CN1863903A - 分离肝细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了分离正常肝细胞的方法，该方法包括以下步骤：在肝切除的过程中回收患者的肝脏组织；并且通过磁分离将正常肝细胞从回收组织中的不需要的细胞中分离出来。本发明进一步提供了一种制备移植用肝细胞的方法，该方法包括以下步骤：在肝切除的过程中回收患者的肝脏组织；并且通过磁分离将正常肝细胞从回收组织中的不需要的细胞中分离出来。

Description

分离肝细胞的方法
技术领域
本发明主要涉及适用于治疗患有肝脏疾病的患者的分离肝细胞的方法。本发明进一步涉及通过本发明的方法分离的肝细胞和使用通过本发明的方法分离的肝细胞来治疗肝脏疾病的方法。
背景技术
原位肝移植是目前治疗包括急性和慢性肝衰竭在内的各种肝脏疾病的最佳治疗方法。但是，肝移植的一个制约因素是供体组织的获得性问题。在世界范围内存在着移植器官缺乏的问题。在某些情况下，这导致了肝移植候诊名单上大约10％的死亡率(Gibbons，RD等，Biostatistics 4：207-222，2003)。其他制约肝移植广泛使用的因素包括移植费用和潜在的移植排斥问题。
因此，需要有替代疗法来治疗患有肝脏疾病的患者，其不仅仅是作为等待肝移植的患者的临时措施，而且也用于那些可能不适合器官移植的患者或者是作为器官移植的长期替代方案。
这样的替代方法之一是肝细胞移植，其相对于整个或部分肝移植而言具有几个方面的优势，包括费用降低、有创手术更少以及发病率(morbidity)下降(Dhashi，K等，J Mol Med 79：617-630，2001)。临床试验已经证实了肝细胞移植的成功应用，例如在急性暴发型肝功能衰竭患者的恢复中(Fisher，RA等，Transplantation 69：303-307，2000)和在例如克-纳二氏综合症的遗传性肝脏疾病的治疗中(Fox，IJ等，N Engl J Med 338：1422-1426，1998)。但是，成功是有限的。
肝细胞移植的最大制约因素是缺乏合适的肝细胞源。肝细胞的来源之一是不适合移植的肝脏。但是由于肝脏不适合移植的常见原因是脂肪变性，从这些肝脏分离出来的肝细胞通常没有正常肝细胞所具有的代谢能力，因此不适合肝细胞移植。可以选择地，肝细胞也可来源于其他物种。美国专利第6,610,288号公开了分离和使用猪的肝细胞来治疗特征在于肝功能不全的疾病。但是，在人体上使用异种肝细胞的缺点在于潜在的排斥反应。
因而，确实需要合适的移植用肝细胞源。
发明内容
根据本发明的第一实施方式，提供分离正常肝细胞的方法，该方法包括以下步骤：
(a)在肝切除的过程中回收患者的肝脏组织；和
(b)通过磁分离，将正常肝细胞从回收组织中存在的不需要的细胞中分离出来。
可以进行肝切除以便将含有良性或恶性肿瘤的肝脏或其部分切除。因而，通常不需要的细胞是肿瘤细胞。
该方法也可以包括在对细胞进行磁分离之前从回收的肝脏组织中去除肉眼可见的被肿瘤所感染的组织的步骤。
可以使用涂有抗体的超顺磁性胶体来实现细胞的磁分离。抗体可以是特异地识别正常肝细胞表面的抗原决定部位(epitope)或者识别不需要的细胞的单克隆抗体。
根据本发明的第二实施方式，提供根据第一实施方式的方法分离的正常肝细胞。
根据本发明的第三实施方式，提供制备移植用肝细胞的方法，该方法包括以下步骤：
(a)在肝切除的过程中回收患者的肝脏组织；和
(b)通过磁分离，将正常肝细胞从回收组织中存在的不需要的细胞中分离出来。
根据本发明的第四实施方式，提供根据第三实施方式的方法制备的正常肝细胞。
根据本发明的方法分离或制备的肝细胞可以用于患有肝脏疾病的患者的肝细胞移植。肝脏疾病可以选自：克-纳二氏(Crigler-Najar)综合征、吉耳伯氏(Gilbert’s)综合征、杜-约二氏(Dubin Johnson)综合征、家族性高胆固醇血症、鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症、遗传性肺气肿、血友病、病毒性肝炎、肝细胞癌、急性肝衰竭和慢性肝衰竭。
