CN1839152A

CN1839152A - 包含或缺乏CD11b/CD18相互作用结构域的修饰的博德特氏菌腺苷酸环化酶及其用途

Info

Publication number: CN1839152A
Application number: CNA2004800238103A
Authority: CN
Inventors: 克洛德·勒克莱尔; 穆罕默德·阿扎米伊德里西; 达尼埃尔·拉当; 塞西尔·包切; 彼得·塞伯; 伊日娜·劳茨卡; 拉迪姆·奥西斯卡
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Pasteur de Lille
Priority date: 2003-06-18
Filing date: 2004-06-18
Publication date: 2006-09-27
Also published as: US7906123B1; KR20060034645A; JP4824550B2; RU2421241C2; EP1633776A1; AU2004249431A1; RU2006101326A; CA2529565A1; EP1489092A1; JP2007527697A; BRPI0411510A; EP1633776B1; AU2004249431B2; WO2004113372A1; US20060159697A1

Abstract

本发明涉及修饰的博德特氏菌腺苷酸环化酶毒素，其在结合CD11b/CD18方面具有缺陷，还涉及其在制备用于治疗百日咳和/或用于预防博德特氏菌感染的药物组合物中的用途。本发明还涉及博德特氏菌腺苷酸环化酶的特异性片段，其包含CD11b/CD18相互作用结构域，并涉及其用途，特别是用于将感兴趣的分子导向表达CD11b的细胞。

Description

包含或缺乏CD11b/CD18相互作用结构域的修饰的博德特氏菌腺苷酸环化酶及其用途

本发明涉及在结合CD11b/CD18方面具有缺陷的修饰的博德特氏菌腺苷酸环化酶毒素，并涉及其在制备用于治疗百日咳和/或预防博德特氏菌感染的药物组合物中的用途。本发明还涉及包含CD11b/CD18相互作用结构域的博德特氏菌腺苷酸环化酶的特定片段及其用途，特别是用于将感兴趣的分子导向表达CD11b的细胞。

博德特氏菌属包括4种菌种，即百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)、副百日咳博德特氏菌(Bordetella parapertussis)、支气管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)和鸟博德特氏菌(Bordetellaavium)。

博德特氏菌是革兰氏阴性球杆菌(coccobacilli)，引起呼吸道感染。百日咳博德特氏菌和副百日咳博德特氏菌是严格人类病原体。支气管炎博德特氏菌对多种哺乳动物具有致病性，但对人罕有致病性，且不同于百日咳博德特氏菌和副百日咳博德特氏菌的是，其能够在宿主体外存活。鸟博德特氏菌对鸟具有致病性。

对人类最具致病性的是百日咳博德特氏菌，其是百日咳这种高传染性儿童呼吸道疾病的致病因素，百日咳的特征在于支气管肺炎、发作性咳嗽和吸气性哮鸣音。

迄今为止，针对百日咳的免疫接种最常使用的是灭活全细菌。不过，鉴于毒力因子是由细菌分泌的蛋白质而非细菌本身所组成的，因此此类疫苗并非总是无毒的。因此，这些蛋白质可引起严重的病理学效应，既便在细菌死后依然如此。

欧洲专利EP 0 424 158(Institut Pasteur)公开了将博德特氏菌腺苷酸环化酶用作抗百日咳博德特氏菌和支气管炎博德特氏菌的保护性抗原。

欧洲专利EP 0 338 169(Institut Pasteur)还公开了来自副百日咳博德特氏菌的活性腺苷酸环化酶制剂作为抗百日咳的保护性抗原的用途。

也已经开发了一些备选策略，包括使用具有免疫源性的解毒的博德特氏菌毒素制备细胞疫苗。

美国专利SN 6,040,427(Locht等，2000)公开了基于解毒的百日咳毒素的疫苗的实例。

在百日咳博德特氏菌产生的各种毒素中，腺苷酸环化酶(在此也称为CyaA)是在呼吸道建群(colonization)早期细菌毒力的关键因素(Goodwin and Weiss，1990；Khelef等，1992)。该毒素使得细菌能够逃脱宿主的免疫监控，这主要是通过使中性粒细胞和巨噬细胞中毒、引起吞噬细胞功能缺陷和巨噬细胞凋亡(Confer and Eaton，1982；Gueirard等，1998；Harvill等，1999；Khelef and Guiso，1995；Khelef等，1993)。在小鼠呼吸道模型中已经清楚地证明了CyaA在百日咳博德特氏菌致病机理中的作用。实际上，经遗传学修饰的缺乏CyaA表达的百日咳博德特氏菌菌株，其诱导肺部病变和引发致死性感染的能力被消弱(Khelef等，1994；Weiss and Goodwin，1989)。另一方面，在小鼠模型中发现CyaA可诱导抗百日咳博德特氏菌在肺部建群的保护性免疫(Betsou等，1993；Betsou等，1995；Hormozi等，1999)。

