tris-HCl缓冲液(pH8.5)、100mM氯化钠、1mM氯化镁、0.1％Triton X-100、1mM二硫苏糖醇)透析，再用Centricon(Amicon)浓缩约10倍。当浓缩物部分在10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳时，对于使用大肠杆菌BL21-CodonPlus-RIL菌株(Stratagene)作为宿主所得到的样品来说，可以观察到目标蛋白质条带的位置相当于分子量约为144,000。该样品随后用于活性证实。在下文中，人切酶PAZ+RNA酶III结构域蛋白被称为hDi-ASI。
[0078]
(3)降解dsRNA活性的测定
按照实施例2中描述的方法，测定以上实施例4-(2)制备的蛋白质样品降解dsRNA的活性。
结果，在电泳后用溴化乙锭染色的凝胶中，观察到约21个核苷酸的降解产物。因此，观察到RNA酶III结构域蛋白(hDiR)和含有PAZ区的蛋白质(hDi-ASI)降解dsRNA的活性。
[0079]
此外，让蛋白质样品在-80℃冷冻并在室温下融化达6个或10个循环，以便检测冻融稳定性。作为对照，按照类似方式，检测实施例1-(2)中制备的hDiR。
结果，PAZ+RNA酶III结构域蛋白(hDi-ASI)在6个或10个冻融循环后都保持降解活性。另一方面，最多6个冻融循环后，仍能观察到hDiR的活性。根据这些结果证明，通过除了RNA酶III结构域外还包含PAZ结构域，所述蛋白质获得了更高的冻融稳定性。
[0080]
(4)对影响降解的因素的检测
检测了具有与核酸结合活性的蛋白质在正常温度范围内对实施例4-(2)中制备的hDi-ASI的影响。
使用实施例3中制备的来自海栖热袍菌的CspB蛋白，作为具有与核酸结合活性的蛋白质。如下测定对dsRNA降解的影响。
简而言之，通过加入1μl实施例4-(2)中制备的hDi-ASI(酶液)、1μl实施例3中制备的CspB溶液、1μg用作底物的dsRNA、1μl 10mMATP溶液、1μl 50mM氯化镁溶液、2μl 5x反应缓冲液(250mM tris-HCl缓冲液(pH8.5)、750mM氯化钠、0.5％Triton X-100、5mM DTT)和无核酸酶的水，制备总体积为10μl的反应混合物。加入CspB蛋白，终浓度为9.2ng/μl、18.4ng/μl或92ng/μl。将1μl 10mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)作为CspB的形状缓冲液，加入到对照(未加入)中。
制备上述反应混合物并在37℃反应17小时后，5μl的各反应混合物进行15％聚丙烯酰胺凝胶电泳，用溴化乙锭染色，观察切割产物。此外，使用Total Lab第1.11版(Nonlinear Dynamics)，对凝胶进行图像分析，以定量测定约21个核苷酸的dsRNA降解产物。
结果，在hDi-ASI的情况下，也观察到因添加CspB而造成的降解dsRNA量的增加。具体地讲，在9.2ng/μl的浓度上下观察到降解增加。
[0081]
因此证明，CspB提高了含有RNA酶III结构域的人切酶(包括天然形式和突变形式)的dsRNA降解活性。
[0082]
实施例5
检测了用本发明的人源hDiR制备的siRNA的RNA干扰效应。采用市售切酶(GTS)作为对照。基本上根据实施例2-(1)中描述的方法，制备dsRNA降解产物。具体地讲，使用10单位的实施例1-(2)中描述的hDiR或市售切酶，将10μg dsRNA在37℃切割18小时。切割产物用RNA纯化柱1、2(Gene Therapy Systems)进行纯化，并用于以下的dsRNA干扰评价。
[0083]
简而言之，在转移siRNA之前24小时，将适量(5×104个细胞)的293细胞接种到含有D-MEM培养基(SIGMA)并补充了10％FBS和1％青霉素/链霉素的24孔板上，在CO2培养箱中培养过夜。将细胞培养至约80％汇合。将3μl TransIT 293转染试剂(Takara Bio)加入到50μl无血清培养基中。将混合物剧烈搅拌，再让其在室温下静置5分钟。向其中加入0.3μg pQBI25(Wako Pure Chemical Industries)，将所得混合物轻轻混和并让其在室温下静置5分钟。向其中加入4μlTransIT-TKO试剂，将所得混合物轻轻混和并让其在室温下静置5分钟。向其中加入500ng siRNA，将所得混合物轻轻混和并让其在室温下静置5分钟，得到DNA/siRNA溶液。将该DNA/siRNA溶液滴加到每孔250μl补充了10％FBS的D-MEM培养基中，将所得混合物轻轻混合，使各孔溶液变得均匀。将0.3μg pQBI25(Wako PureChemical Industries)或无菌水单独加入到对照中。将细胞在CO2培养箱中培养24小时。用FACS Vantage(Becton-Dickinson)对细胞进行流式细胞术分析，以测定与仅用载体(DNA)的对照相比，转移的DNA/siRNA溶液对GFP表达的抑制效果。结果见表1。
[0084]
表1
| 转移样品 | 平均荧光强度 |
| 对照(未加入）对照(仅有载体)hDiR市售切酶 | 8.091331.4414.9271.57 |
[0085]
如表1所示，与对照(仅有载体)相比，平均荧光强度值越小，表明RNA干扰越大。这表明，用hDiR所得到的siRNA表现出RNA干扰效应，与用市售切酶所得到的类似，所表现的RNA干扰效应比用市售切酶所得到的更强。
根据以上结果，证实本发明的hDiR可用于制备用于RNA干扰的siRNA。
[0086]
实施例6
测定了用本发明hDiR所制备的不同量的siRNA的RNA干扰效应。用市售切酶(Gene Therapy Systems)作为对照。基本上按照实施例2-(1)中描述的方法，进行dsRNA的切割。具体地讲，用10μl实施例1-(2)中描述的hDiR或市售切酶，将10μg dsRNA在37℃切割18小时。加入用于实施例3-(2)的CspB，终浓度为9.2ng/μl，进行反应。
切割产物用RNA纯化柱1、2(Gene Therapy Systems)进行纯化，并用于以下的dsRNA干扰评价。
[0087]
简而言之，在转移siRNA之前24小时，将适量(1.5×105个细胞)的293细胞接种到含有D-MEM培养基(SIGMA)并补充了10％FBS和1％青霉素/链霉素的24孔板上，在CO2培养箱中培养过夜。将细胞培养至约95％汇合。将1μl Genejuice转染试剂(Takara Bio)加入到49μl无血清培养基中。将混合物剧烈搅拌，再让其在室温下静置5分钟。向其中加入0.3μg pQBI25(Wako Pure Chemical Industries)，将所得混合物轻轻混和并让其在室温下静置5分钟。
与此平行的是，在另一试管中，将3μl Ribojuice转染试剂(TakaraBio)加入到47μl无血清培养基中，将所得混合物剧烈搅拌。让其在室温下静置5分钟后，向其中加入166.7ng、55.6ng或18.5ng siRNA，将所得混合物轻轻混和并让其在室温下静置5分钟。
将如上制备的两种溶液之一滴加到每孔250μl补充了10％FBS的D-MEM培养基中，将所得混合物轻轻混合，使各孔溶液变得均匀。将载体(DNA)或无菌水单独加入到对照中。将细胞在CO2培养箱中培养24小时。用FACS Vantage(Becton-Dickinson)对细胞进行流式细胞术分析，以测定与仅用载体(DNA)的对照相比，转移的DNA/siRNA溶液对rsGFP表达的抑制效果。结果见表2。
[0088]
表2
| 转移样品 | 平均荧光强度(相对值) |
| 对照(未加入)对照(仅有载体)hDiR 166.7nghDiR 55.6nghDiR 18.5ng市售切酶 166.7ng市售切酶 55.6ng市售切酶 18.5ng | 010018.2118.9732.6717.7419.8032.34 |
[0089]
如表2所示，与对照(仅有载体)相比，平均荧光强度值越小，表明RNA干扰越大。这表明，用hDiR所得到的siRNA表现出RNA干扰效应，与用市售切酶所得到的类似。
根据以上结果，证实本发明的hDiR可用于制备用于RNA干扰的siRNA。
[0090]
从细胞样品中提取的总RNA进行实时RT-PCR，以定量测定rsGFP的mRNA，用于评价RNA干扰。
[0091]
具体地讲，按照所附方案，使用三唑(Invitrogen)，在转移siRNA后，从在37℃/CO2培养箱中培养24小时的细胞中，提取总RNA并纯化。通过加入80ng总RNA、4μl 5x M-MLV缓冲液(Takara Bio)、1μl10mM dNTP(Takara Bio)、100pmol随机六聚体、20单位RNA酶抑制剂(Takara Bio)、100U M-MLV逆转录酶和无菌水，制备总体积为20μl的反应混合物。将反应混合物放置在TaKaRa PCR ThermalCycler SP(Takara Bio)中，在42℃反应10分钟，然后在95℃反应2分钟。向反应混合物中加入20μl反应稀释液(1x M-MLV缓冲液，0.5mM dNTP混合物)。将所得混合物的10μl等分试样分装。将2.5μl 10x R-PCR缓冲液(Takara Bio)、0.3μl 250mM Mg2+、0.75μl 10mM dNTP、1.25U Takara Ex Taq R-PCR(Takara Bio)、2.5μl 3000倍稀释的SYBRGreen(Takara Bio)的无菌水和1.25μl 100％DMSO加入到10μl反应混合物中。再加入用于检测β-肌动蛋白(Takara Bio)、GAPDH(TakaraBio)、rsGFP(rsGFP-F(SEQ ID NO：20)、rsGFP-R(SEQ ID NO：21)或Neo(Neo-F(SEQ ID NO：22)、Neo-R(SEQ ID NO：23))的5pmol各合成引物和无菌水至总体积为25μl。将反应混合物放置在Smart Cycler IIUnit(Takara Bio)中，在95℃加热变性10秒钟，再进行以下反应：95℃5秒和60℃20秒，进行45个循环。所得数据用于分析，以定量测定来自转移质粒的人β-肌动蛋白和GAPDH以及rsGFP和Neo的mRNA。结果见表3。
[0092]
表3
| 转移样品 | rsGFP mRNA的量(相对值) |
| 对照(未加入)对照(仅有载体)hDiR 166.7nghDiR 55.6nghDiR 18.5ng市售切酶 166.7ng市售切酶 55.6ng市售切酶 18.5ng | 010015.9222.7230.6114.7730.9135.84 |
[0093]
如表3所示，与对照(仅有载体)相比，rsGFP mRNA值越小，表明RNA干扰越大。这表明，用hDiR所导致的RNA干扰效应，与用市售切酶所得到的类似。
根据以上结果，证实本发明的hDiR可用于制备用于RNA干扰的siRNA。
[0094]
实施例7
用dsRNA作为底物，评价实施例1-(2)和实施例4-(2)中制备的样品，以测定它们的dsRNA降解活性，其由萤光素酶基因制备。按照与实施例2-(1)类似的方式，按照所附方案，使用TurboScript T7转录试剂盒(GTS)合成dsRNA。
[0095]
具体地讲，使用质粒pGL3-Basic载体(Promega)作为模板并使用具有T7启动子序列的引物dsl-1(SEQ ID NO：24)和引物dsl-2(SEQID NO：25)，进行PCR，得到插入到质粒pGL3-Basic载体(Promega)中的萤光素酶编码基因，为约500个碱基对的扩增产物。通过RNA合成反应，使用所得的双链DNA作为模板，使用T7 RNA聚合酶，制备约500bp dsRNA。
[0096]
测定了用本发明hDiR或hDi-ASI所制备的siRNA的RNA干扰效应。用市售切酶(Gene Therapy Systems)作为对照。基本上按照实施例2-(1)中描述的方法，进行dsRNA切割。具体地讲，用10μl实施例1-(2)中描述的hDiR、实施例4-(2)中描述的hDi-ASI或市售切酶，将10μg dsRNA在37℃切割18小时。加入用于实施例3-(2)的CspB，终浓度为9.2ng/μl，进行反应。
切割产物用RNA纯化柱1、2(Gene Therapy Systems)进行纯化，并用于以下的dsRNA干扰评价。
[0097]
简而言之，在转移siRNA之前24小时，将适量(1.5×105个细胞)的293细胞接种到含有D-MEM培养基(SIGMA)并补充了10％FBS和1％青霉素/链霉素的24孔板上，在CO2培养箱中培养过夜。将细胞培养至约95％汇合。将1μl Genejuice转染试剂(Takara Bio)加入到49μl无血清培养基中。将混合物剧烈搅拌，再让其在室温下静置5分钟。向其中加入0.5μg pGL3-对照和0.1μg pRL-TK(Promega)，将所得混合物轻轻混和并让其在室温下静置5分钟。
与此平行的是，在另一试管中，将3μl Ribojuice转染试剂(TakaraBio)加入到47μl无血清培养基中，将所得混合物剧烈搅拌。让其在室温下静置5分钟后，向其中加入166.7ng、55.6ng或18.5ng siRNA，将所得混合物轻轻混和并让其在室温下静置5分钟。
将如上制备的两种溶液之一滴加到每孔250μl补充了10％FBS的D-MEM培养基中，将所得混合物轻轻混合，使各孔溶液变得均匀。将载体(DNA)或无菌水单独加入到对照中。将细胞在CO2培养箱中培养24小时。用双重萤光素酶报道基因测定试剂盒(Dual LuciferaseReporter assay kit)(Promega)对细胞进行测定，以确定与仅用载体(DNA)的对照相比，加入的siRNA对GL3蛋白表达的抑制效果。结果见表4。
[0098]
表4
| 转移siRNA样品 | GL3表达水平(相对值) |
| 对照(未加入)对照(仅有载体)hDiR 166.7nghDiR 55.6nghDiR 18.5nghDi-ASI 166.7nghDi-ASI 55.6nghDi-ASI 18.5ng市售切酶 166.7ng市售切酶 55.6ng市售切酶 18.5ng | 010025.7038.9074.5125.8725.0031.0925.1130.1555.41 |
[0099]
如表4所示，与对照(仅有载体)相比，GL3表达水平越低，表明RNA干扰越大。这表明，用hDiR或hDi-ASI所得到的siRNA表现出RNA干扰效应，与用市售切酶所得到的类似。
根据以上结果，证实本发明的hDiR和hDi-ASI可用于制备用于RNA干扰的siRNA。
[0100]
实施例8
测定了加入或不加入CspB时用本发明hDiR或hDi-ASI所制备的siRNA的RNA干扰效应。其过程按照实施例7中描述的方法，使用萤光素酶。用市售切酶(Gene Therapy Systems)作为对照。基本上按照实施例2-(1)中描述制备的方法，进行dsRNA的切割。具体地讲，用10μl实施例1-(2)中描述的hDiR、实施例4-(2)中描述制备的hDi-ASI或市售切酶，将10μg dsRNA在37℃切割18小时。反应进行中加入或不加入终浓度为9.2ng/μl的用于实施例3-(2)的CspB。
切割产物用RNA纯化柱1、2(Gene Therapy Systems)进行纯化，并用于以下的dsRNA干扰评价。
[0101]
表5
| 转移siRNA样品 | GL3表达水平(相对值) |
| 对照(未加入)对照(仅有载体)hDiR 55.6ng+CspBhDiR 55.6nghDi-ASI 55.6ng+CspBhDi-ASI 55.6ng市售切酶 55.6ng+CspB市售切酶 55.6ng | 01009.6616.4014.3113.1910.4012.07 |
[0102]
如表5所示，与对照(仅有载体)相比，GL3表达水平越低，表明RNA干扰越大。这表明，样品中加入或不加入CspB，对RNA干扰效应没有差异。
根据以上结果，证实在siRNA制备时，本发明的CspB并不影响siRNA对RNA干扰的性质。
[0103]
实施例9：酶的稳定性
将实施例4-(2)中纯化的PAZ结构域+RNA酶III结构域蛋白(hDi-ASI)在贮存缓冲液I(50mM tris-HCl缓冲液(pH8.5)、250mM氯化钠、1mM氯化镁、1mM DTT、0.1％Triton X-100、50％甘油)中贮存，其中添加终浓度为92ng/μl的CspB。按以下方法定时取样并测定其dsRNA降解活性。通过加入1μg实施例2-(1)中制备的dsRNA、1μl以上4-(2)制备的蛋白质样品、2μl5x反应缓冲液(100mM tris-HCl缓冲液(pH8.5)、750mM氯化钠、12.5mM氯化镁)和无核酸酶的水，制备总体积为10μl的反应混合物。该反应混合物在37℃反应18小时后，将5μl反应混合物在15％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，用溴化乙锭染色，观察切割产物。结果，在贮存6个月或更长时间的样品中，观察到约21个碱基对的降解产物，表明其dsRNA降解活性。贮存在加有CspB的同样缓冲液中的RNA酶III结构域蛋白(hDiR)保持活性达3个月或更长时间。
[0104]
实施例10：pCold14-TmCspB的构建、重组体培养和纯化
(1)pCold14-TmCspB的构建
参考以下文献中介绍的步骤，将来自海栖热袍菌的CspB(在下文中称为TmCspB)进行克隆：Protein Science，8：394-403(1999)。氨基酸序列和核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10。
首先，使用DNA合成仪，合成合成引物E和F(SEQ ID NO：26和27)，并用常规方法进行纯化。合成引物E是合成DNA，所述DNA在核苷酸11至核苷酸16间具有限制酶NdeI的识别序列，而且在核苷酸14至核苷酸34间具有对应于TmCspB氨基酸序列的氨基酸1至氨基酸7的核苷酸序列(SEQ ID NO：26)。合成引物F是合成DNA，所述DNA在核苷酸11至核苷酸16间具有限制酶BamHI的识别序列，而且在核苷酸20至核苷酸37间具有对应于TmCspB氨基酸序列的氨基酸61至氨基酸66的核苷酸序列(SEQ ID NO：26)。
[0105]
使用合成引物进行PCR。PCR的反应条件如下。
简而言之，加入1μl(50ng)实施例3-(1)描述的模板DNA、5μl 10xEx Taq缓冲液(Takara Bio)、5μl dNTP(Takara Bio)、10pmol合成引物E、10pmol合成引物F、0.5U Takara Ex Taq(Takara Bio)和无菌水，制备总体积为50μl的反应混合物。将反应混合物放置在TaKaRa PCRThermal Cycler SP(Takara Bio)中，进行如下反应：94℃1分钟、55℃1分钟和72℃1分钟，进行30个循环。
反应后，将5μl反应混合物在3.0％琼脂糖凝胶上进行电泳，观察到约220bp的目标DNA片段。将剩余PCR反应混合物进行电泳，回收片段，纯化，然后进行乙醇沉淀。乙醇沉淀后，将回收的DNA悬浮在5μl无菌水中，用限制酶NdeI(Takara Bio)和BamHI(Takara Bio)双重消化。提取NdeI-BamHI消化物，在3.0％琼脂糖凝胶上进行电泳纯化，得到NdeI-BamHI消化的DNA片段。
[0106]
然后，按照WO 99/27117实施例1-6中描述的方法，制备载体pCold04NC2(在下文中，载体pCold04NC2被称为载体pCold14)。
[0107]
采用与制备上述DNA片段相同的限制酶，切割载体pCold14，并且在末端脱磷酸化。将如此制备的载体和NdeI-BamHI消化的DNA片段混合在一起，用DNA连接试剂盒(Takara Bio)将其彼此连接。用20μl连接混合物转化大肠杆菌JM109。让转化子在含有浓度为1.5％(w/v)琼脂的LB培养基(含50μg/ml氨苄青霉素)上生长。
具有目标DNA插入片段的质粒经测序证实。
[0108]
(2)在5L罐中进行培养并纯化CspB
