CN1867351A - 肾疾病治疗剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及以集落刺激因子(CSF)为有效成分的肾疾病治疗剂及以集落刺激因子(CSF)为有效成分的肾组织修复·再生剂。集落刺激因子(CSF)优选粒细胞集落刺激因子(G－CSF)。

Description

肾疾病治疗剂

技术领域

本发明涉及新型肾疾病治疗剂以及肾组织修复·再生剂。本发明的肾疾病治疗剂以及肾组织修复·再生剂含有集落刺激因子(CSF)作为有效成分。

背景技术

人G-CSF是一种作为粒细胞系造血干细胞的分化诱导因子被发现的造血因子，由于其在机体内促进嗜中性粒细胞造血，因而在临床中被用作骨髓移植或癌症化疗后的嗜中性粒细胞减少症治疗剂。此外，除了上述作用之外，人G-CSF还具有通过作用于干细胞刺激其分化增殖的作用和将骨髓中的干细胞动员到外周血中的作用。在实际中，基于后一种作用，为了促进在临床上实施了强化疗后的癌症患者的造血恢复，通常实施移植被人G-CSF动员的外周血造血干细胞的外周血干细胞移植术。但是，并未报告过将G-CSF用于肾疾病的治疗。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肾疾病治疗方法和使肾修复或再生的方法。

本发明要解决的问题

本发明者针对G-CSF的肾疾病治疗效果和肾脏的修复·再生效果进行了研究。结果发现，通过G-CSF给药可以修复被损坏的肾组织，G-CSF可以用作肾疾病治疗剂和肾组织修复·再生剂。本发明是基于上述认识而完成的。

即，本发明提供如下内容：

(1)以集落刺激因子(CSF)为有效成分的肾疾病治疗剂。

(2)如上述(1)所述的肾疾病治疗剂，其中集落刺激因子为粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。

(3)如上述(1)或(2)所述的肾疾病治疗剂，其中肾疾病为慢性肾衰。

(4)如上述(1)或(2)所述的肾疾病治疗剂，其中肾疾病为急性肾衰。

(5)如上述(1)或(2)所述的肾疾病治疗剂，其中肾疾病为肾病。

(6)如上述(5)所述的肾疾病治疗剂，其中肾疾病为糖尿病性肾病。

(7)如上述(5)所述的肾疾病治疗剂，其中肾疾病为动脉硬化性肾病。

(8)以粒细胞集落刺激因子(CSF)为有效成分的肾组织修复·再生剂。

(9)如(8)所述的肾组织修复·再生剂，其中集落刺激因子为粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。

(10)一种通过使G-CSF与肾组织或者存在于肾组织中的细胞相接触，使肾组织或者存在于肾组织中的细胞增殖或再生的方法。

具体实施方式

本发明的肾疾病治疗剂以集落刺激因子(CSF)为有效成分。作为集落刺激因子(CSF)，可以列举出粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(CM-CSF)等，在本发明中，优选使用粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。

与作为本发明的治疗剂的治疗对象的肾疾病并没有特别的限制，可以是肾衰、肾病、梗阻性肾病等任何肾病，但优选为肾衰或肾病。

肾衰通常是指肾机能降低，氮代谢产物的代谢、排泄、水·电解质、酸碱平衡的保持、肾特异性激素等生理活性物质的产生、分泌、代谢等受到阻碍的疾病状态(《新临床内科学》，医学书院，2002年，1289～1296，1331-1335)。

肾衰分为慢性肾衰(chronic renal failure：CRF)和急性肾衰(acute renal failure：ARF)，本发明治疗剂的治疗对象为慢性肾衰、急性肾衰均可。急性肾衰分为肾血流量减少引起的肾前性急性肾衰、两侧性尿路梗阻引起的肾后性急性肾衰、由于肾实质损伤引起的肾性急性肾衰等。作为慢性肾衰的病因，可以列举出糖尿病性肾病、慢性肾小球肾炎、肾硬化症、多囊性肾病等。