CyaA是一种1706个氨基酸残基的多肽，由4个功能性结构域组成：腺苷酸环化酶活性(AC)结构域(1至400位残基)、疏水性通道形成结构域(500至700位残基)、钙结合性富含甘氨酸/天冬氨酸重复结构域(calcium-binding glycin/aspartate rich repeat domain)(1000至1600位残基)、和具有分泌信号的C末端结构域(1600至1706位残基)。CyaA能够侵入真核细胞并将其催化结构域转移至胞浆内，在此，被内源性钙调蛋白激活后，其催化ATP转化为cAMP(Ladant and Ullmann，1999)。cAMP在细胞浆内聚集被认为是该毒素引起毒性反应的原因(Rogel等，1991)。这种中毒的主要后果是细胞凋亡以及吞噬功能改变和产生过氧化物(Conferand Eaton，1982；Friedman等，1987；Khelef等，1993；Njamkepo等，2000；Pearson等，1987)。

百日咳博德特氏菌腺苷酸环化酶的完整序列见SEQ ID NO：1。

支气管炎博德特氏菌腺苷酸环化酶的完整序列见SEQID NO：3。

CyaA需要钙以获得转移特异性构象以便将催化结构域输送至细胞浆内(Rogel and Hanski，1992；Rose等，1995)。首先，CyaA是作为无活性的前毒素(即proCyaA)而产生的，经酰基转移酶进行翻译后修饰，这种cyaC基因的产物才成为活性毒素。这种共价性翻译后脂肪酸酰化对于毒素转移通过靶细胞膜和输送其催化AC结构域以及对于形成溶血性阳离子选择性通道来说均是必需的。proCyaA的酰化发生于两个不同的位置，Lys-983和Lys-860，其位于保守性RTX酰化位点内(Barry等，1991；Hackett等，1994)。尽管Lys-860的酰化对于CyaA的活性似乎是非必需的，但已经发现Lys-983的酰化是至关重要的(Basar等，2001)。

CyaA可穿透许多种类型的细胞，包括缺乏膜运输的哺乳动物红细胞(Bellalou等，1990；Gray等，1999；Rogel and Hanski，1992)。与此不同的是，CyaA的毒性作用，例如消除吞噬能力和诱导凋亡，主要在免疫细胞上得到阐述，即中性粒细胞和巨噬细胞(Confer and Eaton，1982；Khelef等，1993)。此外，在小鼠呼吸道感染中，发现CyaA对肺泡巨噬细胞具有特异性毒性(Gueirard等，1998)。包含固定于异源性表位的由百日咳博德特氏菌产生的重组腺苷酸环化酶毒素的疫苗也在WO93/21324(Institut Pasteur，1993)中公开。最近证实，CyaA通过α_Mβ₂整联蛋白(CD11b/CD18)而特异性结合于靶细胞。这种结合是可饱和的且被抗CD11b单克隆抗体所完全抑制。CyaA对CD11b+细胞具有选择性细胞毒性，说明其与CD11b的相互作用对于催化结构域的转移和随后出现的cAMP升高以及细胞死亡是必需的。此外，在表达CD11b/CD18异二聚体后，CHO细胞对CyaA的细胞毒性的敏感性明显升高。不仅如此，催化结构域转移至细胞内所需的Ca²⁺离子对于CyaA与CD11b的相互作用也是绝对必需的(Guermonprez等，2001)。CD11b对于CyaA与细胞相互作用的重要性在一个系统中被进一步证实，在该系统中，将CyaA用作载体将外来抗原输送至抗原呈递细胞，如树突状细胞。实际上，仅仅CD11c+CD8α-CD11b^high亚群的树突状细胞能够展示相应于插入至重组CyaA中的表位的MHC I类肽复合物(Guermonprez等，2002)。

CD11b蛋白β₂整联蛋白(白细胞粘附分子)大家族的成员，该家族包括LFA1(CD11a)、MAC-1(CD11b)和p150，95(CD11c)。该家族的成员的不同之处在于其α链，其表达后与β链(CD18)形成必不可少的异二聚体(Arnaout，1990)。CD11b也被称为3型补体受体(CR3)，表达于巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞、NK细胞、腹膜B-1细胞和CD8+T细胞的一个亚群(Arnaout，1990；Bell等，1999)。其在白细胞粘附功能方面具有关键的作用并触发对覆有补体的颗粒的吞噬作用(Diamond andSpringer，1993)。CD11b结合各种配体，例如细胞内粘附分子ICAM-1、纤维蛋白原、凝血因子X和失活的补体成分C3b(iC3b)(Altieri andEdgington，1988；Beller等，1982；Diamond等，1990；Wright等，1988)。

基于CyaA与CD11b/CD18的结合特性，欧洲专利申请EP1188446(Institut Pasteur)公开了用于将感兴趣的分子，且特别是抗原，导向树突状细胞的包含重组博德特氏菌腺苷酸环化酶的蛋白质载体。

