CN1849339A - 治疗性结合分子 - Google Patents

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Abstract

包含至少一个抗原结合位点的分子，其在序列中包含高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列Asn－Tyr－Ile－IIe－His(NYIIH)，所述CDR2具有氨基酸序列Tyr－Phe－Asn－Pro－Tyr－Asn－His－Gly－Thr－Lys－Tyr－Asn－Glu－Lys－Phe－Lys－Gly(YFNPYNHGTKYNEKFKG)并且所述CDR3具有氨基酸序列Ser－GIy－Pro－Tyr－Ala－Trp－Phe－Asp－Thr(SGPYAWFDT)；例如，在序列中还包含高变区CDR1’、CDR2’和CDR3’，CDR1’具有氨基酸序列Arg－Ala－Ser－Gln－Asn－IIe－GIy－Thr－Ser－Ile－Gln(RASQNIGTSIQ)，CDR2’具有氨基酸序列Ser－Ser－Ser－Glu－Ser－Ile－Ser(SSSESIS)，CDR3’具有氨基酸序列Gln－Gln－Ser－Asn－Thr－Trp－Pro－Phe－Thr(QQSNTWPFT)，例如，嵌合或人源化的抗体，所述分子可以用作药物。

Description

治疗性结合分子
发明领域
本发明涉及有机化合物，如针对CD45抗原同种型的结合分子，例如单克隆抗体(mAbs)，和它的用途。
发明背景
在多种疾病的治疗中的一种方法是实现病原性白细胞的消除或者失活和实现诱导耐受性以失活病理免疫应答的潜力。
认为器官、细胞和组织移植排斥和多种自身免疫病主要是辅助T细胞引发的T细胞介导的免疫应答的结果，所述辅助T细胞能够识别被捕获的、经加工并由抗原呈递细胞(APC)，如巨噬细胞和树突细胞以抗原-MHC复合体形式呈递给辅助T细胞的特异抗原，即辅助T细胞当识别特异抗原时受到刺激而产生细胞因子，如IL-2和表达或上调某些细胞因子受体和其他激活分子和增殖。这些受活化的辅助T细胞的一些可以直接或间接作用，即帮助效应细胞毒性T细胞或B细胞破坏表达所选抗原的细胞或者组织。免疫应答结束后，一些成熟的经克隆选择的细胞以记忆辅助T细胞和记忆性细胞毒性T细胞保存，所述T细胞在身体内循环并且如果再次出现抗原则快速识别该抗原。如果引发该应答的抗原是无害的环境抗原，那么结果是变态反应，如果抗原不是外来抗原，而是自身抗原，那么可以导致自身免疫病；如果抗原是来自移植器官的抗原，那么结果可以是移植物排斥。
免疫系统已经发展到识别自身与非自身。该性质使得生物在暴露于每天病原体攻击的环境中生存。这种对非自身的特异性和对自身的耐受性在胸腺中T细胞库的发育中通过正和负选择产生，所述选择也包括自身反应性T细胞的识别和清除。该类型的耐受称作中心耐受。然而，这些自身反应性细胞中的一些逃脱该选择机制并造成发生自身免疫病的潜在危险。为了控制逃逸到外周的自身反应性T细胞，免疫系统具有外周调节机制，其提供抗自身免疫的保护。这些机制是外周耐受性的基础。
特定mAb识别的细胞表面抗原通常由相继的国际白细胞分型(International Leukocyte Typing)机构分配的CD(分化抗原簇)号表示，并且应用于此处的术语CD45指细胞表面白细胞共同抗原CD45；针对该抗原的mAb在本文称作“抗-CD45”。
针对白细胞共同抗原(LCA)或CD45的抗体是抗淋巴细胞球蛋白(ALG)的主要成分。CD45属于跨膜酪氨酸磷酸酶家族并且是细胞活化的正和负调节剂，这取决于受体相互作用。CD45的磷酸酶活性似乎是与B和T淋巴细胞的抗原受体结合的Src-家族激酶的活化所需的(Trowbridge IS等人，Annu Rev Immunol.1994；12：85-116)。从而，在T细胞活化中，CD45是信号1必需的并且CD45-缺陷细胞在TCR-介导的活化事件中具有深远的缺陷。
CD45抗原以不同同种型存在，包括跨膜糖蛋白家族。CD45的不同同种型在它们的胞外结构域结构中不同，所述不同由编码CD45胞外区的部分的3种可变外显子的可变剪切引起(Streuli MF.等人，J.Exp.Med.1987；166：1548-1566)。CD45的多种同种型具有不同的胞外结构域，但是具有相同的跨膜和细胞质片段，其具有约300个残基的两个同源的、高度保守的磷酸酶结构域。不同的同种型组合在T和B淋巴细胞的亚群中差别表达(Thomas ML.等人，Immunol.Today 1988；9：320-325)。一些单克隆抗体识别所有不同同种型共同的表位，而其他mAb具有受限的(CD45R)特异性，这取决于它们识别哪种可变剪切的外显子(A、B或C)。例如，识别外显子A的产物的单克隆抗体因此称作CD45RA，识别含有外显子B的多种同种型的那些单克隆抗体称作CD45RB(Beverley PCL等人，Immunol.Supp.1988；1：3-5)。抗体如UCHL1选择性结合180kDa同种型CD45RO(没有可变外显子A、B或C的任一种)，其似乎局限于活化的T细胞、记忆细胞和皮质胸腺细胞的亚群并且在B细胞上检测不到(Terry LA等人，Immunol.1988；64：331-336)。
附图描述
图1表明“候选mAb”对初次MLR的抑制在0.001到10μg/ml的范围内是剂量依赖的。“浓度”为“候选mAb”的浓度。
图2显示了表达载体HCMV-G1 HuA6-VHQ的质粒图，所述载体在完整表达载体核苷酸序列SEQ ID NO：15中包含具有核苷酸序列SEQ IDNO：12(3921-4274)的重链。
图3显示了表达载体HCMV-G1HuA6-VHE的质粒图，所述载体在完整表达载体核苷酸序列SEQ ID NO：16中包含具有核苷酸序列SEQ IDNO：11(3921-4274)的重链。
图4显示了表达载体HCMV-K HuAb-VL1 humV1的质粒图，所述载体在完整表达载体核苷酸序列SEQ ID NO：17中包含具有核苷酸序列SEQID NO：14(3964-4284)的轻链。
图5显示了表达载体HCMV-K HuAb-VL1 humV2的质粒图，所述载体在完整表达载体核苷酸序列SEQ ID NO：18中包含具有核苷酸序列SEQID NO：13(3926-4246)的轻链。
图6显示了表达载体LCVL1SP20的质粒图，所述载体在完整表达载体核苷酸序列SEQ ID NO：36中包含具有核苷酸序列SEQ ID NO：33的轻链。
图7显示了表达载体LCVL2SP20的质粒图，所述载体在完整表达载体核苷酸序列SEQ ID NO：39中包含具有核苷酸序列SEQ ID NO：13的轻链。
图8显示了表达载体HCVHEN73D Sp20的质粒图，所述载体在完整表达载体核苷酸序列SEQ ID NO：37中包含具有核苷酸序列SEQ IDNO：34的重链。
图9显示了表达载体HCVHQN73D Sp20的质粒图，所述载体在完整表达载体核苷酸序列SEQ ID NO：38中包含具有核苷酸序列SEQ IDNO：35的重链。
图10显示了表达载体HCVHESp20的质粒图，所述载体在完整表达载体核苷酸序列SEQ ID NO：40中包含具有核苷酸序列SEQ ID NO：11的重链。
图11显示了表达载体HCVHQSp20的质粒图，所述载体在完整表达载体核苷酸序列SEQ ID NO：41中包含具有核苷酸序列SEQ ID NO：12的重链。
图12显示了VHE/humV1、VHE/humV2、VHQ/humV1和VHQ/humV2，和VHE/humV1与VHE-N73D/humV1一起的大小排阻层析分析。
图13显示了VHE/humV2、VHE/humV1、VHQ/humV2、VHQ/humV1和VHE/humV2与VHE-N73D/humV1一起的阳离子交换层析。
图14显示了VHE/humV2和VHE-N73D/humV1的反相层析。
发明描述
我们现在已经发现一种结合分子，其包含结合CD45RO和CD45RB的多肽序列，将该结合分子此后也称作“CD45RO/RB结合分子”。根据本发明的这些结合分子可以诱导免疫抑制，抑制初次T细胞应答和诱导T细胞耐受性。此外，本发明的结合分子抑制初次混合淋巴细胞应答(MLR)。来自用CD45RO/RB结合分子处理的培养物的细胞优选甚至在二次MLR中缺少CD45RO/RB结合分子时也在二次MLR中具有受损的增殖应答。二次MLR中此类受损的增殖应答表明本发明的结合分子能够诱导耐受性。此外，发现本发明的CD45RO/RB结合分子可以通过人T淋巴细胞中的程序性细胞死亡诱导细胞死亡，可以支持具有特征性T调节细胞(Treg)表型的T细胞的分化；和/或可以诱导能够抑制幼稚T细胞活化的T调节细胞。
此外，发现对用人PBMC注射后经历异-GVHD的重度联合免疫缺损(SCID)小鼠体内施用CD45RO/RB结合分子，与对照处理的小鼠相比，可以延长小鼠存活，尽管在CD45RO/RB结合分子处理的小鼠中仍然可以检测到循环的人T细胞。CD45RO/RB结合分子还可以抑制介导人同种异体移植皮肤排斥的炎性过程。此外，发现CD45RO/RB结合分子可以抑制介导人同种异体移植皮肤排斥的炎性过程，具体地，可以抑制介导用人皮肤移植并且植入单核脾细胞的SCID小鼠体内人同种异体皮肤排斥的炎性过程。此外，发现CD45RO/RB结合分子通过防止移植物-浸润和通过抑制白细胞介导的体内排斥反应延长人胰岛异源移植物的存活。
“CD45RO/RB结合分子”指能够单独或者联合其他分子特异结合CD45抗原的CD45RB和CD45RO同种型的分子。通过标准方法(定性测定)可以显示结合反应，所述方法包括例如任意类型的结合测定法，如直接或间接免疫荧光以及荧光显微术或者细胞荧光光度(FACS)分析、酶联免疫吸附测定(ELISA)或者放射免疫测定，其中可以显现分子对表达特定CD45同种型的细胞的结合。此外，该分子的结合可以导致表达这些同种型的细胞功能的改变。例如，可以确定初次或二次混合淋巴细胞应答(MLR)的抑制，如用体外测定法或者生物测定法来确定存在和不存在CD45RO/RB结合分子时初次或二次MLR的抑制和确定初次MLR抑制的差异。
备选地，例如，MLR中细胞活化后，或者用特定抗原如破伤风类毒素或者其他抗原、或者用多克隆刺激剂如植物凝集素(PHA)或者抗CD3和抗CD28抗体或者佛波酯和Ca2+离子载体刺激后，通过测量PBMC或者T细胞或者CD4+T细胞增殖、细胞因子的产生、细胞表面分子表达的改变也可以确定体外功能调节效果。以关于MLR所描述的类似的方式设置培养物，只是使用可溶性抗原或者多克隆刺激剂(如上面提到的那些)代替同种异体细胞作为刺激剂。优选如上述通过3H-胸苷掺入测量T细胞增殖。
优选通过夹心ELISA测量细胞因子产生，在夹心ELISA中，将细胞因子捕获抗体包被在96-孔板的表面上，加入来自培养物的上清液并在室温孵育1小时，然后加入检测对特异细胞因子特异的抗体，之后加入缀合酶(如辣根过氧化物酶)的第二步抗体，然后加入相应底物并在平板读出器中测量吸收。用对特定细胞表面分子特异的抗体染色靶细胞后，优选通过直接或间接免疫荧光测量细胞表面分子中的改变。可以用荧光色素直接标记抗体或者可以使用对第一种抗体特异的荧光标记的第二步抗体，并用细胞荧光光度计分析细胞。
本发明的结合分子具有对CD45RO和CD45RB的结合特异性(“CD45RO/RB结合分子”)。
优选地，所述结合分子以＜20nM的解离常数(Kd)，优选＜15nM或＜10nM的Kd，更优选＜5nM的Kd结合CD45RO同种型。优选地，所述结合分子以＜50nM的Kd，优选以＜15nM或＜10nM的Kd，更优选＜5nM的Kd结合CD45RB同种型。
在另一优选实施方案中，本发明的结合分子结合那些CD45同种型，其
1)包括CD45分子的A和B表位但不包括C表位；和/或
2)包括CD45分子的B表位但不包括A和C表位；和/或
3)不包括CD45分子的A、B或C表位的任一种。
在另一优选实施方案中，本发明的结合分子不结合这样的CD45同种型，其包括
1)CD45分子的A、B和C表位的全部；和/或
2)CD45分子的B和C表位，但不包括A表位。
在另一优选实施方案中，本发明的结合分子还
1)识别记忆T细胞和体内异常活化(alloactivated)的T细胞；和/或
2)结合其在人T细胞，如PEER细胞上的靶标；其中所述结合优选具有Kd＜15nM，更优选Kd＜10nM，最优选Kd＜5nM；和/或
3)抑制体外异常活性T细胞功能，优选IC50为约小于100nM，优选小于50nM或30nM，更优选IC50为约10或5nM，最优选IC50为约0.5nM或甚至0.1nM；和/或
4)通过人T淋巴细胞中程序性细胞死亡诱导细胞死亡；和/或
5)体外诱导异源抗原特异的T细胞耐受性；和/或
6)当以有效量施用时，防止通过注射人PBMC在SCID小鼠中诱导的致命的异种移植物抗宿主病(GvHD)；和/或
7)结合T淋巴细胞、单核细胞、干细胞、自然杀伤细胞和/或粒细胞，但是不结合血小板或者B淋巴细胞；和/或
8)支持具有特征性T调节细胞(Treg)表型的T细胞的分化；和/或
9)诱导能够抑制幼稚T细胞活化的T调节细胞；和/或
10)抑制介导人异源移植物皮肤排斥的炎症过程，尤其抑制介导用人皮肤移植并植入单核脾细胞的SCID小鼠中体内人异源移植物皮肤排斥的炎症过程；和/或
11)延长hu-PBL-NOD/SCID小鼠模型中人胰岛异源移植物的存活。
在另一优选实施方案中，本发明的结合分子结合与Aversa等人，Cellular Immunology 158，314-328(1994)描述的单克隆抗体“A6”相同的表位。
由于上述结合性质和生物学活性，本发明的此类结合分子可尤其用于药物，用以治疗和/或预防。如将在下面进一步给出，其中本发明的结合分子尤其有用的疾病包括自身免疫病、移植排斥、皮炎、炎性肠病和/或变态反应。
我们已经发现包含SEQ ID NO：1的多肽和SEQ ID NO：2的多肽的分子是CD45RO/RB结合分子。我们还发现CD45RO/RB结合分子中SEQ IDNO：1的高变区CDR1’、CDR2’和CDR3’，CDR1’具有氨基酸序列Arg-Ala-Ser-Gln-Asn-Ile-Gly-Thr-Ser-Ile-Gln(RASQNIGTSIQ)(SEQ IDNO：19)，CDR2’具有氨基酸序列Ser-Ser-Ser-Glu-Ser-Ile-Ser(SSSESIS)(SEQ ID NO：20)，CDR3’具有氨基酸序列Gln-Gln-Ser-Asn-Thr-Trp-Pro-Phe-Thr(QQSNTWPFT)(SEQ ID NO：21)。
我们还发现了CD45RO/RB结合分子中SEQ ID NO：2的高变区CDR1、CDR2和CDR3，CDR1具有氨基酸序列Asn-Tyr-Ile-Ile-His(NYIIH)(SEQID NO：22)，CDR2具有氨基酸序列Tyr-Phe-Asn-Pro-Tyr-Asn-His-Gly-Thr-Lys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly(YFNPYNHGTKYNEKFKG)(SEQ ID NO：23)，CDR3具有氨基酸序列Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phe-Asp-Thr(SGPYAWFDT)(SEQ ID NO：24)。
CDR为三种特异互补决定区，它们也称作高变区，其基本上决定抗原结合特征。这些CDR是可变区，例如，分别为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的部分，其中这些CDR与构架区(FR)，例如恒定区交替。在根据本发明的嵌合抗体中，SEQ ID NO：1是轻链，例如，SEQ ID NO：3的部分，SEQID NO：2是重链，例如，SEQ ID NO：4的部分。重链的CDR与所结合的轻链的CDR基本上组成了本发明分子的抗原结合位点。已知轻链可变区对结合能的贡献与所结合的重链可变区相比较小，并且所分离的重链可变区自身具有抗原结合活性。此类分子通常称作单结构域抗体。
在一方面，本发明提供了包含至少一个抗原结合位点的结合分子，例如，CD45RO/RB结合分子，所述结合分子在序列中包含高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列Asn-Tyr-Ile-Ile-His(NYIIH)(SEQ ID NO：22)，所述CDR2具有氨基酸序列Tyr-Phe-Asn-Pro-Tyr-Asn-His-Gly-Thr-Lys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly(YFNPYNHGTKYNEKFKG)(SEQ ID NO：23)，所述CDR3具有氨基酸序列Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phe-Asp-Thr(SGPYAWFDT)(SEQ IDNO：24)；例如，和它的直接等价物。
另一方面，本发明提供了包含至少一个抗原结合位点的分子，例如，CD45RO/RB结合分子，所述分子包含
a)第一个结构域，其在序列中包含高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列Asn-Tyr-Ile-Ile-His(NYIIH)(SEQ ID NO：22)，所述CDR2具有氨基酸序列Tyr-Phe-Asn-Pro-Tyr-Asn-His-Gly-Thr-Lys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly(YFNPYNHGTKYNEKFKG)(SEQ ID NO：23)，所述CDR3具有氨基酸序列Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phe-Asp-Thr(SGPYAWFDT)(SEQ ID NO：24)；和
b)第二个结构域，其在序列中包含高变区CDR1’、CDR2’和CDR3’，CDR1’具有氨基酸序列Arg-Ala-Ser-Gln-Asn-Ile-Gly-Thr-Ser-Ile-Gln(RASQNIGTSIQ)(SEQ ID NO：19)，CDR2’具有氨基酸序列Ser-Ser-Ser-Glu-Ser-Ile-Ser(SSSESIS)(SEQ ID NO：20)，CDR3’具有氨基酸序列Gln-Gln-Ser-Asn-Thr-Trp-Pro-Phe-Thr(QQSNTWPFT)(SEQ IDNO：21)，例如，和它的直接等价物。
在优选实施方案中，在序列中包含高变区CDR1、CDR2和CDR3的第一个结构域为免疫球蛋白重链，在序列中包含高变区CDR1’、CDR2’和CDR3’的第二个结构域为免疫球蛋白轻链。
在另一方面，本发明提供了分子，例如，CD45RO/RB结合分子，所述分子包含SEQ ID NO：1的多肽和/或SEQ ID NO：2的多肽，优选在一个结构域中包含SEQ ID NO：1的多肽，在另一结构域中包含SEQ ID NO：2的多肽，例如，嵌合单克隆抗体，在另一方面，提供了分子，例如，CD45RO/RB结合分子，所述分子包含SEQ ID NO：3的多肽和/或SEQ IDNO：4的多肽，优选在一个结构域中包含SEQ ID NO：3的多肽，在另一结构域中包含SEQ ID NO：4的多肽，例如，嵌合单克隆抗体。
当抗原结合位点包含第一和第二个结构域，或者分别SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的多肽，和分别SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的多肽时，这些结构域可以位于相同多肽上，或者，优选每个结构域在不同的链上，例如，第一个结构域为重链，例如免疫球蛋白重链的部分或者其片段，第二个结构域为轻链，例如免疫球蛋白轻链的部分或者其片段。
我们还发现根据本发明的CD45RO/RB结合分子是哺乳动物(例如，人)身体环境中的CD45RO/RB结合分子。从而根据本发明的CD45RO/RB结合分子可以称作单克隆抗体(mAb)，其中主要通过如上述的基本上为人来源的CDR区确定结合活性，所述CDR区为例如与其他分子结合而不结合特异性的CDR区，如构架区，例如，恒定区。
在另一方面，本发明提供了CD45RO/RB结合分子，其不是如Aversa等人，Cellular Immunology 158，314-328(1994)描述的单克隆抗体“A6”，将所述文献引用作为用于表征A6的段落的参考。
在另一方面，本发明提供了根据本发明的CD45RO/RB结合分子，其是嵌合的、人源化的或者完全人单克隆抗体。
CD45RO/RB结合分子的实例包括嵌合的或人源化抗体，例如，来自通过B细胞或杂交瘤产生的抗体的嵌合的或人源化抗体和/或其任意片段，例如，F(ab’)2片段和Fab片段，以及单链或者单结构域抗体。单链抗体由通常由10到30个氨基酸，优选15到25个氨基酸组成的肽连接体共价结合的抗体重链和轻链的可变区组成。因此，这种结构不包括重链和轻链的恒定部分并且认为小肽间隔区的抗原性应该小于完整恒定部分的抗原性。嵌合抗体指这样的抗体，其中重链和轻链的恒定区或者两者为人源的，而重链和轻链的可变区都是非人(例如，鼠)源的。人源化抗体指这样的抗体，其中高变区(CDR)为非人(例如，鼠)源的，而所有或者基本上所有其他部分，例如，恒定区和可变区的高度保守部分是人源的。然而，人源化抗体可以在与高变区相邻的可变区的部分中保留鼠序列的一些氨基酸。
高变区，即根据本发明的CDR可以与任意类型的构架区，例如，人源的轻链和重链的恒定部分结合。适宜的构架区例如，在″Sequences ofproteins of immunological interest″，Kabat，E.A.等人，US department ofhealth and human services，Public health service，National Institute ofhealth中描述。优选地，人重链的恒定部分可以是IgG1类型，包括亚型，优选人轻链的恒定部分可以是κ或λ型，更优选为κ型。优选地，所述重链包含不多于一个糖基化位点，最优选地，所述糖基化位点为N-糖基化位点，最优选地，一个糖基化位点位于重链的恒定部分。最优选地，在可变区中不存在糖基化位点，优选地，在构架区中无糖基化位点。
重链的优选的恒定部分为SEQ ID NO：4的多肽(没有上面指出的CDR1′、CDR2′和CDR3′序列)并且轻链的优选恒定部分为SEQ ID NO：3的多肽(没有上面指出的CDR1、CDR2和CDR3序列部分)。
我们还发现人源化抗体，其包含氨基酸SEQ ID NO：7或氨基酸SEQID NO：8的轻链可变区和/或SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的重链可变区，所述轻链可变区包含根据本发明的CDR1′、CDR2′和CDR3′，所述重链可变区包含根据本发明的CDR1、CDR2和CDR3。此外，提供了另一种人源化抗体，其包含氨基酸SEQ ID NO：7或氨基酸SEQ ID NO：8的轻链可变区和/或SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：32的重链可变区，所述轻链可变区包含根据本发明的CDR1′、CDR2′和CDR3′，所述重链可变区包含根据本发明的CDR1、CDR2和CDR3。
另一方面，本发明提供了人源化抗体，其包含SEQ ID NO：9或SEQ IDNO：10的多肽和SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的多肽。本发明的另一方面提供了结合分子，其为人源化抗体，其包含SEQ ID NO：31或SEQ IDNO：32的多肽和SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的多肽。
另一方面，本发明提供了人源化抗体，其包含
-SEQ ID NO：9的多肽和SEQ ID NO：7的多肽(如VHE/humV2)，
-SEQ ID NO：9的多肽和SEQ ID NO：8的多肽(如VHE/humV1)，
-SEQ ID NO：10的多肽和SEQ ID NO：7的多肽(如VHQ/humV2)，
-SEQ ID NO：10的多肽和SEQ ID NO：8的多肽(如VHQ/humV1)，
-SEQ ID NO：31的多肽和SEQ ID NO：7的多肽(如VHEN73D/humV2)，
-SEQ ID NO：31的多肽和SEQ ID NO：8的多肽(如VHEN73D/humV1)，
-SEQ ID NO：32的多肽和SEQ ID NO：7的多肽(如VHQN73D/humV2)，或
-SEQ ID NO：32的多肽和SEQ ID NO：8的多肽(如VHQN73D/humV1)。
根据本发明的多肽，例如，具有本文说明的序列，例如，具有CDR1(SEQ ID NO：22)、CDR2(SEQ ID NO：23)、CDR3(SEQ ID NO：24)、CDR1′(SEQ ID NO：19)、CDR2′(SEQ ID NO：20)、CDR3′(SEQ ID NO：21)，或SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：32的多肽包括所述(多)肽(序列)的直接等价物；例如，包括所述多肽的功能衍生物。所述功能衍生物可以包括所指定的序列的共价修饰，和/或所述功能衍生物可以包括所指定序列的氨基酸序列变体。
如果不在本文中另外指出，“多肽”包括肽或蛋白质，其包含通过肽键相互连接的氨基酸，具有以N-末端的氨基酸序列开始和以C-末端结束的氨基酸序列。优选地，本发明的多肽为单克隆抗体，更优选为嵌合的(V-移植的)或者人源化(CDR-移植的)单克隆抗体。所述人源化(CDR-移植的)单克隆抗体可以或可以不包括引入接受抗体的构架(FR)序列的进一步突变。优选地，所述人源化或嵌合抗体包含不多于一个糖基化位点。最优选地，所述一个糖基化位点为N-糖基化位点。最优选地，可变区中不存在糖基化位点，甚至更优选地，在重链的可变区中不存在糖基化位点，最优选地，在构架区(FR)中不存在糖基化位点。
本文所用的多肽的功能衍生物包括具有和本发明的多肽一样的定性生物学活性，即具有结合CD45RO和CD45RB的能力的分子。功能衍生物包括根据本发明的多肽的片段和肽类似物。片段包含根据本发明的多肽的，例如所指定序列的序列内的区域。术语“衍生物”用于定义根据本发明的多肽，例如，所指定序列的氨基酸变体和共价修饰。根据本发明的多肽，例如，所指定序列的功能衍生物与根据本发明的多肽，例如，所指定序列的氨基酸序列优选具有至少约65％，更优选至少约75％，甚至更优选至少约85％，最优选至少约95％的总序列同源性，并且基本上保持结合CD45RO和CD45RB的能力。优选地，功能衍生物具有至少包含SEQ IDNO：1的多肽和/或SEQ ID NO：2的多肽的结合分子、包含SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的多肽和/或SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的多肽的人源化抗体，或包含SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：32和/或SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的多肽的人源化抗体的结合亲和性。
术语“共价修饰”包括根据本发明的多肽，例如，所指定序列，或者其片段用有机蛋白质性质或非蛋白质性质的衍生剂修饰，融合到异源多肽序列，和翻译后修饰。例如，所指定序列的共价修饰的多肽仍然具有通过交联结合CD45RO和CD45RB的能力。通常通过将靶定氨基酸残基与能够与所选侧基或末端残基反应的有机衍生剂反应，或者通过控制在所选重组宿主细胞中发挥功能的翻译后修饰的机制可以常规地引入共价修饰。某些翻译后修饰是重组宿主细胞作用于所表达的多肽的结果。谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基通常翻译后脱酰胺成相应的谷氨酰基和天冬氨酰基残基。备选地，这些残基在弱酸性条件下脱酰胺。其他翻译后修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰、酪氨酸或苏氨酰基残基的磷酸化、赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α氨基的甲基化。见，例如，T.E.Creighton，Proteins：Structure and Molecular Properties，W.H.Freeman & Co.，SanFrancisco，pp.79-86(1983)。共价修饰例如包括包含根据本发明的多肽，例如，所指定序列的多肽的融合蛋白质和它们的氨基酸序列变体，如免疫粘附素，和与异源信号序列的N-末端融合。
关于天然多肽和其功能衍生物的“同源性”在本文定义为比对序列并且导入缺口(如果必要)以实现最大百分数同源性并且不包括将保守替换考虑为序列同一性的部分后，候选序列中与相应天然多肽的残基同一的氨基酸残基的百分数。不应该将N-或C-末端延伸认为是减小同一性或同源性。用于比对的方法和计算机程序是公知的。
“氨基酸”指所有天然发生的L-α-氨基酸，例如并且包括D-氨基酸。通过公知的单字母或者三字母命名鉴别氨基酸。
术语“氨基酸序列变体”指与根据本发明的，例如所指定序列的多肽相比在它们的氨基酸序列中具有一些不同的分子。根据本发明的的多肽，例如，所指定序列的氨基酸序列变体仍然能够结合CD45RO和CD45RB。替代变体为在根据本发明的多肽，例如，具有所指定序列的多肽中除去至少一个氨基酸残基并且在其相同位置上插入不同氨基酸的变体。这些替代可以是单一的，其中分子中已经替代了仅一个氨基酸，或者它们可以是多个的，其中在相同分子中已经替代了两个或多个氨基酸。插入变体为在根据本发明的多肽中，例如所指定序列的特定位置上氨基酸的紧邻处插入一个或多个氨基酸的变体。紧邻氨基酸指连接该氨基酸的α-羧基或α-氨基官能团。缺失变体为在根据本发明的多肽，例如，所指定序列中除去一个或多个氨基酸的变体。通常，缺失变体将具有所述分子的特定区中缺失的一个或两个氨基酸。
我们还发现了如下的多核苷酸序列：
-GGCCAGTCAGAACATTGGCACAAGCATACAGTG(SEQID NO：25)，其编码CDR1的氨基酸序列；
-TTCTTCTGAGTCTATCTCTGG(SEQ ID NO：26)，其编码CDR2的氨基酸序列；
-ACAAAGTAATACCTGGCCATTCACGTT(SEQ ID NO：27)，其编码CDR3的氨基酸序列；
-TTATATTATCCACTG(SEQ ID NO：28)，其编码CDR1’的氨基酸序列；
-TTTTAATCCTTACAATCATGGTACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAG(SEQ ID NO：29)，其编码CDR2’的氨基酸序列；
-AGGACCCTATGCCTGGTTTGACACCTG(SEQ IDNO：30)，其编码CDR3’的氨基酸序列；
-SEQ ID NO：5，其编码SEQ ID NO：1的多肽，即根据本发明的mAb的轻链的可变区；
-SEQ ID NO：6，其编码SEQ ID NO：2的多肽，即根据本发明的mAb的重链的可变区；
-SEQ ID NO：11，其编码SEQ ID NO：9的多肽，即包括根据本发明的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区；
-SEQ ID NO：12，其编码SEQ ID NO：10的多肽，即包括根据本发明的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区；
-SEQ ID NO：13，其编码SEQ ID NO：7的多肽，即包括根据本发明的CDR1’、CDR2’和CDR3’的轻链可变区；
-SEQ ID NO：14，其编码SEQ ID NO：8的多肽，即包括根据本发明的CDR1’、CDR2’和CDR3’的轻链可变区；
-SEQ ID NO：33，其编码SEQ ID NO：8的多肽，即包括根据本发明的CDR1’、CDR2’和CDR3’的轻链可变区；
-SEQ ID NO：34，其编码SEQ ID NO：31的多肽，即包括根据本发明的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区；和
-SEQ ID NO：35，其编码SEQ ID NO：32的多肽，即包括根据本发明的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区；
在另一方面，本发明提供了分离的多核苷酸，其包含编码CD45RO/RB结合分子，例如，编码根据本发明的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的多核苷酸，和/或优选地和，编码根据本发明的CDR1’、CDR2’和CDR3’的氨基酸序列的多核苷酸；和
包含SEQ ID NO：5的多核苷酸和/或，优选地和，SEQ ID NO：6的多核苷酸的多核苷酸；和
多核苷酸，其包含编码SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的多肽和/或优选地和SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的多肽的多核苷酸；例如编码
-SEQ ID NO：7的多肽和SEQ ID NO：9的多肽，
-SEQ ID NO：7的多肽和SEQ ID NO：10的多肽，
-SEQ ID NO：8的多肽和SEQ ID NO：9的多肽，或
-SEQ ID NO：8的多肽和SEQ ID NO：10的多肽；和
多核苷酸，其包含SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的多核苷酸和/或，优选地和，SEQ ID NO：13的多核苷酸或者SEQ ID NO：14的多核苷酸，优选包含
-SEQ ID NO：11的多核苷酸和SEQ ID NO：13的多核苷酸，
-SEQ ID NO：11的多核苷酸和SEQ ID NO：14的多核苷酸，
-SEQ ID NO：12的多核苷酸和SEQ ID NO：13的多核苷酸，
-SEQ ID NO：12的多核苷酸和SEQ ID NO：14的多核苷酸；和
多核苷酸，其包含编码SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：32的多肽和/或优选地和SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的多肽的多核苷酸；例如编码
-SEQ ID NO：31的多肽和SEQ ID NO：7的多肽，
-SEQ ID NO：31的多肽和SEQ ID NO：8的多肽，
-SEQ ID NO：32的多肽和SEQ ID NO：7的多肽，或
-SEQ ID NO：32的多肽和SEQ ID NO：8的多肽；和
多核苷酸，其包含SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：35的多核苷酸和/或，
优选地和，SEQ ID NO：33；SEQ ID NO：14或13的多核苷酸。
-SEQ ID NO：34的多肽和SEQ ID NO：33的多肽，
-SEQ ID NO：34的多肽和SEQ ID NO：14的多肽，
-SEQ ID NO：34的多肽和SEQ ID NO：13的多肽，
-SEQ ID NO：35的多肽和SEQ ID NO：33的多肽，
-SEQ ID NO：35的多肽和SEQ ID NO：14的多肽，或
-SEQ ID NO：35的多肽和SEQ ID NO：13的多肽。
如果不在本文中另外指出，“多核苷酸”包括任意多核糖核苷酸或者多脱氧核糖核苷酸，其可以是未经修饰的RNA或DNA，或者经修饰的RNA或DNA，包括但不限于单链和双链RNA，和单链和双链区混合的RNA。
根据本发明的多核苷酸，例如，分别编码氨基酸序列CDR1、CDR2、CDR3、CDR1′、CDR2′、CDR3′或SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQID NO：10、SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：32的多核苷酸，如SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：35的多核苷酸包括其等位基因变体和/或它们的互补序列；例如包括分别与SEQID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：35杂交的多核苷酸；例如，编码分别与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQID NO：10、SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：32具有至少80％同一性的多肽，例如包括所述多肽的功能衍生物，例如，所述功能衍生物分别与SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：32具有至少65％同源性，例如，分别包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：32的共价修饰的所述功能衍生物；例如，分别包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQID NO：10、SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：32的氨基酸序列变体的所述功能衍生物；例如，SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：35分别包括一种序列，其由于遗传密码冗余性(简并性)也分别编码SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：31或SEQ ID NO：32的多肽，或者编码与SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：32的氨基酸序列分别具有至少80％同一性的氨基酸序列的多肽。优选地，所述等位基因变体或者功能衍生物具有包含SEQ ID NO：1的多肽和/或SEQ ID NO：2的多肽的结合分子、包含SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的多肽和/或SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的多肽的人源化抗体；包含SEQ IDNO：31或SEQ ID NO：32的多肽和/或SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的多肽的人源化抗体的结合亲和性。
例如，为嵌合或人源化抗体的CD45RO/RB结合分子可以通过重组DNA技术产生。从而，可以构建编码CD45RO/RB的一种或多种DNA分子，将其置于适宜控制序列下并通过适宜载体转移到用于表达的适宜宿主(生物)中。
另一方面，本发明提供了编码根据本发明的CD45RO/RB结合分子的单一重和/或轻链的多核苷酸；和根据本发明的多核苷酸用于通过重组方法产生根据本发明的CD45RO/RB结合分子的用途。
例如，类似地，根据常规方法以及本文提供的信息，例如使用高变区或可变区的氨基酸序列和编码这些区的多核苷酸序列的知识，可以得到CD45RO/RB结合分子。构建可变结构域基因的方法例如，在EP 239 400中描述并且可以简要概述如下：可以克隆具有无论如何的特异性的mAb可变区的基因。确定编码构架区和高变区的DNA片段并除去编码该高变区的DNA片段。通过DNA合成根据本文指定的CDR和CDR’序列制备双链合成CDR盒。提供具有粘性末端的这些盒从而它们可以在人源的目的构架的接点连接。还可以根据，例如，类似地，常规方法制备编码单链抗体的多核苷酸。所制备的根据本发明的多核苷酸可以方便地转移到适宜的表达载体中。
根据，例如，类似地常规方法可以发现适宜的细胞系。例如，包含适宜的启动子和编码重链和轻链恒定部分的表达载体是已知的并且例如可以通过商业途径获得。适宜的宿主是已知的或者可以类似地根据常规方法发现并且包括细胞培养物或者转基因动物。
另一方面，本发明提供了表达载体，其包含编码根据本发明的CD45RO/RB结合分子的多核苷酸，例如，序列SEQ ID NO：15、SEQ IDNO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：41的多核苷酸。
另一方面，本发明提供了
-包含根据本发明的多核苷酸的表达系统，其中当所述表达系统或者其部分存在于相容的宿主细胞中时，所述表达系统或者其部分能够产生根据本发明的CD45RO/RB结合分子；和
-分离的宿主细胞，其包含如上定义的表达系统。
我们还发现如通过体外MLR测定的，根据本发明的CD45RO/RB结合分子以依赖剂量的方式抑制初次同种异体免疫应答。结果表明在根据本发明的CD45RO/RB结合分子存在下异常活化的细胞在它们对异源抗原的应答中受损。这证明根据本发明的CD45RO/RB结合分子可以直接作用于效应异常活化T细胞并调节它们的功能。此外，在再刺激实验中，在二次MLR进一步研究了来自初次MLR的T细胞的功能性质，使用特定刺激细胞或者第三方刺激物评估所观察到的功能效应的特异性。我们已经发现来自初次MLR的细胞(其中存在根据本发明的CD45RO/RB结合分子)应答用特定刺激细胞的随后最佳刺激的能力受损，尽管没有向继代培养物加入抗体。通过用根据本发明的CD45RO/RB结合分子处理的细胞正常应答来自不相关的第三方供者的刺激细胞阐明抑制的特异性。使用来自初次MLR培养物的T细胞的再刺激实验表明已经异常活化根据本发明的CD45RO/RB结合分子的细胞对最初异源抗原是低反应性的，即耐受的。在实施例7和9到13中描述了其他生物学活性。
此外，我们已经发现用根据本发明的CD45RO/RB结合分子预处理的细胞中的细胞增殖可以通过外源IL-2挽救。这表明用根据本发明的CD45RO/RB结合分子处理同种异常反应性T细胞诱导了耐受状态。实际上，在用根据本发明的CD45RO/RB结合分子处理的细胞中观察到的减小的增殖应答是由于T细胞功能的受损，并且这些细胞能够应答外源IL-2，表明这些细胞处于无变应性、真实的无应答状态。通过用根据本发明的CD45RO/RB结合分子处理的细胞正常增殖成不相关的供体细胞到对照处理的细胞水平的能力来证明该应答的特异性。
此外，实验表明根据本发明的CD45RO/RB结合分子与CD45RO和CD45RB的结合可以抑制来自经免疫的供者的外周血单核细胞(PBMC)对回忆抗原的记忆应答。从而根据本发明的CD45RO/RB结合分子与CD45RO和CD45RB的结合在抑制对可溶性Ag的记忆应答中也是有效的。根据本发明的CD45RO/RB结合分子抑制对来自经免疫的供者的PBMC中破伤风的回忆应答表明根据本发明的CD45RO/RB结合分子能够靶定和调节记忆T细胞的活化。例如，这些数据表明根据本发明的CD45RO/RB结合分子除了识别同种异体反应性和活化的T细胞外还能够调节它们的功能，导致T细胞无反应性的诱导。该性质对于对在自身免疫病、变态反应和慢性排斥、和诸如银屑病、炎性肠病的疾病中看到的自身抗原和变应原和可能对异源抗原的正进行的免疫应答的治疗是重要的，在所述疾病中，记忆应答在疾病状态的保持中起作用。认为所述性质是疾病状态，如自身免疫病中的重要特征，在所述疾病中对自身抗原的记忆应答在疾病保持中起主要作用。
我们还发现根据本发明的CD45RO/RB结合分子可以在体内以混合的淋巴细胞反应(MLR)调节T细胞增殖应答，即发现本发明的CD45RO/RB结合分子在体内测试中具有相应的抑制性质，如防止致命的异种移植物抗宿主疾病(GvHD)或者抑制介导SCID小鼠模型中人异源移植物皮肤排斥的炎症过程，或者延长hu-PBL-NOD/SCID小鼠模型中人胰岛异源移植物存活。
根据本发明的CD45RO/RB结合分子从而具有免疫抑制和耐受原性质并且可以用于体内和先体外后体内对异源抗原、自体抗原、变应原和细菌区系抗原的耐受性诱导，例如，根据本发明的CD45RO/RB结合分子可以用于治疗和预防疾病，例如，包括自身免疫病，例如，但不限于，类风湿性关节炎、银屑病关节炎、自身免疫甲状腺炎、突眼性甲状腺肿、I型和II型糖尿病、多发性硬化、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎(UC)、系统性红斑狼疮、舍格伦综合征、硬皮病、自身免疫胃炎、肾小球性肾炎、移植排斥，如，但不限于，器官和组织异源移植物和异种移植排斥，例如，对于受者的例如，心、肺、结合的心-肺、肝脏、肾脏、胰、皮肤或者角膜移植物的治疗，移植物抗宿主疾病(GVHD)，如骨髓移植后移植物抗宿主疾病，和/或胰岛细胞移植排斥，和/或银屑病、皮炎，如特应性皮炎和接触性皮炎，包括过敏性接触性皮炎、炎性肠病和/或变态反应，包括过敏性哮喘。
另一方面，本发明提供了根据本发明的CD45RO/RB结合分子的用途，用作药物，例如，用以治疗和预防自身免疫病、移植排斥，例如，胰岛细胞移植排斥或者移植物抗宿主疾病(GVHD)、银屑病、皮炎、炎性肠病和/或变态反应。
另一方面，本发明提供了根据本发明的CD45RO/RB结合分子，其用于生产用于治疗和预防与自身免疫病、移植排斥，例如，胰岛细胞移植排斥或者移植物抗宿主疾病(GVHD)、银屑病、皮炎、炎性肠病和/或变态反应相关的疾病的药物。
另一方面，本发明提供了治疗和/或预防与自身免疫病、移植排斥、银屑病、皮炎、炎性肠病和/或变态反应相关的疾病的方法，其包括对需要这种治疗和/或预防的个体例如，以根据本发明的药物组合物的形式施用有效量的根据本发明的CD45RO/RB结合分子。
本发明的一个实施方案提供了治疗和/或预防与胰岛细胞移植排斥相关的疾病(例如，胰岛细胞移植排斥)的方法，该方法包括对需要这种治疗和/或预防的个体施用有效量的根据本发明的分子或人源化抗体。
在优选实施方案中，用作药物、用于生产药物或者用于治疗与自身免疫病、移植排斥、银屑病、皮炎、炎性肠病和/或变态反应相关的疾病的方法中的所述CD45RO/RB结合分子包含SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：32的多肽和/或SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的多肽。优选地，所述CD45RO/RB结合分子包含SEQ ID NO：31的多肽和SEQ ID NO：8的多肽。
CD45RO/RB结合分子的“有效量”为足够实现有益的或者所希望的结果的量，所述结果包括临床结果，如直接或间接减轻自身免疫病、移植排斥、银屑病、皮炎、炎性肠病和/或变态反应导致的一种或多种症状、提高患者的生活质量、减少治疗此类疾病所需的其他药物的剂量、增强另一种药物的效果、延迟疾病的恶化，和/或延长患者的存活。
有效量可以以一次或多次施用进行施用，或者可以与或不与另一种药物、化合物或药物组合物结合实现。从而，可以在施用一种或多种治疗剂的上下文中考虑“有效量”，并且可以考虑以有效量给予单一活性剂，如果与一种或多种其他活性剂联合，可以实现或者实现所希望的结果。
还提供了本发明的CD45RO/RB结合分子，其可以以单独活性成分或者与免疫调节方案中的其他药物或者其他消炎剂一起施用，例如，用以治疗或预防与自身免疫病、移植排斥、银屑病、皮炎、炎性肠病和/或变态反应相关的疾病。例如，本发明的CD45RO/RB结合分子可以与钙依赖磷酸酶抑制剂，例如，环孢菌素A、环孢菌素G、FK-506、ABT-281、ASM 981；mTOR抑制剂，例如，雷帕霉素、40-O-(2-羟基)乙基-雷帕霉素、CCI779、ABT578、AP23573、AP23464、AP23675、AP23841、TAFA-93、biolimus-7或bioimus-9；皮质类固醇；环磷酰胺；硫唑嘌呤；氨甲蝶呤；S1P受体激动剂，例如，FTY 720或者其类似物；来氟洛米或者其类似物；咪唑立宾；霉酚酸；霉酚酸酯；15-脱氧斯潘格宁或者其类似物；免疫抑制性单克隆抗体，例如，针对白细胞受体，例如，MHC、CD2、CDS、CD4、CD11a/CD18、CD7、CD25、CD27、B7、CD40、CD45、CD58、CD137、ICOS、CD150(SLAM)、OX40、4-1BB或者它们的配体，例如，CD154的单克隆抗体；或者其他免疫调节化合物，例如，具有CTLA4或者其突变体的细胞外结构域的至少一部分的重组结合分子，例如，结合非CTLA4蛋白质序列，例如CTLA4lg(例如，称作ATCC 68629)或者其突变体(例如，LEA29Y)的CTLA4或者其突变体的至少胞外部分，或者其他粘着分子抑制剂，例如，mAbs或者低分子量抑制剂，包括LFA-1拮抗剂、选择蛋白拮抗剂和VLA-4拮抗剂联合使用。
可以通过常规途径，包括注射或者通过随时间逐渐输注可以施用单独或者结合另一种药物、化合物或药物组合物的本发明的CD45RO/RB结合分子的有效量。施用可以例如，为经口的、静脉内、腹膜内、肌内、腔内、皮下、局部或者经皮。“共同施用”指在相同载体或者单独的载体中一起或者基本上同时施用本发明组合物的组分，从而例如，当经口施用时，两种化合物同时存在于胃肠道中。优选地，将所述化合物作为固定组合施用。
另一方面，本发明提供了包含根据本发明的CD45RO/RB结合分子结合至少一种药学上可接受的载体或者稀释剂的药物组合物。
本文所用术语“药学上可接受的载体或者稀释剂”指适于施用于哺乳动物(包括人)的一种或多种相容的固态或液态填充剂、稀释剂或者包胶物质。术语“载体”指天然或合成的有机或者无机成分，活性成分与所述成分联合以方便应用。
