CN1858235A - 一种致奶牛乳房炎大肠杆菌培养液的配制方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
一种致奶牛乳房炎大肠杆菌培养液的配制方法及其用途，属于动物疫病诊断和防治领域。先将10g蛋白胨、1.5g三号胆盐、10g乳糖、5g氯化钠和5g柠檬酸钠溶于1000ml水中，再用氢氧化钠溶液调整pH值至7.2，再向溶液中加入无菌1％结晶紫水溶液0.5ml和0.4％酚红水溶液4ml，在121℃下灭菌，最后置于4℃保存，制成的培养液可用于快速鉴别致奶牛乳房炎大肠杆菌和抗生素药敏试验。
Description
技术领域
本发明属于动物疫病诊断和防治技术领域。
技术背景
奶牛乳房炎发病率高，危害性大，是影响世界奶牛业发展的最主要疾病之一。据国际牛奶联合会资料记载，大约有50％的母牛患乳房炎，其中大约有2％患临床型乳房炎，48％患隐性乳房炎。我国临床型乳房炎发病率33.41％(9.7％～55.6％)，隐性乳房炎的检出率为50-80％。临床型乳房炎具有泌乳量下降、乳房肿胀、乳汁变质等明显的临床症状，而隐性乳房炎的乳房和乳汁外观虽无可见的肉眼变化，但常常造成原料奶的品质下降，威胁人们的身体健康。据估计，我国每年因乳房炎所造成的经济损失超过3.16亿元。引起乳房炎的病原微生物主要包括金色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、牛乳房链球菌、大肠杆菌、克雷伯氏菌、绿脓杆菌以及其他一些真菌、病毒等。但在这些病原体中，以金黄色葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌为主，约占整个奶牛乳房炎病例90％以上。
奶牛乳房炎的治疗以抗生素为主，但由于抗生素的不规范使用，已导致牛奶中抗生素残留、耐药菌株普遍、无药可治乳房炎病例增多等严重问题。造成这种现象的主要原因是由于奶牛场经济、技术和实验条件的限制，在用抗菌素防治奶牛乳房炎前很少进行必要的细菌分离和药物敏感试验，仅靠兽医的喜好和经验，长期、盲目和超量使用抗菌素。
目前国内外通常使用的药敏试验方法主要有纸片扩散法、肉汤稀释法、琼脂稀释法、自动化药敏仪法和Etest法。其中，纸片扩散法是通过测量抑菌圈的直径来判定细菌对抗生素的敏感或耐受，最大优点是费用低和药物选择灵活，但存在受接种菌量、孵育时间、抗生素含量及扩散力、平皿厚度等多种因素影响，需要严格进行标准化，才能确保结果的可靠性，而且具有耗时、费力和不适用厌氧菌和苛氧菌等缺点；肉汤稀释法和琼脂稀释法是将抗生素倍比稀释在肉汤或琼脂中来定量测定最低抑菌浓度(MIC)的方法，其优点是可精确测定一些厌氧菌和苛氧菌对抗生素的敏感性，而且一套平皿可测多株细菌，但具有耗时和费力等缺点；自动化药敏仪是通过检测浊度、荧光指示剂的荧光强度或荧光底物的水解反应来判读结果，具有快速和强大统计分析功能等优点，但具有药物选择缺乏灵活性、难以检测某些特殊菌和仪器价格昂贵等缺点；Etest法结合扩散法和稀释法的优点，用含有连续浓度梯度抗生素塑料条检测细菌的敏感性，具有精确、可靠、稳定性好等优点，可用于多种细菌的药敏试验，唯一缺点是价格昂贵。
至于致奶牛乳房炎大肠杆菌的鉴定及药敏试验，目前国内外常用的方法是将无菌采集的奶样接种麦康凯等选择性培养基，37℃培养24小时后，根据菌落形态、颜色和革兰氏染色镜检等做出初步鉴定，再挑取可疑菌落进行生化试验进行确认，最后用典型菌落在Mueller-Hinton(MH)等琼脂平板上进行纸片法药敏试验，或将抗生素稀释于肉汤中进行最小抑菌浓度(MIC)的测定。这些方法不仅至少需要3-5天才能得出结果，具备必要的细菌学鉴定的设备、试剂和技术条件，而且用单菌落进行的药敏试验结果有时不能真实反映细菌“群体”对抗生素的敏感性。至于自动化药敏仪和Etest法，由于价格很贵难以被国内兽医临床和奶牛场接受。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种快速选择性扩培奶牛奶样中大肠杆菌培养液的配制方法。