本发明基于以下发现，即百日咳博德特氏菌腺苷酸环化酶的自1166位氨基酸至1281位氨基酸的氨基酸序列(SEQID NO：2)中的一或多个区域对于该毒素与CD11b/CD18的相互作用是至关重要的。这一区域对于CyaA结合CD11b/CD18的能力是必需的，该区域可进一步与作为辅助区域的CyaA的其他区域相结合。

这一发现为制备能够将感兴趣的分子导向树突状细胞的有效而通用的分子输送载体提供了可能性。或者，可将腺苷酸环化酶中鉴定的CD11b/CD18相互作用结构域缺失，这有利于设计一种安全的细胞疫苗，用于抵抗博德特氏菌感染，且特别是百日咳博德特氏菌感染。

本发明还提供了所述鉴定的CD11b/CD18相互作用结构域用于产生中和抗体的用途，所述中和抗体能够阻断由感染性细菌产生的天然腺苷酸环化酶与细胞受体的相互作用。

因此，本发明的一个目的在于提供一种蛋白质，其由博德特氏菌腺苷酸环化酶组成，所述博德特氏菌腺苷酸环化酶的CD11b/CD18相互作用结构域通过一或多个氨基酸的缺失、取代或插入而被修饰，其中所述蛋白质在结合CD11b/CD18方面具有缺陷，但与识别野生型博德特氏菌腺苷酸环化酶的抗血清具有特异性反应性。

本发明的蛋白质可用作抗百日咳的疫苗中的活性成分。因此，CD11b/CD18相互作用结构域中的突变防止了免疫细胞的潜在阴性作用，例如通过类毒素结合整联蛋白而引起的信号转导和/或因CyaA类毒素竞争性结合CD11b而引起的一些功能性干扰，CyaA类毒素也作为补体受体CR3。

在此，术语“多肽”指的是由肽键连接的氨基酸的单链，包含至少6个氨基酸，优选地至少10个氨基酸，且更优选地至少50个氨基酸。

术语“蛋白质”指的是一种大分子，其基本上由一或多个多肽组成。

在本发明中，术语“博德特氏菌腺苷酸环化酶”包括钙调蛋白依赖性腺苷酸环化酶，其在博德特氏菌中天然地合成，并且是细菌在肺内建群的最初阶段所必需的主要毒力因子。

在一个优选的实施方式中，通过对百日咳博德特氏菌(人类百日咳的致病因子)腺苷酸环化酶进行修饰而得到本发明的蛋白质。

在百日咳博德特氏菌中，腺苷酸环化酶以一种1706个氨基酸的多肽(SEQ ID NO：1)的形式而合成并分泌。钙调蛋白依赖性催化活性位于前400个氨基酸，该区域在此被称为“N末端催化结构域”。如先前所述，为了得到活性，通过与cyaC基因产物共表达进行翻译后修饰，使得所述腺苷酸环化酶毒素具有侵袭性和溶血性。

根据本发明，“CD11b/CD18相互作用结构域”这一表述指的是：

a.百日咳博德特氏菌的CD11b/CD18相互作用结构域，百日咳博德特氏菌腺苷酸环化酶的自1166位氨基酸至1281位氨基酸(SEQ ID NO：2)，或

b.博德特氏菌的腺苷酸环化酶结构域，相应于百日咳博德特氏菌的CD11b/CD18相互作用结构域，通过将所述博德特氏菌的腺苷酸环化酶的序列与百日咳博德特氏菌的腺苷酸环化酶的序列进行比对而鉴定，采用的是寻找最佳局部比对的算法。

寻找最佳局部比对的算法的一个实例是BLAST算法(Altschul等，1990)。

支气管炎博德特氏菌的CD11b/CD18相互作用结构域以SEQ ID NO：4表示。

在此，“在结合CD11b/CD18方面具有缺陷”这一表述指的是本发明的蛋白质不与野生型博德特氏菌腺苷酸环化酶竞争性结合表达CD11b/CD18α_Mβ₂的细胞。“CD11b/CD18α_Mβ₂”或“CD11b/CD18”指的是博德特氏菌腺苷酸环化酶的细胞受体(Guermonprez等，2001)。在后面的实验部分描述了用于评价重组毒素与表达CD11b/CD18α_Mβ₂的细胞的特异性结合的结合分析法的实例。与野生型博德特氏菌腺苷酸环化酶相比，本发明的蛋白质与CD11b/CD18α_Mβ₂的结合亲和力低于50％。更优选地，本发明的蛋白质的经测定的结合亲和力低于10％，且更优选地低于5％。

在此，术语“表达CD11b的细胞”涉及的是在其表面表达CD11b/CD18α_Mβ₂的细胞。具体而言，这些细胞是粒细胞/中性粒细胞、巨噬细胞、NK细胞、TCD8+亚群和B细胞亚群以及髓性树突状细胞。

为了提供本发明的蛋白质，通过一或多个氨基酸的插入、缺失或取代对博德特氏菌腺苷酸环化酶的CD11b/CD18相互作用结构域进行修饰，所得蛋白质在结合CD11b/CD18方面具有缺陷。