术语“药学上可接受的”指不干扰活性成分的生物活性的有效性的无毒材料。此类制剂可以常规地含有药学上可接受浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、相容的载体、补充的免疫增强剂，如佐剂和细胞因子和任选其他治疗剂，如化学治疗剂。
当用于药物中时，所述盐应该是药学上可接受的，但是非药学上可接受的盐可以方便地用来制备其药学上可接受的盐并且不排除在本发明范围外。
药物组合物可以含有适宜的缓冲剂，包括：盐形式的乙酸、盐形式的柠檬酸、盐形式的硼酸、盐形式的磷酸。
药物组合物还可以任选含有适宜的防腐剂，如：苯扎氯铵、氯代丁醇、对羟基苯甲酸酯类和硫柳汞。
可以根据不同参数，尤其根据所用的施用方式和个体的状态选择施用于个体的多肽或编码所述多肽的核酸的剂量。其他因素包括所希望的治疗时间。如果在最初应用剂量下个体中的响应不足，那么可以使用更高剂量(或者通过不同的、更局部化递送途径施用更高剂量)到该患者耐受允许的程度。
所述药物组合物可以方便地以单位剂型存在或者可以通过药学领域公知的任意方法制备。所有方法包括将活性剂与构成一种或多种辅助成分的载体结合。通常，通过将活性化合物均匀和紧密地与液态载体、细分的固态载体或者两者结合，然后如果必要，成形所述产物来制备组合物。
适于经口施用的组合物可以以离散单位，如胶囊剂、片剂、锭剂存在，每一种含有预定量的活性化合物。其他组合物包括水性液体或者非水性液体中的混悬剂，如糖浆剂、酏剂或者乳剂。
适于肠胃外施用的组合物通常包含多肽或者编码该多肽的核酸的无菌水性或非水性制剂，其优选与受者的血液等渗。根据已知的方法，使用适宜的分散或者湿润剂和悬浮剂可以配制该制剂。无菌可注射的制剂还可以是无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射的溶液剂或者混悬剂，例如，作为1，3-丁二醇中的溶液剂。可以使用的可接受的载体和溶剂包括水、林格液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌、不挥发油通常用作溶剂或者悬浮介质。为此，可以使用任意温和的不挥发油，包括合成的甘油一酯或甘油二酯。此外，可注射剂的制备中可以使用脂肪酸，如油酸。适于经口、皮下、静脉内、肌内等施用的载体制剂可以见Remington’sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，PA。
药物组合物可以还包含其他的，例如，活性成分，例如，其他免疫调节抗体，如但不限于，抗-ICOS、抗-CD154、抗-CD134L或者重组蛋白质，如，但不限于rCTLA-4(CD152)、rOX40(CD134)或者消炎剂或者免疫调节化合物例如，但不限于环孢菌素A、FTY720、RAD、雷帕霉素、FK506、15-脱氧斯潘格宁、类固醇；如上述。此类药物组合物可以以单独剂型包含根据本发明的CD45RO/RB结合分子和免疫调节药物和/或消炎剂，优选地，其中单位剂型适于以协同有效量施用组分化合物，以及用法说明，任选促进组分化合物施用的依从性的其他工具，如标签或图。本发明的组合物可以以自由组合施用，或者可以配制成固定组合。化合物的绝对剂量将取决于许多因素，例如，个体、施用途径、所希望的持续时间、活性剂的释放速率和待治疗的状况的性质和严重性。
将用根据本发明的CD45RO/RB结合分子单独或者联合其他药物治疗的上面列出的疾病包括，但不限于自身免疫病，包括类风湿性关节炎、银屑病关节炎、自身免疫甲状腺炎、突眼性甲状腺肿、I型和II型糖尿病、多发性硬化、克罗恩氏病(CD)、溃疡性结肠炎(UC)、系统性红斑狼疮、舍格伦综合征、硬皮病、自身免疫胃炎和肾小球性肾炎；移植排斥，包括，但不限于，器官和组织异源移植物和异种移植排斥，例如，用于治疗受者的例如，心、肺、结合的心-肺、肝脏、肾脏、胰、皮肤或者角膜移植物，移植物抗宿主疾病(GVHD)，如骨髓移植后的移植物抗宿主疾病，和/或胰岛细胞移植排斥；银屑病、皮炎，如特应性皮炎和接触性皮炎，包括过敏性接触性皮炎、炎性肠病和/或变态反应，包括过敏性哮喘。
实施例
通过参考下面的实施例将更完整地理解本发明。然而，不应该将所述实施例理解为限制本发明的范围。在下面的实施例中，所有温度都为摄氏度。
“候选mAb”或者“嵌合抗体”为包含SEQ ID NO：3的轻链和SEQ IDNO：4的重链的根据本发明的CD45RO/RB结合分子。
“人源化抗体”为根据本发明的CD45RO/RB结合分子，其包含SEQID NO：8的多肽和SEQ ID NO：9的多肽(VHE/humV1、VHE/VL1或VHE/VLh)；SEQ ID NO：8的多肽和SEQ ID NO：10的多肽(VHQ/humV1、VHQ/VL1或VHQ/VLh)；SEQ ID NO：7的多肽和SEQ ID NO：9的多肽(VHE/humV2、VHE/VL2或VHE/VLm)；SEQ ID NO：7的多肽和SEQ IDNO：10的多肽(VHQ/humV2、VHQ/VL2或VHQ/VLm)；SEQ ID NO：8的多肽和SEQ ID NO：31的多肽(VHEN73D/humV1、VHEN73D/VL1或VHEN73D/VLh)；SEQ ID NO：8的多肽和SEQ ID NO：32的多肽(VHQN73D/humV1、VHQN73D/VL1或VHQN73D/VLh)；SEQ ID NO：7的多肽和SEQ ID NO：31的多肽(VHEN73D/humV2、VHEN73D/VL2或VHEN73D/VLm)；或者SEQ ID NO：7的多肽和SEQ ID NO：32的多肽(VHQN73D/humV2、VHQN73D/VL2或VHEN73D/VLm)。
使用下面的缩写：
APC       抗原呈递细胞
CEX       阳离子交换层析
c.p.m.    每分钟计数
dhfr      二氢叶酸还原酶
EDTA      乙二胺四乙酸
ELISA     酶联免疫吸附测定
ESI-Q-TOF 电喷射电离-四极-飞行时间
FACS      荧光激活细胞分选术
Fc        可结晶的片段
F(ab’)2 二价抗原结合片段
FITC      异硫氰酸荧光素
FBS       胎牛血清
GVHD      移植物抗宿主疾病
HCMV      人巨细胞病毒启动子
HPLC      高效液相层析
IFN-γ          γ干扰素
IgE       免疫球蛋白同种型E
IgG       免疫球蛋白同种型G
IL-2      白细胞介素2
IU        国际单位
MALDI-TOF 基质辅助的激光解吸电离-飞行时间
MLR       混合淋巴细胞反应
MLC       混合淋巴细胞培养
MP1       来自流感嗜血杆菌的基质蛋白1
MTX       氨甲蝶呤
PBS       磷酸缓冲盐水
PBL       外周血白细胞
PBMC      外周血单核细胞
PCR       聚合酶链反应
RP        反相层析
SEC       大小排阻层析
SCID      重度联合免疫缺损
Treg      T调节细胞
xGVHD     异-移植物抗宿主疾病
实施例1：初次混合淋巴细胞反应(MLR)
细胞
从健康人供者得到血样。通过在菲可帕克(Pharmacia LKB)上离心从来自全外周血的白细胞、白细胞分离法(leukopheresis)或者具有已知血型但是未知HLA型的血沉棕黄层分离外周血单核细胞(PBMC)。在一些MLR实验中，PBMC在40Gy的辐射后直接用作刺激细胞。在其他实施方案中，通过使用CD2或CD3 Dynabeads(Dynal，Oslo，Norway)从PBMC耗竭T细胞。通过磁场除去珠子和污染性细胞。T细胞耗竭的PBMC在辐射后用作刺激细胞。
PBMC、CD3+T细胞或者CD4+T细胞用作MLR中的应答细胞。从不同供者制备细胞成刺激细胞。使用抗-CD16 mAb(Zymed，CA)、山羊抗小鼠IgG Dynabeads、抗-CD14 Dynabeads、CD19 Dynabeads通过阴性选择纯化CD3+T细胞。此外，用抗-CD8 Dynabeads纯化CD4+T细胞。通过FACScan或FACSCalibur(Becton Dickinson & Co.，CA)分析所得的细胞，所得细胞的纯度为＞75％。将细胞悬浮在RPMI1640培养基中，该培养基补加10％热失活的FBS、青霉素、链霉素和L-谷氨酰胺。
试剂
还产生了嵌合的抗-CD45R0/RB mAb“候选mAb”和同种型匹配的对照嵌合抗体。从BD Pharmingen(San Diego，CA)购买对KLH(匙孔血蓝蛋白)或者重组人IL-10特异的小鼠(人)对照IgG1抗体。根据Lederman等人1992的方法制备抗-人CD154mAb 5c8。
初次混合淋巴细胞反应(MLR)
将1×105个PBMC或5×104个CD3+或CD4+细胞的等分试样与1×105个经辐射的PBMC或5×104个T细胞耗竭的经辐射的(50Gy)PBMC在96孔培养板(Costar，Cambridge，MA)的每孔中在所指出的mAb存在或者Ab的不存在下混合。在一些实验中，除了候选mAb，还加入10μg/ml山羊抗小鼠Ig的F(ab’)2片段或者对Fc部分特异的山羊抗人Ig(JacksonImmunoResearch，West Grove，PA)以确保靶CD45分子的最佳体外交联。在37℃下5％CO2中培养混合细胞4或5天并在最后16-20小时培养中通过用3H-胸苷脉冲细胞来确定增殖。其他实验类似于上述实验，但是具有下面的例外：1)所用的培养基为含有10％FBS和1％人血浆的EX-VIVO(Bio-Whittaker)；2)将抗小鼠总IgG(5μg/ml)用作二次交联步骤；3)刺激细胞的辐射为60Gy。
在“候选mAb”或者对照嵌合IgG1(10μg/ml)的存在下，都用第二步试剂：对Fc部分特异的山羊抗人Ig的F(ab’)2片段(10μg/ml)进行初次MLR。与对照IgG1的存在下的细胞增殖比较来计算“候选mAb”的抑制百分数。结果在下面的表1中显示：
表1
10μg/ml根据本发明的候选mAb对初次MLR的抑制
应答者 刺激者(Irr.PBMC) 抑制％
  #211CD4   #219CD3   63.51
  #220CD4   #219CD3depl.   63.07
  #227CD4   #220CD3depl.   65.96
  #229CD4   #219CD3depl.   50.76
  平均值±SD   60.83±6.83*
*与对照值显著不同(P＜0.001)
如可以从表1看出，根据本发明的候选mAB抑制初次MLR。在四种不同供体来源的CD4+T细胞中平均抑制效果为60.83±6.83％并且是统计学上显著的。
如图1所示，“候选mAb”对初次MLR的抑制在0.001到10μg/ml“候选mAb”的范围内是剂量依赖的。
使用一种供者PBMC作为应答细胞，从三个单独的MLR实验的结果确定“候选mAb”对初次MLR抑制的IC50。从而，来自供者#229和#219的应答CD4+T细胞与作为刺激剂的耗竭T细胞的经辐射的PBMC在“候选mAb”或者对照嵌合Ab存在下与10μg/ml山羊抗人Ig的F(ab’)2片段混合。实验重复3次并与存在对照Ab时T细胞的增殖比较来计算存在“候选mAb”时增殖百分数。使用Origin(V.6.0)确定IC50值。细胞活性IC50值经计算为0.87±0.35nM(0.13±0.052μg/ml)。
实施例2：二次MLR
为了评估“候选mAb”是否诱导CD4+T细胞对特异异源抗原的无应答性，初次MLC后在不存在任意抗体下进行MLR。在所指出的抗体存在下，CD4+T细胞与经辐射的同种异体刺激细胞(T细胞耗竭的PBMC)在96孔板中培养10天(初次MLC)。然后，收集细胞，将其在菲可帕克梯度上分层以除去死细胞，用RPMI洗涤两次，并用相同的刺激剂：第三方刺激细胞或者IL-2(50U/ml)再次刺激。培养细胞3天并通过在培养的后16-20小时用3H-胸苷脉冲细胞来确定增殖应答。
特别地，在10μg/ml“候选mAb”、对照IgG1嵌合Ab和山羊抗人Ig的F(ab’)2片段存在下用经辐射的同种异体刺激细胞(采自其他供者的T细胞耗竭的PBMC)培养CD4+T细胞。在第5天测定初次MLR增殖。对于二次MLR，在“候选mAb”存在下培养应答细胞和刺激细胞10天，然后收获细胞，将其用RPMI1640洗涤两次并用特定刺激剂：第三方刺激剂或者IL-2(50U/ml)，在无任何Ab存在下再次刺激。在第3天确定细胞增殖。结果在表2中给出：
表2
  应答CD4+T细胞供者#   2ry MLR的抑制％
  #211   49.90*
  #220   59.33*
  #227   58.68*
*与对照值显著差异(p＝＜0.001，通过斯氏t检测确定，SigmaStatV.2.03).#p＝＜0.046
为了测试受损的增殖是否是由于用“候选mAb”处理导致的无应答性，在IL-2(50U/ml)存在下培养来自初次MLR的细胞。加入IL-2导致在初次MLR中用“候选mAb”处理的T细胞的增殖应答挽救到类似于IgG1对照抗体存在下观察到的水平。这些数据表明用“候选mAb”处理的T细胞中受损的二次应答是由于应答T细胞的功能改变，所述应答T细胞变得对特定刺激细胞无反应性。
根据下式计算抑制百分数：
用SigmaStat(Vers.2.03)进行统计分析。
通过双向ANOVA，然后通过Dunnett方法分析数据。在所有检验步骤中，认为概率＜0.05是显著的。在一些实验中，使用斯氏t检验(SigmaStatV.2.03)。
实施例3：SCID小鼠中体内存活研究
SCID小鼠中hu-PBL的移入
将人外周血单核细胞(PBMC)腹膜内注射到SCID小鼠C.B 17/GbmsTac-Prkdcscid Lystbg小鼠(Taconic，Germantown，NY)中，用量足够在细胞转移后的4周内在＞90％的小鼠中足够诱导致命的异基因移植物抗宿主疾病(xGvHD)。下文中将此类经处理的SCID小鼠称作hu-PBL-SCID小鼠。
hu-PBL-SCID小鼠的Mab处理
在第0天、PBMC注射后即刻、第3天、第7天和之后以每周间隔，用“候选mAb”或者小鼠或嵌合同种型匹配的mAb对照处理hu-PBL-SCID小鼠。以100μl PBS中5mg/kg体重的终浓度皮下递送Mab。当所有对照小鼠都死亡时停止处理。
处理结果的评估
在该研究中评估“候选mAb”的功效的主要标准是hu-PBL-SCID小鼠的存活。通过使用时序检验(Log-rank test)(Mantel方法)用Systat v9.01软件评估结果的显著性。存活分析的方法是非参数检验，其不仅考虑具体小鼠是否仍然活着而且它是否由于与治疗/疾病不相关的原因(如需要用它的器官/细胞进行体外分析)而被处死。从死亡小鼠得到肝、肺、肾和脾的活组织检查用于进一步评估。此外，在实验开始(细胞转移前)和整个(每两天)实验中称量hu-PBL-SCID小鼠作为它们的健康状况的间接估计。用从每只小鼠得到的体重对PBMC转移后天数值产生线性回归线，并随后，用非参数曼-怀二氏检验(Mann-Whithey test)比较它们的斜率(对照对抗-CD45处理的小鼠)。
结果
用小鼠mAb对照处理的所有hu-PBL-SCID小鼠在肺、肝和脾中都具有浸润的白细胞并且在细胞转移后约2到3周内死亡(4/4)。死亡可能是xGvHD的结果。约10％和以上的对照mAb处理的小鼠在以后的3周内以线性方式减轻体重。
用“候选mAb”处理的所有hu-PBL-SCID小鼠在四周以上都存活(4/4)并且没有任何明显的疾病病征，尽管3周后停止了“候选mAb”处理。多达约5％用“候选mAb”处理的小鼠在4周内以线性方式增加体重。
实施例4：本发明抗体的表达
包含SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10 SEQID NO：31或SEQ ID NO：32的人源化抗体的表达
构建根据如图2到11所示的质粒图的表达载体，其包含分别编码人源化轻链可变区humV1(SEQ ID NO：8；图4和6)、人源化轻链可变区humV2(SEQ ID NO：7；图5和7)、人源化重链可变区VHE(SEQ ID NO：9；图3和10)，或人源化重链可变区VHQ(SEQ ID NO：10；图2和11)、人源化重链可变区VHE-N73D(SEQ ID NO：31；图8)或人源化重链可变区VHQ-N73D(SEQ ID NO：32；图9)的氨基酸序列的相应核苷酸。这些表达载体具有DNA(核苷酸)序列SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：41(VHQ)、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：40(VHE)、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO36(humV1)、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：39(humV2)、或SEQ ID NO37(VHE-N73D)和SEQ ID NO 38(VHQ-N73D)。
构建用于在COS细胞中表达的人源化抗体重链和轻链表达载体
用于VLh和VLm形式的人κ轻链表达载体
为了构建编码人κ同种型的完全人源化轻链的最终表达载体，用HindIII和BglII从含有VLh和VLm的PCR-Script克隆载体(Stratagene)(VLm区)切除编码完整轻链可变区(VLh和VLm)的DNA片段。然后将凝胶纯化的片段亚克隆到C21-HCMV Kappa表达载体的HindIII和BamHI位点，所述表达载体在人源化抗-IgE抗体TESC-21的构建中产生(Kolbinger等人1993)并且最初从M.Bendig(MRC Collaborative Centre，London，UK)(Maeda等人1991)得到。通过苯酚/氯仿萃取纯化连接产物，并电穿孔到电穿孔-感受态Epicurian C0liXL1-Blue株(Cat.N°#200228，Stratagene)。在LB/amp琼脂板上铺板37℃过夜后，用BioRobot 9600(Qiagen)从3ml培养物挑选每种12个菌落以制备质粒DNA。这产生分别用于人源化抗体形式VLh和VLm的轻链表达载体，如附图详细描述。
用于VHQ的人γ-1重链表达载体
为了构建VHQ表达载体，采用逐步方法。首先，通过根据Kolbinger等人1993(Protein Eng.1993Nov；6(8)：971-80)描述的方法的PCR装配VHQ的完整可变区并将其亚克隆到C21-HCMV-γ-1表达载体，已经使用相同酶从该表达载体除去C21插入片段。然后将含有完整可变区的PCRSeript克隆VHQ的HindIII/BamHI片段亚克隆到用相同酶切割的表达载体C21-HCMV-γ-1。这产生用于人源化抗体形式VHQ的最终表达载体。
用于VHE的人γ-1重链表达载体
通过将编码可变区的HindIII和BamHI限制性消化的PCR片段直接连接到C21-HCMVγ-1表达载体的HindIII和BamHI位点实现编码人γ-1同种型的完整人源化重链的最终VHE表达载体的构建，C21-HCMVγ-1表达载体在人源化抗-IgE抗体TESC-21(Kolbinger等人1993)的构建期间产生并且最初从M.Bendig(MRC Collaborative Centre，London，UK)(Maeda等人1991)得到。
COS细胞中的瞬时表达
下面的转染方案适于150mm细胞培养皿中的贴壁COS细胞，使用SuperFectTM转染试剂(Cat.N°301305，Qiagen)。上述四种不同的表达载体用于细胞的瞬时转染。为了表达人源化抗体，将含有重链插入片段(分别VHE或VHQ)的两种克隆的每一种与编码轻链(分别humV1或humV2)的两种克隆的每一种共转染到细胞，轻链和重链表达载体共有4种不同的组合(VHE/humV1、VHE/humV2、VHQ/humV1和VHQ/humV2)。转染前，将质粒用限制性内切酶PvuI线性化，该内切酶在编码氨苄青霉素的抗性基因的区域内切割。转染前，将30ml新鲜培养基中的4×106个COS细胞接种在150mm细胞培养皿中。以该细胞密度接种通常在24小时后产生80％汇合。在转染当天，以没有血清和抗生素的900μl总体积的新鲜培养基稀释线性化重链和轻链DNA表达载体的4种不同组合(每种15μg)。然后将180μl SuperFect转染试剂与DNA溶液充分混合。在室温孵育DNA混合物10分钟以允许复合体形成。发生复合体形成时，从COS细胞培养基除去生长培养基，并用PBS洗涤细胞一次。然后向含有转染复合体的每个反应管加入9ml新鲜培养基(含有10％FBS和抗生素)并充分混合。将最终制备物立即转移到待转染的4种培养物的每一种并温和混合。然后将细胞培养物与DNA复合体在37℃和5％CO2中孵育3小时。孵育后，除去含有转染复合体的培养基并用30ml新鲜培养基替换。转染后48小时，收获培养上清液。
培养上清液的浓缩
对于ELISA和FACS分析，如下浓缩从用重-和轻链质粒转染的COS细胞收集的培养上清液。按照生产商的描述将10ml每种上清液加到Centriprep YM-50离心过滤装置(Centrifugal Filter Devices)(Cat.N°4310，Millipore)。室温下以3000转/分钟离心Centriprep滤器10分钟。再次重复离心步骤，剩余的20ml上清液使用仅5分钟离心，并监视浓缩物发展。收集中间的500μl浓缩上清液并转移到新的Microcon离心过滤装置(Cat.N°42412，Microcon)并按照生产商的方案进一步浓缩。在室温下以3000转/分钟离心浓缩上清液4次24分钟，一次以6000转/分钟10分钟，三次5分钟，总是监视浓缩物发展。实现的浓缩条件培养基的最终体积为100-120μl，对应于最初培养基的250-300倍浓度，并保存在4℃备用。对于比较和对照，使用上述相同的浓缩方案，类似地浓缩未转染细胞的培养基。
产生分泌人源化抗-CD45RO/RB抗体的稳定的Sp2/0骨髓瘤转染子
用上述编码结合CD45RO/RB的人源化抗体的重(VHE或VHQ)和轻(humV1或humV2)链的CHO-表达载体电穿孔小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0(ATCC，CRL-1581)。重和轻链表达载体的四种不同的组合(VHE/humV1、VHE/humV2、VHQ/humV1和VHQ/humV2)用于根据下面方案的转染：
在电穿孔杯(0.4cm间隙)中将20μg每种质粒的超螺旋化DNA与悬浮在DMEM/10％FCS培养基中的8×106个活Sp2/0细胞混合。电穿孔设置为1500V，25μF，使用BioRad GenePulser仪器。电穿孔后，在培养基(补加10％FCS青霉素、链霉素和L-谷氨酰胺的DMEM)中培养细胞20小时。
在第二天，加入选择药物G418(Cat.N°10131-019，Gibco)至终浓度为1mg活性药物/ml并将细胞分布到96孔板中，每孔200μl，每孔约105个细胞。10到15天后，在含有G418的培养基中扩大G418-幸存克隆。使用包被抗体：山羊抗人IgG/Fcγ(Cat.N°109-005-098，Jackson Labs)和针对人κ轻链的过氧化物酶偶联的抗体(Cat.N°A-7164，Sigma)，通过ELISA评估人源化mAbs从这些转染子的分泌。再次使用ELISA，选择在该测定中得分为正的转染子用于比较每天每个细胞的生产力(见下面)。选择每种转染子的最佳克隆用于通过有限稀释立即亚克隆，使用每孔1个细胞的接种密度。再次如上述确定G418幸存亚克隆的生产力。在含有G418的选择培养基中扩大亚克隆，直到培养物体积达到150ml，在该阶段继续培养，但是培养瓶中没有指定加入滚瓶的G418。
第一次转染和选择后，从96孔板长出稳定的转染子，频率为对于VHE/humV1为20.8％，对于VHQ/humV1为11.5％，对于VHE/humV2为18.8％，对于VHQ/humV2为7.3％。两轮亚克隆后，VHE/humV1的最佳的两种生产株为克隆1.33.25(3.87pg/细胞/天)和克隆1.33.26(3.43pg/细胞/天)，VHQ/humV1的最佳的两种生产株为克隆12.1.4(1.19pg/细胞/天)和克隆12.1.20(1.05pg/细胞/天)。随后扩大VHE/humV1和VHQ/humV1的稳定的Sp2/0转染子用于抗体产生和纯化。
使用固定化抗-人IgGFc基质和大小排阻层析，通过亲和层析的联合从含有10％FCS的稳定转染的Sp2/0骨髓瘤细胞系的上清液纯化抗体。如果需要，使用Acticlean Etox柱(Sterogene Bioseparations)除去内毒素。
构建用于在Sp2/0细胞中表达的人源化抗体重和轻链表达载体
用于形式VLh和VLm的人κ轻链表达载体：
使用引物HuCD45LC-Mlu(5’-AAAACGCGTTGTGACATTCTGCTGACCCAGTCT-3’；SEQ ID NO：42)和HuCD45LC-Hind(5’-AAAAAAGCTTGGTCCCCTGGCCGAACGTGAA-3’；SEQ ID NO：43)，通过PCR从CHO表达质粒SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18分别扩增humV1(＝VL1)或humV2(＝VL2)cDNA。将每种321bp PCR片段用MluI和HindIII消化并直接连接到用相同酶消化的轻链表达载体chA6HC k.dhfr。所得质粒分别命名为LCVL1Sp20(SEQ ID NO：36；图6)和LCVL2Sp20(SEQ ID NO：39；图7)。然后LCVL1Sp20用于在Sp2/0细胞中表达人源化CD45RO/RB-结合分子VHE/humV1、VHQ/humV1或VHE-N73D/humV1；然后LCVL2Sp20可以用于在Sp2/0细胞中表达人源化CD45RO/RB-结合分子VHE/humV2、VHQ/humV2或VHE-N73D/humV2。
用于VHQ和VHE的人γ-1重链表达载体
使用PCR引物HuCD45HCEup(5’-CAGGCAGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCA-3’；SEQ ID NO：44)或HuCD45HCQup(5’-CAGGCACAGGTGCAGCTGGTGGAGTCA-3’；SEQ ID NO：45)和HuCD45HClo(5’-AAATCCTTCTAGAACTCACCTGAGGAGAC-3’；SEQ ID NO：46)，通过PCR分别从重组质粒HCMV-G1HuA6-VHE(SEQID NO：16；图3)和HCMV-G1HuA6-VHQ(SEQ ID NO：15图2)扩增两个人源化VHcDNA区。用BstEII消化PCR片段3’末端。然后将每种PCR片段克隆到用BstEII和平端切割酶HincII切割的重链盒载体HCcassREAL。所得质粒是最终表达构建体的中间物并且分别命名为HCcassHVESP20和HCcassHVQSP20。该亚克隆还导致与最初载体的两个VH区结合的前导序列的改变。而旧前导序列的氨基酸序列为MDWTWRVFCLLAVVAPGAHS(SEQ ID NO：47)，它已经在亚克隆期间用MAWVWTLPFLMAAAQSVQA(SEQ ID NO：48)替换。
用ScaI消化中间质粒HCcassVHESP20或HCcassVHQSP20，并随后将所述质粒用BamHI和EcoRI消化。纯化含有Ig重链启动子和VH区的2.9kb片段并将其与重链表达构建体的BamHI和EcoRI消化的8.7kb片段连接。所得质粒分别命名为HCVHESp20(SEQ ID NO：40；图10)和HCVHQSp20(SEQ ID NO：41；11)；并用于在Sp2/0细胞中表达人源化CD45RO/RB-结合分子VHE/humV1、VHQ/humVl。
用于VHEN73D的人γ-1重链表达载体
表达载体HCVHESp20(SEQ ID NO：40；图10)和HCVHQSp20(SEQID NO：41；图11)用作定点诱变的模板以实现N73D突变(CD45RO/RB-结合分子的重链的73位氨基酸中天冬酰胺替换成天冬氨酸)。该突变除去了推定的N-糖基化位点。用QuikChangeMulti-Site Direeted Mutagenesis试剂盒(Stratagene)和引物aCD45H-N73D(5’-磷酸GCCACACTAACTGCAGACAAATCCATCAGCACAGC-3’；SEQ ID NO：49)根据试剂盒手册进行诱变。所得构建体HCVHEN73DSp20和HCVHQN73DSp20的序列经证实并且分别公开为SEQ NO：37和SEQ NO：38，和图8和9。HCVHEN73DSp20(SEQ NO：37)与轻链表达构建体LCVL1SP20(SEQNO：36)一起用于在Sp2/0细胞中表达人源化CD45RO/RB-结合分子VHE-N73D/humV1。
产生分泌人源化抗-CD45RO/RB抗体VHE-N73D/humV1的稳定的Sp2/0骨髓瘤转染子
用编码人源化CD45RO/RB-结合分子VHEN73D/humV1的重链(HCVHEN73DSp20；SEQ ID NO：37)和轻链轻(LCVL1SP20；SEQ IDNO：36)的载体电穿孔小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0Ag14.10。对于转染，使用指数生长期中生活力高于95％的细胞。将细胞用冷TF-缓冲液(272mM蔗糖，1mM MgCl2，7mM磷酸缓冲液pH 7.4)洗涤两次，并用TF-缓冲液调节细胞浓度至2×107个细胞/ml。将0.8ml细胞悬浮液与15μg每种重链和轻链质粒构建体混合并置于冰上10分钟。通过电穿孔使用Biorad GenePulser(280V和25μF)进行5次转染。电穿孔后，将细胞置于冰上15分钟，然后转移到50ml冷培养基(没有FCS的基于RPMI的培养基)中并在37℃和5％CO2下孵育2天。
对于转染子的选择，在1.1mg/ml G418(Geneticin，Gibco lot 3069464)存在下培养细胞约2到3周。位于轻链构建体上的dhfr(二氢叶酸还原酶)扩增标记允许通过叶酸类似物氨甲蝶呤(MTX)扩增dhfr以及转基因。在200nM MTX存在下培养G418抗性细胞2-3周，然后进一步增加MTX浓度至1μM，导致扩增的异源细胞库。通过分析蛋白A HPLC测定抗体浓度。通过有限稀释，选择用于克隆的最佳生产库，使用每孔0.3个细胞的接种密度分离高生产克隆。
实施例5：通过ELISA测定重组人IgG表达
VHE/humV1、VHE/humV2、VHQ/humV1和VHQ/humV2的表征
为了确定培养上清液中表达的重组人抗体的IgG浓度，已经开发了夹层ELISA方案并使用人IgG作为标准进行优化。用100μl山羊抗人IgG(完整分子，Cat.N°I1011，SIGMA)以PBS中0.5μg/ml的终浓度在4℃过夜包被平底96孔微量滴定板(Cat.N°4-39454，Nunc Immunoplate Maxisorp)。然后将孔用洗涤缓冲液(含有0.05％Tween 20的PBS)洗涤3次并在37℃用封闭缓冲液(PBS中的0.5％BSA)封闭1.5小时。3次洗涤循环后，通过用封闭缓冲液连续1.5倍稀释制备抗体样品和标准人IgG(Cat.No.I4506，SIGMA)。将100μl经稀释的样品或者标准以一式两份转移到经包被的板并在室温孵育1小时。孵育后，将板用洗涤缓冲液洗涤3次并随后用在封闭缓冲液中以1/4000稀释的100μl辣根过氧化物酶-缀合的山羊抗人IgGκ轻链(Cat.N°A-7164，SIGMA)孵育1小时。对照孔接受100μl封闭缓冲液或者浓缩的正常培养基。洗涤后，使用TMB过氧化物酶EIA底物试剂盒(Cat.N°172-1067，Bio-Rad)根据生产商的教导进行样品和标准孔中结合的过氧化物酶的比色定量。将过氧化物酶混合物以100μl/孔加入并在室温黑暗中孵育30分钟。通过加入100μl 1M硫酸中止比色反应并使用ELISA平板读出器(Model 3350-UV，BioRad)在450nm读出每孔中的吸收。
对于IgG标准曲线，使用0.998的校正系数，为从受转染的COS细胞得到的4种不同培养浓缩物(约250-300倍浓缩)确定下面的浓度：
VHE/humV1上清液＝8.26μg/ml
VHE/humV2上清液＝6.27μg/ml
VHQ/humV1上清液＝5.3μg/ml
VHQ/humV2上清液＝5.56μg/ml
大小排阻层析分析(SEC)
在TSKgel Super SW3000SWXL上通过大小排阻层析(SEC)分析亲和纯化的抗体VHE/humV1、VHE/humV2、VHQ/humV1和VHQ/humV2以便确定蛋白质含量、小聚集物(寡聚抗体)的百分数以及可能的副产物和降解产物。对VHE/humV1、VHE/humV2、VHQ/humV1和VHQ/humV2的层析图表明主峰是分裂的并且对于具有重链E的库的分离更明显(图12)。结果表明至少两种分子的存留时间是在每种样品中存在的Ig抗体典型的。
还原条件下的SDS-PAGE
在还原条件(梯度凝胶，4到20％Tris-甘氨酸凝胶，Novex)下通过SDS-PAGE分析人源化CD45RO/RB结合分子VHE/humV1、VHE/humV2、VHQ/humV1和VHQ/humV2表明存在意外的附加带，其迁移到稍微高于相应于每种样品中重链的带。估计质量的差异为2到4kDa范围内。蛋白质印迹分析表明上面的条带由抗-人(H+L)抗体识别，表明所述附加带为重链变体。
阳离子交换层析(CEX)
使用PolyCatA柱(PolyLC Inc)通过阳离子交换层析(CEX)评估电荷不均匀性。尽管嵌合mAb基本上无除了C-末端赖氨酸变体之外的电荷不均匀性，但是发现所有人源化CD45RO/RB结合分子，即VHE/humV1、VHE/humV2、VHQ/humV1和VHQ/humV2在电荷中非常不均匀。抗体中电荷不均匀性的共同原因是在抗体重链的C-末端存在/缺乏Lys，导致CEX中三个峰。每个层析图上可见到的高数目的峰(＞10；图13)表明在所有四种CD45RO/RB结合分子中存在至少一种额外的修饰。
SDS-PAGE
为了评估在VHE/humV1、VHE/humV2、VHQ/humV1和VHQ/humV2的蛋白质库中发现的两种抗体种类之间的分子差异，选择VHE/humV2用于进一步分析。以半制备模式收集VHE/humV2的两个SEC峰并通过SEC再次分析以证实它们的纯度。通过SEC收集级分(级分1和级分2)，然后通过SDS-PAGE在还原条件下分析。约49kDa处的意外的额外带的比例在两种级分之间不同。级分2基本上无该额外的较高带。
ESI-Q-TOF质谱法
然后通过ESI-Q-TOF质谱法进一步分析SEC级分F1、F2和VHE/humV2的蛋白质库。在蛋白质库和级分2的谱图中，观察到相同组的信号。在约148’000Da的第一组信号在所述蛋白质库和级分2中发现，但是未在级分1中检测到。在级分1中，检测到第二组信号(在约150’300Da)，此外还检测在约152’500Da的另一组信号。在约150’320Da的所述第二组信号不能与任意通常观察到的抗体形式相关。这些发现表明SEC中的两个峰和还原SDS-PAGE中的两个较上的条带对应于所预期的蛋白质的每种变体。
反相层析
为了得到质谱中较不复杂的图式，进一步单独分析抗体链。将级分还原并烷基化。为了证实反应的完全性，通过反相(RP)层析(SORBAX，Poroshell 300SB-C8)分析还原和烷基化的样品。还原和烷基化后，峰形几乎与仅还原后的相同。观察到存留时间的偏移。对SEC级分1和级分2还原并烷基化样品得到类似图式。用ESI-Q-TOF质谱法分析VHE/humV2蛋白质库样品、SEC级分1和SEC级分2(还原并烷基化的)。一些质峰可以分配预期的抗体形式。在所有三个样品(蛋白质库、F1和F2)中发现相同的主峰，但是它们在级分2中的强度非常低(图14)。
重链变体的糖分析
在反相(RP)层析柱上注射经还原和烷基化的抗体并收集对应于重链变体的两个峰。然后确定这些RP-分级分离的抗体的寡糖谱。在所有样品中发现的预期的G0和G1寡糖残基中，在级分1的层析图中检测到一些其他峰(在级分2和蛋白质库的层析图中也检测到那些峰的痕迹)。
总体看来，这些结果表明较大的抗体种类含有不通常在SP2/0中表达的单克隆抗体中发现的额外的糖基化，其造成质量差异。因为通过糖分析和质谱发现的大的、复杂的糖基化对于抗体的恒定区中保守糖基化位点是非常不可能的，所以在人源化抗体的氨基酸序列中进行其他可能位点的搜索。在两种重链变体的可变结构域中鉴定了N-糖基化(N-X-S)的可能位点(N73)。
通过CEX的制备性分级分离
使用从库VHE/humV1纯化的物质进行进一步分析。为了减小该物质的异质性，通过羧肽酶-B处理除去C-末端-赖氨酸。通过制备性阳离子交换层析，使用SP Sepharose(Pharmacia)分级分离VHE/humV1抗体。将柱子用25mM磷酸钠缓冲液，pH6.0(＝缓冲液A)平衡并用缓冲液A中的250mM NaCI(＝缓冲液B；从0-65％的梯度B)洗脱结合的蛋白质。使用CEX分析级分的纯度。将收集的级分再注射到SEC柱上以寻找用这两种技术得到的结果之间的相关性。层析图表明CEX中的第一组峰与抗体的SEC分析中的前峰相关，CEX中第二组峰一起导致蛋白质库(或者级分1)的SEC分析中的第一个峰，并且CEX中的最后一个峰如SEC(或级分2)中的最后一个峰一样洗脱。
总之，上述结果(SEC级分1和2的寡糖谱、脱羧后所得CEX图式、以CEX收集的级分所得CEX图式、质谱)强烈表明存在具有复杂寡糖的抗体种类，其导致a)质量不均匀性，导致SEC中的双峰和b)在还原SDS-PAGE电荷不均匀性中观察到的双重链带，其导致CEX图式。
CEX级分的分析表征
因为较大的抗体种类在CEX上较早洗脱，表明它们所带正电荷较少，所以测量通过制备CEX得到的不同级分中唾液酸(复杂糖基化的一种组分并且带负电)的存在。唾液酸不同程度地存在于所有4种样品中。所发现的唾液酸最可能是N-羟乙酰神经氨酸形式(基于与N-乙酰基-神经氨酸标准相比较短的存留时间)。在一种CEX级分中唾液酸的极低存在相比另一种CEX级分中它的极高丰度强烈表明带负电的糖组分造成了质量/电荷不均匀性。通过ESI-Q-TOF质谱分析CEX级分。
SDS-PAGE
还通过SDS-PAGE在还原条件下分析相同级分。可以得出结论，较上的重链条带对应于含有唾液酸的具有复杂寡糖谱的抗体部分。较下的重链条带对应于显示常规寡糖谱的预期的抗体。
在Mono-S柱上分离木瓜蛋白酶消化的CEX级分
为了证实潜在糖基化位点在重链的可变结构域中的使用，用木瓜蛋白酶处理约1mg每种CEX级分以分离抗体的Fab和Fc部分。在Mono-S柱上进行制备层析。将收集的每种亚级分再次注射到RP柱上以按照Fab和/或Fc结构域鉴定它的含量。然后用ESI-Q-TOF质谱分析所收集的每种亚级分。所得结果表明a)重链的Fc部分中保守糖基化位点由不具有(G0)、具有一个(G1)或两个末端(G2)半乳糖单位的双触角寡糖形式占据；b)相比，不规则糖基化位点(N73)携带含有N-羟乙酰神经氨酸的复杂寡糖。
总之，发现重链的可变结构域中天冬酰胺残基N73是部分N-糖基化的。这些糖种类导致通过SDS-PAGE、大小排阻层析和阳离子交换层析检测到的质量不均匀性以及电荷不均匀性。
VHE-N73D/humV1的表征
为了消除人源化VHE/humV1、VHE/humV2、VHQ/humV1和VHQ/humV2抗体的不均匀性，通过天冬氨酸残基替代重链的可变结构域中N73位的天冬酰胺残基(见实施例4)。然后进一步分析VHE-N73D/humV1。
大小排阻层析分析(SEC)
如上述进行SEC。在SEC中观察到VHE/humV1和VHE-N73D/humV1之间的明显不同。与对VHE/humV1得到的双峰相比，对VHE-N73D/humV1仅得到一个峰(图12)。通过SEC定量约0.2％聚集物。
还原条件下的SDS-PAGE
如上述在还原条件下通过SDS-PAGE进一步分析VHE/humV2和VHE-N73D/humV1。在预期的重链(HC)位置(约50kDa)观察到VHE-N73D/humV1的仅一条带。对VHE-N73D/humV1观察的HC-带对应于对VHE/humV2观察的双峰的较低带。轻链带的位置与所分析的蛋白质的相同。
阳离子交换层析(CEX)
如上述进行阳离子交换层析(CEX)。对CEX分析所得结果表明与VHE/humV2的高电荷不均匀性(＞10；图13)相比，VHE-N73D/humV1的电荷不均匀性简化成C-末端赖氨酸变体(三个峰)。
MALDI TOF分析(质谱法)
通过MALDI TOF分析(质谱法)所得重链和轻链的检测的质量与从VHE-N73D/humV1的氨基酸序列推导的预期质量非常一致。
反相层析(RP)
用DDT还原后，通过反相层析(RP)分析两种人源化抗体VHE/humV2和VHE-N73D/humV1。由于天冬酰胺N73上的部分糖基化，在对应于轻链的峰(约17.3min)中观察到VHE/humV2的两条“重链”(约18.5min的双峰)。对于VHE-N73D/humV1，对所述重链观察到仅一个峰(图14)。
实施例6：FACS竞争分析(结合亲和性)
选择人T细胞系PEER作为FACS分析的靶细胞，因为它在它的细胞表面上表达CD45抗原。为了分析人源化抗体上清液的结合亲和性，用FITC-标记的嵌合抗体作为参照进行竞争实验并与所纯化的小鼠抗体和嵌合抗体的抑制进行比较。以3000转/分钟离心PEER细胞培养物10秒钟并除去培养基。将细胞重悬浮在FACS缓冲液(含有1％FBS和0.1％叠氮化钠的PBS)中并以1×105个细胞/孔的细胞密度接种在96孔圆底微量滴定板中。将板离心并丢弃上清液。对于阻断研究，将25μl浓缩的未经转染的培养基或者同种型匹配的对照抗体(阴性对照)、未经标记的小鼠抗体或者嵌合抗体(阳性对照)以及含有人源化抗体的多种组合的浓缩上清液(样品)首先以文中指出的浓度加入每孔。在4℃孵育1小时后，用200μl FACS缓冲液通过离心洗涤PEER细胞。随后将细胞与25μl FACS缓冲液中终浓度为20μg/ml的缀合FITC的嵌合抗体在4℃孵育1小时。洗涤细胞并将其重悬浮在含有2μg/ml碘化丙锭的300μl FACS缓冲液中，碘化丙锭允许活细胞的门控(gating)。在流式细胞仪(FACSCalibur，BectonDickinson)上分析细胞制备物。
FACS分析表明浓缩的人源化抗体培养上清液对荧光染料标记的嵌合抗体的依赖剂量的阻断。用同种型匹配的对照抗体看到嵌合抗体结合的非剂量依赖性阻断，表明不同人源化抗体组合的阻断效果是表位特异的并且在人源化过程后似乎保留了表位特异性。
将来自上面提及的SP2/0转染子的未经稀释的上清液或者溶于培养基中的2μg/ml嵌合抗体(阳性对照)或者同种型匹配的对照抗体(阴性对照)与100μl 1.5×105PEER细胞在4℃孵育30分钟。然后，向每个样品加入含有FITC标记的嵌合抗体的100μl PBS并在4℃继续孵育30分钟。洗涤后，将细胞重悬浮在含有1μg/ml 7-氨基-放线菌素D的FACS-PBS中并通过流式细胞术使用Becton Dickinson FACSCalibur仪器和CellQuest Pro软件进行分析。对活细胞门控，即7-氨基-放线菌素D-阴性事件。
FACS分析表明未经标记的人源化CD45RB/RO结合分子，例如，VHE/humV1和VHQ/humV1但不是同种型匹配的对照抗体与FITC标记的嵌合抗体竞争结合人CD45-阳性T细胞系PEER。
VHE-N73D/humV1的特异性
为了评估人源化CD45R0/RB结合分子VHE/humV1的修饰，即CD45R0/RB结合分子的重链的73位氨基酸天冬酰胺向天冬氨酸的改变是否修饰了与相关表位的反应性，在竞争结合实验中分析了VHE-N73D/humV1与表达CD45的人T细胞系PEER的反应性。
将PEER细胞与VHE-N73D/humV1、其嵌合前驱物或者非结合的同种型对照IgG1抗体孵育。洗除未结合的抗体并将细胞与荧光染料异硫氰酸荧光素(FITC)标记的嵌合抗-CD45R0/RB mAb或FITC-标记的同种型IgG1对照抗体孵育。洗涤后，对细胞进行流式细胞术分析以定量结合预孵育的PEER细胞的FITC-标记的抗体的量：将PEER细胞培养物以400倍标准重力(g)离心10分钟并除去培养基。将细胞在FACS缓冲液(含有1％v/v FBS，0.1w/v EDTA和0.1％w/v叠氮化钠)的FACS缓冲液中重悬浮并以每孔1×105个细胞的细胞密度接种在96孔V底微量滴定板中。离心板并丢弃上清液。在含有20μg/ml嵌合抗-CD45R0/RB mAb、VHE-N73D/humV1或IgG1对照Ab的50μl FACS缓冲液中4℃下孵育每种细胞样品30分钟。然后，通过离心用150μl FACS缓冲液洗涤PEER细胞两次。随后将细胞在含有20μg/ml缀合FITC的嵌合mAb或者FITC-缀合的3G5对照Ab的50μl FACS缓冲液中在4℃孵育30分钟。最后，洗涤细胞并将其以1μg/ml重悬浮在含有7-氨基放线菌素D(7-AAD)的200μl FACS缓冲液中，7-氨基放线菌素D允许在分析期间鉴定活细胞。在FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson)上分析细胞制备物。
观察到如通过降低的荧光信号测定的，未标记的VHE-N73D/humV1和未标记的嵌合抗-CD45R0/RB mAb但不是IgG1对照抗体防止FITC-标记的嵌合抗-CD45R0/RB mAb结合表达CD45的PEER细胞。总之，发现VHE/humV1抗体对VHE-N73D/humV1的修饰不改变人源化抗-CD45R0/RB结合分子的表位特异性。
VHE-N73D/humV1对人或者猕猴CD45的亲和性
为了确定VHE-N73D/humV1抗体对其表位的亲和性，可以以类似于Daley等人，1995；J.Mol.Biol.253：243中描述的方法，用竞争结合实验定量VHE-N73D/humV1与人的表达-CD45的T细胞系PEER或者猕猴的表达-CD45的T细胞系HSC-F的反应性。
简言之，在多种浓度的未经标记的竞争抗体的存在下，用PEER或HSC-F细胞与FITC-标记的抗体的染色强度计算未经标记的抗体的亲和性。更精确地，在第一步中，测量FITC-标记的小鼠来源的抗人CD45RB/RO结合分子A6(mA6)的浓度和荧光染料标记化学计量。接着，通过利用上述FITC-缀合的mA6 yes(小鼠来源的抗-huCD45)抗体并使用具有已知分子标记程度的荧光珠确定PEER或HSC-F细胞系表面上靶分子CD45的浓度。知道细胞CD45受体和它的FITC-缀合的配体的浓度后，通过基于FACS的平衡滴定方法测定FITC-缀合的mA6对细胞CD45受体的亲和性。最后，用PEER或HSC-F细胞上FITC-缀合的mA6，从竞争染色反应测定未经标记的抗体VHE-N73D/humV1的亲和性，所述反应测量FITC荧光的增加作为VHE-N73D/humV1的总浓度的函数。如果将代表结合一种受体的两种竞争配体的混合物中结合平衡的代数学上的明确描述的三次方程在程序Origin 7.5中实现，那么在反复曲线拟合分析时用该软件程序计算VHE-N73D/humV1的解离常数(Kd)值。
在一个实验中，假定二价抗体结合靶CD45RO/RB分子，对于人PEER细胞靶标，VHE-N73D/humV1的解离常数计算为2.44±0.07nM，对于猕猴HSC-F细胞靶标，它计算为1.67±0.00nM。
实施例7：CD45RB/RO结合分子的生物活性
在该研究中，我们已经处理了当存在于多克隆激活的原代人T细胞的培养物中时，结合CD45RB/RO的嵌合抗体是否(i)支持具有特征性Treg表型的T细胞的分化，(ii)防止或者增强T细胞活化后的程序性细胞死亡，和(iii)影响再刺激后特定抗原和受体亚群的表达。
结合CD45RB/RO的嵌合抗体增强多克隆活化的T细胞中细胞死亡
在结合CD45RB/RO的嵌合抗体的存在或不存在(＝对照)下，通过抗-CD3加上抗-CD28mAb(每种200ng/ml)激活原代T细胞(CD4+和CD8+T亚群的混合物)。在第二天通过洗涤除去过量抗体。被程序性细胞死亡和坏死细胞摄入的作为DNA染色染料的7-氨基放线菌素D(7-AAD)用于测量活化后的细胞死亡。结果表明结合CD45RB/RO的嵌合抗体的存在下T细胞的活化在活化后第二天增加7-AAD阳性细胞部分两倍以上。在第7天，结合CD45RB/RO的嵌合抗体处理的培养物和对照培养物中7-AAD阳性细胞的部分再次类似。
结合CD45RB/RO的嵌合抗体但不是对照mAb处理的T细胞显示出T调节细胞(Treg)表型
CD25和负调节蛋白质CTLA-4(CD152)的增加的表达是Treg细胞的标记。结合CD45RB/RO的嵌合抗体对原代和继代T细胞应答的功能抑制可能是由于Treg细胞的诱导。为了解决该问题，通过抗-CD3+CD28mAbs活化T细胞并在结合CD45RB/RO的嵌合抗体或者抗-LPS对照mAb存在下培养。CTLA-4和CD25表达的时程揭示了在再次刺激后第1和3天用对照和结合CD45RB/RO的嵌合抗体处理的T细胞之间的显著差异，表明Treg表型。
在结合CD45RB/RO的嵌合抗体存在下维持细胞内CTLA-4表达
已经报导也可以在细胞内发现大量CTLA-4。因此，与表面CTLA-4染色平行，分析胞内CTLA-4表达。在刺激后第4天看到T细胞培养物之间的中等差异。然而，延长培养后，仅在结合CD45RB/RO的嵌合抗体处理的但不在对照T细胞中维持胞内CTLA-4的高水平。
结合CD45RB/RO的嵌合抗体处理的T细胞变得对CD4和CD8双阳性