本发明的技术方案是：先将10g蛋白胨、1.5g三号胆盐、10g乳糖、5g氯化钠和5g柠檬酸钠溶于1000ml水中，再用氢氧化钠溶液调整pH值至7.2，再向溶液中加入1％结晶紫水溶液0.5ml和0.4％酚红水溶液4ml，在121℃下灭菌，最后置于4℃保存。
还可在每升上述液体培养液中加15克琼脂粉即为MQQ琼脂平板，并于4℃保存，备用。
本发明中另一目的是提供上述致奶牛乳房炎大肠杆菌培养液的用途：
用途之一是：用于鉴别致奶牛乳房炎大肠杆菌的方法：将培养液分装于培养板孔，接种奶样，在37℃条件下培养24小时，培养液红色变为黄色，判断奶样中有大肠杆菌。
用途之二是：用于致奶牛乳房炎大肠杆菌的药敏试验：在包被有经过实验校正MIC抗生素的培养板孔加入培养液，再接种奶样，在35℃条件下培养24小时，测定大肠杆菌对抗生素的敏感性。
本发明在大肠杆菌鉴别培养麦康凯培养基的基础上，对蛋白胨和胆盐的含量进行调整，并添加抑制粪链球菌生长的柠檬酸钠和抑制葡萄球菌生长的结晶紫，制成的培养液名命为MQQ培养液，加入琼脂即成为MQQ琼脂平板。
在判断奶样中有无大肠杆菌时，经培养24小时后，培养液由红色变为黄色，则，可明确奶样中有葡萄球菌。如培养液仍然为红色，则，奶样中无大肠杆菌。
在测定大肠杆菌对抗生素的敏感性时，经培养24小时后，根据培养液是否由红色变为黄色物判断有无大肠杆菌生长及对相应抗生素的敏感性或耐药性。
本发明是在现有麦康凯培养基的基础上，发明了一种能直接用临床奶样进行链球菌快速鉴别和药敏试验方法，其显著优点是快速、准确、价廉和不需复杂的仪器设备，特别适合国内中小型奶牛场和基层兽医使用。
附图说明
图1为大肠杆菌在MQQ培养液和普通肉汤中生长动态的比较图。
具体实施例
一、配制MQQ培养液：
用天平分别称取蛋白胨10g、三号胆盐1.5g、乳糖10g、氯化钠5g、柠檬酸钠5g，将上述各成份加入1000毫升水中，搅拌至完全溶解。再用10mol氢氧化钠溶液调节pH值至7.2。再向溶液中加入浓度为1％结晶紫水溶液0.5ml和0.4％酚红水溶液4ml，搅拌，充分混和后，将容器置于121℃高温下灭菌15分钟，4℃保存备用。
还可在每升液体培养液中加15克琼脂粉即为MQQ琼脂平板。
二、大肠杆菌快速鉴别：
根据临床检查或加州乳房炎试验(CMT)检测结果初步判断患临床型或隐性乳房炎奶牛，用常规挤奶法挤去前三把奶，用常规消毒液消毒乳头及其附近区域，用酒精棉球消毒乳头。将消毒试管盖打开，一手将试管保持水平状态，另一手挤奶，并使奶“射入”试管中，立即盖好试管盖，置于冰浴中立即带回实(检)验室。在无菌工作台内打开无菌的24或96孔培养板，将MQQ培养液分装于培养板孔中，每孔200μl，向每孔中加入未稀释或用生理盐水适当稀释的奶样10μl，盖好盖后37℃静置培养24小时，根据培养液是否由红色变为黄色判断有无大肠杆菌生长。
三、大肠杆菌对抗生素的敏感性快速测定：
1、抗生素最小抑菌浓度的确定及合适的抗生素培养板包被量的确定：参照国际美国临床实验室标准化委员会(NCCLS20012)关于大肠杆菌药敏抑制圈的解释标准和相关的最小抑菌浓度(MIC)，筛选出对5类8种抗生素敏感或耐药的大肠杆菌32株。以0.5、1.0、1.5和2.0倍于标准MIC的5类8种抗菌素包被96孔培养板，用MQQ培养液进行大肠杆菌的快速药敏试验，通过与标准纸片扩散法药敏试验结果比较，确定MQQ培养液对所试抗生素抑菌活性的影响以及合适的抗生素包被量。将抗生素配成1000倍于校正后的MIC，分装96孔培养板，在无菌工作台内自然吹干或冷冻干燥后，4℃保存备用。
2、快速药敏试验：将MQQ培养液分装于包被有抗生素的96孔培养板，接种大肠杆菌初次选择培养物或临床奶样，35℃培养24小时，根据培养液是否由红色变为黄色判断有无大肠杆菌生长及对相应抗生素的敏感性。
四、对比试验：
1、大肠杆菌在MQQ琼脂平板上的生长情况：将从乳房炎患牛分离的大肠杆菌划线接种MQQ琼脂平板，37℃培养24小时后，生长的大肠杆菌菌落与在麦康凯琼脂平板上相同，为圆形、边缘整齐、直径为2-3mm的红色菌落。挑取典型菌落制成细菌涂片，经革兰氏染色后镜检，在MQQ琼脂平板上生长的大肠杆菌为革兰氏染色阴性小杆菌。挑取典型菌落进行纯培养，然后进行糖发酵和吲哚等生化试验，结果在MQQ平板上生长的大肠杆菌为吲哚试验阳性，符合标准大肠杆菌的生化反应特性。