在本发明的一个实施方式中，通过在其中插入一种肽而修饰所述CD11b/CD18相互作用结构域。例如，所述CD11b/CD18相互作用结构域中插入了一种由6至12个残基组成的序列。

具体的实施方式包括在1166和1167位残基之间或1281位和1282位残基之间(数字代表野生型百日咳博德特氏菌腺苷酸环化酶中的氨基酸位置)插入含有6至12个氨基酸的肽而修饰的百日咳博德特氏菌腺苷酸环化酶。在后面的实验部分描述了在这些位置插入FLAG序列的表位的实例，在此称为CyaA1166/FLAG和CyaA1281/FLAG。

或者，可将参与结合CD11b/CD18的残基缺失或以非功能性残基取代。

在一个具体实施方式中，通过在百日咳博德特氏菌腺苷酸环化酶的自1208至1243位残基区域或其他博德特氏菌腺苷酸环化酶的相应区域中进行一或多个氨基酸的插入、缺失或取代而对博德特氏菌腺苷酸环化酶进行修饰。

本发明的蛋白质的优选实施方式包括含有一或多个氨基酸的缺失或被非功能性氨基酸取代的百日咳博德特氏菌腺苷酸环化酶。

在一个优选的实施方式中，所述博德特氏菌腺苷酸环化酶通过完全缺失CD11b/CD18相互作用结构域而修饰。

根据本发明的另一个具体的实施方式，百日咳博德特氏菌腺苷酸环化酶通过缺失自1245位至1273位氨基酸额被修饰，这些氨基酸任选地被非功能性氨基酸取代，例如使用在实验部分所例举的一种八肽，在此称为CyaAA1245-1273。

或者，为了确保全面安全地将本发明的蛋白质施用于活生物体，对博德特氏菌腺苷酸环化酶进行修饰以便除去其催化活性。根据本发明的一个实施方式，通过在N末端催化结构域进行一或多个氨基酸的插入、缺失或取代而进一步修饰博德特氏菌腺苷酸环化酶，其中所述修饰的博德特氏菌腺苷酸环化酶所具有的催化活性相对于野生型博德特氏菌腺苷酸环化酶的催化活性是降低的。优选地，所述催化活性低于野生型博德特氏菌腺苷酸环化酶的催化活性的10％，且更优选地，所述催化活性是不明显的。

N末端催化结构域突变的实例是现有技术中已知的(例如见WO93/21324，Institut Pasteur)。

本发明的蛋白质的实施方式包括缺失N末端催化结构域的至少1至300位氨基酸、且优选地缺失1至373位氨基酸的修饰的博德特氏菌腺苷酸环化酶。

或者，可将二肽插入百日咳博德特氏菌腺苷酸环化酶的188和190位残基之间ATP结合位点或来自其他博德特氏菌的腺苷酸环化酶的相应残基之间。

本发明还发现，博德特氏菌腺苷酸环化酶的酰化参与毒素与CD11b/CD18的结合以及随后转移至细胞内。因此，在本发明的蛋白质的一个优选的实施方式中，所述蛋白质是非酰化的。尤其是，在发生转录后酰化的氨基酸处对博德特氏菌腺苷酸环化酶进行进一步修饰。这些氨基酸相应于百日咳博德特氏菌腺苷酸环化酶的Lys-983和Lys-860。

在这一具体实施方式中，所述蛋白质在腺苷酸环化酶序列的983和/或860位没有被酰化。

在另一个实施方式中，所述蛋白质没有被酰化。

本发明的蛋白质优选地具有免疫原性，但基本上是非毒性蛋白质，即所述蛋白质在细胞受体结合方面具有缺陷，且任选地在腺苷酸环化酶活性方面具有缺陷，但仍然能够被抗腺苷酸环化酶毒素抗体特异性识别。

本发明还涉及包含上述蛋白质和药学上可接受的载体(pharmaceutical acceptable vehicle)的药物组合物。

根据一个实施方式，所述组合物是适合施用于人或动物的疫苗。所述疫苗优选地能够诱导针对百日咳的免疫。所述疫苗包含免疫保护和非毒性量的本发明的蛋白质。相应地，所述组合物可进一步包含一或多种合适的引发佐剂(priming adjuvant)。其他已知的可与本发明的蛋白质一同施用的抗原也可纳入本发明的疫苗中。此类其他成分包括其他已知的博德特氏菌的保护性抗原、破伤风类毒素和/或白喉类毒素。

当然，本发明还涉及用于免疫人或动物以抵抗博德特氏菌感染和/或与由博德特氏菌感染引起的疾病有关的症状的方法，该方法包含给该人或动物施用本发明的疫苗。

本发明的疫苗的施用途径可以是将免疫保护量的本发明的蛋白质输送给宿主的任何合适的途径。不过，优选地通过肌内或皮下途径经胃肠外施用所述疫苗。如果需要，也可以采用其他施用途径，例如口服或其他胃肠外途径，即经皮内、鼻内或静脉施用。