刺激后，T细胞诱导并上调一些表面受体，如CD25、CD152(CTLA-4)、CD154(CD40-配体)和其他受体的表达。相比，认为CD4或者CD8的表达水平保持相对恒定。我们再现地观察到活化后，结合CD45RB/RO的嵌合抗体处理的但不是对照Ab处理的T细胞上CD4和CD8抗原的强烈增加。CD4/CD8双阳性T细胞群的出现似乎是由于CD8+亚群上CD4的上调和相反地，CD4+亚群上CD8的上调。这与对照培养物中双阳性T细胞的中等低百分数形成对比。
结合CD45RB/RO的嵌合抗体处理的T细胞表达高IL-2受体α链，但是极低β-链
已知Treg细胞对CD25——IL-2受体α链为组成性阳性。Treg细胞上三聚体IL-2受体的其他亚基的调节还未知。最近，我们已经比较了在结合CD45RB/RO的嵌合抗体的存在或不存在下激活和增殖的T细胞上IL-2受体的β链(例如，CD122)的表达。结果表明与对照培养物中T细胞相比，结合CD45RB/RO的嵌合抗体处理的T细胞具有低为约1/10的CD122表达。该差异可以表明Treg细胞需要不同于IL-2的因子用来增殖。
实施例8：本发明的序列(本发明的CDR序列加下划线)
SEQ ID NO：1
嵌合轻链的部分氨基酸序列
DILLTQSPAILSVSPGERVSFSC RASQNIGTSIQWYQQRTNGSPRLLIR SSSESISGIPSRFSG
SGSGTDFTLSINSVESEDIADYYC QQSNTWPFTFGSGTKLEIK
SEQ ID NO：2
嵌合重链的部分氨基酸序列
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFT NYIIHWVKQEPGQGLEWIG YFNPYNHGTKY
NEKFKGRATLTADKSSNTAYMDLSSLTSEDSAIYYCAR SGPYAWFDTWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：3
嵌合轻链的氨基酸序列
DILLTQSPAILSVSPGERVSFSC RASQNIGTSIQWYQQRTNGSPRLLIR SSSESISGIPSRFSG
SGSGTDFTLSINSVESEDIADYYC QQSNTWPFTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKS
GTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE
KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：4
嵌合重链的氨基酸序列
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFT NYIIHWVKQEPGQGLEWIG YFNPYNHGTKY
NEKFKGRATLTADKSSNTAYMDLSSLTSEDSAIYYCAR SGPYAWFDTWGQGTTVTVSSAS
TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY
SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL
FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV
SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS
LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS
CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：5
编码SEQ ID NO：1的多肽的核苷酸序列
GACATTCTGCTGACCCAGTCTCCAGCCATCCTGTCTGTGAGTCCAGGAGAAAGAGTCA
GTTTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAACATTGGCACAAGCATACAGTGGTATCAACAAAGA
ACAAATGGTTCTCCAAGGCTTCTCATAAGGTCTTCTTCTGAGTCTATCTCTGGGATCCCT
TCCAGGTTTAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTTACTCTTAGCATCAACAGTGTGGA
GTCTGAAGATATTGCAGATTATTACTGTCAACAAAGTAATACCTGGCCATTCACGTTCGG
CTCGGGGACCAAGCTTGAAATCAAA
SEQ ID NO：6
编码SEQ ID NO：2的多肽的核苷酸序列
GAGGTGCAGCTGCAGCAGTCAGGACCTGAACTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAG
ATGTCCTGCAAGGCCTCTGGATACACATTCACTAATTATATTATCCACTGGGTGAAGCA
GGAGCCTGGTCAGGGCCTTGAATGGATTGGATATTTTAATCCTTACAATCATGGTACTA
AGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAGGGCCACACTAACTGCAGACAAATCCTCCAACACA
GCCTACATGGACCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGATCTACTACTGTGCAA
GATCAGGACCCTATGCCTGGTTTGACACCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTC
CTCA
SEQ ID NO：7
称作humV2(humV2＝VLm)的人源化轻链的部分氨基酸序列
DILLTQSPAT LSLSPGERAT FSC RASQNIG TSIQWYQQKT NGAPRLLIR S SSESISGIPS
RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYC QQ SNTWPFTFGQ GTKLEIK
SEQ ID NO：8
称作humV1(humV1＝VLh)的人源化轻链的部分氨基酸序列
DILLTQSPAT LSLSPGERAT LSC RASQNIG TSIQWYQQKP GQAPRLLIR S SSESISGIPS
RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYC QQ SNTWPFTFGQ GTKLEIK
SEQ ID NO：9
称作VHE的人源化重链的部分氨基酸序列
EVQLVESGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT  NYIIHWVKQE PGQGLEWIG Y
FNPYNHGTKY NEKFKGRATL TANKSISTAY MELSSLRSED TAVYYCAR SG
PYAVVFDTWGQ GTTVTVSS
SEQ ID NO：10
称作VHQ的人源化重链的部分氨基酸序列
QVQLVESGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT  NYIIHWVKQE PGQGLEWIG Y
FNPYNHGTKY NEKFKGRATL TANKSISTAY MELSSLRSED TAVYYCAR SG
PYAWFDTWGQ GTTVTVSS
SEQ ID NO：11
编码氨基酸序列SEQ ID NO：9的核苷酸序列
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCAGGAGCCGAAGTGAAAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAG
GTGTCCTGCAAGGCCTCTGGATACACATTCACTAATTATATTATCCACTGGGTGAAGCA
GGAGCCTGGTCAGGGCCTTGAATGGATTGGATATTTTAATCCTTACAATCATGGTACTA
AGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAGGGCCACACTAACTGCAAACAAATCCATCAGCACA
GCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGCGCTCTGAGGACACTGCGGTCTACTACTGTGCAA
GATCAGGACCCTATGCCTGGTTTGACACCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTC
CTCA
SEQ ID NO：12
编码氨基酸序列SEQ ID NO：10的核苷酸序列
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCAGGAGCCGAAGTGAAAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAG
GTGTCCTGCAAGGCCTCTGGATACACATTCACTAATTATATTATCCACTGGGTGAAGCA
GGAGCCTGGTCAGGGCCTTGAATGGATTGGATATTTTTAATCCTTACAATCATGGTACTA
AGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAGGGCCACACTAACTGCAAACAAATCCATCAGCACA
GCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGCGCTCTGAGGACACTGCGGTCTACTACTGTGCAA
GATCAGGACCCTATGCCTGGTTTGACACCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTC
CTCA
SEQ ID NO：13
编码氨基酸序列SEQ ID NO：7的核苷酸序列
GACATTCTGCTGACCCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTCTGAGTCCAGGAGAAAGAGCCA
CTTTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAACATTGGCACAAGCATACAGTGGTATCAACAAAAA
ACAAATGGTGCTCCAAGGCTTCTCATAAGGTCTTCTTCTGAGTCTATCTCTGGGATCCC
TTCCAGGTTTAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTTACTCTTACCATCAGCAGTCTGG
AGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAACAAAGTAATACCTGGCCATTCACGTTC
GGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA
SEQ ID NO：14
编码氨基酸序列SEQ ID NO：8的核苷酸序列
GACATTCTGCTGACCCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTCTGAGTCCAGGAGAAAGAGCCA
CTCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAACATTGGCACAAGCATACAGTGGTATCAACAAAAA
CCAGGTCAGGCTCCAAGGCTTCTCATAAGGTCTTCTTCTGAGTCTATCTCTGGGATCCC
TTCCAGGTTTAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTTACTCTTACCATCAGCAGTCTGG
AGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAACAAAGTAATACCTGGCCATTCACGTTC
GGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA
SEQ ID NO：15
表达载体HCMV-G1HuA6-VHQ的核苷酸序列
(从3921-4274包含SEQ ID NO：12(VHQ)的人源化重链表达载体的完整DNA序列)
   1   AGCTTTTTGC AAAAGCCTAG GCCTCCAAAA AAGCCTCCTC ACTACTTCTG
  51   GAATAGCTCA GAGGCCGAGG CGGCCTCGGC CTCTGCATAA ATAAAAAAAA
 101   TTAGTCAGCC ATGGGGCGGA GAATGGGCGG AACTGGGCGG AGTTAGGGGC
 151   GGGATGGGCG GAGTTAGGGG CGGGACTATG GTTGCTGACT AATTGAGATG
 201   CATGCTTTGC ATACTTCTGC CTGCTGGGGA GCCTGGTTGC TGACTAATTG
 251   AGATGCATGC TTTGCATACT TCTGCCTGCT GGGGAGCCTG GGGACTTTCC
 301   ACACCCTAAC TGACACACAT TCCACAGCTG CCTCGCGCGT TTCGGTGATG
 351   ACGGTGAAAA CCTCTGACAC ATGCAGCTCC CGGAGACGGT CACAGCTTGT
 401   CTGTAAGCGG ATGCCGGGAG CAGACAAGCC CGTCAGGGCG CGTCAGCGGG
 451   TGTTGGCGGG TGTCGGGGCG CAGCCATGAC CCAGTCACGT AGCGATAGCG
 501   GAGTGTATAC TGGCTTAACT ATGCGGCATC AGAGCAGATT GTACTGAGAG
 551   TGCACCATAT GCGGTGTGAA ATACCGCACA GATGCGTAAG GAGAAAATAC
 601   CGCATCAGGC GCTCTTCCGC TTCCTCGCTC ACTGACTCGC TGCGCTCGGT
 651   CGTTCGGCTG CGGCGAGCGG TATCAGCTCA CTCAAAGGCG GTAATACGGT
 701   TATCCACAGA ATCAGGGGAT AACGCAGGAA AGAACATGTG AGCAAAAGGC
 751   CAGCAAAAGG CCAGGAACCG TAAAAAGGCC GCGTTGCTGG CGTTTTTCCA
 801   TAGGCTCCGC CCCCCTGACG AGCATCACAA AAATCGACGC TCAAGTCAGA
 851   GGTGGCGAAA CCCGACAGGA CTATAAAGAT ACCAGGCGTT TCCCCCTGGA
 901   AGCTCCCTCG TGCGCTCTCC TGTTCCGACC CTGCCGCTTA CCGGATACCT
 951   GTCCGCCTTT CTCCCTTCGG GAAGCGTGGC GCTTTCTCAT AGCTCACGCT
1001   GTAGGTATCT CAGTTCGGTG TAGGTCGTTC GCTCCAAGCT GGGCTGTGTG
1051   CACGAACCCC CCGTTCAGCC CGACCGCTGC GCCTTATCCG GTAACTATCG
1101   TCTTGAGTCC AACCCGGTAA GACACGACTT ATCGCCACTG GCAGCAGCCA
1151   CTGGTAACAG GATTAGCAGA GCGAGGTATG TAGGCGGTGC TACAGAGTTC
1201   TTGAAGTGGT GGCCTAACTA CGGCTACACT AGAAGGACAG TATTTGGTAT
1251   CTGCGCTCTG CTGAAGCCAG TTACCTTCGG AAAAAGAGTT GGTAGCTCTT
1301   GATCCGGCAA ACAAACCACC GCTGGTAGCG GTGGTTTTTT TGTTTGCAAG
1351   CAGCAGATTA CGCGCAGAAA AAAAGGATCT CAAGAAGATC CTTTGATCTT
1401   TTCTACGGGG TCTGACGCTC AGTGGAACGA AAACTCACGT TAAGGGATTT
1451   TGGTCATGAG ATTATCAAAA AGGATCTTCA CCTAGATCCT TTTAAATTAA
1501   AAATGAAGTT TTAAATCAAT CTAAAGTATA TATGAGTAAA CTTGGTCTGA
1551   CAGTTACCAA TGCTTAATCA GTGAGGCACC TATCTCAGCG ATCTGTCTAT
1601   TTCGTTCATC CATAGTTGCC TGACTCCCCG TCGTGTAGAT AACTACGATA
1651   CGGGAGGGCT TACCATCTGG CCCCAGTGCT GCAATGATAC CGCGAGACCC
1701   ACGCTCACCG GCTCCAGATT TATCAGCAAT AAACCAGCCA GCCGGAAGGG
1751   CCGAGCGCAG AAGTGGTCCT GCAACTTTAT CCGCCTCCAT CCAGTCTATT
1801   AATTGTTGCC GGGAAGCTAG AGTAAGTAGT TCGCCAGTTA ATAGTTTGCG
1851   CAACGTTGTT GCCATTGCTG CAGGCATCGT GGTGTCACGC TCGTCGTTTG
1901   GTATGGCTTC ATTCAGCTCC GGTTCCCAAC GATCAAGGCG AGTTACATGA
1951   TCCCCCATGT TGTGCAAAAA AGCGGTTAGC TCCTTCGGTC CTCCGATCGT
2001   TGTCAGAAGT AAGTTGGCCG CAGTGTTATC ACTCATGGTT ATGGCAGCAC
2051   TGCATAATTC TCTTACTGTC ATGCCATCCG TAAGATGCTT TTCTGTGACT
2101   GGTGAGTACT CAACCAAGTC ATTCTGAGAA TAGTGTATGC GGCGACCGAG
2151   TTGCTCTTGC CCGGCGTCAA CACGGGATAA TACCGCGCCA CATAGCAGAA
2201   CTTTAAAAGT GCTCATCATT GGAAAACGTT CTTCGGGGCG AAAACTCTCA
2251   AGGATCTTAC CGCTGTTGAG ATCCAGTTCG ATGTAACCCA CTCGTGCACC
2301   CAACTGATCT TCAGCATCTT TTACTTTCAC CAGCGTTTCT GGGTGAGCAA
2351   AAACAGGAAG GCAAAATGCC GCAAAAAAGG GAATAAGGGC GACACGGAAA
2401   TGTTGAATAC TCATACTCTT CCTTTTTCAA TATTATTGAA GCATTTATCA
2451   GGGTTATTGT CTCATGAGCG GATACATATT TGAATGTATT TAGAAAAATA
2501   AACAAATAGG GGTTCCGCGC ACATTTCCCC GAAAAGTGCC ACCTGACGTC
2551   TAAGAAACCA TTATTATCAT GACATTAACC TATAAAAATA GGCGTATCAC
2601   GAGGCCCTTT CGTCTTCAAG AATTCAGCTT GGCTGCAGTG AATAATAAAA
2651   TGTGTGTTTG TCCGAAATAC GCGTTTTGAG ATTTCTGTCG CCGACTAAAT
2701   TCATGTCGCG CGATAGTGGT GTTTATCGCC GATAGAGATG GCGATATTGG
2751   AAAAATCGAT ATTTGAAAAT ATGGCATATT GAAAATGTCG CCGATGTGAG
2801   TTTCTGTGTA ACTGATATCG CCATTTTTCC AAAAGTGATT TTTGGGCATA
2851   CGCGATATCT GGCGATAGCG CTTATATCGT TTACGGGGGA TGGCGATAGA
2901   CGACTTTGGT GACTTGGGCG ATTCTGTGTG TCGCAAATAT CGCAGTTTCG
2951   ATATAGGTGA CAGACGATAT GAGGCTATAT CGCCGATAGA GGCGACATCA
3001   AGCTGGCACA TGGCCAATGC ATATCGATCT ATACATTGAA TCAATATTGG
3051   CCATTAGCCA TATTATTCAT TGGTTATATA GCATAAATCA ATATTGGCTA
3101   TTGGCCATTG CATACGTTGT ATCCATATCA TAATATGTAC ATTTATATTG
3151   GCTCATGTCC AACATTACCG CCATGTTGAC ATTGATTATT GACTAGTTAT
3201  TAATAGTAAT CAATTACGGG GTCATTAGTT CATAGCCCAT ATATGGAGTT
3251  CCGCGTTACA TAACTTACGG TAAATGGCCC GCCTGGCTGA CCGCCCAACG
3301  ACCCCCGCCC ATTGACGTCA ATAATGACGT ATGTTCCCAT AGTAACGCCA
3351  ATAGGGACTT TCCATTGACG TCAATGGGTG GAGTATTTAC GGTAAACTGC
3401  CCACTTGGCA GTACATCAAG TGTATCATAT GCCAAGTACG CCCCCTATTG
3451  ACGTCAATGA CGGTAAATGG CCCGCCTGGC ATTATGCCCA GTACATGACC
3501  TTATGGGACT TTCCTACTTG GCAGTACATC TACGTATTAG TCATCGCTAT
3551  TACCATGGTG ATGCGGTTTT GGCAGTACAT CAATGGGCGT GGATAGCGGT
3601  TTGACTCACG GGGATTTCCA AGTCTCCACC CCATTGACGT CAATGGGAGT
3651  TTGTTTTGGC ACCAAAATCA ACGGGACTTT CCAAAATGTC GTAACAACTC
3701  CGCCCCATTG ACGCAAATGG GCGGTAGGCG TGTACGGTGG GAGGTCTATA
3751  TAAGCAGAGC TCGTTTAGTG AACCGTCAGA TCGCCTGGAG ACGCCATCCA
3801  CGCTGTTTTG ACCTCCATAG AAGACACCGG GACCGATCCA GCCTCCGCAA
3851  GCTTGCCGCC ACCATGGACT GGACCTGGAG GGTGTTCTGC CTGCTGGCCG
3901  TGGCCCCCGG CGCCCACAGC CAGGTGCAGC TGGTGGAGTC AGGAGCCGAA
3951  GTGAAAAAGC CTGGGGCTTC AGTGAAGGTG TCCTGCAAGG CCTCTGGATA
4001  CACATTCACT AATTATATTA TCCACTGGGT GAAGCAGGAG CCTGGTCAGG
4051  GCCTTGAATG GATTGGATAT TTTAATCCTT ACAATCATGG TACTAAGTAC
4101  AATGAGAAGT TCAAAGGCAG GGCCACACTA ACTGCAAACA AATCCATCAG
4151  CACAGCCTAC ATGGAGCTCA GCAGCCTGCG CTCTGAGGAC ACTGCGGTCT
4201  ACTACTGTGC AAGATCAGGA CCCTATGCCT GGTTTGACAC CTGGGGCCAA
4251  GGGACCACGG TCACCGTCTC CTCAGGTGAG TTCTAGAAGG ATCCCAAGCT
4301  AGCTTTCTGG GGCAGGCCAG GCCTGACCTT GGCTTTGGGG CAGGGAGGGG
4351  GCTAAGGTGA GGCAGGTGGC GCCAGCCAGG TGCACACCCA ATGCCCATGA
4401  GCCCAGACAC TGGACGCTGA ACCTCGCGGA CAGTTAAGAA CCCAGGGGCC
4451  TCTGCGCCCT GGGCCCAGCT CTGTCCCACA CCGCGGTCAC ATGGCACCAC
4501  CTCTCTTGCA GCCTCCACCA AGGGCCCATC GGTCTTCCCC CTGGCACCCT
4551  CCTCCAAGAG CACCTCTGGG GGCACAGCGG CCCTGGGCTG CCTGGTCAAG
4601  GACTACTTCC CCGAACCGGT GACGGTGTCG TGGAACTCAG GCGCCCTGAC
4651  CAGCGGCGTG CACACCTTCC CGGCTGTCCT ACAGTCCTCA GGACTCTACT
4701  CCCTCAGCAG CGTGGTGACC GTGCCCTCCA GCAGCTTGGG CACCCAGACC
4751  TACATCTGCA ACGTGAATCA CAAGCCCAGC AACACCAAGG TGGACAAGAA
4801  AGTTGGTGAG AGGCCAGCAC AGGGAGGGAG GGTGTCTGCT GGAAGCCAGG
4851  CTCAGCGCTC CTGCCTGGAC GCATCCCGGC TATGCAGCCC CAGTCCAGGG
4901  CAGCAAGGCA GGCCCCGTCT GCCTCTTCAC CCGGAGGCCT CTGCCCGCCC
4951  CACTCATGCT CAGGGAGAGG GTCTTCTGGC TTTTTCCCCA GGCTCTGGGC
5001  AGGCACAGGC TAGGTGCCCC TAACCCAGGC CCTGCACACA AAGGGGCAGG
5051  TGCTGGGCTC AGACCTGCCA AGAGCCATAT CCGGGAGGAC CCTGCCCCTG
5101  ACCTAAGCCC ACCCCAAAGG CCAAACTCTC CACTCCCTCA GCTCGGACAC
5151  CTTCTCTCCT CCCAGATTCC AGTAACTCCC AATCTTCTCT CTGCAGAGCC
5201  CAAATCTTGT GACAAAACTC ACACATGCCC ACCGTGCCCA GGTAAGCCAG
5251  CCCAGGCCTC GCCCTCCAGC TCAAGGCGGG ACAGGTGCCC TAGAGTAGCC
5301  TGCATCCAGG GACAGGCCCC AGCCGGGTGC TGACACGTCC ACCTCCATCT
5351  CTTCCTCAGC ACCTGAACTC CTGGGGGGAC CGTCAGTCTT CCTCTTCCCC
5401  CCAAAACCCA AGGACACCCT CATGATCTCC CGGACCCCTG AGGTCACATG
5451  CGTGGTGGTG GACGTGAGCC ACGAAGACCC TGAGGTCAAG TTCAACTGGT
5501  ACGTGGACGG CGTGGAGGTG CATAATGCCA AGACAAAGCC GCGGGAGGAG
5551  CAGTACAACA GCACGTACCG TGTGGTCAGC GTCCTCACCG TCCTGCACCA
5601  GGACTGGCTG AATGGCAAGG AGTACAAGTG CAAGGTCTCC AACAAAGCCC
5651  TCCCAGCCCC CATCGAGAAA ACCATCTCCA AAGCCAAAGG TGGGACCCGT
5701  GGGGTGCGAG GGCCACATGG ACAGAGGCCG GCTCGGCCCA CCCTCTGCCC
5751  TGAGAGTGAC CGCTGTACCA ACCTCTGTCC CTACAGGGCA GCCCCGAGAA
5801  CCACAGGTGT ACACCCTGCC CCCATCCCGG GATGAGCTGA CCAAGAACCA
5851  GGTCAGCCTG ACCTGCCTGG TCAAAGGCTT CTATCCCAGC GACATCGCCG
5901  TGGAGTGGGA GAGCAATGGG CAGCCGGAGA ACAACTACAA GACCACGCCT
5951  CCCGTGCTGG ACTCCGACGG CTCCTTCTTC CTCTACAGCA AGCTCACCGT
6001  GGACAAGAGC AGGTGGCAGC AGGGGAACGT CTTCTCATGC TCCGTGATGC
6051  ATGAGGCTCT GCACAACCAC TACACGCAGA AGAGCCTCTC CCTGTCTCCG
6101  GGTAAATGAG TGCGACGGCC GGCAAGCCCC CGCTCCCCGG GCTCTCGCGG
6151  TCGCACGAGG ATGCTTGGCA CGTACCCCCT GTACATACTT CCCGGGCGCC
6201  CAGCATGGAA ATAAAGCACC CAGCGCTGCC CTGGGCCCCT GCGAGACTGT
6251  GATGGTTCTT TCCACGGGTC AGGCCGAGTC TGAGGCCTGA GTGGCATGAG
6301  ATCTGATATC ATCGATGAAT TCGAGCTCGG TACCCGGGGA TCGATCCAGA
6351  CATGATAAGA TACATTGATG AGTTTGGACA AACCACAACT AGAATGCAGT
6401  GAAAAAAATG CTTTATTTGT GAAATTTGTG ATGCTATTGC TTTATTTGTA
6451  ACCATTATAA GCTGCAATAA ACAAGTTAAC AACAACAATT GCATTCATTT
6501  TATGTTTCAG GTTCAGGGGG AGGTGTGGGA GGTTTTTTAA AGCAAGTAAA
6551  ACCTCTACAA ATGTGGTATG GCTGATTATG ATCTCTAGTC AAGGCACTAT
6601  ACATCAAATA TTCCTTATTA ACCCCTTTAC AAATTAAAAA GCTAAAGGTA
6651  CACAATTTTT GAGCATAGTT ATTAATAGCA GACACTCTAT GCCTGTGTGG
6701  AGTAAGAAAA AACAGTATGT TATGATTATA ACTGTTATGC CTACTTATAA
6751  AGGTTACAGA ATATTTTTCC ATAATTTTCT TGTATAGCAG TGCAGCTTTT
6801  TCCTTTGTGG TGTAAATAGC AAAGCAAGCA AGAGTTCTAT TACTAAACAC
6851  AGCATGACTC AAAAAACTTA GCAATTCTGA AGGAAAGTCC TTGGGGTCTT
6901  CTACCTTTCT CTTCTTTTTT GGAGGAGTAG AATGTTGAGA GTCAGCAGTA
6951  GCCTCATCAT CACTAGATGG CATTTCTTCT GAGCAAAACA GGTTTTCCTC
7001  ATTAAAGGCA TTCCACCACT GCTCCCATTC ATCAGTTCCA TAGGTTGGAA
7051  TCTAAAATAC ACAAACAATT AGAATCAGTA GTTTAACACA TTATACACTT
7101  AAAAATTTTA TATTTACCTT AGAGCTTTAA ATCTCTGTAG GTAGTTTGTC
7151  CAATTATGTC ACACCACAGA AGTAAGGTTC CTTCACAAAG ATCCGGGACC
7201  AAAGCGGCCA TCGTGCCTCC CCACTCCTGC AGTTCGGGGG CATGGATGCG
7251  CGGATAGCCG CTGCTGGTTT CCTGGATGCC GACGGATTTG CACTGCCGGT
7301  AGAACTCCGC GAGGTCGTCC AGCCTCAGGC AGCAGCTGAA CCAACTCGCG
7351  AGGGGATCGA GCCCGGGGTG GGCGAAGAAC TCCAGCATGA GATCCCCGCG
7401  CTGGAGGATC ATCCAGCCGG CGTCCCGGAA AACGATTCCG AAGCCCAACC
7451  TTTCATAGAA GGCGGCGGTG GAATCGAAAT CTCGTGATGG CAGGTTGGGC
7501  GTCGCTTGGT CGGTCATTTC GAACCCCAGA GTCCCGCTCA GAAGAACTCG
7551  TCAAGAAGGC GATAGAAGGC GATGCGCTGC GAATCGGGAG CGGCGATACC
7601  GTAAAGCACG AGGAAGCGGT CAGCCCATTC GCCGCCAAGC TCTTCAGCAA
7651  TATCACGGGT AGCCAACGCT ATGTCCTGAT AGCGGTCCGC CACACCCAGC
7701  CGGCCACAGT CGATGAATCC AGAAAAGCGG CCATTTTCCA CCATGATATT
7751  CGGCAAGCAG GCATCGCCAT GGGTCACGAC GAGATCCTCG CCGTCGGGCA
7801  TGCGCGCCTT GAGCCTGGCG AACAGTTCGG CTGGCGCGAG CCCCTGATGC
7851  TCTTCGTCCA GATCATCCTG ATCGACAAGA CCGGCTTCCA TCCGAGTACG
7901  TGCTCGCTCG ATGCGATGTT TCGCTTGGTG GTCGAATGGG CAGGTAGCCG
7951  GATCAAGCGT ATGCAGCCGC CGCATTGCAT CAGCCATGAT GGATACTTTC
8001  TCGGCAGGAG CAAGGTGAGA TGACAGGAGA TCCTGCCCCG GCACTTCGCC
8051  CAATAGCAGC CAGTCCCTTC CCGCTTCAGT GACAACGTCG AGCACAGCTG
8101  CGCAAGGAAC GCCCGTCGTG GCCAGCCACG ATAGCCGCGC TGCCTCGTCC
8151  TGCAGTTCAT TCAGGGCACC GGACAGGTCG GTCTTGACAA AAAGAACCGG
8201  GCGCCCCTGC GCTGACAGCC GGAACACGGC GGCATCAGAG CAGCCGATTG
8251  TCTGTTGTGC CCAGTCATAG CCGAATAGCC TCTCCACCCA AGCGGCCGGA
8301  GAACCTGCGT GCAATCCATC TTGTTCAATC ATGCGAAACG ATCCTCATCC
8351  TGTCTCTTGA TCAGATCTTG ATCCCCTGCG CCATCAGATC CTTGGCGGCA
8401  AGAAAGCCAT CCAGTTTACT TTGCAGGGCT TCCCAACCTT ACCAGAGGGC
8451  GCCCCAGCTG GCAATTCCGG TTCGCTTGCT GTCCATAAAA CCGCCCAGTC
8501  TAGCTATCGC CATGTAAGCC CACTGCAAGC TACCTGCTTT CTCTTTGCGC
8551  TTGCGTTTTC CCTTGTCCAG ATAGCCCAGT AGCTGACATT CATCCGGGGT
8601  CAGCACCGTT TCTGCGGACT GGCTTTCTAC GTGTTCCGCT TCCTTTAGCA
8651  GCCCTTGCGC CCTGAGTGCT TGCGGCAGCG TGAAGCT
SEQ ID NO：16
表达载体HCMV-G1HuA6-VHE的核苷酸序列
(从3921-4274包含SEQ ID NO：11(VHE)的人源化重链表达载体的完整DNA序列)
   1  AGCTTTTTGC AAAAGCCTAG GCCTCCAAAA AAGCCTCCTC ACTACTTCTG
  51  GAATAGCTCA GAGGCCGAGG CGGCCTCGGC CTCTGCATAA ATAAAAAAAA
 101  TTAGTCAGCC ATGGGGCGGA GAATGGGCGG AACTGGGCGG AGTTAGGGGC
 151  GGGATGGGCG GAGTTAGGGG CGGGACTATG GTTGCTGACT AATTGAGATG
 201  CATGCTTTGC ATACTTCTGC CTGCTGGGGA GCCTGGTTGC TGACTAATTG
 251  AGATGCATGC TTTGCATACT TCTGCCTGCT GGGGAGCCTG GGGACTTTCC
 301  ACACCCTAAC TGACACACAT TCCACAGCTG CCTCGCGCGT TTCGGTGATG
 351  ACGGTGAAAA CCTCTGACAC ATGCAGCTCC CGGAGACGGT CACAGCTTGT
 401  CTGTAAGCGG ATGCCGGGAG CAGACAAGCC CGTCAGGGCG CGTCAGCGGG
 451  TGTTGGCGGG TGTCGGGGCG CAGCCATGAC CCAGTCACGT AGCGATAGCG
 501  GAGTGTATAC TGGCTTAACT ATGCGGCATC AGAGCAGATT GTACTGAGAG
 551  TGCACCATAT GCGGTGTGAA ATACCGCACA GATGCGTAAG GAGAAAATAC
 601  CGCATCAGGC GCTCTTCCGC TTCCTCGCTC ACTGACTCGC TGCGCTCGGT
 651  CGTTCGGCTG CGGCGAGCGG TATCAGCTCA CTCAAAGGCG GTAATACGGT
 701  TATCCACAGA ATCAGGGGAT AACGCAGGAA AGAACATGTG AGCAAAAGGC
 751  CAGCAAAAGG CCAGGAACCG TAAAAAGGCC GCGTTGCTGG CGTTTTTCCA
 801  TAGGCTCCGC CCCCCTGACG AGCATCACAA AAATCGACGC TCAAGTCAGA
 851  GGTGGCGAAA CCCGACAGGA CTATAAAGAT ACCAGGCGTT TCCCCCTGGA
 901  AGCTCCCTCG TGCGCTCTCC TGTTCCGACC CTGCCGCTTA CCGGATACCT
 951  GTCCGCCTTT CTCCCTTCGG GAAGCGTGGC GCTTTCTCAT AGCTCACGCT
1001  GTAGGTATCT CAGTTCGGTG TAGGTCGTTC GCTCCAAGCT GGGCTGTGTG
1051  CACGAACCCC CCGTTCAGCC CGACCGCTGC GCCTTATCCG GTAACTATCG
1101  TCTTGAGTCC AACCCGGTAA GACACGACTT ATCGCCACTG GCAGCAGCCA
1151  CTGGTAACAG GATTAGCAGA GCGAGGTATG TAGGCGGTGC TACAGAGTTC
1201  TTGAAGTGGT GGCCTAACTA CGGCTACACT AGAAGGACAG TATTTGGTAT
1251  CTGCGCTCTG CTGAAGCCAG TTACCTTCGG AAAAAGAGTT GGTAGCTCTT
1301  GATCCGGCAA ACAAACCACC GCTGGTAGCG GTGGTTTTTT TGTTTGCAAG
1351  CAGCAGATTA CGCGCAGAAA AAAAGGATCT CAAGAAGATC CTTTGATCTT
1401  TTCTACGGGG TCTGACGCTC AGTGGAACGA AAACTCACGT TAAGGGATTT
1451  TGGTCATGAG ATTATCAAAA AGGATCTTCA CCTAGATCCT TTTAAATTAA
1501  AAATGAAGTT TTAAATCAAT CTAAAGTATA TATGAGTAAA CTTGGTCTGA
1551  CAGTTACCAA TGCTTAATCA GTGAGGCACC TATCTCAGCG ATCTGTCTAT
1601  TTCGTTCATC CATAGTTGCC TGACTCCCCG TCGTGTAGAT AACTACGATA
1651  CGGGAGGGCT TACCATCTGG CCCCAGTGCT GCAATGATAC CGCGAGACCC
1701  ACGCTCACCG GCTCCAGATT TATCAGCAAT AAACCAGCCA GCCGGAAGGG
1751  CCGAGCGCAG AAGTGGTCCT GCAACTTTAT CCGCCTCCAT CCAGTCTATT
1801  AATTGTTGCC GGGAAGCTAG AGTAAGTAGT TCGCCAGTTA ATAGTTTGCG
1851  CAACGTTGTT GCCATTGCTG CAGGCATCGT GGTGTCACGC TCGTCGTTTG
1901  GTATGGCTTC ATTCAGCTCC GGTTCCCAAC GATCAAGGCG AGTTACATGA
1951  TCCCCCATGT TGTGCAAAAA AGCGGTTAGC TCCTTCGGTC CTCCGATCGT
2001  TGTCAGAAGT AAGTTGGCCG CAGTGTTATC ACTCATGGTT ATGGCAGCAC
2051  TGCATAATTC TCTTACTGTC ATGCCATCCG TAAGATGCTT TTCTGTGACT
2101  GGTGAGTACT CAACCAAGTC ATTCTGAGAA TAGTGTATGC GGCGACCGAG
2151  TTGCTCTTGC CCGGCGTCAA CACGGGATAA TACCGCGCCA CATAGCAGAA
2201  CTTTAAAAGT GCTCATCATT GGAAAACGTT CTTCGGGGCG AAAACTCTCA
2251  AGGATCTTAC CGCTGTTGAG ATCCAGTTCG ATGTAACCCA CTCGTGCACC
2301  CAACTGATCT TCAGCATCTT TTACTTTCAC CAGCGTTTCT GGGTGAGCAA
2351  AAACAGGAAG GCAAAATGCC GCAAAAAAGG GAATAAGGGC GACACGGAAA
2401  TGTTGAATAC TCATACTCTT CCTTTTTCAA TATTATTGAA GCATTTATCA
2451  GGGTTATTGT CTCATGAGCG GATACATATT TGAATGTATT TAGAAAAATA
2501  AACAAATAGG GGTTCCGCGC ACATTTCCCC GAAAAGTGCC ACCTGACGTC
2551  TAAGAAACCA TTATTATCAT GACATTAACC TATAAAAATA GGCGTATCAC
2601  GAGGCCCTTT CGTCTTCAAG AATTCAGCTT GGCTGCAGTG AATAATAAAA
2651  TGTGTGTTTG TCCGAAATAC GCGTTTTGAG ATTTCTGTCG CCGACTAAAT
2701  TCATGTCGCG CGATAGTGGT GTTTATCGCC GATAGAGATG GCGATATTGG
2751  AAAAATCGAT ATTTGAAAAT ATGGCATATT GAAAATGTCG CCGATGTGAG
2801  TTTCTGTGTA ACTGATATCG CCATTTTTCC AAAAGTGATT TTTGGGCATA
2851  CGCGATATCT GGCGATAGCG CTTATATCGT TTACGGGGGA TGGCGATAGA
2901  CGACTTTGGT GACTTGGGCG ATTCTGTGTG TCGCAAATAT CGCAGTTTCG
2951  ATATAGGTGA CAGACGATAT GAGGCTATAT CGCCGATAGA GGCGACATCA
3001  AGCTGGCACA TGGCCAATGC ATATCGATCT ATACATTGAA TCAATATTGG
3051  CCATTAGCCA TATTATTCAT TGGTTATATA GCATAAATCA ATATTGGCTA
3101  TTGGCCATTG CATACGTTGT ATCCATATCA TAATATGTAC ATTTATATTG
3151  GCTCATGTCC AACATTACCG CCATGTTGAC ATTGATTATT GACTAGTTAT
3201  TAATAGTAAT CAATTACGGG GTCATTAGTT CATAGCCCAT ATATGGAGTT
3251  CCGCGTTACA TAACTTACGG TAAATGGCCC GCCTGGCTGA CCGCCCAACG
3301  ACCCCCGCCC ATTGACGTCA ATAATGACGT ATGTTCCCAT AGTAACGCCA
3351  ATAGGGACTT TCCATTGACG TCAATGGGTG GAGTATTTAC GGTAAACTGC
3401  CCACTTGGCA GTACATCAAG TGTATCATAT GCCAAGTACG CCCCCTATTG
3451  ACGTCAATGA CGGTAAATGG CCCGCCTGGC ATTATGCCCA GTACATGACC
3501  TTATGGGACT TTCCTACTTG GCAGTACATC TACGTATTAG TCATCGCTAT
3551  TACCATGGTG ATGCGGTTTT GGCAGTACAT CAATGGGCGT GGATAGCGGT
3601  TTGACTCACG GGGATTTCCA AGTCTCCACC CCATTGACGT CAATGGGAGT
3651  TTGTTTTGGC ACCAAAATCA ACGGGACTTT CCAAAATGTC GTAACAACTC
3701  CGCCCCATTG ACGCAAATGG GCGGTAGGCG TGTACGGTGG GAGGTCTATA
3751  TAAGCAGAGC TCGTTTAGTG AACCGTCAGA TCGCCTGGAG ACGCCATCCA
3801  CGCTGTTTTG ACCTCCATAG AAGACACCGG GACCGATCCA GCCTCCGCAA
3851  GCTTGCCGCC ACCATGGACT GGACCTGGAG GGTGTTCTGC CTGCTGGCCG
3901  TGGCCCCCGG CGCCCACAGC GAGGTGCAGC TGGTGGAGTC AGGAGCCGAA
3951  GTGAAAAAGC CTGGGGCTTC AGTGAAGGTG TCCTGCAAGG CCTCTGGATA
4001  CACATTCACT AATTATATTA TCCACTGGGT GAAGCAGGAG CCTGGTCAGG
4051  GCCTTGAATG GATTGGATAT TTTAATCCTT ACAATCATGG TACTAAGTAC
4101  AATGAGAAGT TCAAAGGCAG GGCCACACTA ACTGCAAACA AATCCATCAG
4151  CACAGCCTAC ATGGAGCTCA GCAGCCTGCG CTCTGAGGAC ACTGCGGTCT
4201  ACTACTGTGC AAGATCAGGA CCCTATGCCT GGTTTGACAC CTGGGGCCAA
4251  GGGACCACGG TCACCGTCTC CTCAGGTGAG TTCTAGAAGG ATCCCAAGCT
4301  AGCTTTCTGG GGCAGGCCAG GCCTGACCTT GGCTTTGGGG CAGGGAGGGG