2、大肠杆菌在MQQ培养液中的生长曲线：挑取培养在普通琼脂平板上的大肠杆菌单菌落，接种营养肉汤，37℃培养12小时后，按1∶100的比例接种2ml MQQ选择培养液和营养肉汤，每种培养液接种10管，在37℃振荡培养过程中，每隔2小时取出1管置于4℃冰箱中，在最后一管取出时，统一用分光光度计测定各管的OD600值，以OD600为纵坐标，培养时间为横坐标，描记大肠杆菌在两种液体培养基中的生长曲线。如图1所示，大肠杆菌在MQQ培养液中的生长曲线和在普通肉汤中相似，表明大肠杆菌在MQQ培养液中生长良好。图1中，纵坐标为细菌培养的光吸收值(OD600)，横坐标为培养时间。
3、MQQ培养液的选择特性：取非致病性大肠杆菌、致奶牛乳房炎大肠杆菌、鸡致病性大肠杆菌、猪致病性大肠杆菌(致仔猪黄、白痢或猪水肿)等大肠杆菌，猪伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、产气肠杆菌、禽巴氏杆菌、志贺氏痢疾杆菌、假单胞绿脓杆菌和变形杆菌等革兰氏阴性菌，金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、枯草杆菌和猪丹毒杆菌等革兰氏阳性菌培养物20μl，分别接种2ml MQQ选择培养液，37℃静置培养24h后，根据培养液染色和浑浊度变化判断有无细菌生长，并取各种培养物，接种血清琼脂平板，37℃继续培养24h后观察有无细菌生长，并对生长的细菌进行染色镜检和生化试验，结果仅大肠杆菌能在MQQ培养液中生长。
取大肠杆菌肉汤培养物20μl，分别与等量的金黄色葡萄球菌和粪链球菌液体培养物混合，接种入6ml MQQ培养液，37℃静置培养24h后，各取培养物50μl，分别接种血琼脂平板、Baird-Parker选择琼脂平板和麦康凯琼脂平板，37℃继续培养24h后观察有无大肠杆菌、葡萄球菌和粪链球菌生长，结果经过在MQQ培养液中选择培养24h后，分离到的均为大肠杆菌。
4、MQQ培养液对大肠杆菌的选择灵敏度：用已知的大肠杆菌单菌落接种普通肉汤培养液，37℃培养12小时后，用平板计数法进行细菌计数后，用MQQ培养液将培养物作101、102、103、104、105、106、107、108、109、1010倍稀释，每稀释度取20μl接种2mlMQQ选择性培养液，37℃培养24h后，根据培养液颜色变化初步判断有无大肠杆菌生长，然后从每管中取100μl培养物涂布普通琼脂平板，37℃培养24h后计数菌落，以有大肠杆菌生长的最高稀释倍数为MQQ培养液的选择培养灵敏度，结果MQQ培养液选择培养大肠杆菌的灵敏度为10个细菌。
5、MQQ培养液对临床奶样中大肠杆菌的选择培养效果：根据临床检查和乳汁体细胞检测(标准的CMT法)结果，采集乳房炎阳性奶样43份，划线接种麦康凯琼脂平板，然后挑取典型大肠杆菌菌落进行吲哚产生试验，确定为大肠杆菌感染的奶样12份。各取10μl大肠杆菌阳性奶样与2ml MQQ培养液混合，分别取50μl接种MQQ培养液、麦康凯琼脂平板、Baird-Parker选择琼脂平板和EN琼脂平板。37℃培养24小时后，根据MQQ培养液颜色变化初步判定有无大肠杆菌生长，取阳性培养物制备细菌涂片，经革兰氏染色后进行细菌形态和染色特性观察，以确定有无非大肠杆菌生长；观察和纪录三种琼脂平板上有无大肠杆菌、葡萄球菌和链球菌的典型菌落，结合染色镜检和生化试验对可疑大肠杆菌进行确认。综合上述结果判断MQQ培养液的选择培养效果及其与麦康凯平板选择培养法的符合率。结果显示，经MQQ培养液选择培养的12份大肠杆菌阳性奶样在麦康凯琼脂平板上均生长出典型的大肠杆菌菌落，其中7份奶样还在Baird-Parker琼脂平板上生长出典型的链球菌菌落，另7份奶样还在EN琼脂平板上生长出葡萄球菌菌落(见表1)，说明MQQ培养液对临床奶样中大肠杆菌的选择培养效果与麦康凯琼脂平板一致，部分奶样中有链球菌和葡萄球菌的混合感染。