本发明的另一个方面涉及本发明的蛋白质在制备用于治疗人或动物的与百日咳相关的疾病症状和/或用于保护人或动物抵抗与博德特氏菌感染相关的疾病症状的药物中的用途。

当然，本发明还涉及用于治疗人或动物的博德特氏菌感染和/或与博德特氏菌感染引起的疾病相关的症状的方法，该方法包含给该人或动物施用本发明的药物。

本发明的另一个方面是一种能够结合CD11b/CD18整联蛋白的多肽，所述多肽选自：

a.具有30至500个氨基酸、优选地50至300个氨基酸、且更优选地50至150个氨基酸的博德特氏菌腺苷酸环化酶的片段，所述片段包含所述博德特氏菌腺苷酸环化酶的CD11b/CD18相互作用结构域，或包含足以保留与CD11b/CD18结合的能力的所述野生型CD11b/CD18相互作用结构域的片段，或

b.与所述片段具有至少70％相同性、优选地至少80％相同性、且更优选地至少90％相同性的变体，其中所述变体保留与CD11b/CD18结合的能力。

博德特氏菌腺苷酸环化酶优选地选自百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌和支气管炎博德特氏菌，且更优选地为百日咳博德特氏菌。

本发明的多肽可选自那些采用合适的构象以结合CD11b/CD18的多肽。

在具体的实施方式中，本发明的多肽可包含博德特氏菌腺苷酸环化酶的其他辅助区域，这些区域参与最佳结合CD11b/CD18。这些区域更具体地包括由自1416至1648位的区域组成的氨基酸序列。

在一个优选的实施方式中，本发明的多肽是上述b中所定义的变体，其由CD11b/CD18相互作用结构域中的一或多个10至50个氨基酸片段组成。例如，在一个优选的实施方式中，所述多肽包含来自百日咳博德特氏菌腺苷酸环化酶的自1208至1243位氨基酸的百日咳博德特氏菌腺苷酸环化酶区域中的至少10至50个氨基酸的片段。

百分比相同性所对应的是当采用BLAST算法将两个序列进行比对时，所述变体中与野生型序列相同的氨基酸的百分比。“保留与CD11b/CD18结合的能力”这一表述指的是，所述变体与其所能比对的相应的野生型片段相比，所述变体保留至少80％的与CD11b/CD18的结合亲和力，且优选地至少90％的与CD11b/CD18的结合亲和力。

根据一个优选的实施方式，所述多肽与识别博德特氏菌野生型腺苷酸环化酶的抗血清、优选地与识别百日咳博德特氏菌腺苷酸环化酶抗血清特异性反应。更优选地，当施用于哺乳动物后，所述多肽能够诱发特异性识别博德特氏菌腺苷酸环化酶的抗体。

在一个具体实施方式中，所述多肽是百日咳博德特氏菌腺苷酸环化酶的片段。在另一个具体实施方式中，所述多肽基本上由CD11b/CD18相互作用结构域组成，且更具体地由百日咳博德特氏菌腺苷酸环化酶的自1166至1281位氨基酸(SEQ ID NO：2)的百日咳博德特氏菌的CD11b/CD18相互作用结构域组成。

在其他具体实施方式中，所述多肽还包含博德特氏菌腺苷酸环化酶的酰化结构域和/或疏水性结构域。所述酰化结构域包括在SEQ ID NO：1的700至1000位残基的相应区域内，如WO 93/21324所述，并包含Lys983和/或Lys 860。疏水性结构域相应于SEQ ID NO：1的500至700位残基的区域。

优选地，所述多肽被施用于哺乳动物体内后是无毒的。

本发明的多肽与野生型腺苷酸环化酶竞争结合CD11b/CD18整联蛋白。

因此，本发明还涉及上述多肽在制备用于预防或治疗人类或动物的与百日咳相关的疾病症状和/或用于保护人类或动物抵抗博德特氏菌感染相关的疾病的疫苗或药物中的用途。

更具体地，本发明涉及使用本发明的所述多肽以产生抗博德特氏菌感染的保护性抗体。

已经有报道认为腺苷酸环化酶是一种有效的分子输送载体，能够将不同抗原导向树突状细胞，特别是导致产生强效的CD4+以及CD8+T细胞应答(EP 1188446，Institut Pasteur)。

本发明现在涉及本发明的多肽在制备一种用于将感兴趣的分子特异性导向表达CD11b的细胞的载体中的用途。

术语“特异性”在本申请的说明中指的是当所述多肽用作感兴趣的分子的载体时，由于其CD11b/CD18相互作用结构域与CD11b/CD18具有高结合亲和力，其优先导向表达CD11b的细胞，由此能够将感兴趣的分子以相对于其他细胞而言具有选择性的方式导向所述细胞的表面或所述细胞的内部。

具体而言，在一个实施方式中，对所述分子或肽的这种导向作用在体内是有效的。在其他的实施方式中，对所述分子的这种导向作用在体外或离体是有效的。“体外”指的是靶细胞是体外培养的细胞，“离体”指的是靶细胞是自活生物体中提取出来的、培养于体外的、且准备再次施用于活生物体的细胞。