因此，在本发明的第五实施方式中，提供治疗患者肝脏疾病的方法，该方法包括对患者给予足以治疗肝脏疾病的量和时间的正常肝细胞，该正常肝细胞是根据第一实施方式的方法分离的或者根据第三实施方式的方法制备的。
根据本发明的方法分离的肝细胞也可以用于人工肝脏支持系统。
对上述实施方式而言，通常患者是人类。
根据本发明的第六实施方式，提供在肝切除的过程中回收的被切除的肝脏组织用于分离正常肝细胞的用途，其中正常肝细胞通过磁分离从被切除的组织中的不需要的细胞中分离出来。
根据本发明的方法分离的肝细胞可以冷藏。
定义
本文所使用的术语“正常肝细胞”指的是在分离时保留了执行原位肝细胞的正常细胞功能和活性的能力并且同样适用于移植到需要肝细胞移植的患者身上的肝细胞。同样，希望术语“正常肝细胞”的范围中的肝细胞还包括已经经过修饰的肝细胞，例如修饰以使得能够调节特定基因产物的表达，但是尽管如此，其仍然基本上保留执行原位肝细胞的正常细胞功能和活性的能力。
本文在肝细胞的上下文中所使用的术语“分离(isolated)”是指肝细胞已经基本上从自然环境中以及从邻近的和周围的细胞中分离出来。该术语“分离”不涉及组织切片中存在的肝细胞或者作为组织切片的部分培养的肝细胞。
本文所使用的术语“肝脏疾病”是指特征为例如肝脏代谢活性不足的肝功能异常的疾病或病症，或者任何伴有肝衰竭的疾病，其症状可以通过肝细胞移植得到缓解或减少。因而，本文所使用的术语“治疗”包括缓解或减少肝脏疾病的至少一个症状。
在本说明书的上下文中，术语“包括”指的是“主要包括，但不一定只包括”。而且，单词“包括(comprising)”的变形，例如“包含(comprise)”和“含有(comprises)”，具有相应的各种含义。
附图说明
现在将仅仅通过实施例的方式，参照以下附图描述本发明。
图1.上皮细胞标记物(marker)Ep-CAM通过RT-PCR的扩增。线：(1)分子量标记物；(2)β-肌动蛋白对照；(3)HT29细胞；(4)纯肝细胞；(5)肝细胞+未经处理的50,000个HT29细胞；(6)肝细胞+50,000个用MOC31包覆的Dynabeads处理的HT29细胞；(7)肝细胞+10,000个未经处理的HT29细胞；(8)肝细胞+10,000个用MOC31包覆的Dynabeads处理的HT29细胞。(在每一种情况下，均使106个肝细胞与所指示数量的HT29细胞相混合。)
图2.上皮细胞标记物Ep-CAM通过RT-PCR的扩增。线：(1)分子量标记物；(2)β-肌动蛋白对照；(3)HT29细胞；(4)纯肝细胞；(5)肝细胞+10,000个未经处理的HT29细胞；(6)肝细胞+10,000个用MOC31包覆的Dynabeads处理的HT29细胞；(7)肝细胞+1,000个用MOC31包覆的Dynabeads处理的HT29细胞；(8)肝细胞+1,000个未经处理的HT29细胞。(在每一种情况下，均使106个肝细胞与所指示数量的HT29细胞相混合。)
具体实施方式
目前，在等待原位肝移植的患者中存在相当大的死亡率。这主要是由于用于移植的尸体肝脏的缺乏。同样，肝细胞移植的广泛使用也受到肝脏和其他合适的肝细胞源的获得性(availability)的限制。经计算，为了支持成年人衰竭的肝脏，需要替换大约10-20％的肝细胞团块，需要人体的大约100-150亿个细胞，或者100-150g分离的肝细胞。
良性或恶性肝肿瘤患者，通常需要肝切除。在这些切除操作中，相当大数量的正常的、未被感染的肝脏组织不可避免地与被肿瘤感染的组织一起被切下。
因而，本发明提供了分离移植用肝细胞的方法和制备移植用肝细胞的方法，其中肝细胞由其上被分离出来的肝脏组织是从在肝切除操作的过程中切下的材料中获得的。除了从转移性疾病的切除操作中获得肝脏组织之外，根据本发明用于分离肝细胞的肝脏可以通过其他来源获得，例如从因不适合移植而被舍弃的肝脏供体获得。