4351  GCTAAGGTGA GGCAGGTGGC GCCAGCCAGG TGCACACCCA ATGCCCATGA
4401  GCCCAGACAC TGGACGCTGA ACCTCGCGGA CAGTTAAGAA CCCAGGGGCC
4451  TCTGCGCCCT GGGCCCAGCT CTGTCCCACA CCGCGGTCAC ATGGCACCAC
4501  CTCTCTTGCA GCCTCCACCA AGGGCCCATC GGTCTTCCCC CTGGCACCCT
4551  CCTCCAAGAG CACCTCTGGG GGCACAGCGG CCCTGGGCTG CCTGGTCAAG
4601  GACTACTTCC CCGAACCGGT GACGGTGTCG TGGAACTCAG GCGCCCTGAC
4651  CAGCGGCGTG CACACCTTCC CGGCTGTCCT ACAGTCCTCA GGACTCTACT
4701  CCCTCAGCAG CGTGGTGACC GTGCCCTCCA GCAGCTTGGG CACCCAGACC
4751  TACATCTGCA ACGTGAATCA CAAGCCCAGC AACACCAAGG TGGACAAGAA
4801  AGTTGGTGAG AGGCCAGCAC AGGGAGGGAG GGTGTCTGCT GGAAGCCAGG
4851  CTCAGCGCTC CTGCCTGGAC GCATCCCGGC TATGCAGCCC CAGTCCAGGG
4901  CAGCAAGGCA GGCCCCGTCT GCCTCTTCAC CCGGAGGCCT CTGCCCGCCC
4951  CACTCATGCT CAGGGAGAGG GTCTTCTGGC TTTTTCCCCA GGCTCTGGGC
5001  AGGCACAGGC TAGGTGCCCC TAACCCAGGC CCTGCACACA AAGGGGCAGG
5051  TGCTGGGCTC AGACCTGCCA AGAGCCATAT CCGGGAGGAC CCTGCCCCTG
5101  ACCTAAGCCC ACCCCAAAGG CCAAACTCTC CACTCCCTCA GCTCGGACAC
5151  CTTCTCTCCT CCCAGATTCC AGTAACTCCC AATCTTCTCT CTGCAGAGCC
5201  CAAATCTTGT GACAAAACTC ACACATGCCC ACCGTGCCCA GGTAAGCCAG
5251  CCCAGGCCTC GCCCTCCAGC TCAAGGCGGG ACAGGTGCCC TAGAGTAGCC
5301  TGCATCCAGG GACAGGCCCC AGCCGGGTGC TGACACGTCC ACCTCCATCT
5351  CTTCCTCAGC ACCTGAACTC CTGGGGGGAC CGTCAGTCTT CCTCTTCCCC
5401  CCAAAACCCA AGGACACCCT CATGATCTCC CGGACCCCTG AGGTCACATG
5451  CGTGGTGGTG GACGTGAGCC ACGAAGACCC TGAGGTCAAG TTCAACTGGT
5501  ACGTGGACGG CGTGGAGGTG CATAATGCCA AGACAAAGCC GCGGGAGGAG
5551  CAGTACAACA GCACGTACCG TGTGGTCAGC GTCCTCACCG TCCTGCACCA
5601  GGACTGGCTG AATGGCAAGG AGTACAAGTG CAAGGTCTCC AACAAAGCCC
5651  TCCCAGCCCC CATCGAGAAA ACCATCTCCA AAGCCAAAGG TGGGACCCGT
5701  GGGGTGCGAG GGCCACATGG ACAGAGGCCG GCTCGGCCCA CCCTCTGCCC
5751  TGAGAGTGAC CGCTGTACCA ACCTCTGTCC CTACAGGGCA GCCCCGAGAA
5801  CCACAGGTGT ACACCCTGCC CCCATCCCGG GATGAGCTGA CCAAGAACCA
5851  GGTCAGCCTG ACCTGCCTGG TCAAAGGCTT CTATCCCAGC GACATCGCCG
5901  TGGAGTGGGA GAGCAATGGG CAGCCGGAGA ACAACTACAA GACCACGCCT
5951  CCCGTGCTGG ACTCCGACGG CTCCTTCTTC CTCTACAGCA AGCTCACCGT
6001  GGACAAGAGC AGGTGGCAGC AGGGGAACGT CTTCTCATGC TCCGTGATGC
6051  ATGAGGCTCT GCACAACCAC TACACGCAGA AGAGCCTCTC CCTGTCTCCG
6101  GGTAAATGAG TGCGACGGCC GGCAAGCCCC CGCTCCCCGG GCTCTCGCGG
6151  TCGCACGAGG ATGCTTGGCA CGTACCCCCT GTACATACTT CCCGGGCGCC
6201  CAGCATGGAA ATAAAGCACC CAGCGCTGCC CTGGGCCCCT GCGAGACTGT
6251  GATGGTTCTT TCCACGGGTC AGGCCGAGTC TGAGGCCTGA GTGGCATGAG
6301  ATCTGATATC ATCGATGAAT TCGAGCTCGG TACCCGGGGA TCGATCCAGA
6351  CATGATAAGA TACATTGATG AGTTTGGACA AACCACAACT AGAATGCAGT
6401  GAAAAAAATG CTTTATTTGT GAAATTTGTG ATGCTATTGC TTTATTTGTA
6451  ACCATTATAA GCTGCAATAA ACAAGTTAAC AACAACAATT GCATTCATTT
6501  TATGTTTCAG GTTCAGGGGG AGGTGTGGGA GGTTTTTTAA AGCAAGTAAA
6551  ACCTCTACAA ATGTGGTATG GCTGATTATG ATCTCTAGTC AAGGCACTAT
6601  ACATCAAATA TTCCTTATTA ACCCCTTTAC AAATTAAAAA GCTAAAGGTA
6651  CACAATTTTT GAGCATAGTT ATTAATAGCA GACACTCTAT GCCTGTGTGG
6701  AGTAAGAAAA AACAGTATGT TATGATTATA ACTGTTATGC CTACTTATAA
6751  AGGTTACAGA ATATTTTTCC ATAATTTTCT TGTATAGCAG TGCAGCTTTT
6801  TCCTTTGTGG TGTAAATAGC AAAGCAAGCA AGAGTTCTAT TACTAAACAC
6851  AGCATGACTC AAAAAACTTA GCAATTCTGA AGGAAAGTCC TTGGGGTCTT
6901  CTACCTTTCT CTTCTTTTTT GGAGGAGTAG AATGTTGAGA GTCAGCAGTA
6951  GCCTCATCAT CACTAGATGG CATTTCTTCT GAGCAAAACA GGTTTTCCTC
7001  ATTAAAGGCA TTCCACCACT GCTCCCATTC ATCAGTTCCA TAGGTTGGAA
7051  TCTAAAATAC ACAAACAATT AGAATCAGTA GTTTAACACA TTATACACTT
7101  AAAAATTTTA TATTTACCTT AGAGCTTTAA ATCTCTGTAG GTAGTTTGTC
7151  CAATTATGTC ACACCACAGA AGTAAGGTTC CTTCACAAAG ATCCGGGACC
7201  AAAGCGGCCA TCGTGCCTCC CCACTCCTGC AGTTCGGGGG CATGGATGCG
7251  CGGATAGCCG CTGCTGGTTT CCTGGATGCC GACGGATTTG CACTGCCGGT
7301  AGAACTCCGC GAGGTCGTCC AGCCTCAGGC AGCAGCTGAA CCAACTCGCG
7351  AGGGGATCGA GCCCGGGGTG GGCGAAGAAC TCCAGCATGA GATCCCCGCG
7401  CTGGAGGATC ATCCAGCCGG CGTCCCGGAA AACGATTCCG AAGCCCAACC
7451  TTTCATAGAA GGCGGCGGTG GAATCGAAAT CTCGTGATGG CAGGTTGGGC
7501  GTCGCTTGGT CGGTCATTTC GAACCCCAGA GTCCCGCTCA GAAGAACTCG
7551  TCAAGAAGGC GATAGAAGGC GATGCGCTGC GAATCGGGAG CGGCGATACC
7601  GTAAAGCACG AGGAAGCGGT CAGCCCATTC GCCGCCAAGC TCTTCAGCAA
7651  TATCACGGGT AGCCAACGCT ATGTCCTGAT AGCGGTCCGC CACACCCAGC
7701  CGGCCACAGT CGATGAATCC AGAAAAGCGG CCATTTTCCA CCATGATATT
7751  CGGCAAGCAG GCATCGCCAT GGGTCACGAC GAGATCCTCG CCGTCGGGCA
7801  TGCGCGCCTT GAGCCTGGCG AACAGTTCGG CTGGCGCGAG CCCCTGATGC
7851  TCTTCGTCCA GATCATCCTG ATCGACAAGA CCGGCTTCCA TCCGAGTACG
7901  TGCTCGCTCG ATGCGATGTT TCGCTTGGTG GTCGAATGGG CAGGTAGCCG
7951  GATCAAGCGT ATGCAGCCGC CGCATTGCAT CAGCCATGAT GGATACTTTC
8001  TCGGCAGGAG CAAGGTGAGA TGACAGGAGA TCCTGCCCCG GCACTTCGCC
8051  CAATAGCAGC CAGTCCCTTC CCGCTTCAGT GACAACGTCG AGCACAGCTG
8101  CGCAAGGAAC GCCCGTCGTG GCCAGCCACG ATAGCCGCGC TGCCTCGTCC
8151  TGCAGTTCAT TCAGGGCACC GGACAGGTCG GTCTTGACAA AAAGAACCGG
8201  GCGCCCCTGC GCTGACAGCC GGAACACGGC GGCATCAGAG CAGCCGATTG
8251  TCTGTTGTGC CCAGTCATAG CCGAATAGCC TCTCCACCCA AGCGGCCGGA
8301  GAACCTGCGT GCAATCCATC TTGTTCAATC ATGCGAAACG ATCCTCATCC
8351  TGTCTCTTGA TCAGATCTTG ATCCCCTGCG CCATCAGATC CTTGGCGGCA
8401  AGAAAGCCAT CCAGTTTACT TTGCAGGGCT TCCCAACCTT ACCAGAGGGC
8451  GCCCCAGCTG GCAATTCCGG TTCGCTTGCT GTCCATAAAA CCGCCCAGTC
8501  TAGCTATCGC CATGTAAGCC CACTGCAAGC TACCTGCTTT CTCTTTGCGC
8551  TTGCGTTTTC CCTTGTCCAG ATAGCCCAGT AGCTGACATT CATCCGGGGT
8601  CAGCACCGTT TCTGCGGACT GGCTTTCTAC GTGTTCCGCT TCCTTTAGCA
8651  GCCCTTGCGC CCTGAGTGCT TGCGGCAGCG TGAAGCT
SEQ ID NO：17
表达载体HCMV-K HuAb-VL1 hum V1的核苷酸序列
(从3964-4284包含SEQ ID N0：14(humV1＝VLh)的人源化轻链表达载体的完整DNA序列)
   1  CTAGCTTTTT GCAAAAGCCT AGGCCTCCAA AAAAGCCTCC TCACTACTTC
  51  TGGAATAGCT CAGAGGCCGA GGCGGCCTCG GCCTCTGCAT AAATAAAAAA
 101  AATTAGTCAG CCATGGGGCG GAGAATGGGC GGAACTGGGC GGAGTTAGGG
 151  GCGGGATGGG CGGAGTTAGG GGCGGGACTA TGGTTGCTGA CTAATTGAGA
 201  TGCATGCTTT GCATACTTCT GCCTGCTGGG GAGCCTGGTT GCTGACTAAT
 251  TGAGATGCAT GCTTTGCATA CTTCTGCCTG CTGGGGAGCC TGGGGACTTT
 301  CCACACCCTA ACTGACACAC ATTCCACAGC TGCCTCGCGC GTTTCGGTGA
 351  TGACGGTGAA AACCTCTGAC ACATGCAGCT CCCGGAGACG GTCACAGCTT
 401  GTCTGTAAGC GGATGCCGGG AGCAGACAAG CCCGTCAGGG CGCGTCAGCG
 451  GGTGTTGGCG GGTGTCGGGG CGCAGCCATG ACCCAGTCAC GTAGCGATAG
 501  CGGAGTGTAT ACTGGCTTAA CTATGCGGCA TCAGAGCAGA TTGTACTGAG
 551  AGTGCACCAT ATGCGGTGTG AAATACCGCA CAGATGCGTA AGGAGAAAAT
 601  ACCGCATCAG GCGCTCTTCC GCTTCCTCGC TCACTGACTC GCTGCGCTCG
 651  GTCGTTCGGC TGCGGCGAGC GGTATCAGCT CACTCAAAGG CGGTAATACG
 701  GTTATCCACA GAATCAGGGG ATAACGCAGG AAAGAACATG TGAGCAAAAG
 751  GCCAGCAAAA GGCCAGGAAC CGTAAAAAGG CCGCGTTGCT GGCGTTTTTC
 801  CATAGGCTCC GCCCCCCTGA CGAGCATCAC AAAAATCGAC GCTCAAGTCA
 851  GAGGTGGCGA AACCCGACAG GACTATAAAG ATACCAGGCG TTTCCCCCTG
 901  GAAGCTCCCT CGTGCGCTCT CCTGTTCCGA CCCTGCCGCT TACCGGATAC
 951  CTGTCCGCCT TTCTCCCTTC GGGAAGCGTG GCGCTTTCTC ATAGCTCACG
1001  CTGTAGGTAT CTCAGTTCGG TGTAGGTCGT TCGCTCCAAG CTGGGCTGTG
1051  TGCACGAACC CCCCGTTCAG CCCGACCGCT GCGCCTTATC CGGTAACTAT
1101  CGTCTTGAGT CCAACCCGGT AAGACACGAC TTATCGCCAC TGGCAGCAGC
1151  CACTGGTAAC AGGATTAGCA GAGCGAGGTA TGTAGGCGGT GCTACAGAGT
1201  TCTTGAAGTG GTGGCCTAAC TACGGCTACA CTAGAAGGAC AGTATTTGGT
1251  ATCTGCGCTC TGCTGAAGCC AGTTACCTTC GGAAAAAGAG TTGGTAGCTC
1301  TTGATCCGGC AAACAAACCA CCGCTGGTAG CGGTGGTTTT TTTGTTTGCA
1351  AGCAGCAGAT TACGCGCAGA AAAAAAGGAT CTCAAGAAGA TCCTTTGATC
1401  TTTTCTACGG GGTCTGACGC TCAGTGGAAC GAAAACTCAC GTTAAGGGAT
1451  TTTGGTCATG AGATTATCAA AAAGGATCTT CACCTAGATC CTTTTAAATT
1501  AAAAATGAAG TTTTAAATCA ATCTAAAGTA TATATGAGTA AACTTGGTCT
1551  GACAGTTACC AATGCTTAAT CAGTGAGGCA CCTATCTCAG CGATCTGTCT
1601  ATTTCGTTCA TCCATAGTTG CCTGACTCCC CGTCGTGTAG ATAACTACGA
1651  TACGGGAGGG CTTACCATCT GGCCCCAGTG CTGCAATGAT ACCGCGAGAC
1701  CCACGCTCAC CGGCTCCAGA TTTATCAGCA ATAAACCAGC CAGCCGGAAG
1751  GGCCGAGCGC AGAAGTGGTC CTGCAACTTT ATCCGCCTCC ATCCAGTCTA
1801  TTAATTGTTG CCGGGAAGCT AGAGTAAGTA GTTCGCCAGT TAATAGTTTG
1851  CGCAACGTTG TTGCCATTGC TGCAGGCATC GTGGTGTCAC GCTCGTCGTT
1901  TGGTATGGCT TCATTCAGCT CCGGTTCCCA ACGATCAAGG CGAGTTACAT
1951  GATCCCCCAT GTTGTGCAAA AAAGCGGTTA GCTCCTTCGG TCCTCCGATC
2001  GTTGTCAGAA GTAAGTTGGC CGCAGTGTTA TCACTCATGG TTATGGCAGC
2051  ACTGCATAAT TCTCTTACTG TCATGCCATC CGTAAGATGC TTTTCTGTGA
2101  CTGGTGAGTA CTCAACCAAG TCATTCTGAG AATAGTGTAT GCGGCGACCG
2151  AGTTGCTCTT GCCCGGCGTC AACACGGGAT AATACCGCGC CACATAGCAG
2201  AACTTTAAAA GTGCTCATCA TTGGAAAACG TTCTTCGGGG CGAAAACTCT
2251  CAAGGATCTT ACCGCTGTTG AGATCCAGTT CGATGTAACC CACTCGTGCA
2301  CCCAACTGAT CTTCAGCATC TTTTACTTTC ACCAGCGTTT CTGGGTGAGC
2351  AAAAACAGGA AGGCAAAATG CCGCAAAAAA GGGAATAAGG GCGACACGGA
2401  AATGTTGAAT ACTCATACTC TTCCTTTTTC AATATTATTG AAGCATTTAT
2451  CAGGGTTATT GTCTCATGAG CGGATACATA TTTGAATGTA TTTAGAAAAA
2501  TAAACAAATA GGGGTTCCGC GCACATTTCC CCGAAAAGTG CCACCTGACG
2551  TCTAAGAAAC CATTATTATC ATGACATTAA CCTATAAAAA TAGGCGTATC
2601  ACGAGGCCCT TTCGTCTTCA AGAATTCAGC TTGGCTGCAG TGAATAATAA
2651  AATGTGTGTT TGTCCGAAAT ACGCGTTTTG AGATTTCTGT CGCCGACTAA
2701  ATTCATGTCG CGCGATAGTG GTGTTTATCG CCGATAGAGA TGGCGATATT
2751  GGAAAAATCG ATATTTGAAA ATATGGCATA TTGAAAATGT CGCCGATGTG
2801  AGTTTCTGTG TAACTGATAT CGCCATTTTT CCAAAAGTGA TTTTTGGGCA
2851  TACGCGATAT CTGGCGATAG CGCTTATATC GTTTACGGGG GATGGCGATA
2901  GACGACTTTG GTGACTTGGG CGATTCTGTG TGTCGCAAAT ATCGCAGTTT
2951  CGATATAGGT GACAGACGAT ATGAGGCTAT ATCGCCGATA GAGGCGACAT
3001  CAAGCTGGCA CATGGCCAAT GCATATCGAT CTATACATTG AATCAATATT
3051  GGCCATTAGC CATATTATTC ATTGGTTATA TAGCATAAAT CAATATTGGC
3101  TATTGGCCAT TGCATACGTT GTATCCATAT CATAATATGT ACATTTATAT
3151  TGGCTCATGT CCAACATTAC CGCCATGTTG ACATTGATTA TTGACTAGTT
3201  ATTAATAGTA ATCAATTACG GGGTCATTAG TTCATAGCCC ATATATGGAG
3251  TTCCGCGTTA CATAACTTAC GGTAAATGGC CCGCCTGGCT GACCGCCCAA
3301  CGACCCCCGC CCATTGACGT CAATAATGAC GTATGTTCCC ATAGTAACGC
3351  CAATAGGGAC TTTCCATTGA CGTCAATGGG TGGAGTATTT ACGGTAAACT
3401  GCCCACTTGG CAGTACATCA AGTGTATCAT ATGCCAAGTA CGCCCCCTAT
3451  TGACGTCAAT GACGGTAAAT GGCCCGCCTG GCATTATGCC CAGTACATGA
3501  CCTTATGGGA CTTTCCTACT TGGCAGTACA TCTACGTATT AGTCATCGCT
3551  ATTACCATGG TGATGCGGTT TTGGCAGTAC ATCAATGGGC GTGGATAGCG
3601  GTTTGACTCA CGGGGATTTC CAAGTCTCCA CCCCATTGAC GTCAATGGGA
3651  GTTTGTTTTG GCACCAAAAT CAACGGGACT TTCCAAAATG TCGTAACAAC
3701  TCCGCCCCAT TGACGCAAAT GGGCGGTAGG CGTGTACGGT GGGAGGTCTA
3751  TATAAGCAGA GCTCGTTTAG TGAACCGTCA GATCGCCTGG AGACGCCATC
3801  CACGCTGTTT TGACCTCCAT AGAAGACACC GGGACCGATC CAGCCTCCGC
3851  AAGCTTGATA TCGAATTCCT GCAGCCCGGG GGATCCGCCC GCTTGCCGCC
3901  ACCATGGAGA CCCCCGCCCA GCTGCTGTTC CTGCTGCTGC TGTGGCTGCC
3951  CGACACCACC GGCGACATTC TGCTGACCCA GTCTCCAGCC ACCCTGTCTC
4001  TGAGTCCAGG AGAAAGAGCC ACTCTCTCCT GCAGGGCCAG TCAGAACATT
4051  GGCACAAGCA TACAGTGGTA TCAACAAAAA CCAGGTCAGG CTCCAAGGCT
4101  TCTCATAAGG TCTTCTTCTG AGTCTATCTC TGGGATCCCT TCCAGGTTTA
4151  GTGGCAGTGG ATCAGGGACA GATTTTACTC TTACCATCAG CAGTCTGGAG
4201  CCTGAAGATT TTGCAGTGTA TTACTGTCAA CAAAGTAATA CCTGGCCATT
4251  CACGTTCGGC CAGGGGACCA AGCTGGAGAT CAAACGTGAG TATTCTAGAA
4301  AGATCCTAGA ATTCTAAACT CTGAGGGGGT CGGATGACGT GGCCATTCTT
4351  TGCCTAAAGC ATTGAGTTTA CTGCAAGGTC AGAAAAGCAT GCAAAGCCCT
4401  CAGAATGGCT GCAAAGAGCT CCAACAAAAC AATTTAGAAC TTTATTAAGG
4451  AATAGGGGGA AGCTAGGAAG AAACTCAAAA CATCAAGATT TTAAATACGC
4501  TTCTTGGTCT CCTTGCTATA ATTATCTGGG ATAAGCATGC TGTTTTCTGT
4551  CTGTCCCTAA CATGCCCTGT GATTATCCGC AAACAACACA CCCAAGGGCA
4601  GAACTTTGTT ACTTAAACAC CATCCTGTTT GCTTCTTTCC TCAGGAACTG
4651  TGGCTGCACC ATCTGTCTTC ATCTTCCCGC CATCTGATGA GCAGTTGAAA
4701  TCTGGAACTG CCTCTGTTGT GTGCCTGCTG AATAACTTCT ATCCCAGAGA
4751  GGCCAAAGTA CAGTGGAAGG TGGATAACGC CCTCCAATCG GGTAACTCCC
4801  AGGAGAGTGT CACAGAGCAG GACAGCAAGG ACAGCACCTA CAGCCTCAGC
4851  AGCACCCTGA CGCTGAGCAA AGCAGACTAC GAGAAACACA AAGTCTACGC
4901  CTGCGAAGTC ACCCATCAGG GCCTGAGCTC GCCCGTCACA AAGAGCTTCA
4951  ACAGGGGAGA GTGTTAGAGG GAGAAGTGCC CCCACCTGCT CCTCAGTTCC
5001  AGCCTGACCC CCTCCCATCC TTTGGCCTCT GACCCTTTTT CCACAGGGGA
5051  CCTACCCCTA TTGCGGTCCT CCAGCTCATC TTTCACCTCA CCCCCCTCCT
5101  CCTCCTTGGC TTTAATTATG CTAATGTTGG AGGAGAATGA ATAAATAAAG
5151  TGAATCTTTG CACCTGTGGT TTCTCTCTTT CCTCATTTAA TAATTATTAT
5201  CTGTTGTTTA CCAACTACTC AATTTCTCTT ATAAGGGACT AAATATGTAG
5251  TCATCCTAAG GCGCATAACC ATTTATAAAA ATCATCCTTC ATTCTATTTT
5301  ACCCTATCAT CCTCTGCAAG ACAGTCCTCC CTCAAACCCA CAAGCCTTCT
5351  GTCCTCACAG TCCCCTGGGC CATGGTAGGA GAGACTTGCT TCCTTGTTTT
5401  CCCCTCCTCA GCAAGCCCTC ATAGTCCTTT TTAAGGGTGA CAGGTCTTAC
5451  AGTCATATAT CCTTTGATTC AATTCCCTGA GAATCAACCA AAGCAAATTT
5501  TTCAAAAGAA GAAACCTGCT ATAAAGAGAA TCATTCATTG CAACATGATA
5551  TAAAATAACA ACACAATAAA AGCAATTAAA TAAACAAACA ATAGGGAAAT
5601  GTTTAAGTTC ATCATGGTAC TTAGACTTAA TGGAATGTCA TGCCTTATTT
5651  ACATTTTTAA ACAGGTACTG AGGGACTCCT GTCTGCCAAG GGCCGTATTG
5701  AGTACTTTCC ACAACCTAAT TTAATCCACA CTATACTGTG AGATTAAAAA
5751  CATTCATTAA AATGTTGCAA AGGTTCTATA AAGCTGAGAG ACAAATATAT
5801  TCTATAACTC AGCAATCCCA CTTCTAGATG ACTGAGTGTC CCCACCCACC
5851  AAAAAACTAT GCAAGAATGT TCAAAGCAGC TTTATTTACA AAAGCCAAAA
5901  ATTGGAAATA GCCCGATTGT CCAACAATAG AATGAGTTAT TAAACTGTGG
5951  TATGTTTATA CATTAGAATA CCCAATGAGG AGAATTAACA AGCTACAACT
6001  ATACCTACTC ACACAGATGA ATCTCATAAA AATAATGTTA CATAAGAGAA
6051  ACTCAATGCA AAAGATATGT TCTGTATGTT TTCATCCATA TAAAGTTCAA
6101  AACCAGGTAA AAATAAAGTT AGAAATTTGG ATGGAAATTA CTCTTAGCTG
6151  GGGGTGGGCG AGTTAGTGCC TGGGAGAAGA CAAGAAGGGG CTTCTGGGGT
6201  CTTGGTAATG TTCTGTTCCT CGTGTGGGGT TGTGCAGTTA TGATCTGTGC
6251  ACTGTTCTGT ATACACATTA TGCTTCAAAA TAACTTCACA TAAAGAACAT
6301  CTTATACCCA GTTAATAGAT AGAAGAGGAA TAAGTAATAG GTCAAGACCA
6351  CGCAGCTGGT AAGTGGGGGG GCCTGGGATC AAATAGCTAC CTGCCTAATC
6401  CTGCCCTCTT GAGCCCTGAA TGAGTCTGCC TTCCAGGGCT CAAGGTGCTC
6451  AACAAAACAA CAGGCCTGCT ATTTTCCTGG CATCTGTGCC CTGTTTGGCT
6501  AGCTAGGAGC ACACATACAT AGAAATTAAA TGAAACAGAC CTTCAGCAAG
6551  GGGACAGAGG ACAGAATTAA CCTTGCCCAG ACACTGGAAA CCCATGTATG
6601  AACACTCACA TGTTTGGGAA GGGGGAAGGG CACATGTAAA TGAGGACTCT
6651  TCCTCATTCT ATGGGGCACT CTGGCCCTGC CCCTCTCAGC TACTCATCCA
6701  TCCAACACAC CTTTCTAAGT ACCTCTCTCT GCCTACACTC TGAAGGGGTT
6751  CAGGAGTAAC TAACACAGCA TCCCTTCCCT CAAATGACTG ACAATCCCTT
6801  TGTCCTGCTT TGTTTTTCTT TCCAGTCAGT ACTGGGAAAG TGGGGAAGGA
6851  CAGTCATGGA GAAACTACAT AAGGAAGCAC CTTGCCCTTC TGCCTCTTGA
6901  GAATGTTGAT GAGTATCAAA TCTTTCAAAC TTTGGAGGTT TGAGTAGGGG
6951  TGAGACTCAG TAATGTCCCT TCCAATGACA TGAACTTGCT CACTCATCCC
7001  TGGGGGCCAA ATTGAACAAT CAAAGGCAGG CATAATCCAG CTATGAATTC
7051  TAGGATCGAT CCAGACATGA TAAGATACAT TGATGAGTTT GGACAAACCA
7101  CAACTAGAAT GCAGTGAAAA AAATGCTTTA TTTGTGAAAT TTGTGATGCT
7151  ATTGCTTTAT TTGTAACCAT TATAAGCTGC AATAAACAAG TTAACAACAA
7201  CAATTGCATT CATTTTATGT TTCAGGTTCA GGGGGAGGTG TGGGAGGTTT
7251  TTTAAAGCAA GTAAAACCTC TACAAATGTG GTATGGCTGA TTATGATCTC
7301  TAGTCAAGGC ACTATACATC AAATATTCCT TATTAACCCC TTTACAAATT
7351  AAAAAGCTAA AGGTACACAA TTTTTGAGCA TAGTTATTAA TAGCAGACAC
7401  TCTATGCCTG TGTGGAGTAA GAAAAAACAG TATGTTATGA TTATAACTGT
7451  TATGCCTACT TATAAAGGTT ACAGAATATT TTTCCATAAT TTTCTTGTAT
7501  AGCAGTGCAG CTTTTTCCTT TGTGGTGTAA ATAGCAAAGC AAGCAAGAGT
7551  TCTATTACTA AACACAGCAT GACTCAAAAA ACTTAGCAAT TCTGAAGGAA
7601  AGTCCTTGGG GTCTTCTACC TTTCTCTTCT TTTTTGGAGG AGTAGAATGT
7651  TGAGAGTCAG CAGTAGCCTC ATCATCACTA GATGGCATTT CTTCTGAGCA
7701  AAACAGGTTT TCCTCATTAA AGGCATTCCA CCACTGCTCC CATTCATCAG
7751  TTCCATAGGT TGGAATCTAA AATACACAAA CAATTAGAAT CAGTAGTTTA
7801  ACACATTATA CACTTAAAAA TTTTATATTT ACCTTAGAGC TTTAAATCTC
7851  TGTAGGTAGT TTGTCCAATT ATGTCACACC ACAGAAGTAA GGTTCCTTCA
7901  CAAAGATCCG GGACCAAAGC GGCCATCGTG CCTCCCCACT CCTGCAGTTC
7951  GGGGGCATGG ATGCGCGGAT AGCCGCTGCT GGTTTCCTGG ATGCCGACGG
8001  ATTTGCACTG CCGGTAGAAC TCCGCGAGGT CGTCCAGCCT CAGGCAGCAG
8051  CTGAACCAAC TCGCGAGGGG ATCGAGCCCG GGGTGGGCGA AGAACTCCAG
8101  CATGAGATCC CCGCGCTGGA GGATCATCCA GCCGGCGTCC CGGAAAACGA
8151  TTCCGAAGCC CAACCTTTCA TAGAAGGCGG CGGTGGAATC GAAATCTCGT
8201  GATGGCAGGT TGGGCGTCGC TTGGTCGGTC ATTTCGAACC CCAGAGTCCC
8251  GCTCAGAAGA ACTCGTCAAG AAGGCGATAG AAGGCGATGC GCTGCGAATC
8301  GGGAGCGGCG ATACCGTAAA GCACGAGGAA GCGGTCAGCC CATTCGCCGC
8351  CAAGCTCTTC AGCAATATCA CGGGTAGCCA ACGCTATGTC CTGATAGCGG
8401  TCCGCCACAC CCAGCCGGCC ACAGTCGATG AATCCAGAAA AGCGGCCATT
8451  TTCCACCATG ATATTCGGCA AGCAGGCATC GCCATGGGTC ACGACGAGAT
8501  CCTCGCCGTC GGGCATGCGC GCCTTGAGCC TGGCGAACAG TTCGGCTGGC
8551  GCGAGCCCCT GATGCTCTTC GTCCAGATCA TCCTGATCGA CAAGACCGGC
8601  TTCCATCCGA GTACGTGCTC GCTCGATGCG ATGTTTCGCT TGGTGGTCGA
8651  ATGGGCAGGT AGCCGGATCA AGCGTATGCA GCCGCCGCAT TGCATCAGCC
8701  ATGATGGATA CTTTCTCGGC AGGAGCAAGG TGAGATGACA GGAGATCCTG
8751  CCCCGGCACT TCGCCCAATA GCAGCCAGTC CCTTCCCGCT TCAGTGACAA
8801  CGTCGAGCAC AGCTGCGCAA GGAACGCCCG TCGTGGCCAG CCACGATAGC
8851  CGCGCTGCCT CGTCCTGCAG TTCATTCAGG GCACCGGACA GGTCGGTCTT
8901  GACAAAAAGA ACCGGGCGCC CCTGCGCTGA CAGCCGGAAC ACGGCGGCAT
8951  CAGAGCAGCC GATTGTCTGT TGTGCCCAGT CATAGCCGAA TAGCCTCTCC
9001  ACCCAAGCGG CCGGAGAACC TGCGTGCAAT CCATCTTGTT CAATCATGCG
9051  AAACGATCCT CATCCTGTCT CTTGATCAGA TCTTGATCCC CTGCGCCATC
9101  AGATCCTTGG CGGCAAGAAA GCCATCCAGT TTACTTTGCA GGGCTTCCCA
9151  ACCTTACCAG AGGGCGCCCC AGCTGGCAAT TCCGGTTCGC TTGCTGTCCA
9201  TAAAACCGCC CAGTCTAGCT ATCGCCATGT AAGCCCACTG CAAGCTACCT
9251  GCTTTCTCTT TGCGCTTGCG TTTTCCCTTG TCCAGATAGC CCAGTAGCTG
9301  ACATTCATCC GGGGTCAGCA CCGTTTCTGC GGACTGGCTT TCTACGTGTT
9351  CCGCTTCCTT TAGCAGCCCT TGCGCCCTGA GTGCTTGCGG CAGCGTGAAG
SEQ ID NO：18
表达载体HCMV-K HuAb-VL1hum V2的核苷酸序列
(从3926-4246包含SEQ ID NO：13(humV2＝VLm)的人源化轻链表达载体的完整DNA序列)
   1  CTAGCTTTTT GCAAAAGCCT AGGCCTCCAA AAAAGCCTCC TCACTACTTC
  51  TGGAATAGCT CAGAGGCCGA GGCGGCCTCG GCCTCTGCAT AAATAAAAAA
 101  AATTAGTCAG CCATGGGGCG GAGAATGGGC GGAACTGGGC GGAGTTAGGG
 151  GCGGGATGGG CGGAGTTAGG GGCGGGACTA TGGTTGCTGA CTAATTGAGA
 201  TGCATGCTTT GCATACTTCT GCCTGCTGGG GAGCCTGGTT GCTGACTAAT
 251  TGAGATGCAT GCTTTGCATA CTTCTGCCTG CTGGGGAGCC TGGGGACTTT
 301  CCACACCCTA ACTGACACAC ATTCCACAGC TGCCTCGCGC GTTTCGGTGA
 351  TGACGGTGAA AACCTCTGAC ACATGCAGCT CCCGGAGACG GTCACAGCTT
 401  GTCTGTAAGC GGATGCCGGG AGCAGACAAG CCCGTCAGGG CGCGTCAGCG
 451  GGTGTTGGCG GGTGTCGGGG CGCAGCCATG ACCCAGTCAC GTAGCGATAG
 501  CGGAGTGTAT ACTGGCTTAA CTATGCGGCA TCAGAGCAGA TTGTACTGAG
 551  AGTGCACCAT ATGCGGTGTG AAATACCGCA CAGATGCGTA AGGAGAAAAT
 601  ACCGCATCAG GCGCTCTTCC GCTTCCTCGC TCACTGACTC GCTGCGCTCG
 651  GTCGTTCGGC TGCGGCGAGC GGTATCAGCT CACTCAAAGG CGGTAATACG
 701  GTTATCCACA GAATCAGGGG ATAACGCAGG AAAGAACATG TGAGCAAAAG
 751  GCCAGCAAAA GGCCAGGAAC CGTAAAAAGG CCGCGTTGCT GGCGTTTTTC
 801  CATAGGCTCC GCCCCCCTGA CGAGCATCAC AAAAATCGAC GCTCAAGTCA
 851  GAGGTGGCGA AACCCGACAG GACTATAAAG ATACCAGGCG TTTCCCCCTG
 901  GAAGCTCCCT CGTGCGCTCT CCTGTTCCGA CCCTGCCGCT TACCGGATAC
 951  CTGTCCGCCT TTCTCCCTTC GGGAAGCGTG GCGCTTTCTC ATAGCTCACG
1001  CTGTAGGTAT CTCAGTTCGG TGTAGGTCGT TCGCTCCAAG CTGGGCTGTG
1051  TGCACGAACC CCCCGTTCAG CCCGACCGCT GCGCCTTATC CGGTAACTAT
1101  CGTCTTGAGT CCAACCCGGT AAGACACGAC TTATCGCCAC TGGCAGCAGC
1151  CACTGGTAAC AGGATTAGCA GAGCGAGGTA TGTAGGCGGT GCTACAGAGT
1201  TCTTGAAGTG GTGGCCTAAC TACGGCTACA CTAGAAGGAC AGTATTTGGT
1251  ATCTGCGCTC TGCTGAAGCC AGTTACCTTC GGAAAAAGAG TTGGTAGCTC
1301  TTGATCCGGC AAACAAACCA CCGCTGGTAG CGGTGGTTTT TTTGTTTGCA
1351  AGCAGCAGAT TACGCGCAGA AAAAAAGGAT CTCAAGAAGA TCCTTTGATC
1401  TTTTCTACGG GGTCTGACGC TCAGTGGAAC GAAAACTCAC GTTAAGGGAT
1451  TTTGGTCATG AGATTATCAA AAAGGATCTT CACCTAGATC CTTTTAAATT
1501  AAAAATGAAG TTTTAAATCA ATCTAAAGTA TATATGAGTA AACTTGGTCT
1551  GACAGTTACC AATGCTTAAT CAGTGAGGCA CCTATCTCAG CGATCTGTCT
1601  ATTTCGTTCA TCCATAGTTG CCTGACTCCC CGTCGTGTAG ATAACTACGA
1651  TACGGGAGGG CTTACCATCT GGCCCCAGTG CTGCAATGAT ACCGCGAGAC
1701  CCACGCTCAC CGGCTCCAGA TTTATCAGCA ATAAACCAGC CAGCCGGAAG
1751  GGCCGAGCGC AGAAGTGGTC CTGCAACTTT ATCCGCCTCC ATCCAGTCTA
1801  TTAATTGTTG CCGGGAAGCT AGAGTAAGTA GTTCGCCAGT TAATAGTTTG
1851  CGCAACGTTG TTGCCATTGC TGCAGGCATC GTGGTGTCAC GCTCGTCGTT
1901  TGGTATGGCT TCATTCAGCT CCGGTTCCCA ACGATCAAGG CGAGTTACAT
1951  GATCCCCCAT GTTGTGCAAA AAAGCGGTTA GCTCCTTCGG TCCTCCGATC
2001  GTTGTCAGAA GTAAGTTGGC CGCAGTGTTA TCACTCATGG TTATGGCAGC
2051  ACTGCATAAT TCTCTTACTG TCATGCCATC CGTAAGATGC TTTTCTGTGA
2101  CTGGTGAGTA CTCAACCAAG TCATTCTGAG AATAGTGTAT GCGGCGACCG
2151  AGTTGCTCTT GCCCGGCGTC AACACGGGAT AATACCGCGC CACATAGCAG
2201  AACTTTAAAA GTGCTCATCA TTGGAAAACG TTCTTCGGGG CGAAAACTCT
2251  CAAGGATCTT ACCGCTGTTG AGATCCAGTT CGATGTAACC CACTCGTGCA
2301  CCCAACTGAT CTTCAGCATC TTTTACTTTC ACCAGCGTTT CTGGGTGAGC
2351  AAAAACAGGA AGGCAAAATG CCGCAAAAAA GGGAATAAGG GCGACACGGA
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2751  GGAAAAATCG ATATTTGAAA ATATGGCATA TTGAAAATGT CGCCGATGTG
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2951  CGATATAGGT GACAGACGAT ATGAGGCTAT ATCGCCGATA GAGGCGACAT
3001  CAAGCTGGCA CATGGCCAAT GCATATCGAT CTATACATTG AATCAATATT
3051  GGCCATTAGC CATATTATTC ATTGGTTATA TAGCATAAAT CAATATTGGC
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3151  TGGCTCATGT CCAACATTAC CGCCATGTTG ACATTGATTA TTGACTAGTT
3201  ATTAATAGTA ATCAATTACG GGGTCATTAG TTCATAGCCC ATATATGGAG
3251  TTCCGCGTTA CATAACTTAC GGTAAATGGC CCGCCTGGCT GACCGCCCAA
3301  CGACCCCCGC CCATTGACGT CAATAATGAC GTATGTTCCC ATAGTAACGC
3351  CAATAGGGAC TTTCCATTGA CGTCAATGGG TGGAGTATTT ACGGTAAACT
3401  GCCCACTTGG CAGTACATCA AGTGTATCAT ATGCCAAGTA CGCCCCCTAT
3451  TGACGTCAAT GACGGTAAAT GGCCCGCCTG GCATTATGCC CAGTACATGA
3501  CCTTATGGGA CTTTCCTACT TGGCAGTACA TCTACGTATT AGTCATCGCT
3551  ATTACCATGG TGATGCGGTT TTGGCAGTAC ATCAATGGGC GTGGATAGCG
3601  GTTTGACTCA CGGGGATTTC CAAGTCTCCA CCCCATTGAC GTCAATGGGA
3651  GTTTGTTTTG GCACCAAAAT CAACGGGACT TTCCAAAATG TCGTAACAAC
3701  TCCGCCCCAT TGACGCAAAT GGGCGGTAGG CGTGTACGGT GGGAGGTCTA
3751  TATAAGCAGA GCTCGTTTAG TGAACCGTCA GATCGCCTGG AGACGCCATC
3801  CACGCTGTTT TGACCTCCAT AGAAGACACC GGGACCGATC CAGCCTCCGC
3851  AAGCTTGCCG CCACCATGGA GACCCCCGCC CAGCTGCTGT TCCTGCTGCT
3901  GCTGTGGCTG CCCGACACCA CCGGCGACAT TCTGCTGACC CAGTCTCCAG
3951  CCACCCTGTC TCTGAGTCCA GGAGAAAGAG CCACTTTCTC CTGCAGGGCC
4001  AGTCAGAACA TTGGCACAAG CATACAGTGG TATCAACAAA AAACAAATGG
4051  TGCTCCAAGG CTTCTCATAA GGTCTTCTTC TGAGTCTATC TCTGGGATCC
4101  CTTCCAGGTT TAGTGGCAGT GGATCAGGGA CAGATTTTAC TCTTACCATC
4151  AGCAGTCTGG AGCCTGAAGA TTTTGCAGTG TATTACTGTC AACAAAGTAA
4201  TACCTGGCCA TTCACGTTCG GCCAGGGGAC CAAGCTGGAG ATCAAACGTG