由此，本发明提供了用于设计一些组合物的合适的方式，所述组合物适合于施用于需要导向特定的白细胞且特别是髓性树突状细胞、中性粒细胞或巨噬细胞的动物或人类宿主。

本发明更加具体地涉及用于将感兴趣的分子导向表达CD11b的细胞的载体，其特征在于所述载体包含与该感兴趣的分子相偶联的、如上所述的能够结合CD11b/CD18的多肽。

本发明还涉及在体外将感兴趣的分子导向表达CD11b的细胞的方法，所述方法包含：

a.提供取自活生物体的表达CD11b的细胞，

b.将所述表达CD11b的细胞与本发明的载体在适合将所述载体导向所述表达CD11b的细胞的条件下进行培养。

本发明还提供了包含感兴趣的分子的表达CD11b的细胞，其通过以上所述的方法而获得。

根据本发明，“感兴趣的分子”这一表述指的是任何分子，优选地其不是博德特氏菌腺苷酸环化酶的片段。

感兴趣的分子还可以选自核酸，例如DNA、RNA、寡核苷酸、反义DNA、质粒和粘粒。其还可以选自肽或多肽，且特别是酶、辅酶、受体配体、半抗原、抗原、抗体、及它们的片段。自然，本领域人员能够根据所需的用途而选择合适的分子。

感兴趣的分子可选自药物的有效成分、免疫毒素、抗氧化剂、抗生素、生长因子、细胞内激素、细胞因子、毒素、神经递质、抗微生物制剂特别是抗病毒剂、抗细菌剂、抗寄生虫剂或抗肿瘤剂，且更广泛地，任何感兴趣的治疗性或预防性制剂。

根据一个具体的实施方式，感兴趣的分子选自肽、糖肽、脂肽、多糖、寡糖、核酸、脂质和化合物。

在具体的实施方式中，感兴趣的分子是一种异源性抗原或表位，术语“异源性”指的是不同于载体自身所含有的腺苷酸环化酶的抗原决定簇的抗原或表位。

将感兴趣的分子偶联于本发明的多肽，以提供本发明的载体。

在此，术语“偶联”指的是能够使得所述感兴趣的分子与所述多肽物理性相结合的任何相互作用。优选地，偶联是共价的。可以是直接的共价偶联或通过使用连接剂进行间接偶联，以形成缀合物。化学连接方法是本领域已知的。化学连接可选自例如马来酰亚胺键、肽键、二硫键或硫醚键。例如，可使用N-吡啶基磺酰基-活化的硫氢基(N-pyridylsulfonyl-activated sulfhydryl)的二硫键。

一个具体的方法包括给所述多肽添加一种连接物，所述连接物由至少一个半胱氨酸组成，其可容易地用于进行二硫键连接。另一种措施包括化学偶联一种生物素基团，其能够与结合链霉抗生物素的分子发生偶联。

可通过与不同的半胱氨酸残基形成二硫键而将多个分子与本发明的多肽进行化学偶联，条件是所述偶联不会妨碍与CD11b/CD18的相互作用。

表达CD11b的细胞的功能特性进一步说明了本发明的所述多肽在制备用于将药物导向这些特殊细胞的蛋白质载体中的用途。就此而言，在本发明的一个具有实施方式中，所谓的感兴趣的分子是药物的有效成分。可以将所述有效成分以化学方法或遗传学方法偶联于本发明的多肽。有利地，感兴趣的分子是抗炎药物，当其偶联于腺苷酸环化酶毒素后，被特异性导向参与炎症反应的细胞如中性粒细胞表面。

由于表达CD11b的细胞，且特别是髓性树突状细胞、中性粒细胞和巨噬细胞，参与了免疫系统和先天性防御系统的重要功能，特别是炎症性和特异性免疫应答，因此，在本发明的一个优选的实施方式中，本发明的载体被更加具体地设计为用于引发CD4+和CD8+细胞应答，所述应答出现在所述感兴趣的分子被导向表达CD11b的细胞特别是髓性树突状细胞之后。

在这一方面，感兴趣的分子优选地是或包含表位或抗原。更具体地，感兴趣的分子尤其可以是选自如下一组的抗原：脊髓灰质炎病毒抗原、HIV病毒抗原、流感病毒抗原、淋巴细胞性脉络膜脑膜炎病毒(lymphocytic choromeningitidis virus)、表位、人乳头状瘤病毒(HPV)抗原、细菌抗原、例如结合分枝杆菌抗原。

因此，本发明提供了在患者体内引发CD4+和CD8+细胞应答的手段，其或者通过在体内将抗原或表位导向表达CD11b的细胞，或者通过以离体方式将抗原或表位导向提取出来的表达CD11b的细胞并将所得细胞重新施用于所述患者。