作为本发明的治疗剂的治疗对象的肾病并没有特别的限制，可以是由于全身性疾病引起的肾病、药物引起的肾病、重金属引起的肾病等均可。作为由于全身性疾病引起的肾病，可以列举出由于糖尿病引起的肾病、由于动脉硬化引起的肾病、由于全身性红斑狼疮引起的肾病、进行性全身硬化症引起的肾病、类风湿性关节炎引起的肾病、混合性结缔组织病引起的肾病、冷球蛋白血症引起的肾病、结节性多动脉炎引起的肾病、韦格纳(Wegener)肉芽肿引起的肾病、过敏性(Schonlein-Henoch)紫斑症引起的肾病等，优选糖尿病性肾病或动脉硬化症性肾病。作为由药引起的肾病，可以列举出由抗癌剂、抗生素(例如青霉素类、头孢类、氨基糖苷类、多肽类、抗真菌剂类等)、镇痛剂(非甾体抗炎药等)、免疫抑制剂(环孢菌素A等)、造影剂、青霉胺、锂、海洛因、甲苯磺丁脲、丙磺舒、甲氰咪胍等引起的肾疾病。作为由重金属引起的疾病，可以列举出由汞、铅、铂、金、银、铜、镉、铁等引起的肾病。

此外，本发明的治疗剂还可以用作肾修复或再生剂。因此，本发明涉及以集落刺激因子，特别是G-CSF为有效成分的肾修复·再生剂。

本发明中修复·再生的肾脏可以是受到损伤的肾脏、坏死的肾脏、切除的肾脏等任一种肾脏。例如，在必须对由于药物等损伤的肾脏、血流量不足引起的坏死的肾脏等肾组织进行修复或再生的场合，可以使用本发明的修复·再生剂。

肾的修复·再生可以通过在机体内给予本发明的修复·再生剂来进行，另外，也可以在体外培养肾组织时添加本发明的修复·再生剂。

通过本发明的肾组织修复·治疗剂，可以使降低或丧失的肾功能得到恢复。肾功能的评价通常是已知的，并可以通过本领域技术人员已知的方法来进行评价。例如，可以通过BUN(血尿素氮)值、肌酐值等指标进行评价。

本发明进一步涉及通过使G-CSF与肾组织或者存在于肾组织中的细胞相接触，使肾组织或者存在于肾组织中的细胞增殖或再生的方法。G-CSF与肾组织或者存在于肾组织中的细胞的接触可以在体内进行，也可以在体外进行。

肾组织是由肾实质(肾小球、近端肾小管、细尿管袢、远端肾小管、集合管、肾小球囊、输出小动脉等)和肾盂等构成的，作为存在于肾组织中的细胞，可以举出肾小球系膜细胞、内皮细胞、上皮细胞、肾素分泌细胞、集合管主细胞(P Cell)、集合管闰细胞(I Cell)等。

本发明的肾病治疗剂或肾修复·再生剂的有效成分G-CSF可以使用任何G-CSF，但优选使用高度纯化的G-CSF，更具体来说，是哺乳动物G-CSF，特别是具有与人G-CSF实质上相同的生物活性的G-CSF。G-CSF的来源并没有特别的限制，可以使用天然来源的G-CSF、也可以使用通过基因重组方法得到的G-CSF等，优选使用通过基因重组方法得到的G-CSF等。在通过基因重组方法得到的G-CSF中，可以是与天然来源的G-CSF具有相同的氨基酸序列，或者该氨基酸序列中的1个或多个氨基酸进行缺失、替换、添加等的与天然来源的G-CSF具有相同的生物活性的G-CSF等。氨基酸的缺失、替换、添加等可以通过本领域技术人员已知的方法来进行。例如，本领域技术人员通过定点诱变(Gotoh，T等，(1995)Gene 152，271-275；Zoller，M.J.和Smith，M.(1983)Methods Enzymol.100，468-500；Kramer，W.等(1984)Nucleic Acid Res.12，9441-9456；Kramer，W.和Fritz，H.J.(1987)Methods Enzymol.154，350-367；Kunkel，T.A.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82，488-492；Kunkel(1988)MethodsEnzymol.85，2763-2766)等，在G-CSF的氨基酸中导入适当的突变，可以制备与G-CSF具有同等功能的多肽。此外，氨基酸的变异也可以在自然界中产生。通常，在被替换的氨基酸残基中，优选替换成保持氨基酸侧链的性质的其他的氨基酸。例如，作为氨基酸侧链的性质，可以列举出疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、亲水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、具有脂肪族侧链的氨基酸(G、A、V、L、I、P)、具有含羟基的侧链的氨基酸(S、T、Y)、具有含硫侧链的氨基酸(C、M)、具有含羧酸和酰胺的侧链的氨基酸(D、N、E、Q)、具有含碱基的侧链的氨基酸(R、K、H)、具有含芳基的侧链的氨基酸(H、F、Y、W)(括号内的任何氨基酸都表示为一个字母)。已知，具有相对某一氨基酸序列的1个或多个氨基残基缺失、添加和/或被其他氨基酸替换而修饰的氨基酸序列的多肽能够保持其生物活性(Mark，D.F.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81，5662-5666；Zoller，M.J.和Smith，M.，Nucleic Acids Research(1982)10，6487-6500；Wang，A.等，Science 224，1431-1433；Dalbadie-McFarland，G.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982)79，6409-6413)。