使用以上实施例10-(1)中制备的pCold14-TmCspB，转化大肠杆菌BL21。让转化子在含有浓度为1.5％(w/v)琼脂的LB培养基(含50μg/ml氨苄青霉素)上生长。将生长菌落接种到30ml LB液体培养基(0.3g细菌用胰蛋白胨、0.15g细菌用酵母抽提物、0.15gNaCl、1.5mg氨苄青霉素)中，37℃培养过夜。将30ml培养物接种到装有3L LB液体培养基(30g细菌用胰蛋白胨、15g细菌用酵母抽提物、15g NaCl、150mg氨苄青霉素)的5L小型发酵罐(Able)中，在37℃/150rpm/通气量为0.5L/分钟下，培养至对数生长期。然后，将培养物冷却至15℃。冷却后，向其中加入IPTG，终浓度为1.0mM，在15℃/150rpm/通气量为0.5L/分钟下继续培养24小时，用于诱导表达。离心收集细胞，得到11g湿细胞。将湿细胞(11g)重悬于44ml缓冲液A(20mM tris-HCl缓冲液(pH8.0))中。对超声破碎的细胞进行离心(11,000rpm，20分钟)，使上清提取液与沉淀分离。将上清提取液再进行超速离心(70,000xg，20分钟)，上清提取液与沉淀分离。
[0109]
约53ml上清提取液在水浴(70℃，10分钟)中加热，离心(10,000xg，20分钟)，使上清液与沉淀分离。向加热上清液中加入NaCl，终浓度为200mM。将10ml阴离子交换树脂DE52用缓冲液B(20mMtris-HCl缓冲液(pH8.0)、200mM氯化钠)平衡后，将其加入。将所得混合物在4℃轻轻搅拌过夜。将混合物离心(3,000xg，20分钟)，使上清液与沉淀分离。该上清液经过玻璃滤器过滤。将45ml滤液对3L缓冲液A(20mM tris-HCl缓冲液(pH8.0))透析。
[0110]
将50ml透析液加入到装填在20mm柱中的相当于100ml树脂体积的Q-琼脂糖凝胶F.F(Amersham Biosciences)中。用400ml缓冲液A(20mM tris-HCl缓冲液(pH8.0))洗涤该柱。将未吸附到柱上的流分收集起来，通过UF 30,000-cut Centriprep YM-30(Millipore)。将260ml通过UF的溶液加入到装填在30mm柱中的40ml肝素琼脂糖凝胶CL-6B(Amersham Biosciences)中。用160ml缓冲液A(20mMtris-HCl缓冲液(pH8.0))洗涤该柱。目标蛋白质用0→1M氯化钠/200ml缓冲液A(20mM tris-HCl缓冲液(pH 8.0))梯度洗脱。当进行N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳时，将观察到的具有分子量约7,500的目标蛋白质的流分收集起来，对3L缓冲液A(20mMtris-HCl缓冲液(pH8.0))透析。将65ml透析液用UF 30,00-cut CentriprepYM-3(Millipore)浓缩约144倍，得到约450μl蛋白质样品。将等量甘油加入到蛋白质样品中，得到850μl 50％(w/w)甘油溶液。将该溶液的一部分进行N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，在相当于分子量约7,500处观察到目标蛋白质的单一染色条带。
[0111]
(3)CspB蛋白增加切割活性
使用实施例1-(2)和实施例4-(2)中制备的蛋白质样品，检测具有与核酸结合活性的蛋白质(CspB)的影响。在这种情况下，使用实施例10-(2)中制备的TmCspB。
具体地讲，通过加入1μl实施例1-(2)或实施例4-(2)中制备的蛋白质样品(hDi-R酶液或hDi-ASI酶液）、1μl实施例10-(2)中制备的CspB溶液(92ng/μl)、1μg实施例2-(1)中制备的dsRNA(作为底物)、2μl 5x反应缓冲液(100mM tris-HCl缓冲液(pH8.5)、750mM氯化钠、12.5mM氯化镁)和无核酸酶的水，制备总体积为10μl的反应混合物。CspB蛋白的终浓度为9.2ng/μl。用市售切酶作为对照进行类似过程。就市售切酶(GTS)而言，通过加入2μl酶液、1μl CspB溶液、1μg作为底物的dsRNA、1μl 10mM ATP溶液、0.5μl 50mM氯化镁溶液、4μl所附反应缓冲液和无核酸酶的水，制备总体积为10μl的反应混合物。加入1μl无核酸酶的水替代TmCspB，作为阴性对照。
制备上述反应混合物并在37℃反应18小时后，将5μl各反应混合物分别在15％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，用溴化乙锭染色，观察切割产物。使用Total Lab第1.11版(Nonlinear Dynamics)，对凝胶进行图像分析，以定量测定约21个核苷酸的dsRNA降解产物。
结果，用实施例3-(1)中表达和纯化的TmCspB观察到降解dsRNA量的增加，用实施例10-(2)中表达和纯化的TmCspB也观察到。
[0112]
实施例11：在30L罐中进行培养并纯化hDi-ASI
(1)表达与纯化
用实施例4-(1)中制备的pCold08 hDi-ASI转化大肠杆菌BL21。让转化子在含有浓度为1.5％(w/v)琼脂的LB培养基(含50μg/ml氨苄青霉素)上生长。将生长菌落接种到200ml TB液体培养基(2.4g细菌用胰蛋白胨、4.8g细菌用酵母抽提物、0.8ml甘油、17mM KH2PO4、72mM K2HPO4、10mg氨苄青霉素)中，37℃培养过夜。将200ml培养物接种到20L TB液体培养基(240g细菌用胰蛋白胨、480g细菌用酵母抽提物、80ml甘油、17mM KH2PO4、72mM K2HPO4、1g氨苄青霉素)的30L小型发酵罐(B.E.Marubishi)中，在37℃/100rpm/通气量为6L/分钟下，培养至对数生长期。然后，将培养物冷却至15℃。冷却后，向其中加入IPTG，终浓度为1.0mM，在15℃/100rpm/通气量为6L/分钟下继续培养24小时，用于诱导表达。离心收集细胞，得到26g湿细胞。将部分湿细胞(12g)重悬于48ml细胞破碎液(50mMtris-HCl缓冲液(pH8.5)、100mM氯化钠、1mM氯化镁、蛋白酶抑制剂(完全，无EDTA，Boehringer Mannheim))中。对超声破碎的细胞进行离心(12,000rpm，30分钟)，使上清提取液与沉淀分离。
约56ml上清提取液用镍柱如下进一步纯化。
[0113]
将50ml细胞破碎液加入到相当于16ml体积树脂的Ni-NTA琼脂糖(Qiagen)中并进行混合。混合物以1,500rpm离心几分钟。弃去上清液。该步骤重复两次，收集约8ml树脂。将从破碎细胞中制备的约56ml上清液加入到树脂中，用旋转式摇床在4℃轻轻混合约1小时。然后，将已经吸附目标蛋白质的树脂装填在20mm柱中，用40ml细胞破碎液(50mM tris-HCl缓冲液(pH8.5)、100mM氯化钠、1mM氯化镁、蛋白酶抑制剂(完全，无EDTA，Boehringer Mannheim))洗涤。然后树脂依次用40ml缓冲液A(20mM tris-HCl缓冲液(pH8.5)、100mM氯化钠、1mM氯化镁、10％甘油、20mM咪唑)、40ml缓冲液B(20mM tris-HCl缓冲液(pH8.5)、800mM氯化钠、1mM氯化镁、10％甘油、20mM咪唑)和40ml缓冲液A洗涤，以除去除目标蛋白质外的不必要蛋白。
洗涤后，用24ml缓冲液C(20mM tris-HCl缓冲液(pH8.5)、100mM氯化钠、1mM氯化镁、10％甘油、100mM咪唑)进行洗脱。洗脱液对300ml缓冲液D(20mM tris-HCl缓冲液(pH8.5)、100mM氯化钠、1mM氯化镁、10％甘油)透析。
[0114]
将透析后的酶液加入到1ml装填在10mm柱中的肝素琼脂糖凝胶CL-6B(Amersham Biosciences)中。用5ml缓冲液D(20mM tris-HCl缓冲液(pH8.5)、100mM氯化钠、1mM氯化镁、10％甘油)洗涤该柱。蛋白用5ml缓冲液E(20mM tris-HCl缓冲液(pH8.5)、200mM氯化钠、1mM氯化镁、10％甘油)、5ml缓冲液F(20mM tris-HCl缓冲液(pH8.5)、400mM氯化钠、1mM氯化镁、10％甘油)和5ml缓冲液G(20mMtris-HCl缓冲液(pH8.5)、800mM氯化钠、1mM氯化镁、10％甘油)进行洗脱。每种洗脱样品用Centricon YM-10(Amicon)浓缩约20倍，得到约250μl蛋白质样品。当部分蛋白质样品在10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳时，在相当于分子量约144,000处观察到目标蛋白质条带。该样品用于随后的活性证实。对于如上所述表达和纯化的样品与实施例4-(2)中用大肠杆菌BL21-CodonPlus-RIL菌株(Stratagene)作为宿主所表达和纯化的样品，比较它们两者相当于100ml培养物的活性，表明前者收率大于后者的约2倍。
[0115]
(2)dsRNA降解活性的测定
用以上实施例11-(1)中制备的蛋白质样品，通过加入1μg实施例2-(1)中制备的dsRNA、1μl 11-(1)中制备的蛋白质样品、2μl 5x反应缓冲液(100mM tris-HCl缓冲液(pH8.5)、750mM氯化钠、12.5mM氯化镁)和无核酸酶的水，制备总体积为10μl的反应混合物。反应混合物在37℃反应18小时后，5μl反应混合物在15％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，用溴化乙锭染色，观察切割产物。结果，观察到约21个碱基对的降解产物，表明其dsRNA降解活性。
[0116]
(3)CspB蛋白增加切割活性
使用实施例11-(1)中制备的蛋白质样品，检测具有与核酸结合活性的蛋白质(CspB)的影响。
具体地讲，与实施例10-(3)的方法类似，通过加入1μl实施例11-(1)中制备的蛋白质样品(酶液)、1μl实施例10-(2)中制备的CspB溶液、1μg实施例2-(1)中制备的dsRNA(作为底物)、2μl 5x反应缓冲液(100mM tris-HCl缓冲液(pH8.5)、750mM氯化钠、12.5mM氯化镁)和无核酸酶的水，制备总体积为10μl的反应混合物。CspB蛋白的终浓度为9.2ng/μl。用市售切酶作为对照进行类似过程。就市售切酶(GTS)而言，通过加入2μl酶液、1μl CspB溶液、1μg作为底物的dsRNA、1μl 10mM ATP溶液、0.5μl 50mM氯化镁溶液、4μl所附反应缓冲液和无核酸酶的水，制备总体积为10μl的反应混合物。加入无核酸酶的水替代CspB，作为对照。
[0117]
制备上述反应混合物并在37℃反应18小时后，将5μl反应混合物在15％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，用溴化乙锭染色，观察切割产物。使用Total Lab第1.11版(Nonlinear Dynamics)，对凝胶进行图像分析，以分析约21个核苷酸的dsRNA降解产物和未切割dsRNA。
结果，当使用本发明的含有PAZ+RNA酶III结构域的突变蛋白(hDi-ASI)时，观察到因加入CspB而导致的降解dsRNA量的增加，并且几乎没有未切割底物存在，表明几乎完全降解。另一方面，就市售切酶而言，观察到降解dsRNA数量的增加，尽管仍有一半底物未切割。
因此，当使用本发明的蛋白质时，表明底物可以通过加入CspB而完全降解。
[0118]
实施例12：用hDi-ASI所得到的切割产物的RNAi效应
检测了用实施例11-(1)的蛋白质制备的siRNA的RNA干扰效应。用市售切酶(GTS)作为对照。dsRNA降解产物的制备基本上按照实施例11-(3)中描述的方法进行。就hDi-ASI而言，加入终浓度为9.2ng/μl的实施例10-(2)中制备的CspB。具体地讲，用实施例11-(1)中描述的酶，同时加入CspB或市售切酶，对10μg实施例2-(1)中制备的dsRNA在37℃切割18小时。用Microcon-100和Micropure-EZ(两者都来自Takara Bio)，纯化切割产物，并用于以下的RNA干扰的评价。
[0119]
简而言之，在转移siRNA之前24小时，将适量(1.5×105个细胞)的293细胞接种到含有D-MEM培养基(SIGMA)并补充了10％FBS和1％青霉素/链霉素的24孔板上，在CO2培养箱中培养过夜。将细胞培养至约95％汇合。将1μl Genejuice转染试剂(Takara Bio)加入到49μl无血清培养基中。将混合物剧烈搅拌，再让其在室温下静置5分钟。向其中加入0.3μg pQBI25(Takara Bio)，将所得混合物轻轻混和并让其在室温下静置5分钟。
与此平行的是，在另一试管中，将3μl Ribojuice转染试剂(TakaraBio)加入到47μl无血清培养基中，将所得混合物剧烈搅拌。让其在室温下静置5分钟后，向其中加入55.6ng siRNA，将所得混合物轻轻混和并让其在室温下静置5分钟。
[0120]
将如上制备的两种溶液之一滴加到每孔250μl补充了10％FBS的D-MEM培养基中，将所得混合物轻轻混合，使各孔溶液变得均匀。将载体(DNA)或无菌水单独加入到对照中。将细胞在CO2培养箱中培养24小时。用FACS Vantage(Becton-Dickinson)对细胞进行流式细胞术分析，以测定与仅用载体(DNA)的对照相比，转移的DNA/siRNA溶液对rsGFP表达的抑制效果。结果见表6。
[0121]
表6
| 转移样品 | 平均荧光强度 |
| 对照(未加入)对照(仅有载体)hDi-ASI+CspB市售切酶 | 3.521120.0893.09278.59 |
[0122]
如表6所示，与对照(仅有载体)相比，平均荧光强度值越小，表明RNA干扰越大。这表明，用hDi-ASI+CspB所得到的siRNA表现出RNA干扰效应，与用市售切酶所得到的类似，因此，对RNAi是有效的。此外，证实可以有效产生siRNA，并且，如果使用相同量的siRNA的话，与市售酶相比可以得到更大的RNAi效应。
根据以上结果，证实按照本发明方法制备的所述蛋白质可用于制备用于RNA干扰的siRNA。
工业实用性
[0123]
本发明提供具有降解dsRNA活性的蛋白质，以产生特定长度的dsRNA。此外，根据本发明的方法，也提供用于促进降解成特定长度dsRNA的方法和/或用于促进用于RNA干扰等的RNA合成的方法。此外，也提供组合物和试剂盒，其可用于常规地进行促进降解成特定长度dsRNA的方法和/或用于促进用于本发明的RNA合成的方法。
序列表独立文本
[0124]
SEQ ID NO：3；编码人切酶突变体的基因
SEQ ID NO：4；人切酶突变体的氨基酸序列
SEQ ID NO：5；合成引物1，以扩增编码人切酶突变体的基因
SEQ ID NO：6；合成引物2，以扩增编码人切酶突变体的基因
SEQ ID NO：7；合成引物3，以扩增编码红移绿色荧光蛋白的基因
SEQ ID NO：8；合成引物4，以扩增编码红移绿色荧光蛋白的基因
SEQ ID NO：14；合成引物5，以扩增编码人切酶突变体的基因
SEQ ID NO：15；合成引物6，以扩增编码人切酶突变体的基因
SEQ ID NO：16；编码人切酶突变体的基因
SEQ ID NO：17；人切酶突变体的氨基酸序列
SEQ ID NO：18；人切酶突变体的氨基酸序列
SEQ ID NO：19；编码人切酶突变体的基因
SEQ ID NO：20；合成引物rsGFP-F，以扩增编码rsGFP的基因
SEQ ID NO：21；合成引物rsGFP-R，以扩增编码rsGFP的基因
SEQ ID NO：22；合成引物Neo-F，以扩增编码Neo的基因
SEQ ID NO：23；合成引物Neo-R，以扩增编码Neo的基因
SEQ ID NO：24；合成引物dsl-1，以扩增编码萤光素酶的基因
SEQ ID NO：25；合成引物dsl-2，以扩增编码萤光素酶的基因
SEQ ID NO：26；合成引物E，以扩增编码CspB的基因
SEQ ID NO：27；合成引物F，以扩增编码CspB的基因。
序列表
<110>宝生物工程株式会社(TAKARA BIO INC.)
<120>降解dsRNA和合成RNA的方法
<130>664674
<150>JP 2003-293553
<151>2003-08-14
<150>JP 2003-342126
<151>2003-09-30
<150>JP 2003-409639
<l51>2003-12-08
<150>JP 2004-086129
<151>2004-03-24
<160>27
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1924
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
Met Lys Ser Pro Ala Leu Gln Pro Leu Ser Met Ala Gly Leu Gln Leu
1 5 10 15
Met Thr Pro Ala Ser Ser Pro Met Gly Pro Phe Phe Gly Leu Pro Trp
20 25 30
Gln Gln Glu Ala Ile His Asp Asn Ile Tyr Thr Pro Arg Lys Tyr Gln
35 40 45
Val Glu Leu Leu Glu Ala Ala Leu Asp His Asn Thr Ile Val Cys Leu
50 55 60
Asn Thr Gly Ser Gly Lys Thr Phe Ile Ala Ser Thr Thr Leu Leu Lys
65 70 75 80
Ser Cys Leu Tyr Leu Asp Leu Gly Glu Thr Ser Ala Arg Asn Gly Lys
85 90 95
Arg Thr Val Phe Leu Val Asn Ser Ala Asn Gln Val Ala Gln Gln Val
100 105 110
Ser Ala Val Arg Thr His Ser Asp Leu Lys Val Gly Glu Tyr Ser Asn
115 120 125
Leu Glu Val Asn Ala Ser Trp Thr Lys Glu Arg Trp Asn Gln Glu Phe
130 135 140
Thr Lys His Gln Val Leu Ile Met Thr Cys Tyr Val Ala Leu Asn Val
145 150 155 160
Leu Lys Asn Gly Tyr Leu Ser Leu Ser Asp Ile Asn Leu Leu Val Phe
165 170 175
Asp Glu Cys His Leu Ala Ile Leu Asp His Pro Tyr Arg Glu Phe Met
180 185 190
Lys Leu Cys Glu Ile Cys Pro Ser Cys Pro Arg Ile Leu Gly Leu Thr
195 200 205
Ala Ser Ile Leu Asn Gly Lys Trp Asp Pro Glu Asp Leu Glu Glu Lys
210 215 220
Phe Gln Lys Leu Glu Lys Ile Leu Lys Ser Asn Ala Glu Thr Ala Thr
225 230 235 240
Asp Leu Val Val Leu Asp Arg Tyr Thr Ser Gln Pro Cys Glu Ile Val
245 250 255
Val Asp Cys Gly Pro Phe Thr Asp Arg Ser Gly Leu Tyr Glu Arg Leu
260 265 270
Leu Met Glu Leu Glu Glu Ala Leu Asn Phe Ile Asn Asp Cys Asn Ile
275 280 285
Ser Val His Ser Lys Glu Arg Asp Ser Thr Leu Ile Ser Lys Gln Ile
290 295 300