4251  AGTATTCTAG AAAGATCCTA GAATTCTAAA CTCTGAGGGG GTCGGATGAC
4301  GTGGCCATTC TTTGCCTAAA GCATTGAGTT TACTGCAAGG TCAGAAAAGC
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4451  TTTTAAATAC GCTTCTTGGT CTCCTTGCTA TAATTATCTG GGATAAGCAT
4501  GCTGTTTTCT GTCTGTCCCT AACATGCCCT GTGATTATCC GCAAACAACA
4551  CACCCAAGGG CAGAACTTTG TTACTTAAAC ACCATCCTGT TTGCTTCTTT
4601  CCTCAGGAAC TGTGGCTGCA CCATCTGTCT TCATCTTCCC GCCATCTGAT
4651  GAGCAGTTGA AATCTGGAAC TGCCTCTGTT GTGTGCCTGC TGAATAACTT
4701  CTATCCCAGA GAGGCCAAAG TACAGTGGAA GGTGGATAAC GCCCTCCAAT
4751  CGGGTAACTC CCAGGAGAGT GTCACAGAGC AGGACAGCAA GGACAGCACC
4801  TACAGCCTCA GCAGCACCCT GACGCTGAGC AAAGCAGACT ACGAGAAACA
4851  CAAAGTCTAC GCCTGCGAAG TCACCCATCA GGGCCTGAGC TCGCCCGTCA
4901  CAAAGAGCTT CAACAGGGGA GAGTGTTAGA GGGAGAAGTG CCCCCACCTG
4951  CTCCTCAGTT CCAGCCTGAC CCCCTCCCAT CCTTTGGCCT CTGACCCTTT
5001  TTCCACAGGG GACCTACCCC TATTGCGGTC CTCCAGCTCA TCTTTCACCT
5051  CACCCCCCTC CTCCTCCTTG GCTTTAATTA TGCTAATGTT GGAGGAGAAT
5101  GAATAAATAA AGTGAATCTT TGCACCTGTG GTTTCTCTCT TTCCTCATTT
5151  AATAATTATT ATCTGTTGTT TACCAACTAC TCAATTTCTC TTATAAGGGA
5201  CTAAATATGT AGTCATCCTA AGGCGCATAA CCATTTATAA AAATCATCCT
5251  TCATTCTATT TTACCCTATC ATCCTCTGCA AGACAGTCCT CCCTCAAACC
5301  CACAAGCCTT CTGTCCTCAC AGTCCCCTGG GCCATGGTAG GAGAGACTTG
5351  CTTCCTTGTT TTCCCCTCCT CAGCAAGCCC TCATAGTCCT TTTTAAGGGT
5401  GACAGGTCTT ACAGTCATAT ATCCTTTGAT TCAATTCCCT GAGAATCAAC
5451  CAAAGCAAAT TTTTCAAAAG AAGAAACCTG CTATAAAGAG AATCATTCAT
5501  TGCAACATGA TATAAAATAA CAACACAATA AAAGCAATTA AATAAACAAA
5551  CAATAGGGAA ATGTTTAAGT TCATCATGGT ACTTAGACTT AATGGAATGT
5601  CATGCCTTAT TTACATTTTT AAACAGGTAC TGAGGGACTC CTGTCTGCCA
5651  AGGGCCGTAT TGAGTACTTT CCACAACCTA ATTTAATCCA CACTATACTG
5701  TGAGATTAAA AACATTCATT AAAATGTTGC AAAGGTTCTA TAAAGCTGAG
5751  AGACAAATAT ATTCTATAAC TCAGCAATCC CACTTCTAGA TGACTGAGTG
5801  TCCCCACCCA CCAAAAAACT ATGCAAGAAT GTTCAAAGCA GCTTTATTTA
5851  CAAAAGCCAA AAATTGGAAA TAGCCCGATT GTCCAACAAT AGAATGAGTT
5901  ATTAAACTGT GGTATGTTTA TACATTAGAA TACCCAATGA GGAGAATTAA
5951  CAAGCTACAA CTATACCTAC TCACACAGAT GAATCTCATA AAAATAATGT
6001  TACATAAGAG AAACTCAATG CAAAAGATAT GTTCTGTATG TTTTCATCCA
6051  TATAAAGTTC AAAACCAGGT AAAAATAAAG TTAGAAATTT GGATGGAAAT
6101  TACTCTTAGC TGGGGGTGGG CGAGTTAGTG CCTGGGAGAA GACAAGAAGG
6151  GGCTTCTGGG GTCTTGGTAA TGTTCTGTTC CTCGTGTGGG GTTGTGCAGT
6201  TATGATCTGT GCACTGTTCT GTATACACAT TATGCTTCAA AATAACTTCA
6251  CATAAAGAAC ATCTTATACC CAGTTAATAG ATAGAAGAGG AATAAGTAAT
6301  AGGTCAAGAC CACGCAGCTG GTAAGTGGGG GGGCCTGGGA TCAAATAGCT
6351  ACCTGCCTAA TCCTGCCCTC TTGAGCCCTG AATGAGTCTG CCTTCCAGGG
6401  CTCAAGGTGC TCAACAAAAC AACAGGCCTG CTATTTTCCT GGCATCTGTG
6451  CCCTGTTTGG CTAGCTAGGA GCACACATAC ATAGAAATTA AATGAAACAG
6501  ACCTTCAGCA AGGGGACAGA GGACAGAATT AACCTTGCCC AGACACTGGA
6551  AACCCATGTA TGAACACTCA CATGTTTGGG AAGGGGGAAG GGCACATGTA
6601  AATGAGGACT CTTCCTCATT CTATGGGGCA CTCTGGCCCT GCCCCTCTCA
6651  GCTACTCATC CATCCAACAC ACCTTTCTAA GTACCTCTCT CTGCCTACAC
6701  TCTGAAGGGG TTCAGGAGTA ACTAACACAG CATCCCTTCC CTCAAATGAC
6751  TGACAATCCC TTTGTCCTGC TTTGTTTTTC TTTCCAGTCA GTACTGGGAA
6801  AGTGGGGAAG GACAGTCATG GAGAAACTAC ATAAGGAAGC ACCTTGCCCT
6851  TCTGCCTCTT GAGAATGTTG ATGAGTATCA AATCTTTCAA ACTTTGGAGG
6901  TTTGAGTAGG GGTGAGACTC AGTAATGTCC CTTCCAATGA CATGAACTTG
6951  CTCACTCATC CCTGGGGGCC AAATTGAACA ATCAAAGGCA GGCATAATCC
7001  AGCTATGAAT TCTAGGATCG ATCCAGACAT GATAAGATAC ATTGATGAGT
7051  TTGGACAAAC CACAACTAGA ATGCAGTGAA AAAAATGCTT TATTTGTGAA
7101  ATTTGTGATG CTATTGCTTT ATTTGTAACC ATTATAAGCT GCAATAAACA
7151  AGTTAACAAC AACAATTGCA TTCATTTTAT GTTTCAGGTT CAGGGGGAGG
7201  TGTGGGAGGT TTTTTAAAGC AAGTAAAACC TCTACAAATG TGGTATGGCT
7251  GATTATGATC TCTAGTCAAG GCACTATACA TCAAATATTC CTTATTAACC
7301  CCTTTACAAA TTAAAAAGCT AAAGGTACAC AATTTTTGAG CATAGTTATT
7351  AATAGCAGAC ACTCTATGCC TGTGTGGAGT AAGAAAAAAC AGTATGTTAT
7401  GATTATAACT GTTATGCCTA CTTATAAAGG TTACAGAATA TTTTTCCATA
7451  ATTTTCTTGT ATAGCAGTGC AGCTTTTTCC TTTGTGGTGT AAATAGCAAA
7501  GCAAGCAAGA GTTCTATTAC TAAACACAGC ATGACTCAAA AAACTTAGCA
7551  ATTCTGAAGG AAAGTCCTTG GGGTCTTCTA CCTTTCTCTT CTTTTTTGGA
7601  GGAGTAGAAT GTTGAGAGTC AGCAGTAGCC TCATCATCAC TAGATGGCAT
7651  TTCTTCTGAG CAAAACAGGT TTTCCTCATT AAAGGCATTC CACCACTGCT
7701  CCCATTCATC AGTTCCATAG GTTGGAATCT AAAATACACA AACAATTAGA
7751  ATCAGTAGTT TAACACATTA TACACTTAAA AATTTTATAT TTACCTTAGA
7801  GCTTTAAATC TCTGTAGGTA GTTTGTCCAA TTATGTCACA CCACAGAAGT
7851  AAGGTTCCTT CACAAAGATC CGGGACCAAA GCGGCCATCG TGCCTCCCCA
7901  CTCCTGCAGT TCGGGGGCAT GGATGCGCGG ATAGCCGCTG CTGGTTTCCT
7951  GGATGCCGAC GGATTTGCAC TGCCGGTAGA ACTCCGCGAG GTCGTCCAGC
8001  CTCAGGCAGC AGCTGAACCA ACTCGCGAGG GGATCGAGCC CGGGGTGGGC
8051  GAAGAACTCC AGCATGAGAT CCCCGCGCTG GAGGATCATC CAGCCGGCGT
8101  CCCGGAAAAC GATTCCGAAG CCCAACCTTT CATAGAAGGC GGCGGTGGAA
8151  TCGAAATCTC GTGATGGCAG GTTGGGCGTC GCTTGGTCGG TCATTTCGAA
8201  CCCCAGAGTC CCGCTCAGAA GAACTCGTCA AGAAGGCGAT AGAAGGCGAT
8251  GCGCTGCGAA TCGGGAGCGG CGATACCGTA AAGCACGAGG AAGCGGTCAG
8301  CCCATTCGCC GCCAAGCTCT TCAGCAATAT CACGGGTAGC CAACGCTATG
8351  TCCTGATAGC GGTCCGCCAC ACCCAGCCGG CCACAGTCGA TGAATCCAGA
8401  AAAGCGGCCA TTTTCCACCA TGATATTCGG CAAGCAGGCA TCGCCATGGG
8451  TCACGACGAG ATCCTCGCCG TCGGGCATGC GCGCCTTGAG CCTGGCGAAC
8501  AGTTCGGCTG GCGCGAGCCC CTGATGCTCT TCGTCCAGAT CATCCTGATC
8551  GACAAGACCG GCTTCCATCC GAGTACGTGC TCGCTCGATG CGATGTTTCG
8601  CTTGGTGGTC GAATGGGCAG GTAGCCGGAT CAAGCGTATG CAGCCGCCGC
8651  ATTGCATCAG CCATGATGGA TACTTTCTCG GCAGGAGCAA GGTGAGATGA
8701  CAGGAGATCC TGCCCCGGCA CTTCGCCCAA TAGCAGCCAG TCCCTTCCCG
8751  CTTCAGTGAC AACGTCGAGC ACAGCTGCGC AAGGAACGCC CGTCGTGGCC
8801  AGCCACGATA GCCGCGCTGC CTCGTCCTGC AGTTCATTCA GGGCACCGGA
8851  CAGGTCGGTC TTGACAAAAA GAACCGGGCG CCCCTGCGCT GACAGCCGGA
8901  ACACGGCGGC ATCAGAGCAG CCGATTGTCT GTTGTGCCCA GTCATAGCCG
8951  AATAGCCTCT CCACCCAAGC GGCCGGAGAA CCTGCGTGCA ATCCATCTTG
9001  TTCAATCATG CGAAACGATC CTCATCCTGT CTCTTGATCA GATCTTGATC
9051  CCCTGCGCCA TCAGATCCTT GGCGGCAAGA AAGCCATCCA GTTTACTTTG
9101  CAGGGCTTCC CAACCTTACC AGAGGGCGCC CCAGCTGGCA ATTCCGGTTC
9151  GCTTGCTGTC CATAAAACCG CCCAGTCTAG CTATCGCCAT GTAAGCCCAC
9201  TGCAAGCTAC CTGCTTTCTC TTTGCGCTTG CGTTTTCCCT TGTCCAGATA
9251  GCCCAGTAGC TGACATTCAT CCGGGGTCAG CACCGTTTCT GCGGACTGGC
9301  TTTCTACGTG TTCCGCTTCC TTTAGCAGCC CTTGCGCCCT GAGTGCTTGC
9351  GGCAGCGTGA AG
SEQ ID NO：31：
称作VHE-N73D的人源化重链的部分氨基酸序列
EVQLVESGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT  NYIIHWVKQE PGQGLEWIG Y
FNPYNHGTKY NEKFKGRATL TADKSISTAY MELSSLRSED TAVYYCAR SG
PYAWFDTWGQ GTTVTVSS
SEQ ID NO：32：
称作VHQ-N73D的人源化重链的部分氨基酸序列
QVQLVESGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT  NYIIHWVKQE PGQGLEWIG Y
FNPYNHGTKY NEKFKGRATL TADKSISTAY MELSSLRSED TAVYYCAR SG
PYAWFDTWGQ GTTVTVSS
SEQ ID NO：33：
编码氨基酸序列SEQ ID NO：8的核苷酸序列
GACATTCTGCTGACCCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTCTGAGTCCAGGAGAAAGAGCCA
CTCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAACATTGGCACAAGCATACAGTGGTATCAACAAAAA
CCAGGTCAGGCTCCAAGGCTTCTCATAAGGTCTTCTTCTGAGTCTATCTCTGGGATCCC
TTCCAGGTTTAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTTACTCTTACCATCAGCAGTCTGG
AGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAACAAAGTAATACCTGGCCATTCACGTTC
GGCCAGGGGACCAAGCTTGAAATCAAA
SEQ ID NO：34：
编码氨基酸序列SEQ ID NO：31的核苷酸序列
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCAGGAGCCGAAGTGAAAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAG
GTGTCCTGCAAGGCCTCTGGATACACATTCACTAATTATATTATCCACTGGGTGAAGCA
GGAGCCTGGTCAGGGCCTTGAATGGATTGGATATTTTAATCCTTACAATCATGGTACTA
AGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAGGGCCACACTAACTGCAGACAAATCCATCAGCACA
GCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGCGCTCTGAGGACACTGCGGTCTACTACTGTGCAA
GATCAGGACCCTATGCCTGGTTTGACACCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTC
CTCA
SEQ ID NO：35
编码氨基酸序列SEQ ID NO：32的核苷酸序列
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCAGGAGCCGAAGTGAAAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAG
GTGTCCTGCAAGGCCTCTGGATACACATTCACTAATTATATTATCCACTGGGTGAAGCA
GGAGCCTGGTCAGGGCCTTGAATGGATTGGATATTTTAATCCTTACAATCATGGTACTA
AGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAGGGCCACACTAACTGCAGACAAATCCATCAGCACA
GCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGCGCTCTGAGGACACTGCGGTCTACTACTGTGCAA
GATCAGGACCCTATGCCTGGTTTGACACCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTC
CTCA
SEQ ID No 36
表达载体LCVL1Sp20的核苷酸序列
  1  CTAGAGTCCT AGAGAGGTCT GGTGGAGCCT GCAAAAGTCC AGCTTTCAAA
 51  GGAACACAGA AGTATGTGTA TGGAATATTA GAAGATGTTG CTTTTACTCT
101  TAAGTTGGTT CCTAGGAAAA ATAGTTAAAT ACTGTGACTT TAAAATGTGA
 151  GAGGGTTTTC AAGTACTCAT TTTTTTAAAT GTCCAAAATT TTTGTCAATC
 201  AATTTGAGGT CTTGTTTGTG TAGAACTGAC ATTACTTAAA GTTTAACCGA
 251  GGAATGGGAG TGAGGCTCTC TCATACCCTA TTCAGAACTG ACTTTTAACA
 301  ATAATAAATT AAGTTTAAAA TATTTTTAAA TGAATTGAGC AATGTTGAGT
 351  TGGAGTCAAG ATGGCCGATC AGAACCAGAA CACCTGCAGC AGCTGGCAGG
 401  AAGCAGGTCA TGTGGCAAGG CTATTTGGGG AAGGGAAAAT AAAACCACTA
 451  GGTAAACTTG TAGCTGTGGT TTGAAGAAGT GGTTTTGAAA CACTCTGTCC
 501  AGCCCCACCA AACCGAAAGT CCAGGCTGAG CAAAACACCA CCTGGGTAAT
 551  TTGCATTTCT AAAATAAGTT GAGGATTCAG CCGAAACTGG AGAGGTCCTC
 601  TTTTAACTTA TTGAGTTCAA CCTTTTAATT TTAGCTTGAG TAGTTCTAGT
 651  TTCCCCAAAC TTAAGTTTAT CGACTTCTAA AATGTATTTA GAACTCATTT
 701  TCAAAATTAG GTTATGTAAG AAATTGAAGG ACTTTAGTGT CTTTAATTTC
 751  TAATATATTT AGAAAACTTC TTAAAATTAC TCTATTATTC TTCCCTCTGA
 801  TTATTGGTCT CCATTCAATT CTTTTCCAAT ACCCGAAGCA TTTACAGTGA
 851  CTTTGTTCAT GATCTTTTTT AGTTGTTTGT TTTGCCTTAC TATTAAGACT
 901  TTGACATTCT GGTCAAAACG GCTTCACAAA TCTTTTTCAA GACCACTTTC
 951  TGAGTATTCA TTTTAGGAGA AATACTTTTT TTTTAAATGA ATGCAATTAT
1001  CTAGGACCTG CAGGCATGCT GTTTTCTGTC TGTCCCTAAC ATGCCCTGTG
1051  ATTATCCGCA AACAACACAC CCAAGGGCAG AACTTTGTTA CTTAAACACC
1101  ATCCTGTTTG CTTCTTTCCT CAGGAACTGT GGCTGCACCA TCTGTCTTCA
1151  TCTTCCCGCC ATCTGATGAG CAGTTGAAAT CTGGAACTGC CTCTGTTGTG
1201  TGCCTGCTGA ATAACTTCTA TCCCAGAGAG GCCAAAGTAC AGTGGAAGGT
1251  GGATAACGCC CTCCAATCGG GTAACTCCCA GGAGAGTGTC ACAGAGCAGG
1301  ACAGCAAGGA CAGCACCTAC AGCCTCAGCA GCACCCTGAC GCTGAGCAAA
1351  GCAGACTACG AGAAACACAA AGTCTACGCC TGCGAAGTCA CCCATCAGGG
1401  CCTGAGCTCG CCCGTCACAA AGAGCTTCAA CAGGGGAGAG TGTTAGAGGG
1451  AGAAGTGCCC CCACCTGCTC CTCAGTTCCA GCCTGACCCC CTCCCATCCT
1501  TTGGCCTCTG ACCCTTTTTC CACAGGGGAC CTACCCCTAT TGCGGTCCTC
1551  CAGCTCATCT TTCACCTCAC CCCCCTCCTC CTCCTTGGCT TTAATTATGC
1601  TAATGTTGGA GGAGAATGAA TAAATAAAGT GAATCTTTGC ACCTGTGGTT
1651  TCTCTCTTTC CTCATTTAAT AATTATTATC TGTTGTTTTA CCAACTACTC
1701  AATTTCTCTT ATAAGGGACT AAATATGTAG TCATCCTAAG GCGGGATATC
1751  GAGATCTGAA GCTGATCCAG ACATGATAAG ATACATTGAT GAGTTTGGAC
1801  AAACCACAAC TAGAATGCAG TGAAAAAAAT GCTTTATTTG TGAAATTTGT
1851  GATGCTATTG CTTTATTTGT AACCATTATA AGCTGCAATA AACAAGTTAA
1901  CAACAACAAT TGCATTCATT TTATGTTTCA GGTTCAGGGG GAGGTGTGGG
1951  AGGTTTTTTA AAGCAAGTAA AACCTCTACA AATGTGGTAT GGCTGATTAT
2001  GATCTCTAGT CAAGGCACTA TACATCAAAT ATTCCTTATT AACCCCTTTA
2051  CAAATTAAAA AGCTAAAGGT ACACAATTTT TGAGCATAGT TATTAATAGC
2101  AGACACTCTA TGCCTGTGTG GAGTAAGAAA AAACAGTATG TTATGATTAT
2151  AACTGTTATG CCTACTTATA AAGGTTACAG AATATTTTTC CATAATTTTC
2201  TTGTATAGCA GTGCAGCTTT TTCCTTTGTG GTGTAAATAG CAAAGCAAGC
2251  AAGAGTTCTA TTACTAAACA CAGCATGACT CAAAAAACTT AGCAATTCTG
2301  AAGGAAAGTC CTTGGGGTCT TCTACCTTTC TCTTCTTTTT TGGAGGAGTA
2351  GAATGTTGAG AGTCAGCAGT AGCCTCATCA TCACTAGATG GCATTTCTTC
2401  TGAGCAAAAC AGGTTTTCCT CATTAAAGGC ATTCCACCAC TGCTCCCATT
2451  CATCAGTTCC ATAGGTTGGA ATCTAAAATA CACAAACAAT TAGAATCAGT
2501  AGTTTAACAC ATTATACACT TAAAAATTTT ATATTTACCT TAGAGCTTTA
2551  AATCTCTGTA GGTAGTTTGT CCAATTATGT CACACCACAG AAGTAAGGTT
2601  CCTTCACAAA GATCCGGACC AAAGCGGCCA TCGTGCCTCC CCACTCCTGC
2651  AGTTCGGGGG CATGGATGCG CGGATAGCCG CTGCTGGTTT CCTGGATGCC
2701  GACGGATTTG CACTGCCGGT AGAACTCCGC GAGGTCGTCC AGCCTCAGGC
2751  AGCAGCTGAA CCAACTCGCG AGGGGATCGA GCATCCCCCA TGGTCTTATA
2801  AAAATGCATA GCTTTAGGAG GGGAGCAGAG AACTTGAAAG CATCTTCCTG
2851  TTAGTCTTTC TTCTCGTAGA CTTCAAACTT ATACTTGATG CCTTTTTCCT
2901  CCTGGACCTC AGAGAGGACG CCTGGGTATT CTGGGAGAAG TTTATATTTC
2951  CCCAAATCAA TTTCTGGGAA AAACGTGTCA CTTTCAAATT CCTGCATGAT
3001  CCTTGTCACA AAGAGTCTGA GGTGGCCTGG TTGATTCATG GCTTCCTGGT
3051  AAACAGAACT GCCTCCGACT ATCCAAACCA TGTCTACTTT ACTTGCCAAT
3101  TCCGGTTGTT CAATAAGTCT TAAGGCATCA TCCAAACTTT TGGCAAGAAA
3151  ATGAGCTCCT CGTGGTGGTT CTTTGAGTTC TCTACTGAGA ACTATATTAA
3201  TTCTGTCCTT TAAAGGTCGA TTCTTCTCAG GAATGGAGAA CCAGGTTTTC
3251  CTACCCATAA TCACCAGATT CTGTTTACCT TCCACTGAAG AGGTTGTGGT
3301  CATTCTTTGG AAGTACTTGA ACTCGTTCCT GAGCGGAGGC CAGGGTCGGT
3351  CTCCGTTCTT GCCAATCCCC ATATTTTGGG ACACGGCGAC GATGCAGTTC
3401  AATGGTCGAA CCATGATGGC AGCGGGGATA AAATCCTACC AGCCTTCACG
3451  CTAGGATTGC CGTCAAGTTT GGGGGTACCG AGCTCGAATT AGCTTTTTGC
3501  AAAAGCCTAG GCCTC AAAA AAGCCTCCTC ACTACTTCTG GAATAGCTCA
3551  GAGGGCCGAG GCGGCCTCGG CCTCTGCATA AATAAAAAAA ATTAGTCAGC
3601  CATGGGGCGG AGAATGGGCG GAACTGGGCG GAGTTAGGGG CGGGATGGGC
3651  GGAGTTAGGG GCGGGACTAT GGTTGCTGAC TAATTGAGAT GCATGCTTTG
3701  CATACTTCTG CCTGCTGGGG AGCCTGGGGA CTTTCCACAC CTGGTTGCTG
3751  ACTAATTGAG ATGCATGCTT TGCATACTTC TGCCTGCTGG GGAGCCTGGG
3801  GACTTTCCAC ACCCTAACTG ACACACATTC CACAGCTGCC TCGCGCGTTT
3851  CGGTGATGAC GGTGAAAACC TCTGACACAT GCAGCTCCCG GAGACGGTCA
3901  CAGCTTGTCT GTAAGCGGAT GCCGGGAGCA GACAAGCCCG TCAGGGCGCG
3951  TCAGCGGGTG TTGGCGGGTG TCGGGGCGCA GCCATGACCC AGTCACGTAG
4001  CGATAGCGGA GTGTATACTG GCTTAACTAT GCGGCATCAG AGCAGATTGT
4051  ACTGAGAGTG CACCATATGC GGCCGCATAT GCGGTGTGAA ATACCGCACA
4101  GATGCGTAAG GAGAAAATAC CGCATCAGGC GCTCTTCCGC TTCCTCGCTC
4151  ACTGACTCGC TGCGCTCGGT CGTTCGGCTG CGGCGAGCGG TATCAGCTCA
4201  CTCAAAGGCG GTAATACGGT TATCCACAGA ATCAGGGGAT AACGCAGGAA
4251  AGAACATGTG AGCAAAAGGC CAGCAAAAGG CCAGGAACCG TAAAAAGGCC
4301  GCGTTGCTGG CGTTTTTCCA TAGGCTCCGC CCCCCTGACG AGCATCACAA
4351  AAATCGACGC TCAAGTCAGA GGTGGCGAAA CCCGACAGGA CTATAAAGAT
4401  ACCAGGCGTT TCCCCCTGGA AGCTCCCTCG TGCGCTCTCC TGTTCCGACC
4451  CTGCCGCTTA CCGGATACCT GTCCGCCTTT CTCCCTTCGG GAAGCGTGGC
4501  GCTTTCTCAT AGCTCACGCT GTAGGTATCT CAGTTCGGTG TAGGTCGTTC
4551  GCTCCAAGCT GGGCTGTGTG CACGAACCCC CCGTTCAGCC CGACCGCTGC
4601  GCCTTATCCG GTAACTATCG TCTTGAGTCC AACCCGGTAA GACACGACTT
4651  ATCGCCACTG GCAGCAGCCA CTGGTAACAG GATTAGCAGA GCGAGGTATG
4701  TAGGCGGTGC TACAGAGTTC TTGAAGTGGT GGCCTAACTA CGGCTACACT
4751  AGAAGGACAG TATTTGGTAT CTGCGCTCTG CTGAAGCCAG TTACCTTCGG
4801  AAAAAGAGTT GGTAGCTCTT GATCCGGCAA ACAAACCACC GCTGGTAGCG
4851  GTGGTTTTTT TGTTTGCAAG CAGCAGATTA CGCGCAGAAA AAAAGGATCT
4901  CAAGAAGATC CTTTGATCTT TTCTACGGGG TCTGACGCTC AGTGGAACGA
4951  AAACTCACGT TAAGGGATTT TGGTCATGAG ATTATCAAAA AGGATCTTCA
5001  CCTAGATCCT TTTAAATTAA AAATGAAGTT TTAAATCAAT CTAAAGTATA
5051  TATGAGTAAA CTTGGTCTGA CAGTTACCAA TGCTTAATCA GTGAGGCACC
5101  TATCTCAGCG ATCTGTCTAT TTCGTTCATC CATAGTTGCC TGACTCCCCG
5151  TCGTGTAGAT AACTACGATA CGGGAGGGCT TACCATCTGG CCCCAGTGCT
5201  GCAATGATAC CGCGAGACCC ACGCTCACCG GCTCCAGATT TATCAGCAAT
5251  AAACCAGCCA GCCGGAAGGG CCGAGCGCAG AAGTGGTCCT GCAACTTTAT
5301  CCGCCTCCAT CCAGTCTATT AATTGTTGCC GGGAAGCTAG AGTAAGTAGT
5351  TCGCCAGTTA ATAGTTTGCG CAACGTTGTT GCCATTGCTG CAGGCATCGT
5401  GGTGTCACGC TCGTCGTTTG GTATGGCTTC ATTCAGCTCC GGTTCCCAAC
5451  GATCAAGGCG AGTTACATGA TCCCCCATGT TGTGCAAAAA AGCGGTTAGC
5501  TCCTTCGGTC CTCCGATCGT TGTCAGAAGT AAGTTGGCCG CAGTGTTATC
5551  ACTCATGGTT ATGGCAGCAC TGCATAATTC TCTTACTGTC ATGCCATCCG
5601  TAAGATGCTT TTCTGTGACT GGTGAGTACT CAACCAAGTC ATTCTGAGAA
5651  TAGTGTATGC GGCGACCGAG TTGCTCTTGC CCGGCGTCAA CACGGGATAA
5701  TACCGCGCCA CATAGCAGAA CTTTAAAAGT GCTCATCATT GGAAAACGTT
5751  CTTCGGGGCG AAAACTCTCA AGGATCTTAC CGCTGTTGAG ATCCAGTTCG
5801  ATGTAACCCA CTCGTGCACC CAACTGATCT TCAGCATCTT TTACTTTCAC
5851  CAGCGTTTCT GGGTGAGCAA AAACAGGAAG GCAAAATGCC GCAAAAAAGG
5901  GAATAAGGGC GACACGGAAA TGTTGAATAC TCATACTCTT CCTTTTTCAA
5951  TATTATTGAA GCATTTATCA GGGTTATTGT CTCATGAGCG GATACATATT
6001  TGAATGTATT TAGAAAAATA AACAAATAGG GGTTCCGCGC ACATTTCCCC
6051  GAAAAGTGCC ACCTGACGTC TAAGAAACCA TTATTATCAT GACATTAACC
6101  TATAAAAATA GGCGTATCAC GAGGCCCTTT CGTCTTCAAG AATTCAGCTG
6151  CTCGAGGAAG AGCTCAAACC CATGCTACTC TCTGGCTTGA TGGAAGCAAC
6201  GCTTTCATAG CTGAGCTGTC ATAAATAATA AAGAGATTTT TTTATTAATA
6251  TTGAAAAGAT GGGTTATTTA TGTAAGACTC TGTCTTCATT TTAAAAACCA
6301  CACCTTCCAG TAGTATTCTG TTACTGTTCT GGCAATCACT GTGATCAAGA
6351  AGCTACACGG TGAGTTGTGC TTCTCAGTCC TAAGGGATAC ATCTACAAGA
6401  GGCTCCCATA CTCGAAGCTC AGGAAACATT GTAGAAAAGG AGGCAAAAGA
6451  CTGACAGAGC CAGAGGACCA AGAAATTTGT TGTGAGGTTG TGTCTCCTAC
6501  TAACAATATA AGCAATATCT ATAAATTGTT GATATCATGG CTACTAAAAT
6551  GTGAGTTGAA CGAGGAGGAC ACAAATGAAC ATGACAATCA GAATGAGGCC
6601  TCTCACCTGC AAAAAACACT ATAGAGAAGC AGATAAAGCT GTCAGCAGAA
6651  GAGGCGCACC TCCTTATAGA AGAAGCCTAC CAGGTTTGAT ATATCAGCCT
6701  TGAAAACCTA CATAGTATTT ACATTATATC GAGTCTATGA GACATATTTA
6751  GTAATGCATA TGTATGTGTG TGTGTGCATG TATGTGTGTA AATACATATG
6801  TTCATAGAAA AATGTGTAAA AAGAGATCAT GAATTTAAGA GAGAACTGGG
6851  ACAATTTTTT TCAGGGAGTT GTAATCAGGA AAGTTAAGGG AAAAATGTTG
6901  TAATTAAAAT TCAGGCTCAG AAACAAACAA AGGAAAAGAA AAAAAAACAA
6951  CAACAACAAC AAAAAAACAA AACAAAGGAG AAGCTGTATG GCCACAATAG
7001  CATCTACAGC TAACTGTGAA AGGATAATGG AACAAGTTAT GTACTGCCTA
7051  GAGCAGTATG ATGCCTAAAT CATCTCGACA TGGAGGAAAA TAGAACAAAG
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7151  ACATTAGTTT TGTTTGTTGT TCAAAGAGAC TCACATTCCC ACAAAAAAAT
7201  CTGTGGGATT TTACAGGTCT GCAATAAGCT GCTGACCTGA TGATTTCTGC
7251  AGCTGTGCCT ACCCTTTGCT GATTTGCATG TACCCAAAGC ATAGCTTACT
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7351  TCACACTGAT CACACACAGT CATGAGTGTG CTCACTCAGG TCCTGGCGTT
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7451  GCTTCCTGTA CACTGTGCTG CTTGTCTCTG TGAAAATTCT CTTGTGAATT
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7751  GGGACAGATT TTACTCTTAC CATCAGCAGT CTGGAGCCTG AAGATTTTGC
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7851  GGACCAAGCT TGAAATCAAA CGTAAGTAGA ATCCAAAGTC TCTTTCTTCC
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7951  CTCTGAAACC AGATTCTGGC ACTCTCCAAG GCAAAGATAC AGAGTAACTC
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8051  CAGTGTAATA ATTAACACAA GTGATAGTTT CAGAAATGCT CTAGTT
SEQ ID NO：37
表达载体HcVHEN73Dsp20的核苷酸序列
   1  ctagagaggt ctggtggagc ctgcaaaagt ccagctttca aaggaacaca gaagtatgtg
  61  tatggaatat tagaagatgt tgcttttact cttaagttgg ttcctaggaa aaatagttaa
 121  atactgtgac tttaaaatgt gagagggttt tcaagtactc atttttttaa atgtccaaaa
 181  tttttgtcaa tcaatttgag gtcttgtttg tgtagaactg acattactta aagtttaacc
 241  gaggaatggg agtgaggctc tctcataccc tattcagaac tgacttttaa caataataaa
 301  ttaagtttaa aatattttta aatgaattga gcaatgttga gttggagtca agatggccga
 361  tcagaaccag aacacctgca gcagctggca ggaagcaggt catgtggcaa ggctatttgg
 421  ggaagggaaa ataaaaccac taggtaaact tgtagctgtg gtttgaagaa gtggttttga
 481  aacactctgt ccagccccac caaaccgaaa gtccaggctg agcaaaacac cacctgggta
 541  atttgcattt ctaaaataag ttgaggattc agccgaaact ggagaggtcc tcttttaact
 601  tattgagttc aaccttttaa ttttagcttg agtagtteta gtttccccaa acttaagttt
 661  atcgacttct aaaatgtatt taagctttct ggggcaggcc aggcctgacc ttggctttgg
 721  ggcagggagg gggctaaggt gaggcaggtg gcgccagcca ggtgcacacc caatgcccat
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 961  ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg gtgacggtgt cgtggaactc
1021  aggcgccctg accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc ctacagtcct caggactcta
1081  ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg ggcacccaga cctacatctg
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1261  gctatgcagt cccagtccag ggcagcaagg caggccccgt ctgcctcttc acccggaggc
1321  ctctgcccgc cccactcatg ctcagggaga gggtcttctg gctttttccc caggctctgg
1381  gcaggcacag gctaggtgcc cctaacccag gcectgcaca caaaggggca ggtgctgggc
1441  tcagacctgc caagagceat atccgggagg accctgcccc tgacctaagc ccaccccaaa
1501  ggccaaactc tccactccct cagctcggac accttctctc ctcccagatt ccagtaactc
1561  ccaatcttct ctctgcagag cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc
1621  caggtaagcc agcccaggcc tcgccctcca gctcaaggcg ggacaggtgc cctagagtag
1681  cctgcatcca gggacaggcc ccagccgggt gctgacacgt ccacctccat ctcttcctca
1741  gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc
1801  ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac
1861  cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag
1921  ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac
1981  caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc
2041  cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa ggtgggaccc gtggggtgcg agggccacat
2101  ggacagaggc cggctcggcc caccctctgc cctgagagtg accgctgtac caacctctgt
2161  ccctacaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat
2221  gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc
2281  cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct
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2401  gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca
2461  gaagagcctc tccctgtccc cgggtaaatg agtgcgacgg ccggcaagcc cccgctcccc
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2641  tttccacggg tcaggccgag tctgaggcct gagtggcatg agggaggcag agcgggtccc
2701  actgtcccca cactggccca ggctgtgcag gtgtgcctgg gccgcctagg gtggggctca
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2821  gctgccctgg gctgggccac gagaagccct aggagcccct ggggacagac acacagcccc
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2941  tcgggggcat gcctagtcca tgcgcgtagg gacaggccct ccctcaccca tctaccccca
3001  cggcactaac ccctggcagc cctgcccagc ctcgcacccg catggggaca caaccgactc
3061  cggggacatg cactctcggg ccctgtggag ggactggtgc agatgcccac acacacactc
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3181  cctgcctcgg ccgtcaggga ggactcccgg gctcactcga aggaggtgcc accatttcag
3241  ctttggtagc ttttcttctt cttttaaatt ttctaaagct cattaattgt ctttgatgtt
3301  tcttttgtga tgacaataaa atatcctttt taagtcttgt acttcgtgat gggagccgcc
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3541  catggatgca gtttctcctc ctgctgggca cggtgctgcc tgccctggtc actctgcggg