肝细胞的分离
肝脏切下后，在接下来的从不需要的细胞中分离正常肝细胞之前，可以首先凭肉眼将正常组织从被肿瘤感染的组织或被其他疾病感染的组织中分离出来。
通过磁分离，将正常肝细胞从不需要的细胞，例如肿瘤细胞中，分离出来。各种细胞磁分离的技术和设备是可用的，并且为本领域技术人员所知，例如，美国专利4,710,472(Saur等)、美国专利5,108,933(Liberti等)和美国专利5,795,470(Wang等)所公开的那些，其公开内容在此引入作为参考。
细胞的磁分离可以通过使用小磁性粒子来实现，优选超顺磁性聚合物珠形式的胶体。磁性粒子的直径可以是亚微米级或者微米级的。合适的磁珠可以通过许多来源容易地商业获得。通常，磁珠涂有能够与非均质混合物中一种或多种细胞类型的表面上的分子特异地结合的配位体。在磁珠与目标细胞之间的配合物形成之后(参见下述)，将该混合物暴露于磁场以便能够从混合物中去除配合物。
细胞可以经由正选法分离(positive separation)或负选法分离(negative separation)进行分离。在负选法细胞分离中，结合在磁珠上的细胞是不需要的细胞，即，要被从非均质混合物中清除出去的细胞。在这种情况下，磁珠将涂有特异识别不需要的细胞的配位体。在本发明将正常肝细胞从肿瘤细胞中分离出来的实施方式中，磁珠可以涂有肿瘤细胞上所发现的受体的特异的单克隆抗体。
在正选法细胞分离情况下，正常肝细胞特异地结合到磁珠上。正选法或者负选法细胞分离技术都可以用于本发明的方法。
本领域技术人员将会容易地意识到，超顺磁性珠并不代表将肝细胞从不需要的细胞中磁分离出来的唯一合适的方法。本领域技术人员已知的可供选择的磁性粒子和装置也可用在本发明的方法中。
根据本发明的实施方式使用的磁分离技术可以产生至少大约50％纯度(即除去了至少50％的不需要的细胞)、至少大约75％纯度(除去了至少75％的不需要的细胞)、至少大约80％纯度、至少大约85％纯度或者至少大约90％纯度的正常肝细胞群。可以通过使用多级分离来实现纯度的改进。
可以通过本领域技术人员已知的各种方法测定根据本发明分离的肝细胞的活力。例如，可以使用染料排斥试验，其中将染料稀溶液与分离的肝细胞的悬浮体相混合。排斥染料的肝细胞被认为是有活力的，而被染色的细胞则被认为是没有活力的。在染料排斥试验中使用的合适的染料是台盼蓝(trypan blue)。另外，分离的肝细胞的功能性能力可以通过许多可选择的方法来测定，包括酶活力检验，例如细胞色素P450的减少。
需要正视的是，在本发明的实施方式中，分离的肝细胞可能也要进行筛选以确保肝细胞基本不含有机生物体，例如可能会给肝细胞的接受者带来感染的病毒。例如，可以用能够特异地检测细胞内病毒的存在的合适的标记抗体来处理肝细胞。
根据本发明的方法分离的肝细胞可以冷冻保存，例如，保存在液氮中。冷冻保存的介质和缓冲剂是本领域技术人员已知的，通常包括合适浓度的至少一种冷冻保护剂，例如DMSO或者FBS。一种合适的冷冻保护缓冲剂是RPMI 1640。已经制定了多种冷冻保存标准程序以使所储存的肝细胞在冷冻保存期间和冷冻保存之后的活性最大化。例如，美国专利6,136,525(Mullon等)和Hengstler等(Drug MetabolismReviews 32：81-118，2000)描述了冷冻保存肝细胞的合适方法，其所公开的内容在此引入作为参考。分离的肝细胞的冷冻保存推动了所需要的用于肝细胞移植的可靠的、现行的肝细胞源的发展。在这点上，在分离以后，肝细胞可以适当地标记上详细说明供体详情的信息，包括血型、供体出生日期、肝切除日期、切除原因、分离程序、冷冻细胞数目以及冷冻保存时的肝细胞活力百分比。
肝脏疾病的治疗
根据本发明的方法分离的肝细胞适用于多种目的。通常，根据本发明分离的肝细胞可以用于肝细胞移植。分离的肝细胞也可以用于，例如，制作人工肝脏支持系统和设备以补偿患者丧失的肝功能。