因此，本发明涉及用于在体外将抗原或表位导向表达CD11b的细胞的方法，该方法包括：

a.提供取自活生物体的表达CD11b的细胞，和

b.将所述表达CD11b的细胞与携带抗原或表位作为感兴趣的分子的本发明的载体在适合将所述载体导向所述表达CD11b的细胞的条件下进行培养。

优选地，取自活生物体的表达CD11b的细胞是髓性树突状细胞。

本发明还提供了通过如上所述的方法获得的表达CD11b的细胞，其包含异源性抗原或表位。

本发明因此涉及一种用于针对一种抗原对人或动物进行免疫的细胞治疗产品，其特征在于其包含有效量的通过如上所述的方法获得的包含异源性抗原或表位的表达CD11b的细胞，以及药学可接受的载体。

本发明还涉及通过如上所述的方法获得的包含所述抗原或表位的、表达CD11b的细胞在制备一种用于针对一种抗原对人或动物进行免疫的细胞治疗产品中的用途。

更具体地，本发明提供了用于针对一种抗原对患者进行免疫的方法，其包含：

a.自所述患者提取表达CD11b的细胞，

b.将所述表达CD11b的细胞与携带抗原或表位作为感兴趣的分子的本发明的载体在适合将所述载体导向所述细胞的条件下在体外进行培养，

c.将有效量的包含所述载体的所述细胞重新施用于所述患者以引发CD4+和/或CD8+应答，由此针对所述抗原对所述患者进行免疫。

根据本发明的一个优选的实施方式，所述表达CD11b的细胞是髓性树突状细胞。

本发明因此还涉及一种药物组合物，其包含携带表位或抗原作为感兴趣的分子的本发明的载体，以及药学上可接受的载体。

根据一个具体的实施方式，所述组合物是适合施用于人或动物的疫苗。优选地，所述疫苗能够诱导针对脊髓灰质炎病毒、HIV或淋巴细胞性脉络膜脑膜炎病毒(lymphocytic choromeningitidis virus)的免疫。当然，免疫的类型取决于载体所携带的所选定的抗原。在另一个实施方式中，所述疫苗能够诱导针对百日咳的免疫。

此类疫苗包含免疫保护和非毒性量的本发明的载体。因此，所述组合物可进一步包含合适的引发佐剂。

本发明还涉及用于针对病原体感染对人或动物进行免疫的方法，所述方法包括给所述的人或动物施用包含免疫保护和非毒性量的本发明的载体的疫苗。

本发明还涉及用于制备本发明的多肽、蛋白质或载体的手段。所述手段包括编码选自如下多肽的核酸：

a.本发明的蛋白质，其在结合CD11b/CD18方面具有缺陷；

b.本发明的多肽，其能够结合CD11b/CD18整联蛋白；或

c.将感兴趣的分子导向表达CD11b的细胞的载体。

尤其是，可采用已知的技术自编码任何博德特氏菌菌株的野生型腺苷酸环化酶的DNA衍生得到本发明的核酸，例如自基因文库分离基因，自mRNA模板制备互补链或cDNA或通过聚合酶链反应或来自临床菌种分离物。或者，可通过标准DNA合成技术合成编码野生型腺苷酸环化酶的DNA。可以从商业性保藏机构公开获得各种博德特氏菌菌株。

可采用常规的分子生物学技术通过对野生型DNA进行遗传工程而对编码博德特氏菌腺苷酸环化酶的野生型DNA进行修饰。

本发明的另一个目的涉及一种重组核酸，其由编码本发明的多肽、蛋白质或载体的核酸组成，并被克隆入一种适合在宿主细胞中表达所编码的多肽或蛋白质的表达载体中。任选地，所述重组DNA分子包含额外的编码序列，其编码具有免疫刺激特性的载体多肽，所述载体多肽例如为佐剂，或者可用于表达、纯化和/或配制本发明的多肽。所述编码序列可与本发明的用于导向分子的多肽、蛋白质或载体的编码序列置于一个可读框内。

当然，表达载体的选择取决于所采用的宿主。

优选地，所述表达载体是质粒、粘粒、噬菌粒或病毒DNA。

本发明还涉及一种制备方法，其用于制备本发明的在结合CD11b/CD18方面具有缺陷的蛋白质；如上所述的能够结合CD11b/CD18的多肽；或用于将感兴趣的分子导向表达CD11b的细胞的载体，所述方法的步骤包括：将上述重组核酸整合入合适的宿主细胞以表达相应的感兴趣的多肽、蛋白质或载体；培养转化的重组细胞并回收本发明的合成的重组多肽、蛋白质或载体。

本发明的另一个方面是一种宿主细胞，其以本发明的重组核酸进行转化，且因此包含如上所述的核酸或重组核酸。在一个实施方式中，可通过包括同源重组在内的常规的技术将所述重组核酸整合入宿主细胞的基因组中。

本发明的优选的宿主细胞包括那些属于大肠杆菌和博德特氏菌属的细胞。其他合适的细胞包括但不限于哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母和其他细菌细胞。