Leu Ser Asp Cys Arg Ala Val Leu Val Val Leu Gly Pro Trp Cys Ala
305 310 315 320
Asp Lys Val Ala Gly Met Met Val Arg Glu Leu Gln Lys Tyr Ile Lys
325 330 335
His Glu Gln Glu Glu Leu His Arg Lys Phe Leu Leu Phe Thr Asp Thr
340 345 350
Phe Leu Arg Lys Ile His Ala Leu Cys Glu Glu His Phe Ser Pro Ala
355 360 365
Ser Leu Asp Leu Lys Phe Val Thr Pro Lys Val Ile Lys Leu Leu Glu
370 375 380
Ile Leu Arg Lys Tyr Lys Pro Tyr Glu Arg His Ser Phe Glu Ser Val
385 390 395 400
Glu Trp Tyr Asn Asn Arg Asn Gln Asp Asn Tyr Val Ser Trp Ser Asp
405 410 415
Ser Glu Asp Asp Asp Glu Asp Glu Glu Ile Glu Glu Lys Glu Lys Pro
420 425 430
Glu Thr Asn Phe Pro Ser Pro Phe Thr Asn Ile Leu Cys Gly Ile Ile
435 440 445
Phe Val Glu Arg Arg Tyr Thr Ala Val Val Leu Asn Arg Leu Ile Lys
450 455 460
Glu Ala Gly Lys Gln Asp Pro Glu Leu Ala Tyr Ile Ser Ser Asn Phe
465 470 475 480
Ile Thr Gly His Gly Ile Gly Lys Asn Gln Pro Arg Asn Asn Thr Met
485 490 495
Glu Ala Glu Phe Arg Lys Gln Glu Glu Val Leu Arg Lys Phe Arg Ala
500 505 510
His Glu Thr Asn Leu Leu Ile Ala Thr Ser Ile Val Glu Glu Gly Val
515 520 525
Asp Ile Pro Lys Cys Asn Leu Val Val Arg Phe Asp Leu Pro Thr Glu
530 535 540
Tyr Arg Ser Tyr Val Gln Ser Lys Gly Arg Ala Arg Ala Pro Ile Ser
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Asn Tyr Ile Met Leu Ala Asp Thr Asp Lys Ile Lys Ser Phe Glu Glu
565 570 575
Asp Leu Lys Thr Tyr Lys Ala Ile Glu Lys Ile Leu Arg Asn Lys Cys
580 585 590
Ser Lys Ser Val Asp Thr Gly Glu Thr Asp Ile Asp Pro Val Met Asp
595 600 605
Asp Asp His Val Phe Pro Pro Tyr Val Leu Arg Pro Asp Asp Gly Gly
610 615 620
Pro Arg Val Thr Ile Asn Thr Ala Ile Gly His Ile Asn Arg Tyr Cys
625 630 635 640
Ala Arg Leu Pro Ser Asp Pro Phe Thr His Leu Ala Pro Lys Cys Arg
645 650 655
Thr Arg Glu Leu Pro Asp Gly Thr Phe Tyr Ser Thr Leu Tyr Leu Pro
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Ile Asn Ser Pro Leu Arg Ala Ser Ile Val Gly Pro Pro Met Ser Cys
675 680 685
Val Arg Leu Ala Glu Arg Val Val Ala Leu Ile Cys Cys Glu Lys Leu
690 695 700
His Lys Ile Gly Glu Leu Asp Asp His Leu Met Pro Val Gly Lys Glu
705 710 715 720
Thr Val Lys Tyr Glu Glu Glu Leu Asp Leu His Asp Glu Glu Glu Thr
725 730 735
Ser Val Pro Gly Arg Pro Gly Ser Thr Lys Arg Arg Gln Cys Tyr Pro
740 745 750
Lys Ala Ile Pro Glu Cys Leu Arg Asp Ser Tyr Pro Arg Pro Asp Gln
755 760 765
Pro Cys Tyr Leu Tyr Val Ile Gly Met Val Leu Thr Thr Pro Leu Pro
770 775 780
Asp Glu Leu Asn Phe Arg Arg Arg Lys Leu Tyr Pro Pro Glu Asp Thr
785 790 795 800
Thr Arg Cys Phe Gly Ile Leu Thr Ala Lys Pro Ile Pro Gln Ile Pro
805 810 815
His Phe Pro Val Tyr Thr Arg Ser Gly Glu Val Thr Ile Ser Ile Glu
820 825 830
Leu Lys Lys Ser Gly Phe Met Leu Ser Leu Gln Met Leu Glu Leu Ile
835 840 845
Thr Arg Leu His Gln Tyr Ile Phe Ser His Ile Leu Arg Leu Glu Lys
850 855 860
Pro Ala Leu Glu Phe Lys Pro Thr Asp Ala Asp Ser Ala Tyr Cys Val
865 870 875 880
Leu Pro Leu Asn Val Val Asn Asp Ser Ser Thr Leu Asp Ile Asp Phe
885 890 895
Lys Phe Met Glu Asp Ile Glu Lys Ser Glu Ala Arg Ile Gly Ile Pro
900 905 910
Ser Thr Lys Tyr Thr Lys Glu Thr Pro Phe Val Phe Lys Leu Glu Asp
915 920 925
Tyr Gln Asp Ala Val Ile Ile Pro Arg Tyr Arg Asn Phe Asp Gln Pro
930 935 940
His Arg Phe Tyr Val Ala Asp Val Tyr Thr Asp Leu Thr Pro Leu Ser
945 950 955 960
Lys Phe Pro Ser Pro Glu Tyr Glu Thr Phe Ala Glu Tyr Tyr Lys Thr
965 970 975
Lys Tyr Asn Leu Asp Leu Thr Asn Leu Asn Gln Pro Leu Leu Asp Val
980 985 990
Asp His Thr Ser Ser Arg Leu Asn Leu Leu Thr Pro Arg His Leu Asn
995 1000 1005
Gln Lys Gly Lys Ala Leu Pro Leu Ser Ser Ala Glu Lys Arg Lys
1010 1015 1020
Ala Lys Trp Glu Ser Leu Gln Asn Lys Gln Ile Leu Val Pro Glu
1025 1030 1035
Leu Cys Ala Ile His Pro Ile Pro Ala Ser Leu Trp Arg Lys Ala
1040 1045 1050
Val Cys Leu Pro Ser Ile Leu Tyr Arg Leu His Cys Leu Leu Thr
1055 1060 1065
Ala Glu Glu Leu Arg Ala Gln Thr Ala Ser Asp Ala Gly Val Gly
1070 1075 1080
Val Arg Ser Leu Pro Ala Asp Phe Arg Tyr Pro Asn Leu Asp Phe
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Gly Trp Lys Lys Ser Ile Asp Ser Lys Ser Phe Ile Ser Ile Ser
1100 1105 1110
Asn Ser Ser Ser Ala Glu Asn Asp Asn Tyr Cys Lys His Ser Thr
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Ile Val Pro Glu Asn Ala Ala His Gln Gly Ala Asn Arg Thr Ser
1130 1135 1140
Ser Leu Glu Asn His Asp Gln Met Ser Val Asn Cys Arg Thr Leu
1145 1150 1155
Leu Ser Glu Ser Pro Gly Lys Leu His Val Glu Val Ser Ala Asp
1160 1165 1170
Leu Thr Ala Ile Asn Gly Leu Ser Tyr Asn Gln Asn Leu Ala Asn
1175 1180 1185
Gly Ser Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Asp Phe Cys Gln Gly Asn Gln
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Leu Asn Tyr Tyr Lys Gln Glu Ile Pro Val Gln Pro Thr Thr Ser
1205 1210 1215
Tyr Ser Ile Gln Asn Leu Tyr Ser Tyr Glu Asn Gln Pro Gln Pro
1220 1225 1230
Ser Asp Glu Cys Thr Leu Leu Ser Asn Lys Tyr Leu Asp Gly Asn
1235 1240 1245
Ala Asn Lys Ser Thr Ser Asp Gly Ser Pro Val Met Ala Val Met
1250 1255 1260
Pro Gly Thr Thr Asp Thr Ile Gln Val Leu Lys Gly Arg Met Asp
1265 1270 1275
Ser Glu Gln Ser Pro Ser Ile Gly Tyr Ser Ser Arg Thr Leu Gly
1280 1285 1290
Pro Asn Pro Gly Leu Ile Leu Gln Ala Leu Thr Leu Ser Asn Ala
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Ser Asp Gly Phe Asn Leu Glu Arg Leu Glu Met Leu Gly Asp Ser
1310 1315 1320
Phe Leu Lys His Ala Ile Thr Thr Tyr Leu Phe Cys Thr Tyr Pro
1325 1330 1335
Asp Ala His Glu Gly Arg Leu Ser Tyr Met Arg Ser Lys Lys Val
1340 1345 1350
Ser Asn Cys Asn Leu Tyr Arg Leu Gly Lys Lys Lys Gly Leu Pro
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Ser Arg Met Val Val Ser Ile Phe Asp Pro Pro Val Asn Trp Leu
1370 1375 1380
Pro Pro Gly Tyr Val Val Asn Gln Asp Lys Ser Asn Thr Asp Lys
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Trp Glu Lys Asp Glu Met Thr Lys Asp Cys Met Leu Ala Asn Gly
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Lys Leu Asp Glu Asp Tyr Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Ser
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Leu Met Trp Arg Ala Pro Lys Glu Glu Ala Asp Tyr Glu Asp Asp
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Phe Leu Glu Tyr Asp Gln Glu His Ile Arg Phe Ile Asp Asn Met
1445 1450 1455
Leu Met Gly Ser Gly Ala Phe Val Lys Lys Ile Ser Leu Ser Pro
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Phe Ser Thr Thr Asp Ser Ala Tyr Glu Trp Lys Met Pro Lys Lys
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Ser Ser Leu Gly Ser Met Pro Phe Ser Ser Asp Phe Glu Asp Phe
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Asp Tyr Ser Ser Trp Asp Ala Met Cys Tyr Leu Asp Pro Ser Lys
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Glu Glu Asn Cys Gly Val Asp Thr Gly Lys Gln Ser Ile Ser Tyr
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Cys Val Glu Ala Leu Leu Gly Cys Tyr Leu Thr Ser Cys Gly Glu
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Arg Ala Ala Gln Leu Phe Leu Cys Ser Leu Gly Leu Lys Val Leu
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Pro Val Ile Lys Arg Thr Asp Arg Glu Lys Ala Leu Cys Pro Thr
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Arg Glu Asn Phe Asn Ser Gln Gln Lys Asn Leu Ser Val Ser Cys
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Ala Ala Ala Ser Val Ala Ser Ser Arg Ser Ser Val Leu Lys Asp
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Tyr Leu Leu Gln Ala Phe Thr His Ala Ser Tyr His Tyr Asn Thr
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Ile Thr Asp Cys Tyr Gln Arg Leu Glu Phe Leu Gly Asp Ala Ile
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Leu Asp Tyr Leu Ile Thr Lys His Leu Tyr Glu Asp Pro Arg Gln
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Asn Thr Ile Phe Ala Ser Leu Ala Val Lys Tyr Asp Tyr His Lys
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Phe Val Gln Phe Gln Leu Glu Lys Asn Glu Met Gln Gly Met Asp
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Ser Glu Leu Arg Arg Ser Glu Glu Asp Glu Glu Lys Glu Glu Asp
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Gly Ala Ile Tyr Met Asp Ser Gly Met Ser Leu Glu Thr Val Trp
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Pro Glu Thr Ala Lys Phe Ser Pro Ala Glu Arg Thr Tyr Asp Gly
1865 1870 1875
Lys Val Arg Val Thr Val Glu Val Val Gly Lys Gly Lys Phe Lys
1880 1885 1890
Gly Val Gly Arg Ser Tyr Arg Ile Ala Lys Ser Ala Ala Ala Arg
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1910 1915 1920
Ser
<210>2
<211>5772
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>2
atgaaaagcc ctgctttgca acccctcagc atggcaggcc tgcagctcat gacccctgct 60
tcctcaccaa tgggtccttt ctttggactg ccatggcaac aagaagcaat tcatgataac 120
atttatacgc caagaaaata tcaggttgaa ctgcttgaag cagctctgga tcataatacc 180
atcgtctgtt taaacactgg ctcagggaag acatttattg ctagtactac tctactaaag 240
agctgtctct atctagatct aggggagact tcagctagaa atggaaaaag gacggtgttc 300