此外，还可以使用G-CSF与其他的蛋白质融合的蛋白质。为了制造融合的多肽，例如可以将编码G-CSF的DNA与编码其他蛋白质的DNA符合读框地连接并将其导入到表达载体中，使其在宿主中表达。作为本发明的用于与G-CSF融合的其他蛋白质，并没有特别的限制。

并且，还可以使用化学修饰的G-CSF。作为化学修饰的G-CSF的实例，可以列举出例如进行了糖链结构的改变、添加、缺失操作的G-CSF、或结合了聚乙二醇·维生素B12等无机或有机化合物等的G-CSF等。

本发明所使用的G-CSF可以是通过任何方法制造的，例如培养人肿瘤细胞或产生人G-CSF的杂交瘤的细胞株，通过各种方法对其提取分离纯化的G-CSF，或者通过基因工程方法由大肠杆菌、酵母菌、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、C127细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞、BHK细胞、昆虫细胞等中产生，并通过各种方法提取分离纯化的G-CSF等均可使用。在本发明中所使用的G-CSF优选是通过基因工程方法制造的G-CSF，并优选是使用哺乳动物细胞(特别是CHO细胞)制造的G-CSF(例如特公平1-44200号公报、特公平2-5395号公报、特开昭62-129298号公报、特开昭62-132899号公报、特开昭62-236488号公报、特开昭64-85098号公报)。

在本发明的肾疾病治疗剂或肾修复·再生剂中，可以根据其给药方法和剂型，适当地添加助悬剂、助溶剂、稳定剂、等渗剂、防腐剂、防吸附剂、表面活性剂、稀释剂、赋形剂、pH调节剂、无痛剂、缓冲剂、含硫还原剂、抗氧化剂等。

作为助悬剂的实例，可以列举出甲基纤维素、聚山梨酯80、聚山梨酯20、羟乙基纤维素、阿拉伯胶、黄蓍胶粉末、羧甲基纤维素钠、聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯等。

作为助溶剂，可以列举出聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚山梨酯80、聚山梨酯20、烟酰胺、低分子聚乙二醇混合物(Macrogol)、蓖麻油脂肪酸乙酯等。

作为稳定剂，可以列举出右旋糖苷40、甲基纤维素、明胶、亚硫酸钠、偏亚硫酸钠等。

作为等渗剂，可以列举出D-甘露醇、山梨糖醇等。

作为防腐剂，可以列举出对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、山梨酸、苯酚、甲酚、氯甲酚等。

作为防吸附剂，可以列举出人血清白蛋白、卵磷脂、右旋糖苷、环氧乙烷·环氧丙烷共聚物、羟丙基纤维素、甲基纤维素、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚乙二醇等。