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3901  gtgggaggtt ttttaaagca agtaaaacct ctacaaatgt ggtatggctg attatgatct
3961  ctagtcaagg cactatacat caaatattcc ttattaaccc ctttacaaat taaaaagcta
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4081  agaaaaaaca gtatgttatg attataactg ttatgcctac ttataaaggt tacagaatat
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10201  aggaatagaa tccattatga ttctggaggc aaggaagaac tgatgccaag gtttcagtat
10261  aagagcagta tccactggaa aggataaagt cactacatct gagcacagag caggacatct
10321  acataatgag tggtcactaa tgggccactg ttacactgtt atatgtataa ggctcaagaa
10381  tgagcactga ggctgtaagg tgtatgggtg aggacatcag gatgtaaacc cagctcaggt
10441  agaggactca gaggacagca cagtcagcat gaactaataa acatcagata agataaggca
10501  caagctcagc tatatagggt aagggatctt tgtaaatctg attgtgcatc cagtctagtt
10561  caatgtgact taggaagccc agtcatatgc aaatctagag aagactttag agtagaaatc
10621  tgaggctcac ctcacatacc agcaagcgag tgaccagtta gtcttaaggc accacttctt
10681  agacatcatg gcttgggtgt ggaccttgcc attcctgatg gcagctgccc aaagtaagac
10741  atcagaaaaa agagttccaa ggggaattga agcagttcca tgaatactca ccttcctgtg
10801  ttcttttcac aggtgtccag gcagaggtgc agctggtgga gtcaggagcc gaagtgaaaa
10861  agcctggggc ttcagtgaag gtgtcctgca aggcctctgg atacacattc actaattata
10921  ttatccactg ggtgaagcag gagcctggtc agggccttga atggattgga tattttaatc
10981  cttacaatca tggtactaag tacaatgaga agttcaaagg cagggccaca ctaactgcag
11041  acaaatccat cagcacagcc tacatggagc tcagcagcct gcgctctgag gacactgcgg
11101  tctactactg tgcaagatca ggaccctatg cctggtttga cacctggggc caagggacca
11161  cggtcaccgt ctcctcaggt aagaatggcc actctagggc ctttgttttc tgctgctgcc
11221  tgtgggattt catgagcatt gcaaagttgt cctcgggaca tgttccgagg ggacctgggc
11281  ggactggcca ggaggggacg ggcactgggg tgccttgagg atctgggagc ctctgtggat
11341  tttccgatgc ctttggaaaa tgggactgag gttgggtgcg tctgagacag taactcagcc
11401  tgggggcttg gtgaagatcg ccgcacagca gcgagtccgt gaaatatctt atttagactt
11461  gtgaggtgcg ctgtgtgtca atttacatct taaatccttt attggctgga aagagaattg
11521  ttggagtggg tgaatccagc caggagggac gcggggggat cca
SEQ ID NO：38
表达载体HCVHQN73DSp20的核苷酸序列
   1  CTAGAGAGGT CTGGTGGAGC CTGCAAAAGT CCAGCTTTCA AAGGAACACA GAAGTATGTG
  61  TATGGAATAT TAGAAGATGT TGCTTTTACT CTTAAGTTGG TTCCTAGGAA AAATAGTTAA
 121  ATACTGTGAC TTTAAAATGT GAGAGGGTTT TCAAGTACTC ATTTTTTTAA ATGTCCAAAA
 181  TTTTTGTCAA TCAATTTGAG GTCTTGTTTG TGTAGAACTG ACATTACTTA AAGTTTAACC
 241  GAGGAATGGG AGTGAGGCTC TCTCATACCC TATTCAGAAC TGACTTTTAA CAATAATAAA
 301  TTAAGTTTAA AATATTTTTA AATGAATTGA GCAATGTTGA GTTGGAGTCA AGATGGCCGA
 361  TCAGAACCAG AACACCTGCA GCAGCTGGCA GGAAGCAGGT CATGTGGCAA GGCTATTTGG
 421  GGAAGGGAAA ATAAAACCAC TAGGTAAACT TGTAGCTGTG GTTTGAAGAA GTGGTTTTGA
 481  AACACTCTGT CCAGCCCCAC CAAACCGAAA GTCCAGGCTG AGCAAAACAC CACCTGGGTA
 541  ATTTGCATTT CTAAAATAAG TTGAGGATTC AGCCGAAACT GGAGAGGTCC TCTTTTAACT
 601  TATTGAGTTC AACCTTTTAA TTTTAGCTTG AGTAGTTCTA GTTTCCCCAA ACTTAAGTTT
 661  ATCGACTTCT AAAATGTATT TAAGCTTTCT GGGGCAGGCC AGGCCTGACC TTGGCTTTGG
 721  GGCAGGGAGG GGGCTAAGGT GAGGCAGGTG GCGCCAGCCA GGTGCACACC CAATGCCCAT
 781  GAGCCCAGAC ACTGGACGCT GAACCTCGCG GACAGTTAAG AACCCAGGGG CCTCTGCGCC
 841  CTGGGCCCAG CTCTGTCCCA CACCGCGGTC ACATGGCACC ACCTCTCTTG CAGCCTCCAC
 901  CAAGGGCCCA TCGGTCTTCC CCCTGGCACC CTCCTCCAAG AGCACCTCTG GGGGCACAGC
 961  GGCCCTGGGC TGCCTGGTCA AGGACTACTT CCCCGAACCG GTGACGGTGT CGTGGAACTC
1021  AGGCGCCCTG ACCAGCGGCG TGCACACCTT CCCGGCTGTC CTACAGTCCT CAGGACTCTA
1081  CTCCCTCAGC AGCGTGGTGA CCGTGCCCTC CAGCAGCTTG GGCACCCAGA CCTACATCTG
1141  CAACGTGAAT CACAAGCCCA GCAACACCAA GGTGGACAAG AGAGTTGGTG AGAGGCCAGC
1201  ACAGGGAGGG AGGGTGTCTG CTGGAAGCCA GGCTCAGCGC TCCTGCCTGG ACGCATCCCG
1261  GCTATGCAGT CCCAGTCCAG GGCAGCAAGG CAGGCCCCGT CTGCCTCTTC ACCCGGAGGC
1321  CTCTGCCCGC CCCACTCATG CTCAGGGAGA GGGTCTTCTG GCTTTTTCCC CAGGCTCTGG
1381  GCAGGCACAG GCTAGGTGCC CCTAACCCAG GCCCTGCACA CAAAGGGGCA GGTGCTGGGC
1441  TCAGACCTGC CAAGAGCCAT ATCCGGGAGG ACCCTGCCCC TGACCTAAGC CCACCCCAAA
1501  GGCCAAACTC TCCACTCCCT CAGCTCGGAC ACCTTCTCTC CTCCCAGATT CCAGTAACTC
1561  CCAATCTTCT CTCTGCAGAG CCCAAATCTT GTGACAAAAC TCACACATGC CCACCGTGCC
1621  CAGGTAAGCC AGCCCAGGCC TCGCCCTCCA GCTCAAGGCG GGACAGGTGC CCTAGAGTAG
1681  CCTGCATCCA GGGACAGGCC CCAGCCGGGT GCTGACACGT CCACCTCCAT CTCTTCCTCA
1741  GCACCTGAAC TCCTGGGGGG ACCGTCAGTC TTCCTCTTCC CCCCAAAACC CAAGGACACC
1801  CTCATGATCT CCCGGACCCC TGAGGTCACA TGCGTGGTGG TGGACGTGAG CCACGAAGAC
1861  CCTGAGGTCA AGTTCAACTG GTACGTGGAC GGCGTGGAGG TGCATAATGC CAAGACAAAG
1921  CCGCGGGAGG AGCAGTACAA CAGCACGTAC CGTGTGGTCA GCGTCCTCAC CGTCCTGCAC
1981  CAGGACTGGC TGAATGGCAA GGAGTACAAG TGCAAGGTCT CCAACAAAGC CCTCCCAGCC
2041  CCCATCGAGA AAACCATCTC CAAAGCCAAA GGTGGGACCC GTGGGGTGCG AGGGCCACAT
2101  GGACAGAGGC CGGCTCGGCC CACCCTCTGC CCTGAGAGTG ACCGCTGTAC CAACCTCTGT
2161  CCCTACAGGG CAGCCCCGAG AACCACAGGT GTACACCCTG CCCCCATCCC GGGAGGAGAT
2221  GACCAAGAAC CAGGTCAGCC TGACCTGCCT GGTCAAAGGC TTCTATCCCA GCGACATCGC
2281  CGTGGAGTGG GAGAGCAATG GGCAGCCGGA GAACAACTAC AAGACCACGC CTCCCGTGCT
2341  GGACTCCGAC GGCTCCTTCT TCCTCTATAG CAAGCTCACC GTGGACAAGA GCAGGTGGCA
2401  GCAGGGGAAC GTCTTCTCAT GCTCCGTGAT GCATGAGGCT CTGCACAACC ACTACACGCA
2461  GAAGAGCCTC TCCCTGTCCC CGGGTAAATG AGTGCGACGG CCGGCAAGCC CCCGCTCCCC
2521  GGGCTCTCGC GGTCGCACGA GGATGCTTGG CACGTACCCC GTCTACATAC TTCCCAGGCA
2581  CCCAGCATGG AAATAAAGCA CCCACCACTG CCCTGGGCCC CTGCGAGACT GTGATGGTTC
2641  TTTCCACGGG TCAGGCCGAG TCTGAGGCCT GAGTGGCATG AGGGAGGCAG AGCGGGTCCC
2701  ACTGTCCCCA CACTGGCCCA GGCTGTGCAG GTGTGCCTGG GCCGCCTAGG GTGGGGCTCA
2761  GCCAGGGGCT GCCCTCGGCA GGGTGGGGGA TTTGCCAGCG TGGCCCTCCC TCCAGCAGCA
2821  GCTGCCCTGG GCTGGGCCAC GAGAAGCCCT AGGAGCCCCT GGGGACAGAC ACACAGCCCC
2881  TGCCTCTGTA GGAGACTGTC CTGTCCTGTG AGCGCCCTGT CCTCCGACCC CGATGCCCAC
2941  TCGGGGGCAT GCCTAGTCCA TGCGCGTAGG GACAGGCCCT CCCTCACCCA TCTACCCCCA
3001  CGGCACTAAC CCCTGGCAGC CCTGCCCAGC CTCGCACCCG CATGGGGACA CAACCGACTC
3061  CGGGGACATG CACTCTCGGG CCCTGTGGAG GGACTGGTGC AGATGCCCAC ACACACACTC
3121  AGCCCAGACC CGTTCAACAA ACCCCGCACT GAGGTTGGTC GAGCGGGAGT GCGGCCAGAG
3181  CCTGCCTCGG CCGTCAGGGA GGACTCCCGG GCTCACTCGA AGGAGGTGCC ACCATTTCAG
3241  CTTTGGTAGC TTTTCTTCTT CTTTTAAATT TTCTAAAGCT CATTAATTGT CTTTGATGTT
3301  TCTTTTGTGA TGACAATAAA ATATCCTTTT TAAGTCTTGT ACTTCGTGAT GGGAGCCGCC
3361  TTCCTGTGTC CACGCGCCTC CTGCCCCCGG TGGGAAGCAC GGTCAGGAGG AGGCTGGTCC
3421  AGCTGCACCT CGGGGGCTCC CTGCACTCGC CCCCCGCCTC CTGCAGCCAC ACGCATTGCC
3481  CGAGCGACCC TCCCTGGCCC CTGTCACTAC ATGGACCCCT GGGGCTTCTC CTCTTTTCTA
3541  CATGGATGCA GTTTCTCCTC CTGCTGGGCA CGGTGCTGCC TGCCCTGGTC ACTCTGCGGG
3601  GGACAGGGCC TCCAGGGAAA GCTGGGTCGA GGCTGGGAGC TGGCTCAGGC TGGCCAGGCA
3661  GAGCCACAGG GAGGGCCTTC CAGAACCAAC CATGGTCCGA AGCGAGAGGT GGGTGTCAGA
3721  TCCAGACATG ATAAGATACA TTGATGAGTT TGGACAAACC ACAACTAGAA TGCAGTGAAA
3781  AAAATGCTTT ATTTGTGAAA TTTGTGATGC TATTGCTTTA TTTGTAACCA TTATAAGCTG
3841  CAATAAACAA GTTAACAACA ACAATTGCAT TCATTTTATG TTTCAGGTTC AGGGGGAGGT
3901  GTGGGAGGTT TTTTAAAGCA AGTAAAACCT CTACAAATGT GGTATGGCTG ATTATGATCT
3961  CTAGTCAAGG CACTATACAT CAAATATTCC TTATTAACCC CTTTACAAAT TAAAAAGCTA
4021  AAGGTACACA ATTTTTGAGC ATAGTTATTA ATAGCAGACA CTCTATGCCT GTGTGGAGTA
4081  AGAAAAAACA GTATGTTATG ATTATAACTG TTATGCCTAC TTATAAAGGT TACAGAATAT
4141  TTTTCCATAA TTTTCTTGTA TAGCAGTGCA GCTTTTTCCT TTGTGGTGTA AATAGCAAAG
4201  CAAGCAAGAG TTCTATTACT AAACACAGCA TGACTCAAAA AACTTAGCAA TTCTGAAGGA
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4321  GCAGTAGCCT CATCATCACT AGATGGCATT TCTTCTGAGC AAAACAGGTT TTCCTCATTA
4381  AAGGCATTCC ACCACTGCTC CCATTCATCA GTTCCATAGG TTGGAATCTA AAATACACAA
4441  ACAATTAGAA TCAGTAGTTT AACACATTAT ACACTTAAAA ATTTTATATT TACCTTAGAG
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4561  ACAAAGATCC GGACCAAAGC GGCCATCGTG CCTCCCCACT CCTGCAGTTC GGGGGCATGG
4621  ATGCGCGGAT AGCCGCTGCT GGTTTCCTGG ATGCCGACGG ATTTGCACTG CCGGTAGAAC
4681  TCCGCGAGGT CGTCCAGCCT CAGGCAGCAG CTGAACCAAC TCGCGAGGGG ATCGAGCCCG
4741  GGGTGGGCGA AGAACTCCAG CATGAGATCC CCGCGCTGGA GGATCATCCA GCCGGCGTCC
4801  CGGAAAACGA TTCCGAAGCC CAACCTTTCA TAGAAGGCGG CGGTGGAATC GAAATCTCGT
4861  GATGGCAGGT TGGGCGTCGC TTGGTCGGTC ATTTCGAACC CCAGAGTCCC GCTCAGAAGA
4921  ACTCGTCAAG AAGGCGATAG AAGGCGATGC GCTGCGAATC GGGAGCGGCG ATACCGTAAA
4981  GCACGAGGAA GCGGTCAGCC CATTCGCCGC CAAGCTCTTC AGCAATATCA CGGGTAGCCA
5041  ACGCTATGTC CTGATAGCGG TCCGCCACAC CCAGCCGGCC ACAGTCGATG AATCCAGAAA
5101  AGCGGCCATT TTCCACCATG ATATTCGGCA AGCAGGCATC GCCATGGGTC ACGACGAGAT
5161  CCTCGCCGTC GGGCATGCGC GCCTTGAGCC TGGCGAACAG TTCGGCTGGC GCGAGCCCCT
5221  GATGCTCTTC GTCCAGATCA TCCTGATCGA CAAGACCGGC TTCCATCCGA GTACGTGCTC
5281  GCTCGATGCG ATGTTTCGCT TGGTGGTCGA ATGGGCAGGT AGCCGGATCA AGCGTATGCA
5341  GCCGCCGCAT TGCATCAGCC ATGATGGATA CTTTCTCGGC AGGAGCAAGG TGAGATGACA
5401  GGAGATCCTG CCCCGGCACT TCGCCCAATA GCAGCCAGTC CCTTCCCGCT TCAGTGACAA
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5581  CCTGCGCTGA CAGCCGGAAC ACGGCGGCAT CAGAGCAGCC GATTGTCTGT TGTGCCCAGT
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5701  CAATCATGCG AAACGATCCT CATCCTGTCT CTTGATCAGA TCTTGATCCC CTGCGCCATC
5761  AGATCCTTGG CGGCAAGAAA GCCATCCAGT TTACTTTGCA GGGCTTCCCA ACCTTACCAG
5821  AGGGCGCCCC AGCTGGCAAT TCCGGTTCGC TTGCTGTCCA TAAAACCGCC CAGTCTAGCT
5881  ATCGCCATGT AAGCCCACTG CAAGCTACCT GCTTTCTCTT TGCGCTTGCG TTTTCCCTTG
5941  TCCAGATAGC CCAGTAGCTG ACATTCATCC GGGGTCAGCA CCGTTTCTGC GGACTGGCTT
6001  TCTACGTGTT CCGCTTCCTT TAGCAGCCCT TGCGCCCTGA GTGCTTGCGG CAGCGTGAAG
6061  CTTTTTGCAA AAGCCTAGGC CTCCAAAAAA GCCTCCTCAC TACTTCTGGA ATAGCTCAGA
6121  GGCCGAGGCG GCCTCGGCCT CTGCATAAAT AAAAAAAATT AGTCAGCCAT GGGGCGGAGA
6181  ATGGGCGGAA CTGGGCGGAG TTAGGGGCGG GATGGGCGGA GTTAGGGGCG GGACTATGGT
6241  TGCTGACTAA TTGAGATGCA TGCTTTGCAT ACTTCTGCCT GCTGGGGAGC CTGGGGACTT
6301  TCCACACCTG GTTGCTGACT AATTGAGATG CATGCTTTGC ATACTTCTGC CTGCTGGGGA
6361  GCCTGGGGAC TTTCCACACC CTAACTGACA CACATTCCAC AGCTGCCTCG CGCGTTTCGG
6421  TGATGACGGT GAAAACCTCT GACACATGCA GCTCCCGGAG ACGGTCACAG CTTGTCTGTA
6481  AGCGGATGCC GGGAGCAGAC AAGCCCGTCA GGGCGCGTCA GCGGGTGTTG GCGGGTGTCG
6541  GGGCGCAGCC ATGACCCAGT CACGTAGCGA TAGCGGAGTG TATACTGGCT TAACTATGCG
6601  GCATCAGAGC AGATTGTACT GAGAGTGCAC CATATGCGGT GTGAAATACC GCACAGATGC
6661  GTAAGGAGAA AATACCGCAT CAGGCGCTCT TCCGCTTCCT CGCTCACTGA CTCGCTGCGC
6721  TCGGTCGTTC GGCTGCGGCG AGCGGTATCA GCTCACTCAA AGGCGGTAAT ACGGTTATCC
6781  ACAGAATCAG GGGATAACGC AGGAAAGAAC ATGTGAGCAA AAGGCCAGCA AAAGGCCAGG
6841  AACCGTAAAA AGGCCGCGTT GCTGGCGTTT TTCCATAGGC TCCGCCCCCC TGACGAGCAT
6901  CACAAAAATC GACGCTCAAG TCAGAGGTGG CGAAACCCGA CAGGACTATA AAGATACCAG
6961  GCGTTTCCCC CTGGAAGCTC CCTCGTGCGC TCTCCTGTTC CGACCCTGCC GCTTACCGGA
7021  TACCTGTCCG CCTTTCTCCC TTCGGGAAGC GTGGCGCTTT CTCATAGCTC ACGCTGTAGG
7081  TATCTCAGTT CGGTGTAGGT CGTTCGCTCC AAGCTGGGCT GTGTGCACGA ACCCCCCGTT
7141  CAGCCCGACC GCTGCGCCTT ATCCGGTAAC TATCGTCTTG AGTCCAACCC GGTAAGACAC
7201  GACTTATCGC CACTGGCAGC AGCCACTGGT AACAGGATTA GCAGAGCGAG GTATGTAGGC
7261  GGTGCTACAG AGTTCTTGAA GTGGTGGCCT AACTACGGCT ACACTAGAAG GACAGTATTT
7321  GGTATCTGCG CTCTGCTGAA GCCAGTTACC TTCGGAAAAA GAGTTGGTAG CTCTTGATCC
7381  GGCAAACAAA CCACCGCTGG TAGCGGTGGT TTTTTTGTTT GCAAGCAGCA GATTACGCGC
7441  AGAAAAAAAG GATCTCAAGA AGATCCTTTG ATCTTTTCTA CGGGGTCTGA CGCTCAGTGG
7501  AACGAAAACT CACGTTAAGG GATTTTGGTC ATGAGATTAT CAAAAAGGAT CTTCACCTAG
7561  ATCCTTTTAA ATTAAAAATG AAGTTTTAAA TCAATCTAAA GTATATATGA GTAAACTTGG
7621  TCTGACAGTT ACCAATGCTT AATCAGTGAG GCACCTATCT CAGCGATCTG TCTATTTCGT
7681  TCATCCATAG TTGCCTGACT CCCCGTCGTG TAGATAACTA CGATACGGGA GGGCTTACCA
7741  TCTGGCCCCA GTGCTGCAAT GATACCGCGA GACCCACGCT CACCGGCTCC AGATTTATCA
7801  GCAATAAACC AGCCAGCCGG AAGGGCCGAG CGCAGAAGTG GTCCTGCAAC TTTATCCGCC
7861  TCCATCCAGT CTATTAATTG TTGCCGGGAA GCTAGAGTAA GTAGTTCGCC AGTTAATAGT
7921  TTGCGCAACG TTGTTGCCAT TGCTGCAGGC ATCGTGGTGT CACGCTCGTC GTTTGGTATG
7981  GCTTCATTCA GCTCCGGTTC CCAACGATCA AGGCGAGTTA CATGATCCCC CATGTTGTGC
8041  AAAAAAGCGG TTAGCTCCTT CGGTCCTCCG ATCGTTGTCA GAAGTAAGTT GGCCGCAGTG
8101  TTATCACTCA TGGTTATGGC AGCACTGCAT AATTCTCTTA CTGTCATGCC ATCCGTAAGA
8161  TGCTTTTCTG TGACTGGTGA GTACTCAACC AAGTCATTCT GAGAATAGTG TATGCGGCGA
8221  CCGAGTTGCT CTTGCCCGGC GTCAACACGG GATAATACCG CGCCACATAG CAGAACTTTA
8281  AAAGTGCTCA TCATTGGAAA ACGTTCTTCG GGGCGAAAAC TCTCAAGGAT CTTACCGCTG
8341  TTGAGATCCA GTTCGATGTA ACCCACTCGT GCACCCAACT GATCTTCAGC ATCTTTTACT
8401  TTCACCAGCG TTTCTGGGTG AGCAAAAACA GGAAGGCAAA ATGCCGCAAA AAAGGGAATA
8461  AGGGCGACAC GGAAATGTTG AATACTCATA CTCTTCCTTT TTCAATATTA TTGAAGCATT
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8641  ATCATGACAT TAACCTATAA AAATAGGCGT ATCACGAGGC CCTTTCGTCT TCAAGAATTC
8701  GAGCTCGGTA CCCATCAGCC AAAAAGCATG CCTGCCACAC AACATCAATT TCTGGAAAAC
8761  GCTACACTTA ATTATTTCTA GTAGAACAGC TCTTTGGTTT GCCAAAAAGA ATCACCTATA
8821  GTGGCATCTA AGCACAAAAA GGAGAAAAAA ATCACAAAGA AATGATTGAG AGGCATAATA
8881  AAAATTATCA AAAAATTATG AGTTTTACGA TTTCATCTTT TTCCAAGTTG AAATCATAGG
8941  GTGGCTTTAA CACAGTGACA AGGAATGTGC ATGCTGCCAT TATGGTGCTC TGCCTAAAAT
9001  GGTTGGAGCC TTGTCATGCT ACAGAGAAAC TGTCATACAG CAGGGGGTGC CAAATTTCCA
9061  TATTTTTTTA TATCATTGAG CAGGTGCACA GAAGACCAGA AAGCACTTTC TATCAGGCTG
9121  GCCTTCCTCT TCCTTTCCAG TATGAAGCAA AAACTGCCAA TGAAACTAGC AATTGTTAAA
9181  TTCCTTTTTC AAACAGTATT TGTGCTATCA GAACATAGTG CATTCAAAAG TCTAGCCTGA
9241  GAGAACAACC CAGTTTTATT CATTCCTCCT ACTACCTCTC TCATTCCCAC TGTTTGTGTT
9301  CTCCCTCCCA TTTTAATTGT CTATCTAGTC CAAACTAAGC ACACGATCCA GTCCACATTA
9361  AACAACATGT TTTCACTTTA AGTCAAATAC AAGACACCTT TAATATCAGC CCTTGTTCAT
 9421  AATCGTGCTT CTAGTGACTT AATGTACATG TCACACTGTA CTGTTGGGTT TTGTGTCTCA
 9481  TCATGAACAA TGTTGTGAAG GTATTAAGTG GAGAGTAAGC AGAATTAGAT TCCTCTAATG
 9541  ATGCACACCC ACACTAAGAG CAGAAATAAT ATTAAAAATA GAAAAAAAAG TTTTACATGA
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 9901  AACTGCTGTT CATGAACTTC TTAATTGATA TATCTCATGA GATCTCTAAA CTATTTTTAT
 9961  TATGACACGT TTCACCATTT TCACTGTAAC GATTTTTATG TTTTATATTA ATGTAACTAT
10021  ATGACACTTC CCAAAATCCC CATATTCACA ATTGAACTGT TTCAAAGTTT TACCTTGACT
10081  TATGGGAAAT GAAAACCCAC ATTTTATAAT TTTAAAATGA AATGTTTATT TTATATTTCT
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10921  TTATCCACTG GGTGAAGCAG GAGCCTGGTC AGGGCCTTGA ATGGATTGGA TATTTTAATC
10981  CTTACAATCA TGGTACTAAG TACAATGAGA AGTTCAAAGG CAGGGCCACA CTAACTGCAG
11041  ACAAATCCAT CAGCACAGCC TACATGGAGC TCAGCAGCCT GCGCTCTGAG GACACTGCGG
11101  TCTACTACTG TGCAAGATCA GGACCCTATG CCTGGTTTGA CACCTGGGGC CAAGGGACCA
11161  CGGTCACCGT CTCCTCAGGT AAGAATGGCC ACTCTAGGGC CTTTGTTTTC TGCTGCTGCC
11221  TGTGGGATTT CATGAGCATT GCAAAGTTGT CCTCGGGACA TGTTCCGAGG GGACCTGGGC
11281  GGACTGGCCA GGAGGGGACG GGCACTGGGG TGCCTTGAGG ATCTGGGAGC CTCTGTGGAT
11341  TTTCCGATGC CTTTGGAAAA TGGGACTGAG GTTGGGTGCG TCTGAGACAG TAACTCAGCC
11401  TGGGGGCTTG GTGAAGATCG CCGCACAGCA GCGAGTCCGT GAAATATCTT ATTTAGACTT
11461  GTGAGGTGCG CTGTGTGTCA ATTTACATCT TAAATCCTTT ATTGGCTGGA AAGAGAATTG
11521  TTGGAGTGGG TGAATCCAGC CAGGAGGGAC GCGGGGGGAT CCA
SEQ ID NO：39
表达载体LCVL2Sp20的核苷酸序列
 1  CTAGAGTCCT AGAGAGGTCT GGTGGAGCCT GCAAAAGTCC AGCTTTCAAA
51  GGAACACAGA AGTATGTGTA TGGAATATTA GAAGATGTTG CTTTTACTCT
 101  TAAGTTGGTT CCTAGGAAAA ATAGTTAAAT ACTGTGACTT TAAAATGTGA
 151  GAGGGTTTTC AAGTACTCAT TTTTTTAAAT GTCCAAAATT TTTGTCAATC
 201  AATTTGAGGT CTTGTTTGTG TAGAACTGAC ATTACTTAAA GTTTAACCGA
 251  GGAATGGGAG TGAGGCTCTC TCATACCCTA TTCAGAACTG ACTTTTAACA
 301  ATAATAAATT AAGTTTAAAA TATTTTTAAA TGAATTGAGC AATGTTGAGT
 351  TGGAGTCAAG ATGGCCGATC AGAACCAGAA CACCTGCAGC AGCTGGCAGG
 401  AAGCAGGTCA TGTGGCAAGG CTATTTGGGG AAGGGAAAAT AAAACCACTA
 451  GGTAAACTTG TAGCTGTGGT TTGAAGAAGT GGTTTTGAAA CACTCTGTCC
 501  AGCCCCACCA AACCGAAAGT CCAGGCTGAG CAAAACACCA CCTGGGTAAT
 551  TTGCATTTCT AAAATAAGTT GAGGATTCAG CCGAAACTGG AGAGGTCCTC
 601  TTTTAACTTA TTGAGTTCAA CCTTTTAATT TTAGCTTGAG TAGTTCTAGT
 651  TTCCCCAAAC TTAAGTTTAT CGACTTCTAA AATGTATTTA GAACTCATTT
 701  TCAAAATTAG GTTATGTAAG AAATTGAAGG ACTTTAGTGT CTTTAATTTC
 751  TAATATATTT AGAAAACTTC TTAAAATTAC TCTATTATTC TTCCCTCTGA
 801  TTATTGGTCT CCATTCAATT CTTTTCCAAT ACCCGAAGCA TTTACAGTGA
 851  CTTTGTTCAT GATCTTTTTT AGTTGTTTGT TTTGCCTTAC TATTAAGACT
 901  TTGACATTCT GGTCAAAACG GCTTCACAAA TCTTTTTCAA GACCACTTTC
 951  TGAGTATTCA TTTTAGGAGA AATACTTTTT TTTTAAATGA ATGCAATTAT
1001  CTAGGACCTG CAGGCATGCT GTTTTCTGTC TGTCCCTAAC ATGCCCTGTG
1051  ATTATCCGCA AACAACACAC CCAAGGGCAG AACTTTGTTA CTTAAACACC
1101  ATCCTGTTTG CTTCTTTCCT CAGGAACTGT GGCTGCACCA TCTGTCTTCA
1151  TCTTCCCGCC ATCTGATGAG CAGTTGAAAT CTGGAACTGC CTCTGTTGTG
1201  TGCCTGCTGA ATAACTTCTA TCCCAGAGAG GCCAAAGTAC AGTGGAAGGT
1251  GGATAACGCC CTCCAATCGG GTAACTCCCA GGAGAGTGTC ACAGAGCAGG
1301  ACAGCAAGGA CAGCACCTAC AGCCTCAGCA GCACCCTGAC GCTGAGCAAA
1351  GCAGACTACG AGAAACACAA AGTCTACGCC TGCGAAGTCA CCCATCAGGG
1401  CCTGAGCTCG CCCGTCACAA AGAGCTTCAA CAGGGGAGAG TGTTAGAGGG
1451  AGAAGTGCCC CCACCTGCTC CTCAGTTCCA GCCTGACCCC CTCCCATCCT
1501  TTGGCCTCTG ACCCTTTTTC CACAGGGGAC CTACCCCTAT TGCGGTCCTC
1551  CAGCTCATCT TTCACCTCAC CCCCCTCCTC CTCCTTGGCT TTAATTATGC
1601  TAATGTTGGA GGAGAATGAA TAAATAAAGT GAATCTTTGC ACCTGTGGTT
1651  TCTCTCTTTC CTCATTTAAT AATTATTATC TGTTGTTTTA CCAACTACTC
1701  AATTTCTCTT ATAAGGGACT AAATATGTAG TCATCCTAAG GCGGGATATC
1751  GAGATCTGAA GCTGATCCAG ACATGATAAG ATACATTGAT GAGTTTGGAC
1801  AAACCACAAC TAGAATGCAG TGAAAAAAAT GCTTTATTTG TGAAATTTGT
1851  GATGCTATTG CTTTATTTGT AACCATTATA AGCTGCAATA AACAAGTTAA
1901  CAACAACAAT TGCATTCATT TTATGTTTCA GGTTCAGGGG GAGGTGTGGG
1951  AGGTTTTTTA AAGCAAGTAA AACCTCTACA AATGTGGTAT GGCTGATTAT
2001  GATCTCTAGT CAAGGCACTA TACATCAAAT ATTCCTTATT AACCCCTTTA
2051  CAAATTAAAA AGCTAAAGGT ACACAATTTT TGAGCATAGT TATTAATAGC
2101  AGACACTCTA TGCCTGTGTG GAGTAAGAAA AAACAGTATG TTATGATTAT
2151  AACTGTTATG CCTACTTATA AAGGTTACAG AATATTTTTC CATAATTTTC
2201  TTGTATAGCA GTGCAGCTTT TTCCTTTGTG GTGTAAATAG CAAAGCAAGC
2251  AAGAGTTCTA TTACTAAACA CAGCATGACT CAAAAAACTT AGCAATTCTG
2301  AAGGAAAGTC CTTGGGGTCT TCTACCTTTC TCTTCTTTTT TGGAGGAGTA
2351  GAATGTTGAG AGTCAGCAGT AGCCTCATCA TCACTAGATG GCATTTCTTC
2401  TGAGCAAAAC AGGTTTTCCT CATTAAAGGC ATTCCACCAC TGCTCCCATT
2451  CATCAGTTCC ATAGGTTGGA ATCTAAAATA CACAAACAAT TAGAATCAGT
2501  AGTTTAACAC ATTATACACT TAAAAATTTT ATATTTACCT TAGAGCTTTA
2551  AATCTCTGTA GGTAGTTTGT CCAATTATGT CACACCACAG AAGTAAGGTT
2601  CCTTCACAAA GATCCGGACC AAAGCGGCCA TCGTGCCTCC CCACTCCTGC
2651  AGTTCGGGGG CATGGATGCG CGGATAGCCG CTGCTGGTTT CCTGGATGCC
2701  GACGGATTTG CACTGCCGGT AGAACTCCGC GAGGTCGTCC AGCCTCAGGC
2751  AGCAGCTGAA CCAACTCGCG AGGGGATCGA GCATCCCCCA TGGTCTTATA
2801  AAAATGCATA GCTTTAGGAG GGGAGCAGAG AACTTGAAAG CATCTTCCTG
2851  TTAGTCTTTC TTCTCGTAGA CTTCAAACTT ATACTTGATG CCTTTTTCCT
2901  CCTGGACCTC AGAGAGGACG CCTGGGTATT CTGGGAGAAG TTTATATTTC
2951  CCCAAATCAA TTTCTGGGAA AAACGTGTCA CTTTCAAATT CCTGCATGAT
3001  CCTTGTCACA AAGAGTCTGA GGTGGCCTGG TTGATTCATG GCTTCCTGGT
3051  AAACAGAACT GCCTCCGACT ATCCAAACCA TGTCTACTTT ACTTGCCAAT
3101  TCCGGTTGTT CAATAAGTCT TAAGGCATCA TCCAAACTTT TGGCAAGAAA
3151  ATGAGCTCCT CGTGGTGGTT CTTTGAGTTC TCTACTGAGA ACTATATTAA
3201  TTCTGTCCTT TAAAGGTCGA TTCTTCTCAG GAATGGAGAA CCAGGTTTTC
3251  CTACCCATAA TCACCAGATT CTGTTTACCT TCCACTGAAG AGGTTGTGGT
3301  CATTCTTTGG AAGTACTTGA ACTCGTTCCT GAGCGGAGGC CAGGGTCGGT
3351  CTCCGTTCTT GCCAATCCCC ATATTTTGGG ACACGGCGAC GATGCAGTTC
3401  AATGGTCGAA CCATGATGGC AGCGGGGATA AAATCCTACC AGCCTTCACG
3451  CTAGGATTGC CGTCAAGTTT GGGGGTACCG AGCTCGAATT AGCTTTTTGC
3501  AAAAGCCTAG GCCTCCAAAA AAGCCTCCTC ACTACTTCTG GAATAGCTCA
3551  GAGGGCCGAG GCGGCCTCGG CCTCTGCATA AATAAAAAAA ATTAGTCAGC
3601  CATGGGGCGG AGAATGGGCG GAACTGGGCG GAGTTAGGGG CGGGATGGGC
3651  GGAGTTAGGG GCGGGACTAT GGTTGCTGAC TAATTGAGAT GCATGCTTTG
3701  CATACTTCTG CCTGCTGGGG AGCCTGGGGA CTTTCCACAC CTGGTTGCTG
3751  ACTAATTGAG ATGCATGCTT TGCATACTTC TGCCTGCTGG GGAGCCTGGG
3801  GACTTTCCAC ACCCTAACTG ACACACATTC CACAGCTGCC TCGCGCGTTT
3851  CGGTGATGAC GGTGAAAACC TCTGACACAT GCAGCTCCCG GAGACGGTCA
3901  CAGCTTGTCT GTAAGCGGAT GCCGGGAGCA GACAAGCCCG TCAGGGCGCG
3951  TCAGCGGGTG TTGGCGGGTG TCGGGGCGCA GCCATGACCC AGTCACGTAG
4001  CGATAGCGGA GTGTATACTG GCTTAACTAT GCGGCATCAG AGCAGATTGT
4051  ACTGAGAGTG CACCATATGC GGCCGCATAT GCGGTGTGAA ATACCGCACA
4101  GATGCGTAAG GAGAAAATAC CGCATCAGGC GCTCTTCCGC TTCCTCGCTC
4151  ACTGACTCGC TGCGCTCGGT CGTTCGGCTG CGGCGAGCGG TATCAGCTCA
4201  CTCAAAGGCG GTAATACGGT TATCCACAGA ATCAGGGGAT AACGCAGGAA
4251  AGAACATGTG AGCAAAAGGC CAGCAAAAGG CCAGGAACCG TAAAAAGGCC
4301  GCGTTGCTGG CGTTTTTCCA TAGGCTCCGC CCCCCTGACG AGCATCACAA
4351  AAATCGACGC TCAAGTCAGA GGTGGCGAAA CCCGACAGGA CTATAAAGAT
4401  ACCAGGCGTT TCCCCCTGGA AGCTCCCTCG TGCGCTCTCC TGTTCCGACC
4451  CTGCCGCTTA CCGGATACCT GTCCGCCTTT CTCCCTTCGG GAAGCGTGGC
4501  GCTTTCTCAT AGCTCACGCT GTAGGTATCT CAGTTCGGTG TAGGTCGTTC
4551  GCTCCAAGCT GGGCTGTGTG CACGAACCCC CCGTTCAGCC CGACCGCTGC
4601  GCCTTATCCG GTAACTATCG TCTTGAGTCC AACCCGGTAA GACACGACTT
4651  ATCGCCACTG GCAGCAGCCA CTGGTAACAG GATTAGCAGA GCGAGGTATG
4701  TAGGCGGTGC TACAGAGTTC TTGAAGTGGT GGCCTAACTA CGGCTACACT
4751  AGAAGGACAG TATTTGGTAT CTGCGCTCTG CTGAAGCCAG TTACCTTCGG
4801  AAAAAGAGTT GGTAGCTCTT GATCCGGCAA ACAAACCACC GCTGGTAGCG
4851  GTGGTTTTTT TGTTTGCAAG CAGCAGATTA CGCGCAGAAA AAAAGGATCT
4901  CAAGAAGATC CTTTGATCTT TTCTACGGGG TCTGACGCTC AGTGGAACGA
4951  AAACTCACGT TAAGGGATTT TGGTCATGAG ATTATCAAAA AGGATCTTCA
5001  CCTAGATCCT TTTAAATTAA AAATGAAGTT TTAAATCAAT CTAAAGTATA
5051  TATGAGTAAA CTTGGTCTGA CAGTTACCAA TGCTTAATCA GTGAGGCACC
5101  TATCTCAGCG ATCTGTCTAT TTCGTTCATC CATAGTTGCC TGACTCCCCG
5151  TCGTGTAGAT AACTACGATA CGGGAGGGCT TACCATCTGG CCCCAGTGCT
5201  GCAATGATAC CGCGAGACCC ACGCTCACCG GCTCCAGATT TATCAGCAAT
5251  AAACCAGCCA GCCGGAAGGG CCGAGCGCAG AAGTGGTCCT GCAACTTTAT
5301  CCGCCTCCAT CCAGTCTATT AATTGTTGCC GGGAAGCTAG AGTAAGTAGT
5351  TCGCCAGTTA ATAGTTTGCG CAACGTTGTT GCCATTGCTG CAGGCATCGT
5401  GGTGTCACGC TCGTCGTTTG GTATGGCTTC ATTCAGCTCC GGTTCCCAAC
5451  GATCAAGGCG AGTTACATGA TCCCCCATGT TGTGCAAAAA AGCGGTTAGC
5501  TCCTTCGGTC CTCCGATCGT TGTCAGAAGT AAGTTGGCCG CAGTGTTATC
5551  ACTCATGGTT ATGGCAGCAC TGCATAATTC TCTTACTGTC ATGCCATCCG
5601  TAAGATGCTT TTCTGTGACT GGTGAGTACT CAACCAAGTC ATTCTGAGAA
5651  TAGTGTATGC GGCGACCGAG TTGCTCTTGC CCGGCGTCAA CACGGGATAA
5701  TACCGCGCCA CATAGCAGAA CTTTAAAAGT GCTCATCATT GGAAAACGTT
5751  CTTCGGGGCG AAAACTCTCA AGGATCTTAC CGCTGTTGAG ATCCAGTTCG