ttggtcaact ctgcaaacca ggttgctcaa caagtgtcag ctgtcagaac tcattcagat 360
ctcaaggttg gggaatactc aaacctagaa gtaaatgcat cttggacaaa agagagatgg 420
aaccaagagt ttactaagca ccaggttctc attatgactt gctatgtcgc cttgaatgtt 480
ttgaaaaatg gttacttatc actgtcagac attaaccttt tggtgtttga tgagtgtcat 540
cttgcaatcc tagaccaccc ctatcgagaa tttatgaagc tctgtgaaat ttgtccatca 600
tgtcctcgca ttttgggact aactgcttcc attttaaatg ggaaatggga tccagaggat 660
ttggaagaaa agtttcagaa actagagaaa attcttaaga gtaatgctga aactgcaact 720
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tcgaaacaga tactatcaga ctgtcgtgcc gtattggtag ttctgggacc ctggtgtgca 960
gataaagtag ctggaatgat ggtaagagaa ctacagaaat acatcaaaca tgagcaagag 1020
gagctgcaca ggaaattttt attgtttaca gacactttcc taaggaaaat acatgcacta 1080
tgtgaagagc acttctcacc tgcctcactt gacctgaaat ttgtaactcc taaagtaatc 1140
aaactgctcg aaatcttacg caaatataaa ccatatgagc gacacagttt tgaaagcgtt 1200
gagtggtata ataatagaaa tcaggataat tatgtgtcat ggagtgattc tgaggatgat 1260
gatgaggatg aagaaattga agaaaaagag aagccagaga caaattttcc ttctcctttt 1320
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acaagtattg tagaagaggg tgttgatata ccaaaatgca acttggtggt tcgttttgat 1620
ttgcccacag aatatcgatc ctatgttcaa tctaaaggaa gagcaagggc acccatctct 1680
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actgacattg atcctgtcat ggatgatgat cacgttttcc caccatatgt gttgaggcct 1860
gacgatggtg gtccacgagt cacaatcaac acggccattg gacacatcaa tagatactgt 1920
gctagattac caagtgatcc gtttactcat ctagctccta aatgcagaac ccgagagttg 1980
cctgatggta cattttattc aactctttat ctgccaatta actcacctct tcgagcctcc 2040
attgttggtc caccaatgag ctgtgtacga ttggctgaaa gagttgtcgc tctcatttgc 2100
tgtgagaaac tgcacaaaat tggcgaactg gatgaccatt tgatgccagt tgggaaagag 2160
actgttaaat atgaagagga gcttgatttg catgatgaag aagagaccag tgttccagga 2220
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acacctttac ctgatgaact caactttaga aggcggaagc tctatcctcc tgaagatacc 2400
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cggcttgaaa aacctgcact agaatttaaa cctacagacg ctgattcagc atactgtgtt 2640
ctacctctta atgttgttaa tgactccagc actttggata ttgactttaa attcatggaa 2700
gatattgaga agtctgaagc tcgcataggc attcccagta caaagtatac aaaagaaaca 2760
ccctttgttt ttaaattaga agattaccaa gatgccgtta tcattccaag atatcgcaat 2820
tttgatcagc ctcatcgatt ttatgtagct gatgtgtaca ctgatcttac cccactcagt 2880
aaatttcctt cccctgagta tgaaactttt gcagaatatt ataaaacaaa gtacaacctt 2940
gacctaacca atctcaacca gccactgctg gatgtggacc acacatcttc aagacttaat 3000
cttttgacac ctcgacattt gaatcagaag gggaaagcgc ttcctttaag cagtgctgag 3060
aagaggaaag ccaaatggga aagtctgcag aataaacaga tactggttcc agaactctgt 3120
gctatacatc caattccagc atcactgtgg agaaaagctg tttgtctccc cagcatactt 3180
tatcgccttc actgcctttt gactgcagag gagctaagag cccagactgc cagcgatgct 3240
ggcgtgggag tcagatcact tcctgcggat tttagatacc ctaacttaga cttcgggtgg 3300
aaaaaatcta ttgacagcaa atctttcatc tcaatttcta actcctcttc agctgaaaat 3360
gataattact gtaagcacag cacaattgtc cctgaaaatg ctgcacatca aggtgctaat 3420
agaacctcct ctctagaaaa tcatgaccaa atgtctgtga actgcagaac gttgctcagc 3480
gagtcccctg gtaagctcca cgttgaagtt tcagcagatc ttacagcaat taatggtctt 3540
tcttacaatc aaaatctcgc caatggcagt tatgatttag ctaacagaga cttttgccaa 3600
ggaaatcagc taaattacta caagcaggaa atacccgtgc aaccaactac ctcatattcc 3660
attcagaatt tatacagtta cgagaaccag ccccagccca gcgatgaatg tactctcctg 3720
agtaataaat accttgatgg aaatgctaac aaatctacct cagatggaag tcctgtgatg 3780
gccgtaatgc ctggtacgac agacactatt caagtgctca agggcaggat ggattctgag 3840
cagagccctt ctattgggta ctcctcaagg actcttggcc ccaatcctgg acttattctt 3900
caggctttga ctctgtcaaa cgctagtgat ggatttaacc tggagcggct tgaaatgctt 3960
ggcgactcct ttttaaagca tgccatcacc acatatctat tttgcactta ccctgatgcg 4020
catgagggcc gcctttcata tatgagaagc aaaaaggtca gcaactgtaa tctgtatcgc 4080
cttggaaaaa agaagggact acccagccgc atggtggtgt caatatttga tccccctgtg 4140
aattggcttc ctcctggtta tgtagtaaat caagacaaaa gcaacacaga taaatgggaa 4200
aaagatgaaa tgacaaaaga ctgcatgctg gcgaatggca aactggatga ggattacgag 4260
gaggaggatg aggaggagga gagcctgatg tggagggctc cgaaggaaga ggctgactat 4320
gaagatgatt tcctggagta tgatcaggaa catatcagat ttatagataa tatgttaatg 4380
gggtcaggag cttttgtaaa gaaaatctct ctttctcctt tttcaaccac tgattctgca 4440
tatgaatgga aaatgcccaa aaaatcctcc ttaggtagta tgccattttc atcagatttt 4500
gaggattttg actacagctc ttgggatgca atgtgctatc tggatcctag caaagctgtt 4560
gaagaagatg actttgtggt ggggttctgg aatccatcag aagaaaactg tggtgttgac 4620
acgggaaagc agtccatttc ttacgacttg cacactgagc agtgtattgc tgacaaaagc 4680
atagcggact gtgtggaagc cctgctgggc tgctatttaa ccagctgtgg ggagagggct 4740
gctcagcttt tcctctgttc actggggctg aaggtgctcc cggtaattaa aaggactgat 4800
cgggaaaagg ccctgtgccc tactcgggag aatttcaaca gccaacaaaa gaacctttca 4860
gtgagctgtg ctgctgcttc tgtggccagt tcacgctctt ctgtattgaa agactcggaa 4920
tatggttgtt tgaagattcc accaagatgt atgtttgatc atccagatgc agataaaaca 4980
ctgaatcacc ttatatcggg gtttgaaaat tttgaaaaga aaatcaacta cagattcaag 5040
aataaggctt accttctcca ggcttttaca catgcctcct accactacaa tactatcact 5100
gattgttacc agcgcttaga attcctggga gatgcgattt tggactacct cataaccaag 5160
cacctttatg aagacccgcg gcagcactcc ccgggggtcc tgacagacct gcggtctgcc 5220
ctggtcaaca acaccatctt tgcatcgctg gctgtaaagt acgactacca caagtacttc 5280
aaagctgtct ctcctgagct cttccatgtc attgatgact ttgtgcagtt tcagcttgag 5340
aagaatgaaa tgcaaggaat ggattctgag cttaggagat ctgaggagga tgaagagaaa 5400
gaagaggata ttgaagttcc aaaggccatg ggggatattt ttgagtcgct tgctggtgcc 5460
atttacatgg atagtgggat gtcactggag acagtctggc aggtgtacta tcccatgatg 5520
cggccactaa tagaaaagtt ttctgcaaat gtaccccgtt cccctgtgcg agaattgctt 5580
gaaatggaac cagaaactgc caaatttagc ccggctgaga gaacttacga cgggaaggtc 5640
agagtcactg tggaagtagt aggaaagggg aaatttaaag gtgttggtcg aagttacagg 5700
attgccaaat ctgcagcagc aagaagagcc ctccgaagcc tcaaagctaa tcaacctcag 5760
gttcccaata gc 5772
<210>3
<211>1962
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码人切酶(dicer)突变体的基因
<400>3
caagtgctca agggcaggat ggattctgag cagagccctt ctattgggta ctcctcaagg 60
actcttggcc ccaatcctgg acttattctt caggctttga ctctgtcaaa cgctagtgat 120
ggatttaacc tggagcggct tgaaatgctt ggcgactcct ttttaaagca tgccatcacc 180
acatatctat tttgcactta ccctgatgcg catgagggcc gcctttcata tatgagaagc 240
aaaaaggtca gcaactgtaa tctgtatcgc cttggaaaaa agaagggact acccagccgc 300
atggtggtgt caatatttga tccccctgtg aattggcttc ctcctggtta tgtagtaaat 360
caagacaaaa gcaacacaga taaatgggaa aaagatgaaa tgacaaaaga ctgcatgctg 420
gcgaatggca aactggatga ggattacgag gaggaggatg aggaggagga gagcctgatg 480
tggagggctc cgaaggaaga ggctgactat gaagatgatt tcctggagta tgatcaggaa 540
catatcagat ttatagataa tatgttaatg gggtcaggag cttttgtaaa gaaaatctct 600
ctttctcctt tttcaaccac tgattctgca tatgaatgga aaatgcccaa aaaatcctcc 660
ttaggtagta tgccattttc atcagatttt gaggattttg actacagctc ttgggatgca 720
atgtgctatc tggatcctag caaagctgtt gaagaagatg actttgtggt ggggttctgg 780
aatccatcag aagaaaactg tggtgttgac acgggaaagc agtccatttc ttacgacttg 840
cacactgagc agtgtattgc tgacaaaagc atagcggact gtgtggaagc cctgctgggc 900
tgctatttaa ccagctgtgg ggagagggct gctcagcttt tcctctgttc actggggctg 960
aaggtgctcc cggtaattaa aaggactgat cgggaaaagg ccctgtgccc tactcgggag 1020
aatttcaaca gccaacaaaa gaacctttca gtgagctgtg ctgctgcttc tgtggccagt 1080
tcacgctctt ctgtattgaa agactcggaa tatggttgtt tgaagattcc accaagatgt 1140
atgtttgatc atccagatgc agataaaaca ctgaatcacc ttatatcggg gtttgaaaat 1200
tttgaaaaga aaatcaacta cagattcaag aataaggctt accttctcca ggcttttaca 1260
catgcctcct accactacaa tactatcact gattgttacc agcgcttaga attcctggga 1320
gatgcgattt tggactacct cataaccaag cacctttatg aagacccgcg gcagcactcc 1380
ccgggggtcc tgacagacct gcggtctgcc ctggtcaaca acaccatctt tgcatcgctg 1440
gctgtaaagt acgactacca caagtacttc aaagctgtct ctcctgagct cttccatgtc 1500
attgatgact ttgtgcagtt tcagcttgag aagaatgaaa tgcaaggaat ggattctgag 1560
cttaggagat ctgaggagga tgaagagaaa gaagaggata ttgaagttcc aaaggccatg 1620
ggggatattt ttgagtcgct tgctggtgcc atttacatgg atagtgggat gtcactggag 1680
acagtctggc aggtgtacta tcccatgatg cggccactaa tagaaaagtt ttctgcaaat 1740
gtaccccgtt cccctgtgcg agaattgctt gaaatggaac cagaaactgc caaatttagc 1800
ccggctgaga gaacttacga cgggaaggtc agagtcactg tggaagtagt aggaaagggg 1860
aaatttaaag gtgttggtcg aagttacagg attgccaaat ctgcagcagc aagaagagcc 1920
ctccgaagcc tcaaagctaa tcaacctcag gttcccaata gc 1962
<210>4
<211>654
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人切酶突变体的氨基酸序列
<400>4
Gln Val Leu Lys Gly Arg Met Asp Ser Glu Gln Ser Pro Ser Ile Gly
1 5 10 15
Tyr Ser Ser Arg Thr Leu Gly Pro Asn Pro Gly Leu Ile Leu Gln Ala
20 25 30
Leu Thr Leu Ser Asn Ala Ser Asp Gly Phe Asn Leu Glu Arg Leu Glu
35 40 45
Met Leu Gly Asp Ser Phe Leu Lys His Ala Ile Thr Thr Tyr Leu Phe
50 55 60
Cys Thr Tyr Pro Asp Ala His Glu Gly Arg Leu Ser Tyr Met Arg Ser
65 70 75 80
Lys Lys Val Ser Asn Cys Asn Leu Tyr Arg Leu Gly Lys Lys Lys Gly
85 90 95
Leu Pro Ser Arg Met Val Val Ser Ile Phe Asp Pro Pro Val Asn Trp