6、MQQ培养液对抗生素抑菌活性的影响及合适抗生素包被浓度的确定：从乳房炎阳性奶样中分离到大肠杆菌15株，参照NCCLS20012关于大肠杆菌纸片扩散法药敏试验及相关MIC的解释(表2)，用标准的纸片扩散法药敏试验确定15株大肠杆菌对8种抗生素(氨苄青霉素、头孢拉定、头孢曲松、庆大霉素、丁胺卡那、环丙沙星、氧氟沙星和磺胺甲恶唑)的敏感性(见表3)。取单个菌落接种2ml肉汤，37℃培养12h后备用。将0.5、1.0、1.5、2.0倍于标准MIC的抗菌素加入分装有200μl/孔MQQ培养液的96孔培养板，向各孔中加入10μl大肠杆菌肉汤培养物，35℃培养24h后，根据培养液的颜色变化判断有无细菌生长和用MQQ培养液进行药敏试验所需的抗菌素MIC。结果表明，MQQ培养液对氨苄青霉素、头孢曲松、环丙沙星和氧氟沙星的抑菌活性无影响，对头孢拉定、庆大霉素、丁胺卡那霉素和磺胺甲恶唑的抑菌活性有一定程度的影响(见表4)。据此，在以MQQ培养液进行快速药敏试验时，使用标准MIC的氨苄青霉素、头孢曲松、环丙沙星和氧氟沙星，2倍于标准MIC的头孢拉定和磺胺甲恶唑，2.5倍于标准MIC的庆大霉素和丁胺卡那霉素，所获结果与标准的纸片扩散法相同(见表5)。
7、用乳房炎阳性奶样和MQQ培养液进行快速药敏试验：向每孔分装有200μl MQQ培养液的96孔板孔中加入校正MIC的氨苄青霉素、头孢拉定、头孢曲松、庆大霉素、丁胺卡那、环丙沙星、氧氟沙星、磺胺甲恶唑，再向各孔中分别接种乳房炎奶样及从中分离的大肠杆菌肉汤培养物10μl，35℃静置培养24h后，根据培养液颜色变化判断有无细菌生长和对所试抗生素的敏感性，并比较用临床奶样和细菌纯培养进行快速药敏试验的符合率，结果表明，以MQQ为培养液，用临床奶样和大肠杆菌纯培养进行的快速药敏试验结果与标准的纸片扩散法相同(见表6)。
以上实施结果表明，MQQ培养液(基)对致奶牛乳房炎大肠杆菌具有很强的选择特异性、灵敏度和鉴别能力。将MQQ培养液与24或96孔细菌培养板组合，建立的致奶牛乳房炎大肠杆菌的快速鉴别方法，只要将培养液分装于培养板孔、接种微量奶样和经过24小时培养，即能明确得出是否为大肠杆菌感染的结论。将包被有校正后抗生素的96孔培养板与MQQ培养液组合，建立的致奶牛乳房炎大肠杆菌的快速药敏试验方法，只要将培养液分装、接种微量样品和24小时培养，即能明确知道大肠杆菌对何种抗生素敏感或耐药。建立的大肠杆菌快速鉴别和药敏试验不仅可用于大肠杆菌纯培养的药敏试验，更重要的是能直接用临床奶样进行药敏试验，其特出优点是快速、简便、价廉和不需专门仪器设备，特别适合奶牛场和临床兽医使用。
表1用不同培养基从临床奶样中分离大肠杆菌的效果比较
| 奶样编号 | MQQ培养液(大肠杆菌) | 麦康凯琼脂平板(大肠杆菌) | Baird-Parker琼脂平板(链球菌) | EN琼脂平板(葡萄球菌) |
| 1072 | + | + | + | - |
| 6090 | + | + | + | - |
| 2789 | + | + | + | + |
| 1148 | + | + | + | + |
| 2761 | + | + | - | - |
| 无号 | + | + | + | + |
| 0188 | + | + | - | - |
| 2724 | + | + | + | + |
| 0041 | + | + | - | + |
| 9114 | + | + | + | + |
| 2740 | + | + | - | + |
| 1134 | + | + | - | - |
表2国际标准NCCLS20012关于大肠杆菌纸片扩散法药敏试验及相关MIC的解释
表3 15株大肠杆菌对8种抗生素的敏感性(标准纸片扩散法)
| 3049 | S(19) | S(18) | S(29) | S(25) | S(26) | S(35) | S(28) | R(10) |
| 9952 | S(17) | S(18) | S(30) | S(24) | S(23) | S(25) | S(21) | R(14) |
| E3 | S(17) | S(19) | S(33) | S(23) | S(23) | S(23) | S(20) | R(9) |