5801  ATGTAACCCA CTCGTGCACC CAACTGATCT TCAGCATCTT TTACTTTCAC
5851  CAGCGTTTCT GGGTGAGCAA AAACAGGAAG GCAAAATGCC GCAAAAAAGG
5901  GAATAAGGGC GACACGGAAA TGTTGAATAC TCATACTCTT CCTTTTTCAA
5951  TATTATTGAA GCATTTATCA GGGTTATTGT CTCATGAGCG GATACATATT
6001  TGAATGTATT TAGAAAAATA AACAAATAGG GGTTCCGCGC ACATTTCCCC
6051  GAAAAGTGCC ACCTGACGTC TAAGAAACCA TTATTATCAT GACATTAACC
6101  TATAAAAATA GGCGTATCAC GAGGCCCTTT CGTCTTCAAG AATTCAGCTG
6151  CTCGAGGAAG AGCTCAAACC CATGCTACTC TCTGGCTTGA TGGAAGCAAC
6201  GCTTTCATAG CTGAGCTGTC ATAAATAATA AAGAGATTTT TTTATTAATA
6251  TTGAAAAGAT GGGTTATTTA TGTAAGACTC TGTCTTCATT TTAAAAACCA
6301  CACCTTCCAG TAGTATTCTG TTACTGTTCT GGCAATCACT GTGATCAAGA
6351  AGCTACACGG TGAGTTGTGC TTCTCAGTCC TAAGGGATAC ATCTACAAGA
6401  GGCTCCCATA CTCGAAGCTC AGGAAACATT GTAGAAAAGG AGGCAAAAGA
6451  CTGACAGAGC CAGAGGACCA AGAAATTTGT TGTGAGGTTG TGTCTCCTAC
6501  TAACAATATA AGCAATATCT ATAAATTGTT GATATCATGG CTACTAAAAT
6551  GTGAGTTGAA CGAGGAGGAC ACAAATGAAC ATGACAATCA GAATGAGGCC
6601  TCTCACCTGC AAAAAACACT ATAGAGAAGC AGATAAAGCT GTCAGCAGAA
6651  GAGGCGCACC TCCTTATAGA AGAAGCCTAC CAGGTTTGAT ATATCAGCCT
6701  TGAAAACCTA CATAGTATTT ACATTATATC GAGTCTATGA GACATATTTA
6751  GTAATGCATA TGTATGTGTG TGTGTGCATG TATGTGTGTA AATACATATG
6801  TTCATAGAAA AATGTGTAAA AAGAGATCAT GAATTTAAGA GAGAACTGGG
6851  ACAATTTTTT TCAGGGAGTT GTAATCAGGA AAGTTAAGGG AAAAATGTTG
6901  TAATTAAAAT TCAGGCTCAG AAACAAACAA AGGAAAAGAA AAAAAAACAA
6951  CAACAACAAC AAAAAAACAA AACAAAGGAG AAGCTGTATG GCCACAATAG
7001  CATCTACAGC TAACTGTGAA AGGATAATGG AACAAGTTAT GTACTGCCTA
7051  GAGCAGTATG ATGCCTAAAT CATCTCGACA TGGAGGAAAA TAGAACAAAG
7101  ACACTCTACA TAGACTATGA TAGAAATCAA AATAAGGTGT AAGACATAGA
7151  ACATTAGTTT TGTTTGTTGT TCAAAGAGAC TCACATTCCC ACAAAAAAAT
7201  CTGTGGGATT TTACAGGTCT GCAATAAGCT GCTGACCTGA TGATTTCTGC
7251  AGCTGTGCCT ACCCTTTGCT GATTTGCATG TACCCAAAGC ATAGCTTACT
7301  GACATGAGGA TTTCTTCATA GTCAGGTCAC ACCCTTTGCT GGAGTCAGAA
7351  TCACACTGAT CACACACAGT CATGAGTGTG CTCACTCAGG TCCTGGCGTT
7401  GCTGCTGCTG TGGCTTACAG GTAATGAAGA CAGCACTAGA ATTTTATTGA
7451  GCTTCCTGTA CACTGTGCTG CTTGTCTCTG TGAAAATTCT CTTGTGAATT
7501  AATCATGTGG GGATCTGTTT TCAATTTTTC AATTGTAGGT ACGCGTTGTG
7551  ACATTCTGCT GACCCAGTCT CCAGCCACCC TGTCTCTGAG TCCAGGAGAA
7601  AGAGCCACTT TCTCCTGCAG GGCCAGTCAG AACATTGGCA CAAGCATACA
7651  GTGGTATCAA CAAAAAACAA ATGGTGCTCC AAGGCTTCTC ATAAGGTCTT
7701  CTTCTGAGTC TATCTCTGGG ATCCCTTCCA GGTTTAGTGG CAGTGGATCA
7751  GGGACAGATT TTACTCTTAC CATCAGCAGT CTGGAGCCTG AAGATTTTGC
7801  AGTGTATTAC TGTCAACAAA GTAATACCTG GCCATTCACG TTCGGCCAGG
7851  GGACCAAGCT TGAAATCAAA CGTAAGTAGA ATCCAAAGTC TCTTTCTTCC
7901  GTTGTCTATG TCTGTGGCTT CTATGTCTAA AAATGATGTA TAAAATCTTA
7951  CTCTGAAACC AGATTCTGGC ACTCTCCAAG GCAAAGATAC AGAGTAACTC
8001  CGTAAGCAAA GCTGGGAATA GGCTAGACAT GTTCTCTGGA GAATGAATGC
8051  CAGTGTAATA ATTAACACAA GTGATAGTTT CAGAAATGCT CTAGTT
SEQ ID NO：40
表达载体HCVHESp20的核苷酸序列
   1  CTAGAGAGGT CTGGTGGAGC CTGCAAAAGT CCAGCTTTCA AAGGAACACA
  51  GAAGTATGTG TATGGAATAT TAGAAGATGT TGCTTTTACT CTTAAGTTGG
 101  TTCCTAGGAA AAATAGTTAA ATACTGTGAC TTTAAAATGT GAGAGGGTTT
 151  TCAAGTACTC ATTTTTTTAA ATGTCCAAAA TTTTTGTCAA TCAATTTGAG
 201  GTCTTGTTTG TGTAGAACTG ACATTACTTA AAGTTTAACC GAGGAATGGG
 251  AGTGAGGCTC TCTCATACCC TATTCAGAAC TGACTTTTAA CAATAATAAA
 301  TTAAGTTTAA AATATTTTTA AATGAATTGA GCAATGTTGA GTTGGAGTCA
 351  AGATGGCCGA TCAGAACCAG AACACCTGCA GCAGCTGGCA GGAAGCAGGT
 401  CATGTGGCAA GGCTATTTGG GGAAGGGAAA ATAAAACCAC TAGGTAAACT
 451  TGTAGCTGTG GTTTGAAGAA GTGGTTTTGA AACACTCTGT CCAGCCCCAC
 501  CAAACCGAAA GTCCAGGCTG AGCAAAACAC CACCTGGGTA ATTTGCATTT
 551  CTAAAATAAG TTGAGGATTC AGCCGAAACT GGAGAGGTCC TCTTTTAACT
 601  TATTGAGTTC AACCTTTTAA TTTTAGCTTG AGTAGTTCTA GTTTCCCCAA
 651  ACTTAAGTTT ATCGACTTCT AAAATGTATT TAAGCTTTCT GGGGCAGGCC
 701  AGGCCTGACC TTGGCTTTGG GGCAGGGAGG GGGCTAAGGT GAGGCAGGTG
 751  GCGCCAGCCA GGTGCACACC CAATGCCCAT GAGCCCAGAC ACTGGACGCT
 801  GAACCTCGCG GACAGTTAAG AACCCAGGGG CCTCTGCGCC CTGGGCCCAG
 851  CTCTGTCCCA CACCGCGGTC ACATGGCACC ACCTCTCTTG CAGCCTCCAC
 901  CAAGGGCCCA TCGGTCTTCC CCCTGGCACC CTCCTCCAAG AGCACCTCTG
 951  GGGGCACAGC GGCCCTGGGC TGCCTGGTCA AGGACTACTT CCCCGAACCG
1001  GTGACGGTGT CGTGGAACTC AGGCGCCCTG ACCAGCGGCG TGCACACCTT
1051  CCCGGCTGTC CTACAGTCCT CAGGACTCTA CTCCCTCAGC AGCGTGGTGA
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1251  ACGCATCCCG GCTATGCAGT CCCAGTCCAG GGCAGCAAGG CAGGCCCCGT
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1651  GCTCAAGGCG GGACAGGTGC CCTAGAGTAG CCTGCATCCA GGGACAGGCC
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1951  CGTGTGGTCA GCGTCCTCAC CGTCCTGCAC CAGGACTGGC TGAATGGCAA
2001  GGAGTACAAG TGCAAGGTCT CCAACAAAGC CCTCCCAGCC CCCATCGAGA
2051  AAACCATCTC CAAAGCCAAA GGTGGGACCC GTGGGGTGCG AGGGCCACAT
2101  GGACAGAGGC CGGCTCGGCC CACCCTCTGC CCTGAGAGTG ACCGCTGTAC
2151  CAACCTCTGT CCCTACAGGG CAGCCCCGAG AACCACAGGT GTACACCCTG
2201  CCCCCATCCC GGGAGGAGAT GACCAAGAAC CAGGTCAGCC TGACCTGCCT
2251  GGTCAAAGGC TTCTATCCCA GCGACATCGC CGTGGAGTGG GAGAGCAATG
2301  GGCAGCCGGA GAACAACTAC AAGACCACGC CTCCCGTGCT GGACTCCGAC
2351  GGCTCCTTCT TCCTCTATAG CAAGCTCACC GTGGACAAGA GCAGGTGGCA
2401  GCAGGGGAAC GTCTTCTCAT GCTCCGTGAT GCATGAGGCT CTGCACAACC
2451  ACTACACGCA GAAGAGCCTC TCCCTGTCCC CGGGTAAATG AGTGCGACGG
2501  CCGGCAAGCC CCCGCTCCCC GGGCTCTCGC GGTCGCACGA GGATGCTTGG
2551  CACGTACCCC GTCTACATAC TTCCCAGGCA CCCAGCATGG AAATAAAGCA
2601  CCCACCACTG CCCTGGGCCC CTGCGAGACT GTGATGGTTC TTTCCACGGG
2651  TCAGGCCGAG TCTGAGGCCT GAGTGGCATG AGGGAGGCAG AGCGGGTCCC
2701  ACTGTCCCCA CACTGGCCCA GGCTGTGCAG GTGTGCCTGG GCCGCCTAGG
2751  GTGGGGCTCA GCCAGGGGCT GCCCTCGGCA GGGTGGGGGA TTTGCCAGCG
2801  TGGCCCTCCC TCCAGCAGCA GCTGCCCTGG GCTGGGCCAC GAGAAGCCCT
2851  AGGAGCCCCT GGGGACAGAC ACACAGCCCC TGCCTCTGTA GGAGACTGTC
2901  CTGTCCTGTG AGCGCCCTGT CCTCCGACCC CGATGCCCAC TCGGGGGCAT
2951  GCCTAGTCCA TGCGCGTAGG GACAGGCCCT CCCTCACCCA TCTACCCCCA
3001  CGGCACTAAC CCCTGGCAGC CCTGCCCAGC CTCGCACCCG CATGGGGACA
3051  CAACCGACTC CGGGGACATG CACTCTCGGG CCCTGTGGAG GGACTGGTGC
3101  AGATGCCCAC ACACACACTC AGCCCAGACC CGTTCAACAA ACCCCGCACT
3151  GAGGTTGGTC GAGCGGGAGT GCGGCCAGAG CCTGCCTCGG CCGTCAGGGA
3201  GGACTCCCGG GCTCACTCGA AGGAGGTGCC ACCATTTCAG CTTTGGTAGC
3251  TTTTCTTCTT CTTTTAAATT TTCTAAAGCT CATTAATTGT CTTTGATGTT
3301  TCTTTTGTGA TGACAATAAA ATATCCTTTT TAAGTCTTGT ACTTCGTGAT
3351  GGGAGCCGCC TTCCTGTGTC CACGCGCCTC CTGCCCCCGG TGGGAAGCAC
3401  GGTCAGGAGG AGGCTGGTCC AGCTGCACCT CGGGGGCTCC CTGCACTCGC
3451  CCCCCGCCTC CTGCAGCCAC ACGCATTGCC CGAGCGACCC TCCCTGGCCC
3501  CTGTCACTAC ATGGACCCCT GGGGCTTCTC CTCTTTTCTA CATGGATGCA
3551  GTTTCTCCTC CTGCTGGGCA CGGTGCTGCC TGCCCTGGTC ACTCTGCGGG
3601  GGACAGGGCC TCCAGGGAAA GCTGGGTCGA GGCTGGGAGC TGGCTCAGGC
3651  TGGCCAGGCA GAGCCACAGG GAGGGCCTTC CAGAACCAAC CATGGTCCGA
3701  AGCGAGAGGT GGGTGTCAGA TCCAGACATG ATAAGATACA TTGATGAGTT
3751  TGGACAAACC ACAACTAGAA TGCAGTGAAA AAAATGCTTT ATTTGTGAAA
3801  TTTGTGATGC TATTGCTTTA TTTGTAACCA TTATAAGCTG CAATAAACAA
3851  GTTAACAACA ACAATTGCAT TCATTTTATG TTTCAGGTTC AGGGGGAGGT
3901  GTGGGAGGTT TTTTAAAGCA AGTAAAACCT CTACAAATGT GGTATGGCTG
3951  ATTATGATCT CTAGTCAAGG CACTATACAT CAAATATTCC TTATTAACCC
4001  CTTTACAAAT TAAAAAGCTA AAGGTACACA ATTTTTGAGC ATAGTTATTA
4051  ATAGCAGACA CTCTATGCCT GTGTGGAGTA AGAAAAAACA GTATGTTATG
4101  ATTATAACTG TTATGCCTAC TTATAAAGGT TACAGAATAT TTTTCCATAA
4151  TTTTCTTGTA TAGCAGTGCA GCTTTTTCCT TTGTGGTGTA AATAGCAAAG
4201  CAAGCAAGAG TTCTATTACT AAACACAGCA TGACTCAAAA AACTTAGCAA
4251  TTCTGAAGGA AAGTCCTTGG GGTCTTCTAC CTTTCTCTTC TTTTTTGGAG
4301  GAGTAGAATG TTGAGAGTCA GCAGTAGCCT CATCATCACT AGATGGCATT
4351  TCTTCTGAGC AAAACAGGTT TTCCTCATTA AAGGCATTCC ACCACTGCTC
4401  CCATTCATCA GTTCCATAGG TTGGAATCTA AAATACACAA ACAATTAGAA
4451  TCAGTAGTTT AACACATTAT ACACTTAAAA ATTTTATATT TACCTTAGAG
4501  CTTTAAATCT CTGTAGGTAG TTTGTCCAAT TATGTCACAC CACAGAAGTA
4551  AGGTTCCTTC ACAAAGATCC GGACCAAAGC GGCCATCGTG CCTCCCCACT
4601  CCTGCAGTTC GGGGGCATGG ATGCGCGGAT AGCCGCTGCT GGTTTCCTGG
4651  ATGCCGACGG ATTTGCACTG CCGGTAGAAC TCCGCGAGGT CGTCCAGCCT
4701  CAGGCAGCAG CTGAACCAAC TCGCGAGGGG ATCGAGCCCG GGGTGGGCGA
4751  AGAACTCCAG CATGAGATCC CCGCGCTGGA GGATCATCCA GCCGGCGTCC
4801  CGGAAAACGA TTCCGAAGCC CAACCTTTCA TAGAAGGCGG CGGTGGAATC
4851  GAAATCTCGT GATGGCAGGT TGGGCGTCGC TTGGTCGGTC ATTTCGAACC
4901  CCAGAGTCCC GCTCAGAAGA ACTCGTCAAG AAGGCGATAG AAGGCGATGC
4951  GCTGCGAATC GGGAGCGGCG ATACCGTAAA GCACGAGGAA GCGGTCAGCC
5001  CATTCGCCGC CAAGCTCTTC AGCAATATCA CGGGTAGCCA ACGCTATGTC
5051  CTGATAGCGG TCCGCCACAC CCAGCCGGCC ACAGTCGATG AATCCAGAAA
5101  AGCGGCCATT TTCCACCATG ATATTCGGCA AGCAGGCATC GCCATGGGTC
5151  ACGACGAGAT CCTCGCCGTC GGGCATGCGC GCCTTGAGCC TGGCGAACAG
5201  TTCGGCTGGC GCGAGCCCCT GATGCTCTTC GTCCAGATCA TCCTGATCGA
5251  CAAGACCGGC TTCCATCCGA GTACGTGCTC GCTCGATGCG ATGTTTCGCT
5301  TGGTGGTCGA ATGGGCAGGT AGCCGGATCA AGCGTATGCA GCCGCCGCAT
5351  TGCATCAGCC ATGATGGATA CTTTCTCGGC AGGAGCAAGG TGAGATGACA
5401  GGAGATCCTG CCCCGGCACT TCGCCCAATA GCAGCCAGTC CCTTCCCGCT
5451  TCAGTGACAA CGTCGAGCAC AGCTGCGCAA GGAACGCCCG TCGTGGCCAG
5501  CCACGATAGC CGCGCTGCCT CGTCCTGCAG TTCATTCAGG GCACCGGACA
5551  GGTCGGTCTT GACAAAAAGA ACCGGGCGCC CCTGCGCTGA CAGCCGGAAC
5601  ACGGCGGCAT CAGAGCAGCC GATTGTCTGT TGTGCCCAGT CATAGCCGAA
5651  TAGCCTCTCC ACCCAAGCGG CCGGAGAACC TGCGTGCAAT CCATCTTGTT
5701  CAATCATGCG AAACGATCCT CATCCTGTCT CTTGATCAGA TCTTGATCCC
5751  CTGCGCCATC AGATCCTTGG CGGCAAGAAA GCCATCCAGT TTACTTTGCA
5801  GGGCTTCCCA ACCTTACCAG AGGGCGCCCC AGCTGGCAAT TCCGGTTCGC
5851  TTGCTGTCCA TAAAACCGCC CAGTCTAGCT ATCGCCATGT AAGCCCACTG
5901  CAAGCTACCT GCTTTCTCTT TGCGCTTGCG TTTTCCCTTG TCCAGATAGC
5951  CCAGTAGCTG ACATTCATCC GGGGTCAGCA CCGTTTCTGC GGACTGGCTT
6001  TCTACGTGTT CCGCTTCCTT TAGCAGCCCT TGCGCCCTGA GTGCTTGCGG
6051  CAGCGTGAAG CTTTTTGCAA AAGCCTAGGC CTCCAAAAAA GCCTCCTCAC
6101  TACTTCTGGA ATAGCTCAGA GGCCGAGGCG GCCTCGGCCT CTGCATAAAT
6151  AAAAAAAATT AGTCAGCCAT GGGGCGGAGA ATGGGCGGAA CTGGGCGGAG
6201  TTAGGGGCGG GATGGGCGGA GTTAGGGGCG GGACTATGGT TGCTGACTAA
6251  TTGAGATGCA TGCTTTGCAT ACTTCTGCCT GCTGGGGAGC CTGGGGACTT
6301  TCCACACCTG GTTGCTGACT AATTGAGATG CATGCTTTGC ATACTTCTGC
6351  CTGCTGGGGA GCCTGGGGAC TTTCCACACC CTAACTGACA CACATTCCAC
6401  AGCTGCCTCG CGCGTTTCGG TGATGACGGT GAAAACCTCT GACACATGCA
6451  GCTCCCGGAG ACGGTCACAG CTTGTCTGTA AGCGGATGCC GGGAGCAGAC
6501  AAGCCCGTCA GGGCGCGTCA GCGGGTGTTG GCGGGTGTCG GGGCGCAGCC
6551  ATGACCCAGT CACGTAGCGA TAGCGGAGTG TATACTGGCT TAACTATGCG
6601  GCATCAGAGC AGATTGTACT GAGAGTGCAC CATATGCGGT GTGAAATACC
6651  GCACAGATGC GTAAGGAGAA AATACCGCAT CAGGCGCTCT TCCGCTTCCT
6701  CGCTCACTGA CTCGCTGCGC TCGGTCGTTC GGCTGCGGCG AGCGGTATCA
6751  GCTCACTCAA AGGCGGTAAT ACGGTTATCC ACAGAATCAG GGGATAACGC
6801  AGGAAAGAAC ATGTGAGCAA AAGGCCAGCA AAAGGCCAGG AACCGTAAAA
6851  AGGCCGCGTT GCTGGCGTTT TTCCATAGGC TCCGCCCCCC TGACGAGCAT
6901  CACAAAAATC GACGCTCAAG TCAGAGGTGG CGAAACCCGA CAGGACTATA
6951  AAGATACCAG GCGTTTCCCC CTGGAAGCTC CCTCGTGCGC TCTCCTGTTC
7001  CGACCCTGCC GCTTACCGGA TACCTGTCCG CCTTTCTCCC TTCGGGAAGC
7051  GTGGCGCTTT CTCATAGCTC ACGCTGTAGG TATCTCAGTT CGGTGTAGGT
7101  CGTTCGCTCC AAGCTGGGCT GTGTGCACGA ACCCCCCGTT CAGCCCGACC
7151  GCTGCGCCTT ATCCGGTAAC TATCGTCTTG AGTCCAACCC GGTAAGACAC
7201  GACTTATCGC CACTGGCAGC AGCCACTGGT AACAGGATTA GCAGAGCGAG
7251  GTATGTAGGC GGTGCTACAG AGTTCTTGAA GTGGTGGCCT AACTACGGCT
7301  ACACTAGAAG GACAGTATTT GGTATCTGCG CTCTGCTGAA GCCAGTTACC
7351  TTCGGAAAAA GAGTTGGTAG CTCTTGATCC GGCAAACAAA CCACCGCTGG
7401  TAGCGGTGGT TTTTTTGTTT GCAAGCAGCA GATTACGCGC AGAAAAAAAG
7451  GATCTCAAGA AGATCCTTTG ATCTTTTCTA CGGGGTCTGA CGCTCAGTGG
7501  AACGAAAACT CACGTTAAGG GATTTTGGTC ATGAGATTAT CAAAAAGGAT
7551  CTTCACCTAG ATCCTTTTAA ATTAAAAATG AAGTTTTAAA TCAATCTAAA
7601  GTATATATGA GTAAACTTGG TCTGACAGTT ACCAATGCTT AATCAGTGAG
7651  GCACCTATCT CAGCGATCTG TCTATTTCGT TCATCCATAG TTGCCTGACT
7701  CCCCGTCGTG TAGATAACTA CGATACGGGA GGGCTTACCA TCTGGCCCCA
7751  GTGCTGCAAT GATACCGCGA GACCCACGCT CACCGGCTCC AGATTTATCA
7801  GCAATAAACC AGCCAGCCGG AAGGGCCGAG CGCAGAAGTG GTCCTGCAAC
7851  TTTATCCGCC TCCATCCAGT CTATTAATTG TTGCCGGGAA GCTAGAGTAA
7901  GTAGTTCGCC AGTTAATAGT TTGCGCAACG TTGTTGCCAT TGCTGCAGGC
7951  ATCGTGGTGT CACGCTCGTC GTTTGGTATG GCTTCATTCA GCTCCGGTTC
8001  CCAACGATCA AGGCGAGTTA CATGATCCCC CATGTTGTGC AAAAAAGCGG
8051  TTAGCTCCTT CGGTCCTCCG ATCGTTGTCA GAAGTAAGTT GGCCGCAGTG
 8101  TTATCACTCA TGGTTATGGC AGCACTGCAT AATTCTCTTA CTGTCATGCC
 8151  ATCCGTAAGA TGCTTTTCTG TGACTGGTGA GTACTCAACC AAGTCATTCT
 8201  GAGAATAGTG TATGCGGCGA CCGAGTTGCT CTTGCCCGGC GTCAACACGG
 8251  GATAATACCG CGCCACATAG CAGAACTTTA AAAGTGCTCA TCATTGGAAA
 8301  ACGTTCTTCG GGGCGAAAAC TCTCAAGGAT CTTACCGCTG TTGAGATCCA
 8351  GTTCGATGTA ACCCACTCGT GCACCCAACT GATCTTCAGC ATCTTTTACT
 8401  TTCACCAGCG TTTCTGGGTG AGCAAAAACA GGAAGGCAAA ATGCCGCAAA
 8451  AAAGGGAATA AGGGCGACAC GGAAATGTTG AATACTCATA CTCTTCCTTT
 8501  TTCAATATTA TTGAAGCATT TATCAGGGTT ATTGTCTCAT GAGCGGATAC
 8551  ATATTTGAAT GTATTTAGAA AAATAAACAA ATAGGGGTTC CGCGCACATT
 8601  TCCCCGAAAA GTGCCACCTG ACGTCTAAGA AACCATTATT ATCATGACAT
 8651  TAACCTATAA AAATAGGCGT ATCACGAGGC CCTTTCGTCT TCAAGAATTC
 8701  GAGCTCGGTA CCCATCAGCC AAAAAGCATG CCTGCCACAC AACATCAATT
 8751  TCTGGAAAAC GCTACACTTA ATTATTTCTA GTAGAACAGC TCTTTGGTTT
 8801  GCCAAAAAGA ATCACCTATA GTGGCATCTA AGCACAAAAA GGAGAAAAAA
 8851  ATCACAAAGA AATGATTGAG AGGCATAATA AAAATTATCA AAAAATTATG
 8901  AGTTTTACGA TTTCATCTTT TTCCAAGTTG AAATCATAGG GTGGCTTTAA
 8951  CACAGTGACA AGGAATGTGC ATGCTGCCAT TATGGTGCTC TGCCTAAAAT
 9001  GGTTGGAGCC TTGTCATGCT ACAGAGAAAC TGTCATACAG CAGGGGGTGC
 9051  CAAATTTCCA TATTTTTTTA TATCATTGAG CAGGTGCACA GAAGACCAGA
 9101  AAGCACTTTC TATCAGGCTG GCCTTCCTCT TCCTTTCCAG TATGAAGCAA
 9151  AAACTGCCAA TGAAACTAGC AATTGTTAAA TTCCTTTTTC AAACAGTATT
 9201  TGTGCTATCA GAACATAGTG CATTCAAAAG TCTAGCCTGA GAGAACAACC
 9251  CAGTTTTATT CATTCCTCCT ACTACCTCTC TCATTCCCAC TGTTTGTGTT
 9301  CTCCCTCCCA TTTTAATTGT CTATCTAGTC CAAACTAAGC ACACGATCCA
 9351  GTCCACATTA AACAACATGT TTTCACTTTA AGTCAAATAC AAGACACCTT
 9401  TAATATCAGC CCTTGTTCAT AATCGTGCTT CTAGTGACTT AATGTACATG
 9451  TCACACTGTA CTGTTGGGTT TTGTGTCTCA TCATGAACAA TGTTGTGAAG
 9501  GTATTAAGTG GAGAGTAAGC AGAATTAGAT TCCTCTAATG ATGCACACCC
 9551  ACACTAAGAG CAGAAATAAT ATTAAAAATA GAAAAAAAAG TTTTACATGA
 9601  GATTTCAAAT ACCCAGGTAT GAGCTGCAGT TTCTTCAAGT TAAAGCATCG
 9651  AGGTTGTCAG TTACACTATT ACAGGAAACA TATGCAGAGT TTTTATTTTA
 9701  GTATATTAGT TTTCACATAT GTGGAATTAC TATTAAACTA TTCTTTCTTT
 9751  TCAAATGCTT ACCATTGTAA ATGAGTTTGT GACTTTGTGT AGGTGAGTGC
 9801  ACATGACTCT GGATGCCTAA GAGGACTGAA GAAGTTGGAG TTATAGGTAG
 9851  TTTTATTCTA CTTGACTGTT CAGTGCTAAA AATACAACTG AGGTCCTTTA
 9901  AACTGCTGTT CATGAACTTC TTAATTGATA TATCTCATGA GATCTCTAAA
 9951  CTATTTTTAT TATGACACGT TTCACCATTT TCACTGTAAC GATTTTTATG
10001  TTTTATATTA ATGTAACTAT ATGACACTTC CCAAAATCCC CATATTCACA
10051  ATTGAACTGT TTCAAAGTTT TACCTTGACT TATGGGAAAT GAAAACCCAC
10101  ATTTTATAAT TTTAAAATGA AATGTTTATT TTATATTTCT GCAAATTTCA
10151  CAAGGAAAGA TTAGTCACTG GTGTGTGAGA GCAGAGGAGC ATAAGAGTTC
10201  AGGAATAGAA TCCATTATGA TTCTGGAGGC AAGGAAGAAC TGATGCCAAG
10251  GTTTCAGTAT AAGAGCAGTA TCCACTGGAA AGGATAAAGT CACTACATCT
10301  GAGCACAGAG CAGGACATCT ACATAATGAG TGGTCACTAA TGGGCCACTG
10351  TTACACTGTT ATATGTATAA GGCTCAAGAA TGAGCACTGA GGCTGTAAGG
10401  TGTATGGGTG AGGACATCAG GATGTAAACC CAGCTCAGGT AGAGGACTCA
10451  GAGGACAGCA CAGTCAGCAT GAACTAATAA ACATCAGATA AGATAAGGCA
10501  CAAGCTCAGC TATATAGGGT AAGGGATCTT TGTAAATCTG ATTGTGCATC
10551  CAGTCTAGTT CAATGTGACT TAGGAAGCCC AGTCATATGC AAATCTAGAG
10601  AAGACTTTAG AGTAGAAATC TGAGGCTCAC CTCACATACC AGCAAGCGAG
10651  TGACCAGTTA GTCTTAAGGC ACCACTTCTT AGACATCATG GCTTGGGTGT
10701  GGACCTTGCC ATTCCTGATG GCAGCTGCCC AAAGTAAGAC ATCAGAAAAA
10751  AGAGTTCCAA GGGGAATTGA AGCAGTTCCA TGAATACTCA CCTTCCTGTG
10801  TTCTTTTCAC AGGTGTCCAG GCAGAGGTGC AGCTGGTGGA GTCAGGAGCC
10851  GAAGTGAAAA AGCCTGGGGC TTCAGTGAAG GTGTCCTGCA AGGCCTCTGG
10901  ATACACATTC ACTAATTATA TTATCCACTG GGTGAAGCAG GAGCCTGGTC
10951  AGGGCCTTGA ATGGATTGGA TATTTTAATC CTTACAATCA TGGTACTAAG
11001  TACAATGAGA AGTTCAAAGG CAGGGCCACA CTAACTGCAA ACAAATCCAT
11051  CAGCACAGCC TACATGGAGC TCAGCAGCCT GCGCTCTGAG GACACTGCGG
11101  TCTACTACTG TGCAAGATCA GGACCCTATG CCTGGTTTGA CACCTGGGGC
11151  CAAGGGACCA CGGTCACCGT CTCCTCAGGT AAGAATGGCC ACTCTAGGGC
11201  CTTTGTTTTC TGCTGCTGCC TGTGGGATTT CATGAGCATT GCAAAGTTGT
11251  CCTCGGGACA TGTTCCGAGG GGACCTGGGC GGACTGGCCA GGAGGGGACG
11301  GGCACTGGGG TGCCTTGAGG ATCTGGGAGC CTCTGTGGAT TTTCCGATGC
11351  CTTTGGAAAA TGGGACTGAG GTTGGGTGCG TCTGAGACAGTAACTCAGCC
11401  TGGGGGCTTG GTGAAGATCG CCGCACAGCA GCGAGTCCGT GAAATATCTT
11451  ATTTAGACTT GTGAGGTGCG CTGTGTGTCA ATTTACATCT TAAATCCTTT
11501  ATTGGCTGGA AAGAGAATTG TTGGAGTGGG TGAATCCAGC CAGGAGGGAC
11551  GCGGGGGGAT CCA
SEQ ID NO：41
表达载体HCVHQSp20的核苷酸序列
  1  CTAGAGAGGT CTGGTGGAGC CTGCAAAAGT CCAGCTTTCA AAGGAACACA
 51  GAAGTATGTG TATGGAATAT TAGAAGATGT TGCTTTTACT CTTAAGTTGG
101  TTCCTAGGAA AAATAGTTAA ATACTGTGAC TTTAAAATGT GAGAGGGTTT
151  TCAAGTACTC ATTTTTTTAA ATGTCCAAAA TTTTTGTCAA TCAATTTGAG
201  GTCTTGTTTG TGTAGAACTG ACATTACTTA AAGTTTAACC GAGGAATGGG
251  AGTGAGGCTC TCTCATACCC TATTCAGAAC TGACTTTTAA CAATAATAAA
301  TTAAGTTTAA AATATTTTTA AATGAATTGA GCAATGTTGA GTTGGAGTCA
351  AGATGGCCGA TCAGAACCAG AACACCTGCA GCAGCTGGCA GGAAGCAGGT
401  CATGTGGCAA GGCTATTTGG GGAAGGGAAA ATAAAACCAC TAGGTAAACT
 451  TGTAGCTGTG GTTTGAAGAA GTGGTTTTGA AACACTCTGT CCAGCCCCAC
 501  CAAACCGAAA GTCCAGGCTG AGCAAAACAC CACCTGGGTA ATTTGCATTT
 551  CTAAAATAAG TTGAGGATTC AGCCGAAACT GGAGAGGTCC TCTTTTAACT
 601  TATTGAGTTC AACCTTTTAA TTTTAGCTTG AGTAGTTCTA GTTTCCCCAA
 651  ACTTAAGTTT ATCGACTTCT AAAATGTATT TAAGCTTTCT GGGGCAGGCC
 701  AGGCCTGACC TTGGCTTTGG GGCAGGGAGG GGGCTAAGGT GAGGCAGGTG
 751  GCGCCAGCCA GGTGCACACC CAATGCCCAT GAGCCCAGAC ACTGGACGCT
 801  GAACCTCGCG GACAGTTAAG AACCCAGGGG CCTCTGCGCC CTGGGCCCAG
 851  CTCTGTCCCA CACCGCGGTC ACATGGCACC ACCTCTCTTG CAGCCTCCAC
 901  CAAGGGCCCA TCGGTCTTCC CCCTGGCACC CTCCTCCAAG AGCACCTCTG
 951  GGGGCACAGC GGCCCTGGGC TGCCTGGTCA AGGACTACTT CCCCGAACCG
1001  GTGACGGTGT CGTGGAACTC AGGCGCCCTG ACCAGCGGCG TGCACACCTT
1051  CCCGGCTGTC CTACAGTCCT CAGGACTCTA CTCCCTCAGC AGCGTGGTGA
1101  CCGTGCCCTC CAGCAGCTTG GGCACCCAGA CCTACATCTG CAACGTGAAT
1151  CACAAGCCCA GCAACACCAA GGTGGACAAG AGAGTTGGTG AGAGGCCAGC
1201  ACAGGGAGGG AGGGTGTCTG CTGGAAGCCA GGCTCAGCGC TCCTGCCTGG
1251  ACGCATCCCG GCTATGCAGT CCCAGTCCAG GGCAGCAAGG CAGGCCCCGT
1301  CTGCCTCTTC ACCCGGAGGC CTCTGCCCGC CCCACTCATG CTCAGGGAGA
1351  GGGTCTTCTG GCTTTTTCCC CAGGCTCTGG GCAGGCACAG GCTAGGTGCC
1401  CCTAACCCAG GCCCTGCACA CAAAGGGGCA GGTGCTGGGC TCAGACCTGC
1451  CAAGAGCCAT ATCCGGGAGG ACCCTGCCCC TGACCTAAGC CCACCCCAAA
1501  GGCCAAACTC TCCACTCCCT CAGCTCGGAC ACCTTCTCTC CTCCCAGATT
1551  CCAGTAACTC CCAATCTTCT CTCTGCAGAG CCCAAATCTT GTGACAAAAC
1601  TCACACATGC CCACCGTGCC CAGGTAAGCC AGCCCAGGCC TCGCCCTCCA
1651  GCTCAAGGCG GGACAGGTGC CCTAGAGTAG CCTGCATCCA GGGACAGGCC
1701  CCAGCCGGGT GCTGACACGT CCACCTCCAT CTCTTCCTCA GCACCTGAAC
1751  TCCTGGGGGG ACCGTCAGTC TTCCTCTTCC CCCCAAAACC CAAGGACACC
1801  CTCATGATCT CCCGGACCCC TGAGGTCACA TGCGTGGTGG TGGACGTGAG
1851  CCACGAAGAC CCTGAGGTCA AGTTCAACTG GTACGTGGAC GGCGTGGAGG
1901  TGCATAATGC CAAGACAAAG CCGCGGGAGG AGCAGTACAA CAGCACGTAC
1951  CGTGTGGTCA GCGTCCTCAC CGTCCTGCAC CAGGACTGGC TGAATGGCAA
2001  GGAGTACAAG TGCAAGGTCT CCAACAAAGC CCTCCCAGCC CCCATCGAGA
2051  AAACCATCTC CAAAGCCAAA GGTGGGACCC GTGGGGTGCG AGGGCCACAT
2101  GGACAGAGGC CGGCTCGGCC CACCCTCTGC CCTGAGAGTG ACCGCTGTAC
2151  CAACCTCTGT CCCTACAGGG CAGCCCCGAG AACCACAGGT GTACACCCTG
2201  CCCCCATCCC GGGAGGAGAT GACCAAGAAC CAGGTCAGCC TGACCTGCCT
2251  GGTCAAAGGC TTCTATCCCA GCGACATCGC CGTGGAGTGG GAGAGCAATG
2301  GGCAGCCGGA GAACAACTAC AAGACCACGC CTCCCGTGCT GGACTCCGAC
2351  GGCTCCTTCT TCCTCTATAG CAAGCTCACC GTGGACAAGA GCAGGTGGCA
2401  GCAGGGGAAC GTCTTCTCAT GCTCCGTGAT GCATGAGGCT CTGCACAACC
2451  ACTACACGCA GAAGAGCCTC TCCCTGTCCC CGGGTAAATG AGTGCGACGG
2501  CCGGCAAGCC CCCGCTCCCC GGGCTCTCGC GGTCGCACGA GGATGCTTGG
2551  CACGTACCCC GTCTACATAC TTCCCAGGCA CCCAGCATGG AAATAAAGCA
2601  CCCACCACTG CCCTGGGCCC CTGCGAGACT GTGATGGTTC TTTCCACGGG
2651  TCAGGCCGAG TCTGAGGCCT GAGTGGCATG AGGGAGGCAG AGCGGGTCCC
2701  ACTGTCCCCA CACTGGCCCA GGCTGTGCAG GTGTGCCTGG GCCGCCTAGG
2751  GTGGGGCTCA GCCAGGGGCT GCCCTCGGCA GGGTGGGGGA TTTGCCAGCG
2801  TGGCCCTCCC TCCAGCAGCA GCTGCCCTGG GCTGGGCCAC GAGAAGCCCT
2851  AGGAGCCCCT GGGGACAGAC ACACAGCCCC TGCCTCTGTA GGAGACTGTC
2901  CTGTCCTGTG AGCGCCCTGT CCTCCGACCC CGATGCCCAC TCGGGGGCAT
2951  GCCTAGTCCA TGCGCGTAGG GACAGGCCCT CCCTCACCCA TCTACCCCCA
3001  CGGCACTAAC CCCTGGCAGC CCTGCCCAGC CTCGCACCCG CATGGGGACA
3051  CAACCGACTC CGGGGACATG CACTCTCGGG CCCTGTGGAG GGACTGGTGC
3101  AGATGCCCAC ACACACACTC AGCCCAGACC CGTTCAACAA ACCCCGCACT
3151  GAGGTTGGTC GAGCGGGAGT GCGGCCAGAG CCTGCCTCGG CCGTCAGGGA
3201  GGACTCCCGG GCTCACTCGA AGGAGGTGCC ACCATTTCAG CTTTGGTAGC
3251  TTTTCTTCTT CTTTTAAATT TTCTAAAGCT CATTAATTGT CTTTGATGTT
3301  TCTTTTGTGA TGACAATAAA ATATCCTTTT TAAGTCTTGT ACTTCGTGAT
3351  GGGAGCCGCC TTCCTGTGTC CACGCGCCTC CTGCCCCCGG TGGGAAGCAC
3401  GGTCAGGAGG AGGCTGGTCC AGCTGCACCT CGGGGGCTCC CTGCACTCGC
3451  CCCCCGCCTC CTGCAGCCAC ACGCATTGCC CGAGCGACCC TCCCTGGCCC
3501  CTGTCACTAC ATGGACCCCT GGGGCTTCTC CTCTTTTCTA CATGGATGCA
3551  GTTTCTCCTC CTGCTGGGCA CGGTGCTGCC TGCCCTGGTC ACTCTGCGGG
3601  GGACAGGGCC TCCAGGGAAA GCTGGGTCGA GGCTGGGAGC TGGCTCAGGC
3651  TGGCCAGGCA GAGCCACAGG GAGGGCCTTC CAGAACCAAC CATGGTCCGA
3701  AGCGAGAGGT GGGTGTCAGA TCCAGACATG ATAAGATACA TTGATGAGTT
3751  TGGACAAACC ACAACTAGAA TGCAGTGAAA AAAATGCTTT ATTTGTGAAA
3801  TTTGTGATGC TATTGCTTTA TTTGTAACCA TTATAAGCTG CAATAAACAA
3851  GTTAACAACA ACAATTGCAT TCATTTTATG TTTCAGGTTC AGGGGGAGGT
3901  GTGGGAGGTT TTTTAAAGCA AGTAAAACCT CTACAAATGT GGTATGGCTG
3951  ATTATGATCT CTAGTCAAGG CACTATACAT CAAATATTCC TTATTAACCC
4001  CTTTACAAAT TAAAAAGCTA AAGGTACACA ATTTTTGAGC ATAGTTATTA
4051  ATAGCAGACA CTCTATGCCT GTGTGGAGTA AGAAAAAACA GTATGTTATG
4101  ATTATAACTG TTATGCCTAC TTATAAAGGT TACAGAATAT TTTTCCATAA
4151  TTTTCTTGTA TAGCAGTGCA GCTTTTTCCT TTGTGGTGTA AATAGCAAAG
4201  CAAGCAAGAG TTCTATTACT AAACACAGCA TGACTCAAAA AACTTAGCAA
4251  TTCTGAAGGA AAGTCCTTGG GGTCTTCTAC CTTTCTCTTC TTTTTTGGAG
4301  GAGTAGAATG TTGAGAGTCA GCAGTAGCCT CATCATCACT AGATGGCATT
4351  TCTTCTGAGC AAAACAGGTT TTCCTCATTA AAGGCATTCC ACCACTGCTC