100 105 110
Leu Pro Pro Gly Tyr Val Val Asn Gln Asp Lys Ser Asn Thr Asp Lys
115 120 125
Trp Glu Lys Asp Glu Met Thr Lys Asp Cys Met Leu Ala Asn Gly Lys
130 135 140
Leu Asp Glu Asp Tyr Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Ser Leu Met
145 150 155 160
Trp Arg Ala Pro Lys Glu Glu Ala Asp Tyr Glu Asp Asp Phe Leu Glu
165 170 175
Tyr Asp Gln Glu His Ile Arg Phe Ile Asp Asn Met Leu Met Gly Ser
180 185 190
Gly Ala Phe Val Lys Lys Ile Ser Leu Ser Pro Phe Ser Thr Thr Asp
195 200 205
Ser Ala Tyr Glu Trp Lys Met Pro Lys Lys Ser Ser Leu Gly Ser Met
210 215 220
Pro Phe Ser Ser Asp Phe Glu Asp Phe Asp Tyr Ser Ser Trp Asp Ala
225 230 235 240
Met Cys Tyr Leu Asp Pro Ser Lys Ala Val Glu Glu Asp Asp Phe Val
245 250 255
Val Gly Phe Trp Asn Pro Ser Glu Glu Asn Cys Gly Val Asp Thr Gly
260 265 270
Lys Gln Ser Ile Ser Tyr Asp Leu His Thr Glu Gln Cys Ile Ala Asp
275 280 285
Lys Ser Ile Ala Asp Cys Val Glu Ala Leu Leu Gly Cys Tyr Leu Thr
290 295 300
Ser Cys Gly Glu Arg Ala Ala Gln Leu Phe Leu Cys Ser Leu Gly Leu
305 310 315 320
Lys Val Leu Pro Val Ile Lys Arg Thr Asp Arg Glu Lys Ala Leu Cys
325 330 335
Pro Thr Arg Glu Asn Phe Asn Ser Gln Gln Lys Asn Leu Ser Val Ser
340 345 350
Cys Ala Ala Ala Ser Val Ala Ser Ser Arg Ser Ser Val Leu Lys Asp
355 360 365
Ser Glu Tyr Gly Cys Leu Lys Ile Pro Pro Arg Cys Met Phe Asp His
370 375 380
Pro Asp Ala Asp Lys Thr Leu Asn His Leu Ile Ser Gly Phe Glu Asn
385 390 395 400
Phe Glu Lys Lys Ile Asn Tyr Arg Phe Lys Asn Lys Ala Tyr Leu Leu
405 410 415
Gln Ala Phe Thr His Ala Ser Tyr His Tyr Asn Thr Ile Thr Asp Cys
420 425 430
Tyr Gln Arg Leu Glu Phe Leu Gly Asp Ala Ile Leu Asp Tyr Leu Ile
435 440 445
Thr Lys His Leu Tyr Glu Asp Pro Arg Gln His Ser Pro Gly Val Leu
450 455 460
Thr Asp Leu Arg Ser Ala Leu Val Asn Asn Thr Ile Phe Ala Ser Leu
465 470 475 480
Ala Val Lys Tyr Asp Tyr His Lys Tyr Phe Lys Ala Val Ser Pro Glu
485 490 495
Leu Phe His Val Ile Asp Asp Phe Val Gln Phe Gln Leu Glu Lys Asn
500 505 510
Glu Met Gln Gly Met Asp Ser Glu Leu Arg Arg Ser Glu Glu Asp Glu
515 520 525
Glu Lys Glu Glu Asp Ile Glu Val Pro Lys Ala Met Gly Asp Ile Phe
530 535 540
Glu Ser Leu Ala Gly Ala Ile Tyr Met Asp Ser Gly Met Ser Leu Glu
545 550 555 560
Thr Val Trp Gln Val Tyr Tyr Pro Met Met Arg Pro Leu Ile Glu Lys
565 570 575
Phe Ser Ala Asn Val Pro Arg Ser Pro Val Arg Glu Leu Leu Glu Met
580 585 590
Glu Pro Glu Thr Ala Lys Phe Ser Pro Ala Glu Arg Thr Tyr Asp Gly
595 600 605
Lys Val Arg Val Thr Val Glu Val Val Gly Lys Gly Lys Phe Lys Gly
610 615 620
Val Gly Arg Ser Tyr Arg Ile Ala Lys Ser Ala Ala Ala Arg Arg Ala
625 630 635 640
Leu Arg Ser Leu Lys Ala Asn Gln Pro Gln Val Pro Asn Ser
645 650
<210>5
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成引物1，以扩增编码人切酶的基因
<400>5
tcgagctcgg taccccaagt gctcaagggc aggatg 36
<210>6
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成引物2，以扩增编码人切酶的基因
<400>6
tatctagaaa gcttttagct attgggaacc tgaggt 36
<210>7
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成引物3，以扩增编码红移绿色荧光蛋白的基因
<400>7
gggtaatacg actcactata gggagaatgg ctagcaaagg ag 42
<210>8
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成引物4，以扩增编码红移绿色荧光蛋白的基因
<400>8
gggtaatacg actcactata gggagatcag ttgtacagtt ca 42
<210>9
<211>66
<212>PRT
<213>海栖热袍菌(Thermotoga maritima)
<400>9
Met Arg Gly Lys Val Lys Trp Phe Asp Ser Lys Lys Gly Tyr Gly Phe
1 5 10 15
Ile Thr Lys Asp Glu Gly Gly Asp Val Phe Val His Trp Ser Ala Ile
20 25 30
Glu Met Glu Gly Phe Lys Thr Leu Lys Glu Gly Gln Val Val Glu Phe
35 40 45
Glu Ile Gln Glu Gly Lys Lys Gly Pro Gln Ala Ala His Val Lys Val
50 55 60
Val Glu
65
<210>10
<211>198
<212>DNA
<213>海栖热袍菌(Thermotoga maritima)
<400>10
atgagaggaa aggttaagtg gttcgattcc aagaagggct acggattcat cacaaaggac 60
gaaggaggag acgtgttcgt acactggtca gccatcgaaa tggaaggttt caaaactctg 120
aaggaaggcc aggtcgtcga gttcgagatt caggaaggca agaaaggtcc acaggcagcg 180
cacgtgaaag tagttgag 198
<210>11
<211>720
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码红移绿色荧光蛋白的基因
<400>11
atggctagca aaggagaaga actcttcact ggagttgtcc caattcttgt tgaattagat 60
ggtgatgtta acggccacaa gttctctgtc agtggagagg gtgaaggtga tgcaacatac 120
ggaaaactta ccctgaagtt catctgcact actggcaaac tgcctgttcc atggccaaca 180
ctagtcacta ctctgtgcta tggtgttcaa tgcttttcaa gatacccgga tcatatgaaa 240
cggcatgact ttttcaagag tgccatgccc gaaggttatg tacaggaaag gaccatcttc 300
ttcaaagatg acggcaacta caagacacgt gctgaagtca agtttgaagg tgataccctt 360
gttaatagaa tcgagttaaa aggtattgac ttcaaggaag atggaaacat tctgggacac 420
aaattggaat acaactataa ctcacacaat gtatacatca tggcagacaa acaaaagaat 480
ggaatcaaag tgaacttcaa gacccgccac aacattgaag atggaagcgt tcaactagca 540
gaccattatc aacaaaatac tccaattggc gatggccctg tccttttacc agacaaccat 600
tacctgtcca cacaatctgc cctttcgaaa gatcccaacg aaaagagaga ccacatggtc 660
cttcttgagt ttgtaacagc tgctgggatt acacatggca tggatgaact gtacaactga 720
<210>12
<211>675
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>编码人切酶突变体的氨基酸序列
<400>12
Met Asn His Lys Val His His His His His His Ile Glu Gly Arg Asn
1 5 10 15
Ser Ser Ser Val Pro Gln Val Leu Lys Gly Arg Met Asp Ser Glu Gln
20 25 30
Ser Pro Ser Ile Gly Tyr Ser Ser Arg Thr Leu Gly Pro Asn Pro Gly
35 40 45
Leu Ile Leu Gln Ala Leu Thr Leu Ser Asn Ala Ser Asp Gly Phe Asn
50 55 60
Leu Glu Arg Leu Glu Met Leu Gly Asp Ser Phe Leu Lys His Ala Ile
65 70 75 80
Thr Thr Tyr Leu Phe Cys Thr Tyr Pro Asp Ala His Glu Gly Arg Leu
85 90 95
Ser Tyr Met Arg Ser Lys Lys Val Ser Asn Cys Asn Leu Tyr Arg Leu
100 105 110
Gly Lys Lys Lys Gly Leu Pro Ser Arg Met Val Val Ser Ile Phe Asp
115 120 125
Pro Pro Val Asn Trp Leu Pro Pro Gly Tyr Val Val Asn Gln Asp Lys
130 135 140
Ser Asn Thr Asp Lys Trp Glu Lys Asp Glu Met Thr Lys Asp Cys Met
145 150 155 160
Leu Ala Asn Gly Lys Leu Asp Glu Asp Tyr Glu Glu Glu Asp Glu Glu
165 170 175
Glu Glu Ser Leu Met Trp Arg Ala Pro Lys Glu Glu Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Asp Asp Phe Leu Glu Tyr Asp Gln Glu His Ile Arg Phe Ile Asp Asn
195 200 205
Met Leu Met Gly Ser Gly Ala Phe Val Lys Lys Ile Ser Leu Ser Pro
210 215 220
Phe Ser Thr Thr Asp Ser Ala Tyr Glu Trp Lys Met Pro Lys Lys Ser
225 230 235 240
Ser Leu Gly Ser Met Pro Phe Ser Ser Asp Phe Glu Asp Phe Asp Tyr
245 250 255
Ser Ser Trp Asp Ala Met Cys Tyr Leu Asp Pro Ser Lys Ala Val Glu
260 265 270
Glu Asp Asp Phe Val Val Gly Phe Trp Asn Pro Ser Glu Glu Asn Cys
275 280 285
Gly Val Asp Thr Gly Lys Gln Ser Ile Ser Tyr Asp Leu His Thr Glu
290 295 300
Gln Cys Ile Ala Asp Lys Ser Ile Ala Asp Cys Val Glu Ala Leu Leu
305 310 315 320
Gly Cys Tyr Leu Thr Ser Cys Gly Glu Arg Ala Ala Gln Leu Phe Leu
325 330 335
Cys Ser Leu Gly Leu Lys Val Leu Pro Val Ile Lys Arg Thr Asp Arg
340 345 350
Glu Lys Ala Leu Cys Pro Thr Arg Glu Asn Phe Asn Ser Gln Gln Lys
355 360 365
Asn Leu Ser Val Ser Cys Ala Ala Ala Ser Val Ala Ser Ser Arg Ser
370 375 380
Ser Val Leu Lys Asp Ser Glu Tyr Gly Cys Leu Lys Ile Pro Pro Arg
385 390 395 400
Cys Met Phe Asp His Pro Asp Ala Asp Lys Thr Leu Asn His Leu Ile
405 410 415
Ser Gly Phe Glu Asn Phe Glu Lys Lys Ile Asn Tyr Arg Phe Lys Asn
420 425 430
Lys Ala Tyr Leu Leu Gln Ala Phe Thr His Ala Ser Tyr His Tyr Asn
435 440 445
Thr Ile Thr Asp Cys Tyr Gln Arg Leu Glu Phe Leu Gly Asp Ala Ile
450 455 460
Leu Asp Tyr Leu Ile Thr Lys His Leu Tyr Glu Asp Pro Arg Gln His
465 470 475 480
Ser Pro Gly Val Leu Thr Asp Leu Arg Ser Ala Leu Val Asn Asn Thr
485 490 495
Ile Phe Ala Ser Leu Ala Val Lys Tyr Asp Tyr His Lys Tyr Phe Lys
500 505 510
Ala Val Ser Pro Glu Leu Phe His Val Ile Asp Asp Phe Val Gln Phe
515 520 525
Gln Leu Glu Lys Asn Glu Met Gln Gly Met Asp Ser Glu Leu Arg Arg
530 535 540
Ser Glu Glu Asp Glu Glu Lys Glu Glu Asp Ile Glu Val Pro Lys Ala
545 550 555 560
Met Gly Asp Ile Phe Glu Ser Leu Ala Gly Ala Ile Tyr Met Asp Ser
565 570 575
Gly Met Ser Leu Glu Thr Val Trp Gln Val Tyr Tyr Pro Met Met Arg
580 585 590
Pro Leu Ile Glu Lys Phe Ser Ala Asn Val Pro Arg Ser Pro Val Arg
595 600 605
Glu Leu Leu Glu Met Glu Pro Glu Thr Ala Lys Phe Ser Pro Ala Glu
610 615 620
Arg Thr Tyr Asp Gly Lys Val Arg Val Thr Val Glu Val Val Gly Lys
625 630 635 640
Gly Lys Phe Lys Gly Val Gly Arg Ser Tyr Arg Ile Ala Lys Ser Ala
645 650 655
Ala Ala Arg Arg Ala Leu Arg Ser Leu Lys Ala Asn Gln Pro Gln Val
660 665 670
Pro Asn Ser
675
<210>13
<211>2025
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码人切酶突变体的基因
<400>13
atgaatcaca aagtgcatca tcatcatcat catatcgaag gtaggaattc gagctcggta 60
ccccaagtgc tcaagggcag gatggattct gagcagagcc cttctattgg gtactcctca 120
aggactcttg gccccaatcc tggacttatt cttcaggctt tgactctgtc aaacgctagt 180
gatggattta acctggagcg gcttgaaatg cttggcgact cctttttaaa gcatgccatc 240
accacatatc tattttgcac ttaccctgat gcgcatgagg gccgcctttc atatatgaga 300
agcaaaaagg tcagcaactg taatctgtat cgccttggaa aaaagaaggg actacccagc 360
cgcatggtgg tgtcaatatt tgatccccct gtgaattggc ttcctcctgg ttatgtagta 420
aatcaagaca aaagcaacac agataaatgg gaaaaagatg aaatgacaaa agactgcatg 480