| 9A18 | R(10) | R(17) | R(20) | R(12) | R(16) | S(25) | S(21) | R(10) |
| E5 | R(10) | R(17) | S(23) | S(20) | S(19) | S(21) | S(18) | R(10) |
| 敏感率 | 9/15 | 10/15 | 14/15 | 12/15 | 13/15 | 12/15 | 14/15 | 4/15 |
S代表敏感；R代表不敏感；数字代表抑菌圈直径(mm)。
表4标准纸片扩散法和MQQ液体培养法大肠杆菌药敏试验结果的比较
| 抗生素 | 菌株 | 纸片法 | MQQ液体培养法 | |||
| 0.5MIC | 1.0MIC | 1.5MIC | 2.0MIC | |||
| 氨苄青霉素 | 1079 | S(19) | - | - | - | - |
| 3049 | S(19) | + | - | - | - | |
| E3 | S(17) | - | - | - | - | |
| E5 | R(10) | + | + | + | + | |
| 头孢拉定 | 大肠3 | S(22) | + | - | - | - |
| 1148 | S(19) | + | + | - | - | |
| 1134 | I(16) | + | + | + | + | |
| 无号 | I(16) | + | + | + | + | |
| 头孢曲松 | E5 | S(23) | - | - | - | - |
| 3049 | S(29) | - | - | - | - | |
| E3 | S(33) | - | - | - | - | |
| 9A18 | I(20) | + | + | + | + | |
| 庆大霉素 | E5 | S(20) | - | - | - | - |
| 大肠3 | S(24) | + | + | + | - | |
| 1079 | S(28) | - | - | - | - | |
| 9A18 | R(12) | + | + | + | + | |
| 丁胺卡那 | 1014 | S(18) | + | - | - | - |
| 1079 | S(26) | + | - | - | - | |
| E5 | S(19) | + | + | + | - | |
| 9A18 | I(16) | + | + | + | + | |
| 环丙沙星 | 3049 | S(35) | - | - | - | - |
| E5 | S(21) | - | - | - | - | |
| E5 | S(210 | + | - | - | - | |
| 1014 | I(20) | + | + | - | - | |
| 氧氟沙星 | E3 | S(20) | - | - | - | - |
| 9A18 | S(21) | - | - | - | - | |
| E5 | S(18) | + | - | - | - | |
| 0047 | R(9) | + | + | + | + | |
| 磺胺甲恶唑 | 2740 | S(28) | - | - | - | - |
| 1134 | S(25) | + | - | - | - | |
| 3094 | S(23) | + | + | + | - | |
| 0047 | R(9) | + | + | + | + | |
S代表敏感，I代表中度敏感，R代表耐药，括号内数字代表抑菌圈直径(mm)；+和-分别代表在含不同倍于标准MIC的MQQ培养液中生长和不生长。
表5用MQQ培养液进行快速药敏试验所需的抗菌素浓度的确定
| 抗菌素 | 氨苄青霉素 | 头孢拉定 | 头孢曲松 | 庆大霉素 | 丁胺卡那 | 环丙沙星 | 氧氟沙星 | 磺胺(SMZ) |
| MIC* | 1.0X | 2.0X | 1.0X | 2.5X | 2.5X | 1.0X | 1.0X | 2.0X |
| 实际浓度 | 8μg/ml | 16μg/ml | 8μg/ml | 10μg/ml | 40μg/ml | 1μg/ml | 2μg/ml | 200μg/ml |