4401  CCATTCATCA GTTCCATAGG TTGGAATCTA AAATACACAA ACAATTAGAA
4451  TCAGTAGTTT AACACATTAT ACACTTAAAA ATTTTATATT TACCTTAGAG
4501  CTTTAAATCT CTGTAGGTAG TTTGTCCAAT TATGTCACAC CACAGAAGTA
4551  AGGTTCCTTC ACAAAGATCC GGACCAAAGC GGCCATCGTG CCTCCCCACT
4601  CCTGCAGTTC GGGGGCATGG ATGCGCGGAT AGCCGCTGCT GGTTTCCTGG
4651  ATGCCGACGG ATTTGCACTG CCGGTAGAAC TCCGCGAGGT CGTCCAGCCT
4701  CAGGCAGCAG CTGAACCAAC TCGCGAGGGG ATCGAGCCCG GGGTGGGCGA
4751  AGAACTCCAG CATGAGATCC CCGCGCTGGA GGATCATCCA GCCGGCGTCC
4801  CGGAAAACGA TTCCGAAGCC CAACCTTTCA TAGAAGGCGG CGGTGGAATC
4851  GAAATCTCGT GATGGCAGGT TGGGCGTCGC TTGGTCGGTC ATTTCGAACC
4901  CCAGAGTCCC GCTCAGAAGA ACTCGTCAAG AAGGCGATAG AAGGCGATGC
4951  GCTGCGAATC GGGAGCGGCG ATACCGTAAA GCACGAGGAA GCGGTCAGCC
5001  CATTCGCCGC CAAGCTCTTC AGCAATATCA CGGGTAGCCA ACGCTATGTC
5051  CTGATAGCGG TCCGCCACAC CCAGCCGGCC ACAGTCGATG AATCCAGAAA
5101  AGCGGCCATT TTCCACCATG ATATTCGGCA AGCAGGCATC GCCATGGGTC
5151  ACGACGAGAT CCTCGCCGTC GGGCATGCGC GCCTTGAGCC TGGCGAACAG
5201  TTCGGCTGGC GCGAGCCCCT GATGCTCTTC GTCCAGATCA TCCTGATCGA
5251  CAAGACCGGC TTCCATCCGA GTACGTGCTC GCTCGATGCG ATGTTTCGCT
5301  TGGTGGTCGA ATGGGCAGGT AGCCGGATCA AGCGTATGCA GCCGCCGCAT
5351  TGCATCAGCC ATGATGGATA CTTTCTCGGC AGGAGCAAGG TGAGATGACA
5401  GGAGATCCTG CCCCGGCACT TCGCCCAATA GCAGCCAGTC CCTTCCCGCT
5451  TCAGTGACAA CGTCGAGCAC AGCTGCGCAA GGAACGCCCG TCGTGGCCAG
5501  CCACGATAGC CGCGCTGCCT CGTCCTGCAG TTCATTCAGG GCACCGGACA
5551  GGTCGGTCTT GACAAAAAGA ACCGGGCGCC CCTGCGCTGA CAGCCGGAAC
5601  ACGGCGGCAT CAGAGCAGCC GATTGTCTGT TGTGCCCAGT CATAGCCGAA
5651  TAGCCTCTCC ACCCAAGCGG CCGGAGAACC TGCGTGCAAT CCATCTTGTT
5701  CAATCATGCG AAACGATCCT CATCCTGTCT CTTGATCAGA TCTTGATCCC
5751  CTGCGCCATC AGATCCTTGG CGGCAAGAAA GCCATCCAGT TTACTTTGCA
5801  GGGCTTCCCA ACCTTACCAG AGGGCGCCCC AGCTGGCAAT TCCGGTTCGC
5851  TTGCTGTCCA TAAAACCGCC CAGTCTAGCT ATCGCCATGT AAGCCCACTG
5901  CAAGCTACCT GCTTTCTCTT TGCGCTTGCG TTTTCCCTTG TCCAGATAGC
5951  CCAGTAGCTG ACATTCATCC GGGGTCAGCA CCGTTTCTGC GGACTGGCTT
6001  TCTACGTGTT CCGCTTCCTT TAGCAGCCCT TGCGCCCTGA GTGCTTGCGG
6051  CAGCGTGAAG CTTTTTGCAA AAGCCTAGGC CTCCAAAAAA GCCTCCTCAC
6101  TACTTCTGGA ATAGCTCAGA GGCCGAGGCG GCCTCGGCCT CTGCATAAAT
6151  AAAAAAAATT AGTCAGCCAT GGGGCGGAGA ATGGGCGGAA CTGGGCGGAG
6201  TTAGGGGCGG GATGGGCGGA GTTAGGGGCG GGACTATGGT TGCTGACTAA
6251  TTGAGATGCA TGCTTTGCAT ACTTCTGCCT GCTGGGGAGC CTGGGGACTT
6301  TCCACACCTG GTTGCTGACT AATTGAGATG CATGCTTTGC ATACTTCTGC
6351  CTGCTGGGGA GCCTGGGGAC TTTCCACACC CTAACTGACA CACATTCCAC
6401  AGCTGCCTCG CGCGTTTCGG TGATGACGGT GAAAACCTCT GACACATGCA
6451  GCTCCCGGAG ACGGTCACAG CTTGTCTGTA AGCGGATGCC GGGAGCAGAC
6501  AAGCCCGTCA GGGCGCGTCA GCGGGTGTTG GCGGGTGTCG GGGCGCAGCC
6551  ATGACCCAGT CACGTAGCGA TAGCGGAGTG TATACTGGCT TAACTATGCG
6601   GCATCAGAGC AGATTGTACT GAGAGTGCAC CATATGCGGT GTGAAATACC
6651   GCACAGATGC GTAAGGAGAA AATACCGCAT CAGGCGCTCT TCCGCTTCCT
6701   CGCTCACTGA CTCGCTGCGC TCGGTCGTTC GGCTGCGGCG AGCGGTATCA
6751   GCTCACTCAA AGGCGGTAAT ACGGTTATCC ACAGAATCAG GGGATAACGC
6801   AGGAAAGAAC ATGTGAGCAA AAGGCCAGCA AAAGGCCAGG AACCGTAAAA
6851   AGGCCGCGTT GCTGGCGTTT TTCCATAGGC TCCGCCCCCC TGACGAGCAT
6901   CACAAAAATC GACGCTCAAG TCAGAGGTGG CGAAACCCGA CAGGACTATA
6951   AAGATACCAG GCGTTTCCCC CTGGAAGCTC CCTCGTGCGC TCTCCTGTTC
7001   CGACCCTGCC GCTTACCGGA TACCTGTCCG CCTTTCTCCC TTCGGGAAGC
7051   GTGGCGCTTT CTCATAGCTC ACGCTGTAGG TATCTCAGTT CGGTGTAGGT
7101   CGTTCGCTCC AAGCTGGGCT GTGTGCACGA ACCCCCCGTT CAGCCCGACC
7151   GCTGCGCCTT ATCCGGTAAC TATCGTCTTG AGTCCAACCC GGTAAGACAC
7201   GACTTATCGC CACTGGCAGC AGCCACTGGT AACAGGATTA GCAGAGCGAG
7251   GTATGTAGGC GGTGCTACAG AGTTCTTGAA GTGGTGGCCT AACTACGGCT
7301   ACACTAGAAG GACAGTATTT GGTATCTGCG CTCTGCTGAA GCCAGTTACC
7351   TTCGGAAAAA GAGTTGGTAG CTCTTGATCC GGCAAACAAA CCACCGCTGG
7401   TAGCGGTGGT TTTTTTGTTT GCAAGCAGCA GATTACGCGC AGAAAAAAAG
7451   GATCTCAAGA AGATCCTTTG ATCTTTTCTA CGGGGTCTGA CGCTCAGTGG
7501   AACGAAAACT CACGTTAAGG GATTTTGGTC ATGAGATTAT CAAAAAGGAT
7551   CTTCACCTAG ATCCTTTTAA ATTAAAAATG AAGTTTTAAA TCAATCTAAA
7601   GTATATATGA GTAAACTTGG TCTGACAGTT ACCAATGCTT AATCAGTGAG
7651   GCACCTATCT CAGCGATCTG TCTATTTCGT TCATCCATAG TTGCCTGACT
7701   CCCCGTCGTG TAGATAACTA CGATACGGGA GGGCTTACCA TCTGGCCCCA
7751   GTGCTGCAAT GATACCGCGA GACCCACGCT CACCGGCTCC AGATTTATCA
7801   GCAATAAACC AGCCAGCCGG AAGGGCCGAG CGCAGAAGTG GTCCTGCAAC
7851   TTTATCCGCC TCCATCCAGT CTATTAATTG TTGCCGGGAA GCTAGAGTAA
7901   GTAGTTCGCC AGTTAATAGT TTGCGCAACG TTGTTGCCAT TGCTGCAGGC
7951   ATCGTGGTGT CACGCTCGTC GTTTGGTATG GCTTCATTCA GCTCCGGTTC
8001   CCAACGATCA AGGCGAGTTA CATGATCCCC CATGTTGTGC AAAAAAGCGG
8051   TTAGCTCCTT CGGTCCTCCG ATCGTTGTCA GAAGTAAGTT GGCCGCAGTG
8101   TTATCACTCA TGGTTATGGC AGCACTGCAT AATTCTCTTA CTGTCATGCC
8151   ATCCGTAAGA TGCTTTTCTG TGACTGGTGA GTACTCAACC AAGTCATTCT
8201   GAGAATAGTG TATGCGGCGA CCGAGTTGCT CTTGCCCGGC GTCAACACGG
8251   GATAATACCG CGCCACATAG CAGAACTTTA AAAGTGCTCA TCATTGGAAA
8301   ACGTTCTTCG GGGCGAAAAC TCTCAAGGAT CTTACCGCTG TTGAGATCCA
8351   GTTCGATGTA ACCCACTCGT GCACCCAACT GATCTTCAGC ATCTTTTACT
8401   TTCACCAGCG TTTCTGGGTG AGCAAAAACA GGAAGGCAAA ATGCCGCAAA
8451   AAAGGGAATA AGGGCGACAC GGAAATGTTG AATACTCATA CTCTTCCTTT
8501   TTCAATATTA TTGAAGCATT TATCAGGGTT ATTGTCTCAT GAGCGGATAC
8551   ATATTTGAAT GTATTTAGAA AAATAAACAA ATAGGGGTTC CGCGCACATT
8601   TCCCCGAAAA GTGCCACCTG ACGTCTAAGA AACCATTATT ATCATGACAT
 8651   TAACCTATAA AAATAGGCGT ATCACGAGGC CCTTTCGTCT TCAAGAATTC
 8701   GAGCTCGGTA CCCATCAGCC AAAAAGCATG CCTGCCACAC AACATCAATT
 8751   TCTGGAAAAC GCTACACTTA ATTATTTCTA GTAGAACAGC TCTTTGGTTT
 8801   GCCAAAAAGA ATCACCTATA GTGGCATCTA AGCACAAAAA GGAGAAAAAA
 8851   ATCACAAAGA AATGATTGAG AGGCATAATA AAAATTATCA AAAAATTATG
 8901   AGTTTTACGA TTTCATCTTT TTCCAAGTTG AAATCATAGG GTGGCTTTAA
 8951   CACAGTGACA AGGAATGTGC ATGCTGCCAT TATGGTGCTC TGCCTAAAAT
 9001   GGTTGGAGCC TTGTCATGCT ACAGAGAAAC TGTCATACAG CAGGGGGTGC
 9051   CAAATTTCCA TATTTTTTTA TATCATTGAG CAGGTGCACA GAAGACCAGA
 9101   AAGCACTTTC TATCAGGCTG GCCTTCCTCT TCCTTTCCAG TATGAAGCAA
 9151   AAACTGCCAA TGAAACTAGC AATTGTTAAA TTCCTTTTTC AAACAGTATT
 9201   TGTGCTATCA GAACATAGTG CATTCAAAAG TCTAGCCTGA GAGAACAACC
 9251   CAGTTTTATT CATTCCTCCT ACTACCTCTC TCATTCCCAC TGTTTGTGTT
 9301   CTCCCTCCCA TTTTAATTGT CTATCTAGTC CAAACTAAGC ACACGATCCA
 9351   GTCCACATTA AACAACATGT TTTCACTTTA AGTCAAATAC AAGACACCTT
 9401   TAATATCAGC CCTTGTTCAT AATCGTGCTT CTAGTGACTT AATGTACATG
 9451   TCACACTGTA CTGTTGGGTT TTGTGTCTCA TCATGAACAA TGTTGTGAAG
 9501   GTATTAAGTG GAGAGTAAGC AGAATTAGAT TCCTCTAATG ATGCACACCC
 9551   ACACTAAGAG CAGAAATAAT ATTAAAAATA GAAAAAAAAG TTTTACATGA
 9601   GATTTCAAAT ACCCAGGTAT GAGCTGCAGT TTCTTCAAGT TAAAGCATCG
 9651   AGGTTGTCAG TTACACTATT ACAGGAAACA TATGCAGAGT TTTTATTTTA
 9701   GTATATTAGT TTTCACATAT GTGGAATTAC TATTAAACTA TTCTTTCTTT
 9751   TCAAATGCTT ACCATTGTAA ATGAGTTTGT GACTTTGTGT AGGTGAGTGC
 9801   ACATGACTCT GGATGCCTAA GAGGACTGAA GAAGTTGGAG TTATAGGTAG
 9851   TTTTATTCTA CTTGACTGTT CAGTGCTAAA AATACAACTG AGGTCCTTTA
 9901   AACTGCTGTT CATGAACTTC TTAATTGATA TATCTCATGA GATCTCTAAA
 9951   CTATTTTTAT TATGACACGT TTCACCATTT TCACTGTAAC GATTTTTATG
10001   TTTTATATTA ATGTAACTAT ATGACACTTC CCAAAATCCC CATATTCACA
10051   ATTGAACTGT TTCAAAGTTT TACCTTGACT TATGGGAAAT GAAAACCCAC
10101   ATTTTATAAT TTTAAAATGA AATGTTTATT TTATATTTCT GCAAATTTCA
10151   CAAGGAAAGA TTAGTCACTG GTGTGTGAGA GCAGAGGAGC ATAAGAGTTC
10201   AGGAATAGAA TCCATTATGA TTCTGGAGGC AAGGAAGAAC TGATGCCAAG
10251   GTTTCAGTAT AAGAGCAGTA TCCACTGGAA AGGATAAAGT CACTACATCT
10301   GAGCACAGAG CAGGACATCT ACATAATGAG TGGTCACTAA TGGGCCACTG
10351   TTACACTGTT ATATGTATAA GGCTCAAGAA TGAGCACTGA GGCTGTAAGG
10401   TGTATGGGTG AGGACATCAG GATGTAAACC CAGCTCAGGT AGAGGACTCA
10451   GAGGACAGCA CAGTCAGCAT GAACTAATAA ACATCAGATA AGATAAGGCA
10501   CAAGCTCAGC TATATAGGGT AAGGGATCTT TGTAAATCTG ATTGTGCATC
10551   CAGTCTAGTT CAATGTGACT TAGGAAGCCC AGTCATATGC AAATCTAGAG
10601   AAGACTTTAG AGTAGAAATC TGAGGCTCAC CTCACATACC AGCAAGCGAG
10651   TGACCAGTTA GTCTTAAGGC ACCACTTCTT AGACATCATG GCTTGGGTGT
10701   GGACCTTGCC ATTCCTGATG GCAGCTGCCC AAAGTAAGAC ATCAGAAAAA
10751   AGAGTTCCAA GGGGAATTGA AGCAGTTCCA TGAATACTCA CCTTCCTGTG
10801   TTCTTTTCAC AGGTGTCCAG GCACAGGTGC AGCTGGTGGA GTCAGGAGCC
10851   GAAGTGAAAA AGCCTGGGGC TTCAGTGAAG GTGTCCTGCA AGGCCTCTGG
10901   ATACACATTC ACTAATTATA TTATCCACTG GGTGAAGCAG GAGCCTGGTC
10951   AGGGCCTTGA ATGGATTGGA TATTTTAATC CTTACAATCA TGGTACTAAG
11001   TACAATGAGA AGTTCAAAGG CAGGGCCACA CTAACTGCAA ACAAATCCAT
11051   CAGCACAGCC TACATGGAGC TCAGCAGCCT GCGCTCTGAG GACACTGCGG
11101   TCTACTACTG TGCAAGATCA GGACCCTATG CCTGGTTTGA CACCTGGGGC
11151   CAAGGGACCA CGGTCACCGT CTCCTCAGGT AAGAATGGCC ACTCTAGGGC
11201   CTTTGTTTTC TGCTGCTGCC TGTGGGATTT CATGAGCATT GCAAAGTTGT
11251   CCTCGGGACA TGTTCCGAGG GGACCTGGGC GGACTGGCCA GGAGGGGACG
11301   GGCACTGGGG TGCCTTGAGG ATCTGGGAGC CTCTGTGGAT TTTCCGATGC
11351   CTTTGGAAAA TGGGACTGAG GTTGGGTGCG TCTGAGACAG TAACTCAGCC
11401   TGGGGGCTTG GTGAAGATCG CCGCACAGCA GCGAGTCCGT GAAATATCTT
11451   ATTTAGACTT GTGAGGTGCG CTGTGTGTCA ATTTACATCT TAAATCCTTT
11501   ATTGGCTGGA AAGAGAATTG TTGGAGTGGG TGAATCCAGC CAGGAGGGAC
11551   GCGGGGGGAT CCA
实施例9：结合CD45RO/RB的人源化抗体的体外功效
VHE/humV1和VHQ/humV1
为了确定与嵌合抗体相比，结合CD45R0/RB的人源化抗体VHE/humV1和VHQ/humV1的功效，分析了诱导人T细胞中程序性细胞死亡的能力和抑制人T细胞增殖的能力。
细胞和试剂
通过在菲可帕克(Pharmacia LKB)上离心从具有已知血型但是未知HLA类型的健康人供者的leukopheresis样品分离外周血单核细胞(PBMC)。通过使用CD3包被的铁磁珠(Miltenyi)首先将用作刺激剂的PBMC耗竭T和NK细胞。通过磁场除去珠子和污染性细胞。T细胞耗竭的PBMC在辐射(50Gy)后用作刺激细胞。CD4+T细胞用作MLR中的应答细胞并且用CD4T细胞阴性选择试剂盒(Miltenyi)从PBMC分离。
通过FACScan或FACSCalibur(Becton Dickinson & Co.，CA)分析所得的细胞，所得细胞的纯度为＞75％。将细胞悬浮在RPMI1640培养基中，该培养基补加10％热失活的FCS、青霉素、链霉素和L-谷氨酰胺。
程序性细胞死亡测定
在结合CD45R0/RB的嵌合mAb、人源化抗体(VHE/humV1和VHQ/humV1)或者抗-LPS对照mAb的存在下在生长培养基(RPMI1640+10％FCS)中过夜(＜16h)培养三名健康志愿供者的人PBMC。如果指出，包括交联试剂：山羊抗人-IgG的F(ab’)2-片段(Cat.No.109-006-098，JacksonLab)，其浓度(μg/ml)为样品的抗-CD45抗体浓度的2倍。通过抗体试剂导入的所有孔中PBS-浓度在所有样品中保持恒定，即对于没有交联剂的样品为20％(v/v)，对于具有交联剂的样品为40％(v/v)。先前的实验表明PBS的量不影响读出。
在抗体存在下过夜培养后，将样品进行流式细胞术分析并用程序性细胞死亡标记膜联蛋白V-FITC(Cat.No.556419，BD/Pharmingen)和T细胞标记CD2-PE(Cat.No.556609，BD/Pharmingen)染色。在Becton DickinsonFACSCalibur仪器中运行样品并且使用CellQuest Pro软件分析数据。
使用软件Origin v7.0300从所收集的数据拟合曲线，用于拟合的方程为
y = A 1 - A 2 1 + ( x / x 0 ) P + A 2 (“Sigmoid-Logistic”)
A1：最终值(对于拟合期设置为“共享的”和“浮点的”)
A2：初始值(对于拟合期设置为“共享的”和“浮点的”)
p：幂
X0：ED50；IC50(见下面)。
没有交联剂时，VHE/humV1最有效，ED50值为148±71nM，然后为VHQ/humV1，ED50值为377±219nM。结合CD45R0/RB的嵌合抗体有效性较低，ED50值为2440±1205nM。
存在交联性抗血清时，ED50值向更高功效显著偏移至少两个数量级。此外，交联剂的存在允许在非常高的抗体浓度下较高水平的程序性细胞死亡，现在高达80％，而不存在交联剂时仅允许最高50％程序性细胞死亡。
存在交联剂时，曲线(抗体浓度/％程序性细胞死亡)为具有两个平台的双峰：第一个平台在低抗体浓度(～5nM)时达到，而程序性细胞死亡水平对应于不存在交联剂时得到的最大水平。第二个平台在高抗体浓度(～500nM)下达到，并且在70-80％的T细胞群体中观察到程序性细胞死亡。
两种结合CD45R0/RB的人源化mAb关于在原代人T细胞中诱导程序性细胞死亡的能力同等有效并且比结合CD45R0/RB的嵌合mAb更好或相当。
混合的淋巴细胞反应测定
在96孔培养板的每孔中不同浓度mAb的存在或不存在下，将1×105PBMC或5×104个CD4+细胞与1×105或5×104个T细胞耗竭的经辐射(50Gy)PBMC混合。
培养混合细胞5天并通过在培养的最后16-20小时内用3H-胸苷脉冲细胞来测定增殖。每种抗体浓度下MLR抑制表达为实施例2中描述的百分数抑制。
以三种应答者：刺激者组合评估增加浓度的VHE/humV1和VHQ/humV1对MLR的影响。所有抗体都以依赖剂量的方式抑制MLR。IC50值对于人源化Ab VHE/humV1(7±7nM)和VHQ/humV1(39±54nM)是相似的(见上面)。两种人源化抗体在抑制MLR中比亲代嵌合抗体更有效(IC50为347±434nM)。如用MLR实验通常看到的，在这些实验中供体变化性是高的。
VHE-N73D/humV1
为了处理VHE-N73D/humV1在人外周血单核细胞(PBMC)中诱导程序性细胞死亡的生物效应，在多种浓度的VHE-N73D/humV1存在下过夜孵育靶PBMC并随后通过流式细胞术分析程序性细胞死亡标记膜联蛋白V的结合：在含有多种浓度的VHE-N73D/humV1或另一种人源化CD45RO/RB结合分子变体、VHE/humV1、或者嵌合抗-CD45RO/RB mAb或同种型IgG1对照mAb的1ml组织培养基中过夜孵育人PBMC。此外，加入每种mAb的2倍质量浓度的山羊抗人Ig Fc的交联F(ab’)2片段，模拟Fc-受体对CD45RO/RB结合分子的交联，其可以在体内发生。第二天，通过以400倍标准重力(g)离心10分钟洗涤细胞并除去培养基。将细胞重悬浮在FACS缓冲液(含有1％v/v FBS，0.1％w/v EDTA和0.1％w/v叠氮化钠的PBS)并以每孔1×105个细胞的细胞密度接种在96孔V底微量滴定板中。在含有100μg/ml正常小鼠血清的50μl FACS缓冲液中4℃下孵育每种细胞样品30分钟以封闭细胞上的非特异结合位点并用缀合藻红蛋白(PE)的CD2鉴定人T细胞。通过离心洗涤两次后，将细胞重悬浮在含有1∶100v/v FITC-标记的膜联蛋白V的100μl钙-proficient膜联蛋白V染色缓冲液(供应商BD/Pharmingen试剂盒556419)中。在室温下黑暗中孵育15分钟时，加入7-氨基放线菌素D(7-AAD)至终浓度1μg/ml并使用FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson)分析。可以用软件Origin 7.5使用S形/对数曲线拟合方程从诱导的程序性细胞死亡的量(＝膜联蛋白V-FITC荧光的强度)作为抗体浓度的函数计算抗体诱导程序性细胞死亡的功效的ED50值。
进行此类分析时，观察到所有测试的CD45RO/RB结合分子的双相作用：在低抗体浓度下，发现小于30％的低水平T细胞程序性细胞死亡。计算达到该程序性细胞死亡水平的ED50值对于VHE-N73D/humV1为0.31±0.13nM。在更高的抗体浓度下，可以在高达70％T细胞中诱导程序性细胞死亡。达到该更高水平程序性细胞死亡的ED50值对于VHE-N73D/humV1计算为352±83nM。总之，发现VHE-N73D/humV1在人T细胞中也诱导程序性细胞死亡，其可以通过交联增强。
实施例10：CD45RB/RO结合分子的特异性
嵌合CD45RB/RO结合分子
CD45分子在所有白细胞上表达。然而，多种白细胞亚群表达不同的CD45同种型。为了确定结合CD45RB/RO的嵌合抗体分子的白细胞亚群反应性，进行用亚群特异标记对人白细胞的免疫荧光标记和用缀合染料的结合CD45RB/RO的嵌合抗体的同时免疫荧光标记，然后进行流式细胞术分析。
简言之，通过与针对CD2(T淋巴细胞)、CD14(单核细胞)、CD19(B淋巴细胞)、CD34(干细胞)、CD42a(血小板)、CD56(自然杀伤细胞)或CD66b(粒细胞)的藻红蛋白-偶联的抗体孵育来鉴定人外周血单核细胞(PBMC)、人血小板、人外周血嗜中性粒细胞或者人骨髓来源的造血干细胞的新鲜分离的制备物的特定亚群。在T淋巴细胞、单核细胞、干细胞、自然杀伤细胞和粒细胞上检测到FITC-标记的嵌合CD45RB/RO结合分子的同时结合，但是在血小板或B细胞上没有检测到所述结合。
VHE-N73D/humV1
为了确定VHE-N73D/humV1的淋巴细胞亚群反应性，进行用亚群特异标记对人白细胞的免疫荧光标记和用缀合染料的VHE-N73D/humV1的同时免疫荧光标记，然后进行流式细胞术分析。
简言之，通过与针对CD3、CD4、CD8(T淋巴细胞)、CD14(单核细胞)、CD16(自然杀伤细胞和单核细胞)、CD19(B淋巴细胞)、或CD66b(粒细胞)的藻红蛋白-偶联的抗体孵育鉴定人外周血单核细胞(PBMC)或人外周血嗜中性粒细胞的新鲜分离的制备物的特定亚群。在T淋巴细胞、单核细胞、自然杀伤细胞和粒细胞上检测到FITC-标记的VHE-N73D/humV1的同时结合，但是在B淋巴细胞上没有检测到所述结合。从而，VHE-N73D/humV1分子不与人B淋巴细胞反应。
实施例11：抑制性T细胞(T调节细胞)和功能麻痹的T细胞的体外诱导
为了阐明结合CD45RO/RB的嵌合抗体诱导抑制性T细胞的能力，在产生与流感嗜血菌(hemophilus influenza)的抗原基质蛋白1(MP1)反应的CD8+T细胞系期间，包括多种浓度的所述抗体。通过CD8+人淋巴细胞与用所述抗原脉冲的CD14+人单核细胞的反复共同培养产生这些系。之后，可以用人白细胞抗原-2阳性细胞系代替CD14+单核细胞作为MP1抗原呈递细胞(APC)。如果来自培养物的包括结合CD45RO/RB的嵌合抗体的此类MP1-特异的CD8+T细胞与新鲜分离的人CD8+T细胞混合并且用APC上的MP1抗原刺激该细胞混合物，那么在CD45RO/RB结合分子存在下，加入来自所述培养物的CD8+T细胞能够以抗体-剂量依赖性方式减小IFN-γ产生。在该IFN-γ测定培养期间不存在结合CD45RO/RB的嵌合抗体，表明用CD45RO/RB mAb预处理已经诱导了能够抑制新鲜分离的T细胞活化的CD8+T细胞。因为结合CD45RO/RB的嵌合抗体对抑制性T调节细胞的诱导，所述抗体可以用于疾病中，其中认为所述疾病中失调和/或活化的T细胞群造成了该病理。此类疾病的实例包括自身免疫病、移植排斥、银屑病、皮炎、炎性肠病和变态反应。
为了阐明嵌合的CD45RO/RB结合分子使得T细胞对进一步刺激低反应性(无变应性)，即功能上麻痹T细胞的能力，如上述在与流感嗜血菌的抗原基质蛋白1(MP1)反应的CD8+T细胞系的产生期间包括所述抗体。通过APC呈递的MP1抗原激活所述T细胞(在结合CD45RO/RB的嵌合抗体之前暴露)评估麻痹。该培养物中不存在CD45RO/RB结合分子。未暴露于结合CD45RO/RB的嵌合抗体的CD8+T细胞以前当受到所述刺激时产生IFN-γ。相比，用结合CD45RO/RB的嵌合抗体预处理的CD8+T细胞在应答该抗原刺激中表现出显著降低到不产生该细胞因子，表明结合CD45RO/RB的嵌合抗体能够在功能上麻痹人T细胞。由于CD45RO/RB结合分子对功能T细胞低反应性的该诱导，所以可以在其中认为活化的T细胞群造成所述病理的疾病中使用该抗体，所述疾病为例如自身免疫病、移植排斥、银屑病、皮炎、炎性肠病或变态反应。
实施例12：在SCID-hu Skin小鼠的体内研究
使用SCID小鼠试验了结合CD45RO/RB的嵌合抗体在皮肤炎症中的治疗效果。将来自正常个体的人类皮肤移植到SCID小鼠(SCID-hu Skin)上并通过从与所述人皮肤供体不相关的人分离的单核淋巴细胞的过继转移模拟炎症过程。
在SCID小鼠(SCID-hu Skin小鼠)中移植人成年皮肤
将由完整表皮、乳头状真皮和部分网状真皮组成的两小片(1cm2)人成年皮肤(从West Hungarian Regional Tissue Bank；WHRTB，Gyor得到)移植在SCID小鼠C.B 17/GbmsTac-Prkdcscid Lystbg小鼠(Taconic，Germantown，NY)的右和左上背侧代替小鼠皮肤。在移植后5-6周内监视移植物的质量并选择成功移植的小鼠(SCID-hu Skin小鼠，通常＞85％)用于结合CD45RO/RB的嵌合抗体的体内试验。
SCID小鼠中人单核细胞的移入
细胞悬浮(使用装备50目大小的细胞解离筛)和标准密度梯度步骤后从人成年脾脏活组织检查(WHRTB，Gyor)分离单核淋巴细胞(SpD。在实验的第0天，将～5×108Spl的等分试样重悬浮在1.5ml RPMI-10％FCS并腹膜内(i.p.)注射到SCID-hu Skin小鼠。已经在以前的实验中发现这些Spl数对于细胞转移后4-6周内在＞90％的所述小鼠中诱导致命xeno-GvHD是足够的。
SCID-hu Skin小鼠的抗体治疗
在第0天、单核细胞注射后立即、第3和第7天和之后以每周间隔用结合CD45RO/RB的嵌合抗体或者用抗-LPS对照mAb处理用人Spl重建的SCID-hu Skin小鼠。以1mg/kg体重(b.w.)的终浓度皮下(s.c.)递送100μlPBS中的抗体。
抗-CD45处理的评估
通过经移植小鼠的存活和通过监视皮肤移植物的排斥评估结合CD45RB/RO的嵌合抗体的功效。通过存活分析的统计学方法，使用Log-rank检验(Mantel方法)，用Systat v10软件评估结果的显著性。在实验结束时，从处死的小鼠得到人皮肤移植物和小鼠肝、肺、肾和脾的实验活组织检查用于组织学目的。在开始(细胞转移前)和整个实验(每两天)中称量所有小鼠作为它们的健康状况的间接估计。使用体重相对于从每只小鼠得到的PBMC转移值后天数值产生线性回归线，并随后，用非参数曼-怀二氏检验(Mann-Whitney test)比较它们的斜率(对照对抗-CD45处理的小鼠)。
结果
SCID小鼠非常良好地耐受人皮肤移植物。最初，移植物经历角质形成细胞超增殖期，导致形成过度角化痂。移植后约5周，痂从移植物脱落并显示出含有在正常人皮肤中观察到的所有特征性结构的组织。在该过程期间，人皮肤移植物与相邻的小鼠皮肤融合并产生新生长的人血管网络，其连接移植物与下面的小鼠组织。转移到SCID-hu Skin小鼠(在实验第0天、皮肤移植后约6周)的循环的人Spl渗入皮肤移植物并且识别表达在人皮肤上的异源抗原分子后产生炎症反应，其类似于在银屑病皮肤中发生的皮肤炎症过程并且在一些情况中完全破坏该移植物。
用结合CD45RB/RO的嵌合抗体处理这些小鼠抑制了炎症过程并且防止人皮肤移植物的排斥。相比，从对照处理的小鼠得到的样品显示出大量浸润，其具有表皮坏死和显著破坏的多种病征。可以通过眼睛容易地监视该过程并且用小鼠的简单照片进行记录。
用异源人Spl转移并用对照抗-LPS mAb处理的6只SCID-hu Skin小鼠中的6只在单核细胞转移后23天显示出通过眼睛可以容易地观察到的强烈炎症反应。所有小鼠都显示出大量病变，包括红斑、脱皮和显著脓疱。相比，用结合CD45RB/RO的嵌合抗体处理的所有小鼠的皮肤移植物都具有正常外观。两组小鼠之间的显著不同明确地是由于抗体处理，因为在实验开始时所有小鼠的人皮肤都具有相同外观。直到细胞移植后第二周该方面才改变，在此时对照组开始产生皮肤病变。在单核细胞移植后第34天结束实验。那时，一只对照小鼠已经死亡(第30天)，由于强xeno-GvHD而处死四只其他小鼠(在第27、27、27和30天)。在抗体对照处理的小鼠中观察到的病理反应也与这些动物中体重的减轻相关。
相比，结合CD45RB/RO的嵌合抗体处理的组在整个实验时间期间显示出健康状态。
实施例13：人胰岛细胞移植模型中结合CD45RB/RO的嵌合抗体的体内活性
小鼠
在特定无病原体的条件下保持NOD/SCID雌性小鼠(Charles RiverLaboratories，Calco，Italy)。用Glucometer Elite系统(Bayer，Germany)定量静脉尾部血中的葡萄糖水平。通过静脉内注射180mg/kg链脲佐菌素(Sigma，St.Luis，MO)在NOD/SCID小鼠中诱导糖尿病。在2次连续葡萄糖测量高于250mg/dl诊断为糖尿病。
胰岛制备和移植
从心搏尸体多器官供者(heart-beating cadaveric multiorgan donors)得到胰腺。根据Bertuzzi等人，Diabetes，1999，48：1971-8中描述的方法分离胰岛。在含有25ml M199培养基(Seromed Biochrom，Berlin，Germany)(补加10％FCS，1％L-谷氨酰胺，100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素)(完全培养基)的无菌瓶中培养纯化的胰岛。在30℃5％CO2和95％增湿空气中孵育胰岛。用腹膜内注射三溴乙醇麻醉小鼠并如Davalli A.M.等人，Diabetes，1996，45：1161-7中描述的将1500IE人胰岛的等分试样移植在受者糖尿病NOD/SCID小鼠的肾囊下。移植后，将50×106个新鲜分离的PBMC腹膜内注射到NOD/SCID小鼠。
移植小鼠的处理
在第0、+3和+5天用1mg/kg结合CD45RB/RO的嵌合抗体皮下处理Hu-PBL-NOD/SCID移植的小鼠。用盐溶液或者用IgG纯化的mAb处理对照小鼠(Vinci.Biochem，Italy)。
组织学分析
将含有人胰岛移植物的肾极(kidney pole)在Tissue Tek(Miles Lab.，IN)中快速冷冻并在-70℃保存。将5μm厚的冰冻切片用针对人胰岛素或者人CD3的生物素化mAb然后用链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶缀合物染色。二氨基联苯胺(DAKO，Carpenteria，CA)用作色原并且苏木精作为复染剂。用苏木精和伊红染色的冰冻切片评估移植物的淋巴细胞浸润。
结果
用人胰岛移植的正常NOD/SCID小鼠在移植后保持血糖正常长达100天，而用人胰岛移植的hu-PBL-NOD/SCID小鼠的平均排斥时间为35±13天。用本发明的mAb短暂处理用人胰岛移植的hu-PBL-NOD/SCID小鼠显著延长了人胰岛存活，在移植后第60天时存活率＞70％，在第100天时＞50％。
hu-PBL-NOD/SCID小鼠中移植后100天进行的人胰岛移植物的组织学分析表明对照受者小鼠中CD3+、CD4+和CD8+阳性T细胞的大量浸润。相比，在用结合CD45RB/RO的嵌合抗体处理的受者小鼠中观察到人细胞的显著较低的浸润。胰岛素的阳性染色表明与对照受者小鼠相比用结合CD45RB/RO的嵌合抗体处理的hu-PBL-NOD/SCID受者小鼠中的移植物功能。与对照受者小鼠相比，在胰岛移植并且用结合CD45RB/RO的嵌合抗体处理的hu-PBL-NOD/SCID小鼠的血清中检测到较低量的人IFN-γ。
这些数据表明用结合CD45RB/RO的嵌合抗体短期处理通过防止移植物浸润和通过抑制体内白细胞介导的排斥反应导致延长人胰岛异源移植物的存活。

Claims (43)

1.包含至少一个抗原结合位点的结合分子，其在序列中包含高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列Asn-Tyr-Ile-Ile-His(NYIIH)，所述CDR2具有氨基酸序列Tyr-Phe-Asn-Pro-Tyr-Asn-His-Gly-Thr-Lys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly(YFNPYNHGTKYNEKFKG)，所述CDR3具有氨基酸序列Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phe-Asp-Thr(SGPYAWFDT)。
2.根据权利要求1的结合分子，其包含
a)在序列中包含高变区CDR1、CDR2和CDR3的第一个结构域，所述CDR1具有氨基酸序列Asn-Tyr-Ile-Ile-His(NYIIH)，所述CDR2具有氨基酸序列Tyr-Phe-Asn-Pro-Tyr-Asn-His-Gly-Thr-Lys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly(YFNPYNHGTKYNEKFKG)并且所述CDR3具有氨基酸序列Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phe-Asp-Thr(SGPYAWFDT)；
b)在序列中包含高变区CDR1’、CDR2’和CDR3’的第二个结构域，所述CDR1’具有氨基酸序列Arg-Ala-Ser-Gln-Asn-Ile-Gly-Thr-Ser-Ile-Gln(RASQNIGTSIQ)，CDR2’具有氨基酸序列Ser-Ser-Ser-Glu-Ser-Ile-Ser(SSSESIS)，CDR3’具有氨基酸序列Gln-Gln-Ser-Asn-Thr-Trp-Pro-Phe-Thr(QQSNTWPFT)。
3.根据权利要求1或2任一项的结合分子，其是嵌合或人源化的结合分子。
4.根据权利要求1到3任一项的结合分子，其中所述嵌合或人源化的结合分子是嵌合或人源化的单克隆抗体。
5.根据权利要求1到4任一项的结合分子，其包含不超过1个糖基化位点。
6.根据权利要求5的结合分子，其中所述糖基化位点是N-糖基化位点。
7.根据权利要求1到6任一项的结合分子，其中在可变区中不存在糖基化位点。
8.根据权利要求1到7任一项的结合分子，其包含SEQ ID NO：1的多肽和/或SEQ ID NO：2的多肽。
9.根据权利要求1到7任一项的结合分子，其包含SEQ ID NO：3的多肽和/或SEQ ID NO：4的多肽。
10.根据权利要求8或9任一项的结合分子，其是嵌合单克隆抗体。
11.结合分子，其是包含SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的多肽和/或SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的多肽的人源化抗体。
12.结合分子，其是包含SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：32的多肽和/或SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的多肽的人源化抗体。
13.结合分子，其是包含
-SEQ ID NO：9的多肽和SEQ ID NO：7的多肽，
-SEQ ID NO：9的多肽和SEQ ID NO：8的多肽，
-SEQ ID NO：10的多肽和SEQ ID NO：7的多肽，
-SEQ ID NO：10的多肽和SEQ ID NO：8的多肽
-SEQ ID NO：31的多肽和SEQ ID NO：7的多肽，
-SEQ ID NO：31的多肽和SEQ ID NO：8的多肽，
-SEQ ID NO：32的多肽和SEQ ID NO：7的多肽，或
-SEQ ID NO：32的多肽和SEQ ID NO：8的多肽的人源化抗体。
14.分离的多核苷酸，其包含编码根据权利要求1到13任一项的结合分子的多核苷酸。
15.根据权利要求14的多核苷酸，其编码根据权利要求2的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列和/或编码根据权利要求2的CDR1’、CDR2’和CDR3’的氨基酸序列。
16.编码CDR1’、CDR2’和CDR3’的氨基酸序列的多核苷酸，所述CDR1’具有氨基酸序列Arg-Ala-Ser-Gln-Asn-Ile-Gly-Thr-Ser-Ile-Gln(RASQNIGTSIQ)，CDR2’具有氨基酸序列Ser-Ser-Ser-Glu-Ser-Ile-Ser(SSSESIS)，CDR3’具有氨基酸序列Gln-Gln-Ser-Asn-Thr-Trp-Pro-Phe-Thr(QQSNTWPFT)。
17.多核苷酸，其包含SEQ ID NO：5的多核苷酸和/或SEQ ID NO：6的多核苷酸。
18.多核苷酸，其包含编码SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的多肽和/或SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的多肽的多核苷酸。
19.多核苷酸，其包含SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的多核苷酸和/或SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14的多核苷酸。
20.多核苷酸，其包含编码SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的多肽和/或SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：32的多肽的多核苷酸。
21.多核苷酸，其包含SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：35的多核苷酸和/或SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：13的多核苷酸。
22.表达载体，其包含根据权利要求14到21任一项的多核苷酸。
23.表达系统，其包含根据权利要求14到21任一项的多核苷酸，其中当所述表达系统或其部分存在于相容的宿主细胞中时，所述表达系统或其部分能够产生权利要求1到13任一项的多肽。
24.包含根据权利要求14到21任一项的多核苷酸的表达系统，其中当所述表达系统或其部分存在于相容的宿主细胞中时，所述表达系统或其部分能够产生包含至少一个抗原结合位点的结合分子，该结合分子在序列中包含高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列Asn-Tyr-Ile-Ile-His(NYIIH)，所述CDR2具有氨基酸序列Tyr-Phe-Asn-Pro-Tyr-Asn-His-Gly-Thr-Lys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly(YFNPYNHGTKYNEKFKG)并且所述CDR3具有氨基酸序列Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phe-Asp-Thr(SGPYAWFDT)。
25.分离的宿主细胞，其包含根据权利要求23或24的表达系统。
26.根据权利要求1到13任一项的结合分子或者人源化抗体用作药物的用途。
27.根据权利要求26的用途，用于治疗和/或预防自身免疫病、移植排斥、银屑病、皮炎、炎性肠病和/或变态反应。
28.根据权利要求27的用途，用于治疗和/或预防移植物抗宿主疾病(GVHD)。
29.根据权利要求1到13任一项的结合分子或者人源化抗体的用途，用于制备治疗胰岛细胞移植排斥的药物。
30.根据权利要求26到29任一项的用途，其中所述结合分子或者人源化抗体包含SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：32的多肽和/或SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的多肽。
31.药物组合物，其包含根据权利要求1到13任一项的分子或者人源化抗体，以及至少一种药学上可接受的载体或稀释剂。
32.治疗和/或预防与自身免疫病、移植排斥、银屑病、皮炎、炎性肠病和/或变态反应相关的疾病的方法，其包括对需要这种治疗和/或预防的个体施用有效量的根据权利要求1到13任一项的分子或者人源化抗体。
33.治疗和/或预防银屑病的方法，其包括对需要这种治疗和/或预防的个体施用有效量的根据权利要求1到13任一项的结合分子或者人源化抗体。
34.治疗和/或预防预防移植物抗宿主疾病(GVHD)的方法，其包括对需要这种治疗和/或预防的个体施用有效量的根据权利要求1到13任一项的分子或者人源化抗体。
35.治疗和/或预防与胰岛细胞移植排斥相关的疾病的方法，其包括对需要这种治疗和/或预防的个体施用有效量的根据权利要求1到13任一项的结合分子或者人源化抗体。
36.根据权利要求32到35任一项的方法，其中所述结合分子或人源化抗体包含SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：32的多肽和/或SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的多肽。
37.对CD45RO和CD45RB都具有结合特异性的结合分子用于药物的用途。
38.根据权利要求37的用途，其中所述结合分子为嵌合的、人源化的或者完全人单克隆抗体。
39.根据权利要求37或38的用途，其中所述结合分子以＜15nM的解离常数(Kd)结合CD45RO同种型。
40.根据权利要求37或38任一项的用途，其中所述结合分子以＜15nM的解离常数(Kd)结合CD45RB同种型。
41.根据权利要求37到40任一项的用途，其中所述结合分子结合CD45同种型，所述同种型
-包括CD45分子的A和B表位，但是不包括C表位；和/或
-包括CD45分子的B表位，但是不包括A和C表位；和/或
-不包括CD45分子的A、B或C表位的任何一个。
42.根据权利要求37到41任一项的用途，其中所述结合分子不结合CD45同种型，所述同种型
-包括CD45分子的A、B和C表位全部；和/或
-包括CD45分子的B和C表位，但是不包括A表位。
43.根据权利要求37到42任一项的用途，其中所述结合分子结合PEER细胞上它的靶表位，并且其中所述结合以Kd＜15nM进行。
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