ctggcgaatg gcaaactgga tgaggattac gaggaggagg atgaggagga ggagagcctg 540
atgtggaggg ctccgaagga agaggctgac tatgaagatg atttcctgga gtatgatcag 600
gaacatatca gatttataga taatatgtta atggggtcag gagcttttgt aaagaaaatc 660
tctctttctc ctttttcaac cactgattct gcatatgaat ggaaaatgcc caaaaaatcc 720
tccttaggta gtatgccatt ttcatcagat tttgaggatt ttgactacag ctcttgggat 780
gcaatgtgct atctggatcc tagcaaagct gttgaagaag atgactttgt ggtggggttc 840
tggaatccat cagaagaaaa ctgtggtgtt gacacgggaa agcagtccat ttcttacgac 900
ttgcacactg agcagtgtat tgctgacaaa agcatagcgg actgtgtgga agccctgctg 960
ggctgctatt taaccagctg tggggagagg gctgctcagc ttttcctctg ttcactgggg 1020
ctgaaggtgc tcccggtaat taaaaggact gatcgggaaa aggccctgtg ccctactcgg 1080
gagaatttca acagccaaca aaagaacctt tcagtgagct gtgctgctgc ttctgtggcc 1140
agttcacgct cttctgtatt gaaagactcg gaatatggtt gtttgaagat tccaccaaga 1200
tgtatgtttg atcatccaga tgcagataaa acactgaatc accttatatc ggggtttgaa 1260
aattttgaaa agaaaatcaa ctacagattc aagaataagg cttaccttct ccaggctttt 1320
acacatgcct cctaccacta caatactatc actgattgtt accagcgctt agaattcctg 1380
ggagatgcga ttttggacta cctcataacc aagcaccttt atgaagaccc gcggcagcac 1440
tccccggggg tcctgacaga cctgcggtct gccctggtca acaacaccat ctttgcatcg 1500
ctggctgtaa agtacgacta ccacaagtac ttcaaagctg tctctcctga gctcttccat 1560
gtcattgatg actttgtgca gtttcagctt gagaagaatg aaatgcaagg aatggattct 1620
gagcttagga gatctgagga ggatgaagag aaagaagagg atattgaagt tccaaaggcc 1680
atgggggata tttttgagtc gcttgctggt gccatttaca tggatagtgg gatgtcactg 1740
gagacagtct ggcaggtgta ctatcccatg atgcggccac taatagaaaa gttttctgca 1800
aatgtacccc gttcccctgt gcgagaattg cttgaaatgg aaccagaaac tgccaaattt 1860
agcccggctg agagaactta cgacgggaag gtcagagtca ctgtggaagt agtaggaaag 1920
gggaaattta aaggtgttgg tcgaagttac aggattgcca aatctgcagc agcaagaaga 1980
gccctccgaa gcctcaaagc taatcaacct caggttccca atagc 2025
<210>14
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成引物5，以扩增编码人切酶突变体的基因
<400>14
tcgagctcgg tacccgcctc cattgttggt ccacca 36
<210>15
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成引物6，以扩增编码人切酶突变体的基因
<400>15
tatctagaaa gcttttagct attgggaacc tgaggt 36
<210>16
<211>3741
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码人切酶突变体的基因
<400>16
gcctccattg ttggtccacc aatgagctgt gtacgattgg ctgaaagagt tgtcgctctc 60
atttgctgtg agaaactgca caaaattggc gaactggatg accatttgat gccagttggg 120
aaagagactg ttaaatatga agaggagctt gatttgcatg atgaagaaga gaccagtgtt 180
ccaggaagac caggttccac gaaacgaagg cagtgctacc caaaagcaat tccagagtgt 240
ttgagggata gttatcccag acctgatcag ccctgttacc tgtatgtgat aggaatggtt 300
ttaactacac ctttacctga tgaactcaac tttagaaggc ggaagctcta tcctcctgaa 360
gataccacaa gatgctttgg aatactgacg gccaaaccca tacctcagat tccacacttt 420
cctgtgtaca cacgctctgg agaggttacc atatccattg agttgaagaa gtctggtttc 480
atgttgtctc tacaaatgct tgagttgatt acaagacttc accagtatat attctcacat 540
attcttcggc ttgaaaaacc tgcactagaa tttaaaccta cagacgctga ttcagcatac 600
tgtgttctac ctcttaatgt tgttaatgac tccagcactt tggatattga ctttaaattc 660
atggaagata ttgagaagtc tgaagctcgc ataggcattc ccagtacaaa gtatacaaaa 720
gaaacaccct ttgtttttaa attagaagat taccaagatg ccgttatcat tccaagatat 780
cgcaattttg atcagcctca tcgattttat gtagctgatg tgtacactga tcttacccca 840
ctcagtaaat ttccttcccc tgagtatgaa acttttgcag aatattataa aacaaagtac 900
aaccttgacc taaccaatct caaccagcca ctgctggatg tggaccacac atcttcaaga 960
cttaatcttt tgacacctcg acatttgaat cagaagggga aagcgcttcc tttaagcagt 1020
gctgagaaga ggaaagccaa atgggaaagt ctgcagaata aacagatact ggttccagaa 1080
ctctgtgcta tacatccaat tccagcatca ctgtggagaa aagctgtttg tctccccagc 1140
atactttatc gccttcactg ccttttgact gcagaggagc taagagccca gactgccagc 1200
gatgctggcg tgggagtcag atcacttcct gcggatttta gataccctaa cttagacttc 1260
gggtggaaaa aatctattga cagcaaatct ttcatctcaa tttctaactc ctcttcagct 1320
gaaaatgata attactgtaa gcacagcaca attgtccctg aaaatgctgc acatcaaggt 1380
gctaatagaa cctcctctct agaaaatcat gaccaaatgt ctgtgaactg cagaacgttg 1440
ctcagcgagt cccctggtaa gctccacgtt gaagtttcag cagatcttac agcaattaat 1500
ggtctttctt acaatcaaaa tctcgccaat ggcagttatg atttagctaa cagagacttt 1560
tgccaaggaa atcagctaaa ttactacaag caggaaatac ccgtgcaacc aactacctca 1620
tattccattc agaatttata cagttacgag aaccagcccc agcccagcga tgaatgtact 1680
ctcctgagta ataaatacct tgatggaaat gctaacaaat ctacctcaga tggaagtcct 1740
gtgatggccg taatgcctgg tacgacagac actattcaag tgctcaaggg caggatggat 1800
tctgagcaga gcccttctat tgggtactcc tcaaggactc ttggccccaa tcctggactt 1860
attcttcagg ctttgactct gtcaaacgct agtgatggat ttaacctgga gcggcttgaa 1920
atgcttggcg actccttttt aaagcatgcc atcaccacat atctattttg cacttaccct 1980
gatgcgcatg agggccgcct ttcatatatg agaagcaaaa aggtcagcaa ctgtaatctg 2040
tatcgccttg gaaaaaagaa gggactaccc agccgcatgg tggtgtcaat atttgatccc 2100
cctgtgaatt ggcttcctcc tggttatgta gtaaatcaag acaaaagcaa cacagataaa 2160
tgggaaaaag atgaaatgac aaaagactgc atgctggcga atggcaaact ggatgaggat 2220
tacgaggagg aggatgagga ggaggagagc ctgatgtgga gggctccgaa ggaagaggct 2280
gactatgaag atgatttcct ggagtatgat caggaacata tcagatttat agataatatg 2340
ttaatggggt caggagcttt tgtaaagaaa atctctcttt ctcctttttc aaccactgat 2400
tctgcatatg aatggaaaat gcccaaaaaa tcctccttag gtagtatgcc attttcatca 2460
gattttgagg attttgacta cagctcttgg gatgcaatgt gctatctgga tcctagcaaa 2520
gctgttgaag aagatgactt tgtggtgggg ttctggaatc catcagaaga aaactgtggt 2580
gttgacacgg gaaagcagtc catttcttac gacttgcaca ctgagcagtg tattgctgac 2640
aaaagcatag cggactgtgt ggaagccctg ctgggctgct atttaaccag ctgtggggag 2700
agggctgctc agcttttcct ctgttcactg gggctgaagg tgctcccggt aattaaaagg 2760
actgatcggg aaaaggccct gtgccctact cgggagaatt tcaacagcca acaaaagaac 2820
ctttcagtga gctgtgctgc tgcttctgtg gccagttcac gctcttctgt attgaaagac 2880
tcggaatatg gttgtttgaa gattccacca agatgtatgt ttgatcatcc agatgcagat 2940
aaaacactga atcaccttat atcggggttt gaaaattttg aaaagaaaat caactacaga 3000
ttcaagaata aggcttacct tctccaggct tttacacatg cctcctacca ctacaatact 3060
atcactgatt gttaccagcg cttagaattc ctgggagatg cgattttgga ctacctcata 3120
accaagcacc tttatgaaga cccgcggcag cactccccgg gggtcctgac agacctgcgg 3180
tctgccctgg tcaacaacac catctttgca tcgctggctg taaagtacga ctaccacaag 3240
tacttcaaag ctgtctctcc tgagctcttc catgtcattg atgactttgt gcagtttcag 3300
cttgagaaga atgaaatgca aggaatggat tctgagctta ggagatctga ggaggatgaa 3360
gagaaagaag aggatattga agttccaaag gccatggggg atatttttga gtcgcttgct 3420
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ttgcttgaaa tggaaccaga aactgccaaa tttagcccgg ctgagagaac ttacgacggg 3600
aaggtcagag tcactgtgga agtagtagga aaggggaaat ttaaaggtgt tggtcgaagt 3660
tacaggattg ccaaatctgc agcagcaaga agagccctcc gaagcctcaa agctaatcaa 3720
cctcaggttc ccaatagcta a 3741
<210>17
<211>1246
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人切酶突变体的氨基酸序列
<400>17
Ala Ser Ile Val Gly Pro Pro Met Ser Cys Val Arg Leu Ala Glu Arg
1 5 10 15
Val Val Ala Leu Ile Cys Cys Glu Lys Leu His Lys Ile Gly Glu Leu
20 25 30
Asp Asp His Leu Met Pro Val Gly Lys Glu Thr Val Lys Tyr Glu Glu
35 40 45
Glu Leu Asp Leu His Asp Glu Glu Glu Thr Ser Val Pro Gly Arg Pro
50 55 60
Gly Ser Thr Lys Arg Arg Gln Cys Tyr Pro Lys Ala Ile Pro Glu Cys
65 70 75 80
Leu Arg Asp Ser Tyr Pro Arg Pro Asp Gln Pro Cys Tyr Leu Tyr Val
85 90 95
Ile Gly Met Val Leu Thr Thr Pro Leu Pro Asp Glu Leu Asn Phe Arg
100 105 110
Arg Arg Lys Leu Tyr Pro Pro Glu Asp Thr Thr Arg Cys Phe Gly Ile
115 120 125
Leu Thr Ala Lys Pro Ile Pro Gln Ile Pro His Phe Pro Val Tyr Thr
130 135 140
Arg Ser Gly Glu Val Thr Ile Ser Ile Glu Leu Lys Lys Ser Gly Phe
145 150 155 160
Met Leu Ser Leu Gln Met Leu Glu Leu Ile Thr Arg Leu His Gln Tyr
165 170 175
Ile Phe Ser His Ile Leu Arg Leu Glu Lys Pro Ala Leu Glu Phe Lys
180 185 190
Pro Thr Asp Ala Asp Ser Ala Tyr Cys Val Leu Pro Leu Asn Val Val
195 200 205
Asn Asp Ser Ser Thr Leu Asp Ile Asp Phe Lys Phe Met Glu Asp Ile
210 215 220
Glu Lys Ser Glu Ala Arg Ile Gly Ile Pro Ser Thr Lys Tyr Thr Lys
225 230 235 240
Glu Thr Pro Phe Val Phe Lys Leu Glu Asp Tyr Gln Asp Ala Val Ile
245 250 255
Ile Pro Arg Tyr Arg Asn Phe Asp Gln Pro His Arg Phe Tyr Val Ala
260 265 270
Asp Val Tyr Thr Asp Leu Thr Pro Leu Ser Lys Phe Pro Ser Pro Glu
275 280 285
Tyr Glu Thr Phe Ala Glu Tyr Tyr Lys Thr Lys Tyr Asn Leu Asp Leu
290 295 300
Thr Asn Leu Asn Gln Pro Leu Leu Asp Val Asp His Thr Ser Ser Arg
305 310 315 320
Leu Asn Leu Leu Thr Pro Arg His Leu Asn Gln Lys Gly Lys Ala Leu
325 330 335
Pro Leu Ser Ser Ala Glu Lys Arg Lys Ala Lys Trp Glu Ser Leu Gln
340 345 350
Asn Lys Gln Ile Leu Val Pro Glu Leu Cys Ala Ile His Pro Ile Pro
355 360 365
Ala Ser Leu Trp Arg Lys Ala Val Cys Leu Pro Ser Ile Leu Tyr Arg
370 375 380
Leu His Cys Leu Leu Thr Ala Glu Glu Leu Arg Ala Gln Thr Ala Ser
385 390 395 400
Asp Ala Gly Val Gly Val Arg Ser Leu Pro Ala Asp Phe Arg Tyr Pro
405 410 415
Asn Leu Asp Phe Gly Trp Lys Lys Ser Ile Asp Ser Lys Ser Phe Ile
420 425 430
Ser Ile Ser Asn Ser Ser Ser Ala Glu Asn Asp Asn Tyr Cys Lys His