根据本发明的实施方式分离的肝细胞的移植可以用于治疗患有肝脏疾病的患者。可以通过移植根据本发明的方法分离的正常肝细胞来治疗的肝脏疾病包括与异常肝功能或者肝衰竭有关的任何疾病。
合适的肝脏疾病可以是遗传性疾病，包括例如克-纳二氏综合征、吉耳伯氏综合征、杜-约二氏综合征、家族性高胆固醇血症、鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症、遗传性肺气肿和血友病。可供选择地，肝脏疾病也可以是非遗传来源的，例如由摄入药物或者毒物、病毒感染或者代谢性疾病所致的疾病。病毒源性肝脏疾病的例子包括A型肝炎和B型肝炎。可以根据本发明治疗的进一步的肝脏疾病包括肝细胞癌、急性肝衰竭、慢性肝衰竭和其他与异常肝功能或活性相关的任何疾病。
为治疗肝脏疾病而给予根据本发明分离的肝细胞的时间和量适合减少或者减轻肝脏疾病的至少一种病征。对本领域普通技术人员而言显而易见的是，最佳的治疗方式(例如，所给予的肝细胞的数量和治疗持续时间)可以通过本领域技术人员使用传统的治疗检测试验的方式来确定。此外，对本领域普通技术人员而言显而易见的是，最佳数量和单次肝细胞剂量的间隔将根据所治疗的疾病的性质和程度、形式、给药途径和部位以及所治疗的具体个体的特性等决定。同样，这种最佳条件可以通过传统的技术来确定。
可以通过任意合适的途径给药而将肝细胞输送到需要的部位以使至少部分肝细胞有活性。因而，可以通过例如腹腔内注射、静脉或动脉输注、或者脾内注射进行给药。静脉输注肝细胞可以通过例如门静脉或者肠系膜静脉输送。典型地，至少大约5％所给予的肝细胞保持活力，更典型地至少大约10％保持活力，更典型地至少大约20％保持活力，更加典型地至少大约40％保持活力。
为了易于移植，根据本发明分离的肝细胞可以被结合到微载体珠上，例如，涂有胶原的葡聚糖珠。根据本发明分离的肝细胞也可以与一种或者多种药学可接受的载体和/或稀释剂一起给药。载体和稀释剂在与组合物的其他成分相容的方面必须是“可接受的”，并且不会对其接受者造成伤害。药学可接受的载体和稀释剂的例子为软化水或者蒸馏水；盐水；植物油，例如花生油(peanut oil)、红花油、橄榄油、棉籽油、玉米油、芝麻油，例如花生油、红花油、橄榄油、棉籽油、玉米油、芝麻油、花生油(arachis oil)或者椰子油；硅油，包括聚硅氧烷，例如甲基聚硅氧烷、苯基聚硅氧烷以及甲苯基聚硅氧烷；挥发性聚硅氧烷；矿物油，例如液态石蜡、软石蜡或者角鲨烷；纤维素衍生物，例如甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或者羟丙基甲基纤维素；低级链烷醇，例如，乙醇或者异丙醇；低级芳醇；低级聚亚烷基二醇或者低级亚烷基二醇，例如，聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1，3-丁二醇或者甘油；脂肪酸酯，例如棕榈酸异丙酯、肉豆蔻酸异丙酯或者油酸乙酯；聚乙烯基吡咯烷酮；琼脂；角叉菜胶；黄蓍胶或者阿拉伯树胶，以及凡士林油。
肝细胞也可以与一种或者多种其它药剂联合使用。例如，理想的可以是将肝细胞与增强肝细胞移植的药剂协同使用，例如肝细胞生长因子，或者治疗肝脏疾病的其它药剂，例如化疗药剂或者抗病毒药剂，这要根据所治疗的肝脏疾病的特性和严重程度来决定。还可以理想地将一种或者多种免疫抑制剂与肝细胞联合给予以使诱发不利的免疫反应的风险最小化。多种合适的免疫抑制剂是本领域人员已知的。
对于这种联合治疗，联合治疗的各成份可以同时给予、或者按任意顺序依次给予、或者在不同时间给药，以便提供理想的治疗效果。可以优选将多种组分通过相同的给药途径来给药，尽管并非一定要这样做。