*国际标准的最小抑菌浓度。
表6用临床奶样和大肠杆菌纯培养进行的MQQ液体培养法与标准纸片扩散法药敏试验结果
| 菌株编号 | 方法 | 抗生素 | |||||||
| 氨苄青霉素 | 头孢拉定 | 头孢曲松 | 庆大霉素 | 丁胺卡那霉素 | 环丙沙星 | 氧氟沙星 | 磺胺甲恶唑 | ||
| 0047 | 纸片法 | S | R | R | S | S | S | S | S |
| MQQ/纯培养 | - | + | + | - | - | - | - | - | |
| MQQ/奶样 | - | + | + | - | - | - | - | - | |
| 3094 | 纸片法 | S | S | S | S | S | S | S | S |
| MQQ/纯培养 | - | - | - | - | - | - | - | - | |
| MQQ/奶样 | - | - | - | - | - | - | - | - | |
| 2740 | 纸片法 | S | S | S | S | S | S | S | S |
| MQQ/纯培养 | - | - | - | - | - | - | - | - | |
| MQQ/奶样 | - | - | - | - | - | - | - | - | |
| 无号 | 纸片法 | R | R | R | R | S | S | S | R |
| MQQ/纯培养 | + | + | + | + | - | - | - | + | |
| MQQ/奶样 | + | + | + | + | - | - | - | + | |
| 1148 | 纸片法 | S | S | S | S | S | S | S | S |
| MQQ/纯培养 | - | - | - | - | - | - | - | - | |
| MQQ/奶样 | - | - | - | - | - | - | - | - | |
| 1134 | 纸片法 | S | S | S | S | S | S | S | S |
| MQQ/纯培养 | - | - | - | - | - | - | - | - | |
| MQQ/奶样 | - | - | - | - | - | - | - | - | |
| 9A18 | 纸片法 | R | R | R | R | R | S | S | R |
| MQQ/纯培养 | + | + | + | + | + | - | - | + | |
| MQQ/奶样 | + | + | + | + | + | - | - | + | |
| 大肠3 | 纸片法 | S | S | S | S | S | S | S | R |
| MQQ/纯培养 | - | - | - | - | - | - | - | + | |
| MQQ/奶样 | - | - | - | - | - | - | - | + | |
S代表敏感；R代表耐药；+和-分别代表在校正后MIC及MQQ培养液中生长(耐药)和不生长(敏感)。
Claims (3)
1、一种致奶牛乳房炎大肠杆菌培养液的配制方法，其特征在于：先将10g蛋白胨、1.5g三号胆盐、10g乳糖、5g氯化钠和5g柠檬酸钠溶于1000ml水中，再用氢氧化钠溶液调整pH值至7.2，再向溶液中加入无菌1％结晶紫水溶液0.5ml和0.4％酚红水溶液4ml，在121℃下灭菌，最后置于4℃保存。
2、根据权利要求1所述的大肠杆菌培养液用于鉴别致奶牛乳房炎大肠杆菌的方法，其特征在于：将培养液分装于培养板孔，接种奶样，在37℃条件下培养24小时，培养液红色变为黄色，判断奶样中有大肠杆菌。
3、根据权利要求1所述的大肠杆菌培养液用于致奶牛乳房炎大肠杆菌的药敏试验，其特征在于：在包被有实验校正后MIC抗生素的培养板孔加入培养液，再接种奶样，在35℃条件下培养24小时，根据培养液颜色变化测定大肠杆菌对抗生素的敏感性。
Priority Applications (1)
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