435 440 445
Ser Thr Ile Val Pro Glu Asn Ala Ala His Gln Gly Ala Asn Arg Thr
450 455 460
Ser Ser Leu Glu Asn His Asp Gln Met Ser Val Asn Cys Arg Thr Leu
465 470 475 480
Leu Ser Glu Ser Pro Gly Lys Leu His Val Glu Val Ser Ala Asp Leu
485 490 495
Thr Ala Ile Asn Gly Leu Ser Tyr Asn Gln Asn Leu Ala Asn Gly Ser
500 505 510
Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Asp Phe Cys Gln Gly Asn Gln Leu Asn Tyr
515 520 525
Tyr Lys Gln Glu Ile Pro Val Gln Pro Thr Thr Ser Tyr Ser Ile Gln
530 535 540
Asn Leu Tyr Ser Tyr Glu Asn Gln Pro Gln Pro Ser Asp Glu Cys Thr
545 550 555 560
Leu Leu Ser Asn Lys Tyr Leu Asp Gly Asn Ala Asn Lys Ser Thr Ser
565 570 575
Asp Gly Ser Pro Val Met Ala Val Met Pro Gly Thr Thr Asp Thr Ile
580 585 590
Gln Val Leu Lys Gly Arg Met Asp Ser Glu Gln Ser Pro Ser Ile Gly
595 600 605
Tyr Ser Ser Arg Thr Leu Gly Pro Asn Pro Gly Leu Ile Leu Gln Ala
610 615 620
Leu Thr Leu Ser Asn Ala Ser Asp Gly Phe Asn Leu Glu Arg Leu Glu
625 630 635 640
Met Leu Gly Asp Ser Phe Leu Lys His Ala Ile Thr Thr Tyr Leu Phe
645 650 655
Cys Thr Tyr Pro Asp Ala His Glu Gly Arg Leu Ser Tyr Met Arg Ser
660 665 670
Lys Lys Val Ser Asn Cys Asn Leu Tyr Arg Leu Gly Lys Lys Lys Gly
675 680 685
Leu Pro Ser Arg Met Val Val Ser Ile Phe Asp Pro Pro Val Asn Trp
690 695 700
Leu Pro Pro Gly Tyr Val Val Asn Gln Asp Lys Ser Asn Thr Asp Lys
705 710 715 720
Trp Glu Lys Asp Glu Met Thr Lys Asp Cys Met Leu Ala Asn Gly Lys
725 730 735
Leu Asp Glu Asp Tyr Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Ser Leu Met
740 745 750
Trp Arg Ala Pro Lys Glu Glu Ala Asp Tyr Glu Asp Asp Phe Leu Glu
755 760 765
Tyr Asp Gln Glu His Ile Arg Phe Ile Asp Asn Met Leu Met Gly Ser
770 775 780
Gly Ala Phe Val Lys Lys Ile Ser Leu Ser Pro Phe Ser Thr Thr Asp
785 790 795 800
Ser Ala Tyr Glu Trp Lys Met Pro Lys Lys Ser Ser Leu Gly Ser Met
805 810 815
Pro Phe Ser Ser Asp Phe Glu Asp Phe Asp Tyr Ser Ser Trp Asp Ala
820 825 830
Met Cys Tyr Leu Asp Pro Ser Lys Ala Val Glu Glu Asp Asp Phe Val
835 840 845
Val Gly Phe Trp Asn Pro Ser Glu Glu Asn Cys Gly Val Asp Thr Gly
850 855 860
Lys Gln Ser Ile Ser Tyr Asp Leu His Thr Glu Gln Cys Ile Ala Asp
865 870 875 880
Lys Ser Ile Ala Asp Cys Val Glu Ala Leu Leu Gly Cys Tyr Leu Thr
885 890 895
Ser Cys Gly Glu Arg Ala Ala Gln Leu Phe Leu Cys Ser Leu Gly Leu
900 905 910
Lys Val Leu Pro Val Ile Lys Arg Thr Asp Arg Glu Lys Ala Leu Cys
915 920 925
Pro Thr Arg Glu Asn Phe Asn Ser Gln Gln Lys Asn Leu Ser Val Ser
930 935 940
Cys Ala Ala Ala Ser Val Ala Ser Ser Arg Ser Ser Val Leu Lys Asp
945 950 955 960
Ser Glu Tyr Gly Cys Leu Lys Ile Pro Pro Arg Cys Met Phe Asp His
965 970 975
Pro Asp Ala Asp Lys Thr Leu Asn His Leu Ile Ser Gly Phe Glu Asn
980 985 990
Phe Glu Lys Lys Ile Asn Tyr Arg Phe Lys Asn Lys Ala Tyr Leu Leu
995 1000 1005
Gln Ala Phe Thr His Ala Ser Tyr His Tyr Asn Thr Ile Thr Asp
1010 1015 1020
Cys Tyr Gln Arg Leu Glu Phe Leu Gly Asp Ala Ile Leu Asp Tyr
1025 1030 1035
Leu Ile Thr Lys His Leu Tyr Glu Asp Pro Arg Gln His Ser Pro
1040 1045 1050
Gly Val Leu Thr Asp Leu Arg Ser Ala Leu Val Asn Asn Thr Ile
1055 1060 1065
Phe Ala Ser Leu Ala Val Lys Tyr Asp Tyr His Lys Tyr Phe Lys
1070 1075 1080
Ala Val Ser Pro Glu Leu Phe His Val Ile Asp Asp Phe Val Gln
1085 1090 1095
Phe Gln Leu Glu Lys Asn Glu Met Gln Gly Met Asp Ser Glu Leu
1100 1105 1110
Arg Arg Ser Glu Glu Asp Glu Glu Lys Glu Glu Asp Ile Glu Val
1115 1120 1125
Pro Lys Ala Met Gly Asp Ile Phe Glu Ser Leu Ala Gly Ala Ile
1130 1135 1140
Tyr Met Asp Ser Gly Met Ser Leu Glu Thr Val Trp Gln Val Tyr
1145 1150 1155
Tyr Pro Met Met Arg Pro Leu Ile Glu Lys Phe Ser Ala Asn Val
1160 1165 1170
Pro Arg Ser Pro Val Arg Glu Leu Leu Glu Met Glu Pro Glu Thr
1175 1180 1185
Ala Lys Phe Ser Pro Ala Glu Arg Thr Tyr Asp Gly Lys Val Arg
1190 1195 1200
Val Thr Val Glu Val Val Gly Lys Gly Lys Phe Lys Gly Val Gly
1205 1210 1215
Arg Ser Tyr Arg Ile Ala Lys Ser Ala Ala Ala Arg Arg Ala Leu
1220 1225 1230
Arg Ser Leu Lys Ala Asn Gln Pro Gln Val Pro Asn Ser
1235 1240 1245
<210>18
<211>1267
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人切酶突变体的氨基酸序列
<400>18
Met Asn His Lys Val His His His His His His Ile Glu Gly Arg Asn
1 5 10 15
Ser Ser Ser Val Pro Ala Ser Ile Val Gly Pro Pro Met Ser Cys Val
20 25 30
Arg Leu Ala Glu Arg Val Val Ala Leu Ile Cys Cys Glu Lys Leu His
35 40 45
Lys Ile Gly Glu Leu Asp Asp His Leu Met Pro Val Gly Lys Glu Thr
50 55 60
Val Lys Tyr Glu Glu Glu Leu Asp Leu His Asp Glu Glu Glu Thr Ser
65 70 75 80
Val Pro Gly Arg Pro Gly Ser Thr Lys Arg Arg Gln Cys Tyr Pro Lys
85 90 95
Ala Ile Pro Glu Cys Leu Arg Asp Ser Tyr Pro Arg Pro Asp Gln Pro
100 105 110
Cys Tyr Leu Tyr Val Ile Gly Met Val Leu Thr Thr Pro Leu Pro Asp
115 120 125
Glu Leu Asn Phe Arg Arg Arg Lys Leu Tyr Pro Pro Glu Asp Thr Thr
130 135 140
Arg Cys Phe Gly Ile Leu Thr Ala Lys Pro Ile Pro Gln Ile Pro His
145 150 155 160
Phe Pro Val Tyr Thr Arg Ser Gly Glu Val Thr Ile Ser Ile Glu Leu
165 170 175
Lys Lys Ser Gly Phe Met Leu Ser Leu Gln Met Leu Glu Leu Ile Thr
180 185 190
Arg Leu His Gln Tyr Ile Phe Ser His Ile Leu Arg Leu Glu Lys Pro
195 200 205
Ala Leu Glu Phe Lys Pro Thr Asp Ala Asp Ser Ala Tyr Cys Val Leu
210 215 220
Pro Leu Asn Val Val Asn Asp Ser Ser Thr Leu Asp Ile Asp Phe Lys
225 230 235 240
Phe Met Glu Asp Ile Glu Lys Ser Glu Ala Arg Ile Gly Ile Pro Ser
245 250 255
Thr Lys Tyr Thr Lys Glu Thr Pro Phe Val Phe Lys Leu Glu Asp Tyr
260 265 270
Gln Asp Ala Val Ile Ile Pro Arg Tyr Arg Asn Phe Asp Gln Pro His
275 280 285
Arg Phe Tyr Val Ala Asp Val Tyr Thr Asp Leu Thr Pro Leu Ser Lys
290 295 300
Phe Pro Ser Pro Glu Tyr Glu Thr Phe Ala Glu Tyr Tyr Lys Thr Lys
305 310 315 320
Tyr Asn Leu Asp Leu Thr Asn Leu Asn Gln Pro Leu Leu Asp Val Asp
325 330 335
His Thr Ser Ser Arg Leu Asn Leu Leu Thr Pro Arg His Leu Asn Gln
340 345 350
Lys Gly Lys Ala Leu Pro Leu Ser Ser Ala Glu Lys Arg Lys Ala Lys
355 360 365
Trp Glu Ser Leu Gln Asn Lys Gln Ile Leu Val Pro Glu Leu Cys Ala
370 375 380
Ile His Pro Ile Pro Ala Ser Leu Trp Arg Lys Ala Val Cys Leu Pro
385 390 395 400
Ser Ile Leu Tyr Arg Leu His Cys Leu Leu Thr Ala Glu Glu Leu Arg
405 410 415
Ala Gln Thr Ala Ser Asp Ala Gly Val Gly Val Arg Ser Leu Pro Ala
420 425 430
Asp Phe Arg Tyr Pro Asn Leu Asp Phe Gly Trp Lys Lys Ser Ile Asp
435 440 445
Ser Lys Ser Phe Ile Ser Ile Ser Asn Ser Ser Ser Ala Glu Asn Asp
450 455 460
Asn Tyr Cys Lys His Ser Thr Ile Val Pro Glu Asn Ala Ala His Gln
465 470 475 480
Gly Ala Asn Arg Thr Ser Ser Leu Glu Asn His Asp Gln Met Ser Val
485 490 495
Asn Cys Arg Thr Leu Leu Ser Glu Ser Pro Gly Lys Leu His Val Glu
500 505 510
Val Ser Ala Asp Leu Thr Ala Ile Asn Gly Leu Ser Tyr Asn Gln Asn
515 520 525
Leu Ala Asn Gly Ser Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Asp Phe Cys Gln Gly
530 535 540
Asn Gln Leu Asn Tyr Tyr Lys Gln Glu Ile Pro Val Gln Pro Thr Thr
545 550 555 560
Ser Tyr Ser Ile Gln Asn Leu Tyr Ser Tyr Glu Asn Gln Pro Gln Pro
565 570 575
Ser Asp Glu Cys Thr Leu Leu Ser Asn Lys Tyr Leu Asp Gly Asn Ala
580 585 590
Asn Lys Ser Thr Ser Asp Gly Ser Pro Val Met Ala Val Met Pro Gly
595 600 605
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610 615 620
Ser Pro Ser Ile Gly Tyr Ser Ser Arg Thr Leu Gly Pro Asn Pro Gly
625 630 635 640
Leu Ile Leu Gln Ala Leu Thr Leu Ser Asn Ala Ser Asp Gly Phe Asn
645 650 655
Leu Glu Arg Leu Glu Met Leu Gly Asp Ser Phe Leu Lys His Ala Ile
660 665 670
Thr Thr Tyr Leu Phe Cys Thr Tyr Pro Asp Ala His Glu Gly Arg Leu
675 680 685
Ser Tyr Met Arg Ser Lys Lys Val Ser Asn Cys Asn Leu Tyr Arg Leu
690 695 700
Gly Lys Lys Lys Gly Leu Pro Ser Arg Met Val Val Ser Ile Phe Asp
705 710 715 720
Pro Pro Val Asn Trp Leu Pro Pro Gly Tyr Val Val Asn Gln Asp Lys
725 730 735
Ser Asn Thr Asp Lys Trp Glu Lys Asp Glu Met Thr Lys Asp Cys Met
740 745 750
Leu Ala Asn Gly Lys Leu Asp Glu Asp Tyr Glu Glu Glu Asp Glu Glu
755 760 765
Glu Glu Ser Leu Met Trp Arg Ala Pro Lys Glu Glu Ala Asp Tyr Glu
770 775 780
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785 790 795 800
Met Leu Met Gly Ser Gly Ala Phe Val Lys Lys Ile Ser Leu Ser Pro
805 810 815
Phe Ser Thr Thr Asp Ser Ala Tyr Glu Trp Lys Met Pro Lys Lys Ser
820 825 830
Ser Leu Gly Ser Met Pro Phe Ser Ser Asp Phe Glu Asp Phe Asp Tyr
835 840 845
Ser Ser Trp Asp Ala Met Cys Tyr Leu Asp Pro Ser Lys Ala Val Glu
850 855 860
Glu Asp Asp Phe Val Val Gly Phe Trp Asn Pro Ser Glu Glu Asn Cys
865 870 875 880
Gly Val Asp Thr Gly Lys Gln Ser Ile Ser Tyr Asp Leu His Thr Glu
885 890 895
Gln Cys Ile Ala Asp Lys Ser Ile Ala Asp Cys Val Glu Ala Leu Leu
900 905 910
Gly Cys Tyr Leu Thr Ser Cys Gly Glu Arg Ala Ala Gln Leu Phe Leu
915 920 925
Cys Ser Leu Gly Leu Lys Val Leu Pro Val Ile Lys Arg Thr Asp Arg
930 935 940
Glu Lys Ala Leu Cys Pro Thr Arg Glu Asn Phe Asn Ser Gln Gln Lys
945 950 955 960
Asn Leu Ser Val Ser Cys Ala Ala Ala Ser Val Ala Ser Ser Arg Ser
965 970 975