本领域技术人员还意识到，分离的正常肝细胞可以在其用于肝细胞移植之间进行必要的修饰。根据将要通过肝细胞移植来治疗的肝脏疾病的特性，可以理想地增加或者减少将要给予的肝细胞中的特异基因产物的表达。可以修饰肝细胞以改变细胞内特异基因产物的表达水平，例如通过在肝细胞中导入合适的药剂，例如能够诱导期望的基因表达的转录因子。可以选择地，或者另外地，可以对肝细胞进行修饰以表达未修饰的肝细胞所无法表达的基因产物。可以通过多种本领域技术人员已知的常规重组DNA技术将编码有期望的因子或者产物的核苷酸序列导入到分离的肝细胞中，并且可以以包括裸露DNA在内的多种形式导入到病毒载体(例如腺病毒载体)中或者导入到缺陷的逆转录酶病毒中。
本发明将参照下列具体实施例更详细地描述，这些实施例不应该被看作以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1：肝切除后肝细胞的收集
5例因肝脏转移肿瘤而经受肝切除的患者的肝细胞。该研究得到了澳大利亚新南威尔士州圣乔治医院道德委员会的批准(批准号01/123)。这些患者转移肿瘤的定位的详细信息和切除情况详见表1。
                     表1：肝切除的详细情况
  患者(性别) 原发肿瘤1  肝脏切除日期  切除节段  肿瘤大小(cm)
  1(女) CRC2-Mar 01  2003年4月  4  4×3×2
2(男) CRC-Nov 00 2002年5月  2，3&4(收集2+3) 4×4×2
  3(女) CRC-Nov 00  2002年4月  2，  3  2×2×1.5
4(男) CRC-Apr 01 2002年5月  2，3 & 7(收集2+3)  2×2.5×24.5×2.7×2
  5(男) 胰腺癌-Apr 01  2002年5月  5，  6  2×2×1
1包括诊断日期
2CRC-结肠直肠癌
肝脏切除后，将切除的肝节段转移到手术室的无菌修整台(sterileback table)上。第二手术组切除肿瘤，然后送去进行病理解剖检查。然后，在将要收集的肝脏切缘处的1到2条血管内插入2mm的导管并且用肝素盐水(hepsaline)(1L生理盐水中含有5000单位的肝素)冲洗这个肝段以去除血管内的血凝块。然后，通过改良的Seglen’s两步法(Seglen，Methods Cell Bilo 13：29-34，1976)进行肝脏分解(hepaticdigestion)。用于冲洗肝脏的第一溶液包括含有5mmol/L的EDTA的Leffert’s缓冲液。用于分解肝脏的第二溶液包括含有0.05g IV型胶原酶(Sigma)和浓度为0.3％的Ca2+的Leffert’s缓冲液。用每一种溶液灌注该肝节段10分钟。由于各肝节段的大小不同以及血管的直径不同，所以手工控制流速。
在进行两级灌注之后，该肝节段被转送到实验室并且在Leffert’s介质内用解剖刀切成2-3mm的碎块。然后收集分解后的实质(parenchyma)，并且通过420μm孔隙的钢网过滤，在4℃下以50×g离心5分钟来清洗3次。使用台盼蓝评价肝细胞的收率和活力(参见表2)。在组织培养基中加入10％的DMSO之后，将其放到液氮中进行肝细胞的冷冻保存。
                 表2：肝细胞的数目和活力/克肝脏
 患者  肝脏重量(g) 细胞数目 活力 细胞数/克  有活力的细胞数/克
 1  338  5×106  20％ 15,000  3,000
 2  73  40×106  60％ 550,000  330,000
 3  298  100×106  60％ 340,000  204,000
 4  395  300×106  65％ 760,000  494,000
 5  250  300×106  72％ 1,200,000  864,000
实施例2：无肿瘤肝细胞的分离
获得有活力的肝细胞后(实施例1)，将肝细胞从伴随的肿瘤细胞中分离出来。使用涂有MOC31单克隆抗体的4.5μm超顺磁性珠(Dynabeads M450；Dynal，Oslo，Norway)通过Flatmark等(ClinicalCancer Research 8：444-449，2002)描述的免疫磁分离方法分离肿瘤细胞。MOC31识别Ep-CAM抗原，后者存在于大多数上皮细胞的表面，尤其在结肠直肠癌中高度表达。