作为表面活性剂，作为其典型实例，可以列举出非离子表面活性剂，例如山梨糖醇酐单辛酸酯、山梨糖醇酐单月桂酸酯、山梨糖醇酐单棕榈酸酯等山梨糖醇酐脂肪酸酯；单辛酸甘油酯、单肉豆蔻酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯等脂肪酸甘油酯；单硬脂酸十甘油酯、双硬脂酸十甘油酯、单亚油酸十甘油酯等聚甘油脂肪酸酯；聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐三油酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐三硬脂酸酯等聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯；聚氧乙烯山梨糖醇四硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇四油酸酯等聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯；聚氧乙烯单硬脂酸甘油酯等聚氧乙烯脂肪酸甘油酯；聚乙二醇二硬脂酸酯等聚乙二醇脂肪酸酯；聚氧乙烯月桂基醚等聚氧乙烯烷基醚；聚氧乙烯聚氧丙烯醚、聚氧乙烯聚氧丙烯丙基醚、聚氧乙烯聚氧丙烯十六烷基醚等聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚；聚氧乙烯壬基苯基醚等聚氧乙烯烷基苯基醚；聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油(聚氧乙烯氢化蓖麻油)等聚氧乙烯固化蓖麻油；聚氧乙烯山梨糖醇蜂蜡等聚氧乙烯蜂蜡衍生物；聚氧乙烯羊毛脂等聚氧乙烯羊毛脂衍生物；聚氧乙烯硬脂酰胺等HLB6～18的聚氧乙烯脂肪酰胺；阴离子表面活性剂，例如鲸蜡基硫酸钠、月桂基硫酸钠、油基硫酸钠等具有碳原子数10～18的烷基的烷基硫酸盐；聚氧乙烯十二烷基硫酸钠等环氧乙烷的平均加成摩尔数为2～4且烷基碳原子数为10～18的聚氧乙烯烷基醚硫酸盐；十二烷基磺基琥珀酸钠等具有8～18个碳原子的烷基的烷基硫代琥珀酸酯/盐；天然来源的表面活性剂，例如卵磷脂、甘油磷脂；鞘磷脂等鞘脂质；碳原子数12～18的脂肪酸的蔗糖脂肪酸酯等。在本发明的制剂中，可以将这些表面活性剂的1种或2种以上组合添加。优选的表面活性剂为聚山梨酯20、40、60或80等聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯，特别优选聚山梨酯20、80。此外，还优选泊洛沙姆(Pluronic F-68等)为代表的聚氧乙烯聚氧丙烯醚。

作为含硫还原剂，可以列举出N-乙酰基半胱氨酸、N-乙酰基高半胱氨酸、硫辛酸、硫撑二乙醇、硫代乙醇胺、硫代甘油、硫代山梨糖醇、巯基乙酸及其盐、硫代硫酸钠、谷胱甘肽、具有1～7个碳原子的硫代链烷酸等含巯基化合物等。

作为抗氧化剂，可以列举出例如异抗坏血酸、二丁基羟基甲苯、丁羟基苯甲醚、α-生育酚、生育酚乙酸酯、L-抗坏血酸及其盐、L-抗坏血酸棕榈酸酯、L-抗坏血酸硬脂酸酯、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、没食子酸三戊酯、没食子酸丙酯或者乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、焦磷酸钠、偏磷酸钠等螯合剂。

进而，还可以包含氯化钠、氯化钾、氯化钙、磷酸钠、磷酸钾、磷酸氢钠等无机盐；柠檬酸钠、柠檬酸钾、醋酸钠等有机盐等通常添加的成分。

本发明的肾疾病治疗剂或肾修复·再生剂可以作为注射剂(皮下、皮内、肌肉内、静脉内、腹腔内、肾脏内等)，或者作为适于经皮、经粘膜、经鼻等给药的剂型，或是作为适于口服给药的剂型(片剂、胶囊剂、颗粒剂、液剂、混悬剂等)给药。本发明并不受到给药途径和剂型等的限制。

在制成注射剂的场合，可以通过将上述成分溶解到磷酸缓冲液(优选磷酸一氢钠-磷酸二氢钠体系)和/或柠檬酸缓冲液(优选柠檬酸钠的缓冲液)和/或醋酸缓冲液等液体制剂领域中已知的水溶性缓冲液中配制液体制剂。缓冲液的浓度通常为1～500mM，优选为5～100mM，更优选为10～20mM。此外，注射剂可以是液体制剂，也可以是冻干剂。

本发明的以G-CSF为有效成分的肾疾病治疗剂或肾修复·再生剂的给药量、给药次数可通过考虑治疗对象的患者的症状由本领域技术人员适当决定，通常，成人每人为0.1～500μg/kg/天、优选0.5～20μg/kg/天的用量给药G-CSF。给药次数通常为每周1～7天。但是，本发明并不受人G-CSF的用量的限制。