Ser Val Leu Lys Asp Ser Glu Tyr Gly Cys Leu Lys Ile Pro Pro Arg
980 985 990
Cys Met Phe Asp His Pro Asp Ala Asp Lys Thr Leu Asn His Leu Ile
995 1000 1005
Ser Gly Phe Glu Asn Phe Glu Lys Lys Ile Asn Tyr Arg Phe Lys
1010 1015 1020
Asn Lys Ala Tyr Leu Leu Gln Ala Phe Thr His Ala Ser Tyr His
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1040 1045 1050
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1055 1060 1065
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1070 1075 1080
Leu Val Asn Asn Thr Ile Phe Ala Ser Leu Ala Val Lys Tyr Asp
1085 1090 1095
Tyr His Lys Tyr Phe Lys Ala Val Ser Pro Glu Leu Phe His Val
1100 1105 1110
Ile Asp Asp Phe Val Gln Phe Gln Leu Glu Lys Asn Glu Met Gln
1115 1120 1125
Gly Met Asp Ser Glu Leu Arg Arg Ser Glu Glu Asp Glu Glu Lys
1130 1135 1140
Glu Glu Asp Ile Glu Val Pro Lys Ala Met Gly Asp Ile Phe Glu
1145 1150 1155
Ser Leu Ala Gly Ala Ile Tyr Met Asp Ser Gly Met Ser Leu Glu
1160 1165 1170
Thr Val Trp Gln Val Tyr Tyr Pro Met Met Arg Pro Leu Ile Glu
1175 1180 1185
Lys Phe Ser Ala Asn Val Pro Arg Ser Pro Val Arg Glu Leu Leu
1190 1195 1200
Glu Met Glu Pro Glu Thr Ala Lys Phe Ser Pro Ala Glu Arg Thr
1205 1210 1215
Tyr Asp Gly Lys Val Arg Val Thr Val Glu Val Val Gly Lys Gly
1220 1225 1230
Lys Phe Lys Gly Val Gly Arg Ser Tyr Arg Ile Ala Lys Ser Ala
1235 1240 1245
Ala Ala Arg Arg Ala Leu Arg Ser Leu Lys Ala Asn Gln Pro Gln
1250 1255 1260
Val Pro Asn Ser
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<210>19
<211>3804
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码人切酶突变体的基因
<400>19
atgaatcaca aagtgcatca tcatcatcat catatcgaag gtaggaattc gagctcggta 60
cccgcctcca ttgttggtcc accaatgagc tgtgtacgat tggctgaaag agttgtcgct 120
ctcatttgct gtgagaaact gcacaaaatt ggcgaactgg atgaccattt gatgccagtt 180
gggaaagaga ctgttaaata tgaagaggag cttgatttgc atgatgaaga agagaccagt 240
gttccaggaa gaccaggttc cacgaaacga aggcagtgct acccaaaagc aattccagag 300
tgtttgaggg atagttatcc cagacctgat cagccctgtt acctgtatgt gataggaatg 360
gttttaacta cacctttacc tgatgaactc aactttagaa ggcggaagct ctatcctcct 420
gaagatacca caagatgctt tggaatactg acggccaaac ccatacctca gattccacac 480
tttcctgtgt acacacgctc tggagaggtt accatatcca ttgagttgaa gaagtctggt 540
ttcatgttgt ctctacaaat gcttgagttg attacaagac ttcaccagta tatattctca 600
catattcttc ggcttgaaaa acctgcacta gaatttaaac ctacagacgc tgattcagca 660
tactgtgttc tacctcttaa tgttgttaat gactccagca ctttggatat tgactttaaa 720
ttcatggaag atattgagaa gtctgaagct cgcataggca ttcccagtac aaagtataca 780
aaagaaacac cctttgtttt taaattagaa gattaccaag atgccgttat cattccaaga 840
tatcgcaatt ttgatcagcc tcatcgattt tatgtagctg atgtgtacac tgatcttacc 900
ccactcagta aatttccttc ccctgagtat gaaacttttg cagaatatta taaaacaaag 960
tacaaccttg acctaaccaa tctcaaccag ccactgctgg atgtggacca cacatcttca 1020
agacttaatc ttttgacacc tcgacatttg aatcagaagg ggaaagcgct tcctttaagc 1080
agtgctgaga agaggaaagc caaatgggaa agtctgcaga ataaacagat actggttcca 1140
gaactctgtg ctatacatcc aattccagca tcactgtgga gaaaagctgt ttgtctcccc 1200
agcatacttt atcgccttca ctgccttttg actgcagagg agctaagagc ccagactgcc 1260
agcgatgctg gcgtgggagt cagatcactt cctgcggatt ttagataccc taacttagac 1320
ttcgggtgga aaaaatctat tgacagcaaa tctttcatct caatttctaa ctcctcttca 1380
gctgaaaatg ataattactg taagcacagc acaattgtcc ctgaaaatgc tgcacatcaa 1440
ggtgctaata gaacctcctc tctagaaaat catgaccaaa tgtctgtgaa ctgcagaacg 1500
ttgctcagcg agtcccctgg taagctccac gttgaagttt cagcagatct tacagcaatt 1560
aatggtcttt cttacaatca aaatctcgcc aatggcagtt atgatttagc taacagagac 1620
ttttgccaag gaaatcagct aaattactac aagcaggaaa tacccgtgca accaactacc 1680
tcatattcca ttcagaattt atacagttac gagaaccagc cccagcccag cgatgaatgt 1740
actctcctga gtaataaata ccttgatgga aatgctaaca aatctacctc agatggaagt 1800
cctgtgatgg ccgtaatgcc tggtacgaca gacactattc aagtgctcaa gggcaggatg 1860
gattctgagc agagcccttc tattgggtac tcctcaagga ctcttggccc caatcctgga 1920
cttattcttc aggctttgac tctgtcaaac gctagtgatg gatttaacct ggagcggctt 1980
gaaatgcttg gcgactcctt tttaaagcat gccatcacca catatctatt ttgcacttac 2040
cctgatgcgc atgagggccg cctttcatat atgagaagca aaaaggtcag caactgtaat 2100
ctgtatcgcc ttggaaaaaa gaagggacta cccagccgca tggtggtgtc aatatttgat 2160
ccccctgtga attggcttcc tcctggttat gtagtaaatc aagacaaaag caacacagat 2220
aaatgggaaa aagatgaaat gacaaaagac tgcatgctgg cgaatggcaa actggatgag 2280
gattacgagg aggaggatga ggaggaggag agcctgatgt ggagggctcc gaaggaagag 2340
gctgactatg aagatgattt cctggagtat gatcaggaac atatcagatt tatagataat 2400
atgttaatgg ggtcaggagc ttttgtaaag aaaatctctc tttctccttt ttcaaccact 2460
gattctgcat atgaatggaa aatgcccaaa aaatcctcct taggtagtat gccattttca 2520
tcagattttg aggattttga ctacagctct tgggatgcaa tgtgctatct ggatcctagc 2580
aaagctgttg aagaagatga ctttgtggtg gggttctgga atccatcaga agaaaactgt 2640
ggtgttgaca cgggaaagca gtccatttct tacgacttgc acactgagca gtgtattgct 2700
gacaaaagca tagcggactg tgtggaagcc ctgctgggct gctatttaac cagctgtggg 2760
gagagggctg ctcagctttt cctctgttca ctggggctga aggtgctccc ggtaattaaa 2820
aggactgatc gggaaaaggc cctgtgccct actcgggaga atttcaacag ccaacaaaag 2880
aacctttcag tgagctgtgc tgctgcttct gtggccagtt cacgctcttc tgtattgaaa 2940
gactcggaat atggttgttt gaagattcca ccaagatgta tgtttgatca tccagatgca 3000
gataaaacac tgaatcacct tatatcgggg tttgaaaatt ttgaaaagaa aatcaactac 3060
agattcaaga ataaggctta ccttctccag gcttttacac atgcctccta ccactacaat 3120
actatcactg attgttacca gcgcttagaa ttcctgggag atgcgatttt ggactacctc 3180
ataaccaagc acctttatga agacccgcgg cagcactccc cgggggtcct gacagacctg 3240
cggtctgccc tggtcaacaa caccatcttt gcatcgctgg ctgtaaagta cgactaccac 3300
aagtacttca aagctgtctc tcctgagctc ttccatgtca ttgatgactt tgtgcagttt 3360
cagcttgaga agaatgaaat gcaaggaatg gattctgagc ttaggagatc tgaggaggat 3420
gaagagaaag aagaggatat tgaagttcca aaggccatgg gggatatttt tgagtcgctt 3480
gctggtgcca tttacatgga tagtgggatg tcactggaga cagtctggca ggtgtactat 3540
cccatgatgc ggccactaat agaaaagttt tctgcaaatg taccccgttc ccctgtgcga 3600
gaattgcttg aaatggaacc agaaactgcc aaatttagcc cggctgagag aacttacgac 3660
gggaaggtca gagtcactgt ggaagtagta ggaaagggga aatttaaagg tgttggtcga 3720
agttacagga ttgccaaatc tgcagcagca agaagagccc tccgaagcct caaagctaat 3780
caacctcagg ttcccaatag ctaa 3804
<210>20
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成引物rsGFP-F，以扩增编码rsGFP的基因
<400>20
gccacaacat tgaagatgga 20
<210>21
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成引物rsGFP-R，以扩增编码rsGFP的基因
<400>21
gaaagggcag attgtgtgga 20
<210>22
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成引物Neo-F，以扩增编码Neo的基因
<400>22
atagcgttgg ctacccgtga 20
<210>23
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成引物Neo-R，以扩增编码Neo的基因
<400>23
gaaggcgata gaaggcgatg 20
<210>24
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成引物dsl-1，以扩增编码萤光素酶的基因
<400>24
gggtaatacg actcactata gggagaatgg aagacgccaa aa 42
<210>25
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成引物dsl-2，以扩增编码萤光素酶的基因
<400>25
gggtaatacg actcactata gggagagaac gtgtacatcg ac 42
<210>26
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成引物E，以扩增编码CspB的基因
<400>26
gagcggataa catatgagag gaaaggttaa gtgg 34
<210>27
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成引物F，以扩增编码CspB的基因
<400>27
gagcggataa ggatccttac tcaactactt tcacgtg 37
Claims (29)
1.一种具有降解dsRNA活性的蛋白质，所述蛋白质具有作用于dsRNA以产生特定长度dsRNA的活性。
2.权利要求1的蛋白质，所述蛋白质具有切酶的功能结构域。
3.权利要求2的蛋白质，其中所述切酶的功能结构域由RNA酶IIIa、RNA酶IIIb和dsRNA结合结构域组成。
4.权利要求3的蛋白质，其中所述蛋白质还包含PAZ结构域。
5.权利要求1的蛋白质，其中所述特定长度的dsRNA是约15-30个碱基对的dsRNA。
6.权利要求1的蛋白质，所述蛋白质是由SEQ ID NO：4或17的氨基酸序列、或者由SEQ ID NO：3或16的核苷酸序列所编码的氨基酸序列组成的蛋白质。
7.权利要求1的蛋白质，所述蛋白质是由在SEQ ID NO：4或17的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入或添加的氨基酸序列组成的蛋白质。
8.一种用于产生权利要求1所限定的具有降解dsRNA活性的蛋白质的方法，所述方法包括将密码子转变成适合于在宿主中表达的密码子，或者增强宿主使用罕用密码子。
9.一种用于产生权利要求1所限定的具有降解dsRNA活性的蛋白质的方法，所述方法包括使用冷诱导型载体来表达所述蛋白质。
10.一种试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1所限定的具有降解dsRNA活性的蛋白质。
11.一种降解dsRNA的方法，所述方法包括在具有与核酸结合活性的蛋白质的存在下，让具有降解dsRNA活性的蛋白质作用于dsRNA，以产生特定长度的dsRNA。
12.权利要求11的方法，其中所述具有与核酸结合活性的蛋白质和具有降解dsRNA活性的蛋白质是融合蛋白。
13.权利要求11的方法，其中所述具有与核酸结合活性的蛋白质是具有与RNA结合活性的蛋白质。
14.权利要求13的方法，其中所述具有与RNA结合活性的蛋白质是冷激蛋白。
15.权利要求14的方法，其中所述冷激蛋白来源于嗜热菌或耐热菌。
16.权利要求15的方法，其中所述冷激蛋白是来自海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的冷激蛋白B。
17.权利要求11的方法，其中所述特定长度的dsRNA是约15-30个碱基对的dsRNA。
18.权利要求11的方法，其中所述具有降解dsRNA活性的蛋白质是权利要求1-7中任一项限定的蛋白质。
19.权利要求11的方法，其中所述具有降解dsRNA活性的蛋白质是天然切酶或其功能性等同物。
20.一种合成RNA的方法，所述方法包括在具有与核酸结合活性的蛋白质的存在下，用具有合成RNA活性的蛋白质，进行RNA合成反应。
21.权利要求20的方法，其中使用所述具有与核酸结合活性的蛋白质和所述具有合成RNA活性的蛋白质的融合蛋白。
22.权利要求20的方法，其中所述具有与核酸结合活性的蛋白质是冷激蛋白。
23.权利要求22的方法，其中所述冷激蛋白来源于嗜热菌或耐热菌。
24.权利要求23的方法，其中所述冷激蛋白是来自海栖热袍菌的冷激蛋白B。
25.权利要求20的方法，其中所述具有合成RNA活性的蛋白质是依赖DNA的RNA聚合酶。
26.一种用于权利要求11所限定的方法的组合物，所述组合物包含具有与核酸结合活性的蛋白质和具有降解dsRNA活性的蛋白质。
27.一种用于权利要求11所限定的方法的试剂盒，所述试剂盒包含具有与核酸结合活性的蛋白质和具有降解dsRNA活性的蛋白质。
28.一种用于权利要求20所限定的方法的组合物，所述组合物包含具有与核酸结合活性的蛋白质和具有合成RNA活性的蛋白质。
29.一种用于权利要求20所限定的方法的试剂盒，所述试剂盒包含具有与核酸结合活性的蛋白质和具有合成RNA活性的蛋白质。
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