将5百万个肝细胞与1百万个HT29结肠直肠细胞在1ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)中相混合。将200μl的Dynabeads M450悬浮在1ml PBS中，并且加入20μl的MOC31抗体。将该悬浮体在4℃下培育30分钟，随后将涂有MOC3 1的Dynabeads混合物加入到含有肝细胞加HT29细胞混合物的试管内，使得总体积达到2ml。在4℃下培育30分钟后，对该试管使用磁铁以便诱导肿瘤细胞附着到Dynabeads上，从而使得能够从细胞混合物中除去肿瘤细胞。
实施例3：无肿瘤肝细胞的分离的验证
在使用涂有MOC31的免疫磁珠除去肿瘤细胞之后(实施例2)，通过使用RT-PCR检测上皮细胞粘附分子(Ep-CAM)基因的表达，来分析制备的肝细胞是否残留有肿瘤细胞。Ep-CAM是有用的细胞表面标记物，在包括HT29在内的大多数上皮细胞和肿瘤细胞的表面表达。在基于Ep-CAM基因表达的肿瘤细胞检测中的RT-PCR的敏感性大约为10个肿瘤细胞/107个非肿瘤细胞(Sakaguchi，M等，Brit J Cancer 79：416-422，1999)。
下列引物(primer)用于RT-PCR分析：
有义链(sense strand)：5’-GAACAATGATGGGCTTTATGA-3’
无义链(antisense strand)：5’-TGAGAATTCAGGTGCTTTTT-3’
使用这些引物进行的Ep-CAM的成功的PCR扩增生成了515bp的产物。
如实施例1所述的方法获得肝细胞。然后，将肝细胞与HT29肿瘤细胞相混合，比例为：(i)106个肝细胞+50,000个HT29细胞；(ii)106个肝细胞+10,000个HT29细胞；或者(iii)106个肝细胞+1,000个HT29细胞。在RT-PCR分析之前，每一种混合物的一个样本进行实施例2所述的免疫磁分离，同时第二个样本未经处理直接用于RT-PCR。使用市售的RNA抽提试剂盒(SuperScript III，Invitrogen，Australia)分离总的RNA。作为对照，同时也从106个HT29细胞抽提和分析RNA。
为了RT-PCR，使用10μl的RNA与One Step SuperScript III试剂盒。PCR循环为：53℃下30分钟；接着94℃下3分钟；接着进行42个循环的如下循环：94℃下30秒钟、56℃下30秒钟和72℃下30秒钟；接着是终止步骤72℃下10分钟。然后在4℃下保持反应直到在1.5％的琼脂糖凝胶中电泳分析为止。
结果如表1和2所示。通过用BamH1分解PCR产物来证实Ep-CAM条带的有效性(数据未显示)。
作为对照，25pg来自HT29细胞的RNA足以检测Ep-CAM的PCR产物(图1，线3；图2，线3)，而25 pg的肝细胞的RNA未显示任何Ep-CAM的PCR产物(图1，线4；图2，线4)。
没有经过免疫磁分离的含有肝细胞加50,000个HT29细胞的样本也显示了Ep-CAM的PCR产物(图1，线5)。与之相反，在用涂有MOC31的Dynabeads处理同样的样本之后没有检测到Ep-CAM的PCR产物(图1，线6)，证明通过免疫磁分离成功地去除了HT29细胞。在肝细胞加10,000个HT29细胞的样本(图1，线7和8；图2，线5和6)和肝细胞加1,000个HT29细胞的样本(图2，线7和8)中也获得了同样的结果。

Claims (23)

1.分离正常肝细胞的方法，该方法包括以下步骤：
(a)在肝切除的过程中，回收患者的肝脏组织；并且
(b)通过磁分离，将正常肝细胞从回收组织中的不需要的细胞中分离出来。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的肝切除是通过将含有良性或者恶性肿瘤的肝脏或者其一部分切除而实现的。