并且，本发明的肾疾病治疗剂或肾修复·再生剂还可以与其他的药物联合使用。

本发明的肾疾病治疗剂或肾修复·再生剂的效果可以通过实施了结扎左肾动脉的缺血再灌注术的肾病模型小鼠进行试验。其结果是，在肾小管损伤和甲状腺化中，G-CSF给药组比对照组得到改善。此外，BUN(血尿素氮)值与对照组相比，G-CSF给药组也有显著的改善。因此，可以确认G-CSF可以用作肾疾病的治疗剂。并且，这些结果显示，因结扎动脉而坏死的肾组织通过G-CSF给药得以修复、再生，因此，可以认为G-CSF可以用作肾的修复·再生剂。

通过如下实施例对本发明进行更详细的说明，但是本发明的范围并不限于此。本领域技术人员可以基于本发明的记载进行各种变更、修饰，这些变更、修饰也包括在本发明中。

实施例

实施例1

对B6小鼠实施结扎左肾动脉60分钟的缺血再灌注手术，从第二天开始通过皮下给药(s.c.)的方式每天早晚2次、连续5天给予100μg/kg的G-CSF。术后1个月后进行病理解剖，通过福尔马林固定左右肾脏后，进行病理学评价。准备安慰剂给药组作为对照组。另外，作为安慰剂，给予溶解G-CSF时所使用的溶解剂。

在本模型中，可以确认在肾中存在强烈的肾小管损伤和甲状腺化，可以认为是肾病模型。该模型的肾病变主要表现为肾小管的萎缩或部分坏死的因缺血引起的肾病，与临床动脉硬化性的肾病、糖尿病引起的动脉硬化性肾病类似。

在该实施例中，通过观察肾小管损伤和甲状腺化来评价肾的病理组织。评价标准如下：

(1)肾小管损伤

-：无变化

±：远端肾小管轻度损伤

+：远端肾小管受到主要损伤

++：除了远端肾小管之外，近端肾小管也出现病变

+++：肾小管全部萎缩

(2)甲状腺化(可以观察到由于蛋白尿潴留而甲状腺化)

-：无变化

±：轻微变化

+：发现1/4左右

++：发现1/3左右

+++：发现1/2以上

病理评价结果如下所示

[表1]

                             G-CSF对缺血再灌注后的肾病变的影响

组	肾小管萎缩(％)						甲状腺化(％)
												只数	-	±	+	++	+++	-	±	+	++	+++
	安慰剂G-CSF	1110	00	90	1860	7240	00	00	910	1880	6310												90

肾小管萎缩在安慰剂组中最多观察到++为72％，而G-CSF给药组则减少到了++为40％。

甲状腺化在安慰剂组中最多观察到++为63％，而G-CSF给药组则减少到了++为10％。

通过外周血中的BUN(血尿素氮)值评价对肾功能的影响。结果是：BUN值与对照组(32.1+/-1.4mg/dL)相比，G-CSF给药组为24.7+/-0.7mg/dL(p＜0.001)，确认有显著改善。

以上结果可认为，G-CSF作为肾疾病治疗剂是有用的。

并且，这些结果显示，通过G-CSF给药而修复·再生使得由于结扎动脉坏死的肾组织得以修复·再生，因此，可以认为G-CSF可以用作肾的修复·再生剂。

Claims (10)

1.肾疾病治疗剂，以集落刺激因子CSF为有效成分。

2.如权利要求1所述的治疗剂，其中集落刺激因子为粒细胞集落刺激因子G-CSF。

3.如权利要求1或2所述的治疗剂，其中肾疾病为慢性肾衰。

4.如权利要求1或2所述的治疗剂，其中肾疾病为急性肾衰。

5.如权利要求1或2所述的治疗剂，其中肾疾病为肾病。

6.如权利要求5所述的治疗剂，其中肾疾病为糖尿病性肾病。

7.如权利要求5所述的治疗剂，其中肾疾病为动脉硬化性肾病。

8.肾组织修复·再生剂，以集落刺激因子CSF为有效成分。

9.如权利要求8所述的肾组织修复·再生剂，其中集落刺激因子为粒细胞集落刺激因子G-CSF。

10.使肾组织或者存在于肾组织中的细胞增殖或再生的方法，通过使G-CSF与肾组织或者存在于肾组织中的细胞相接触。