3.根据权利要求2所述的方法，进一步包括在通过磁分离来分离所述肝细胞的步骤之前从所述回收的肝脏组织中去除肉眼可见的被肿瘤感染的组织的步骤。
4.根据权利要求1到3中任意一项所述的方法，其中所述不需要的细胞是肿瘤细胞。
5.根据权利要求1到4中任意一项所述的方法，其中所述细胞的磁分离是使用涂有抗体的超顺磁性胶体来完成的。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述的抗体是特异地识别所述正常肝细胞表面的抗原决定簇的单克隆抗体。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述的抗体是特异地识别所述不需要的细胞的单克隆抗体。
8.制备移植用肝细胞的方法，该方法包括以下步骤：
(a)在肝切除的过程中，回收患者的肝脏组织；和
(b)通过磁分离，将正常肝细胞从回收组织中的不需要的细胞中分离出来。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述的肝切除是通过将含有良性或者恶性肿瘤的肝脏或者其一部分切除而实现的。
10.根据权利要求9所述的方法，进一步包括在通过磁分离来分离所述肝细胞的步骤之前从所述回收的肝脏组织中除去肉眼可见的被肿瘤感染的组织的步骤。
11.根据权利要求8到10中任意一项所述的方法，其中所述不需要的细胞是肿瘤细胞。
12.根据权利要求8到11中任意一项所述的方法，其中所述细胞的磁分离是使用涂有抗体的超顺磁性胶体来完成的。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述的抗体是特异地识别所述正常肝细胞表面的抗原决定簇的单克隆抗体。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述的抗体是特异地识别所述不需要的细胞的单克隆抗体。
15.根据权利要求1至7中任意一项所述的方法分离的正常肝细胞。
16.根据权利要求8至14中任意一项所述的方法制备的正常肝细胞。
17.根据权利要求1至7中任意一项所述的方法分离或者根据权利要求8至14中任意一项所述的方法制备的正常肝细胞在患有肝脏疾病的患者的肝细胞移植中的用途。
18.根据权利要求17所述的用途，其中所述的肝脏疾病选自：克-纳二氏综合征、吉耳伯氏综合征、杜-约二氏综合征、家族性高胆固醇血症、鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症、遗传性肺气肿、血友病、病毒性肝炎、肝细胞癌、急性肝衰竭和慢性肝衰竭。
19.治疗患者肝脏疾病的方法，该方法包括对该患者给予足以治疗该肝脏疾病的量和时间的正常肝细胞，该正常肝细胞是根据权利要求1到7中任意一项所述的方法分离或者根据权利要求8到14中任意一项所述的方法制备的。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述的肝脏疾病选自：克-纳二氏综合征、吉耳伯氏综合征、杜一约二氏综合征、家族性高胆固醇血症、鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症、遗传性肺气肿、血友病、病毒性肝炎、肝细胞癌、急性肝衰竭和慢性肝衰竭。
21.根据权利要求1至7中任意一项所述的方法分离的正常肝细胞在人工肝脏支持系统中的用途。
22.在肝切除的过程中回收的切除肝脏组织在分离正常肝细胞中的用途，其中该正常肝细胞通过磁分离从切除组织中的不需要的细胞中分离出来。
23.在肝切除的过程中回收的切除肝脏组织在制备移植用肝细胞中的用途，其中该正常肝细胞通过磁分离从切除组织中的不需要的细胞中分离出来。
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