本发明还包含可通过以本发明的多肽、蛋白质、载体或组合物免疫动物或人而获得的多克隆血清。

在一个优选的实施方式中，所述多克隆血清可通过以由博德特氏菌腺苷酸环化酶的CD11b/CD18相互作用结构域组成的多肽、优选地由百日咳博德特氏菌腺苷酸环化酶的自1166至1281位氨基酸的CD11b/CD18相互作用结构域组成的多肽免疫动物或人而获得。

本发明还涉及特异性针对包含CD11b/CD18相互作用结构域的本发明的多肽的单克隆抗体。

在一个优选的实施方式中，所述单克隆抗体针对位于CD11b/CD18相互作用结构域内的表位，优选地针对位于百日咳博德特氏菌腺苷酸环化酶的自1166至1281位氨基酸的CD11b/CD18相互作用结构域内的表位。

优选地，所述多克隆血清或单克隆抗体能够阻断野生型腺苷酸环化酶与CD11b/CD18的结合。可通过将所述多克隆血清或单克隆抗体与野生型腺苷酸环化酶的混合物与CD11b/CD18相结合的能力与野生型腺苷酸环化酶单独与CD11b/CD18相结合的能力相比较，进行评价，从而测定所述阻断。

在一个具体实施方式中，所述药物提供针对博德特氏菌感染的被动免疫。

为了用于人类生物体，本发明的抗体可进行人源化，例如通过以由上述技术获得的单克隆免疫球蛋白的高变区取代人免疫球蛋白中不具有抗体功能的高变区部分而进行人源化。

例如，进行抗体人源化的技术可参见Waldmann T.，June 1991，Science，vol.252，p.1657-1662；Winter G.et al，1993，Immunology Today，vol.14，No.6，p.243-246；Carter等，May 1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.89，p.4285-4289；Singer等，1 April 1993，Journal of Immunology，vol.150，No.7，p.2844-2857。

本发明还涉及一种药物组合物，其包含所述多克隆血清或单克隆血清、以及药学可接受的载体。

本发明还涉及本发明的多克隆血清或单克隆抗体在制备用于治疗人或动物的与百日咳相关的疾病症状和/或用于保护人或动物抵抗与博德特氏菌感染相关的疾病症状的药物中的用途。

以下实验部分给出了用于确定(i)翻译后酰化在CyaA与CD11b的相互作用中的作用(ii)百日咳博德特氏菌腺苷酸环化酶的CD11b相互作用结构域的结果。

附图说明

图1.CyaA特异性结合CD11b细胞并抑制CyaA-生物素和抗CD11b单克隆抗体两者与这些细胞的结合

(A)CHO细胞或CHO-CD11b细胞与指定浓度的CyaA进行温育。以抗CyaA Mab(5G12)通过FACS检测表面结合的CyaA。结果表示为AMFI＝(与CyaA进行温育的细胞的MFI值)-(未与CyaA进行温育的细胞的MFI值)，且结果代表至少2次独立实验的结果。

(B)CHO-CD11b与指定浓度的CyaA进行预温育。然后在持续存在毒素的情况下分别加入CyaA-生物素(30nM)或抗CD Mab(2μg/ml)，并通过FACS测定它们的结合。

(C)与指定浓度的CyaA进行预温育后，在持续存在毒素的情况下将CHO-CD11b细胞或CHO-CD11c细胞分别与抗CD11b或抗CD11c单克隆抗体进行温育。然后通过FACS测定抗体结合。

对于(B)和(C)，结果表示为结合百分比＝(样品结合)/(最大结合)×100，并代表至少2次独立实验的结果。

图2.CyaA或proCyaA与CHO转染体直接结合

CHO-CD11b细胞(A)或CHO细胞(B)与指定浓度的CyaA或proCyaA进行温育。以抗CyaA Mab(5G12)检测表面结合的CyaA。结果表示为AMFI＝(与CyaA进行温育的细胞的MFI值)-(未与CyaA进行温育的细胞的MFI值)，结果代表2次独立实验的结果。

图3.CyaA的酰化对于与CHO-CD11b细胞的稳定结合是必需的

CHO-CD11b细胞与指定浓度的CyaA或proCyaA的进行预温育。任何在持续存在CyaA或proCyaA的情况下加入CyaA-生物素(A)或抗CD11b Mab(B)。通过FACS测定表面结合的CyaA-生物素或抗CD11bMab。结果表示为结合百分比＝(样品结合)/(最大结合)×100，且代表至少2次独立实验的结果。

图4.CyaA的酰化是CyaA诱导的cAMP聚集和细胞毒性所必需的

CHO-CD11b细胞与指定浓度的CyaA或proCyaA在37℃温育20min。然后裂解细胞并测定cAMP(A)。与此平行地，将CHO-CD11b在存在指定浓度的CyaA或proCyaA的情况下在37℃温育4小时后，通过测定释放至培养基中的乳酸脱氢酶的量而测定毒性(B)。结果代表至少2次独立实验的结果。

图5.催化结构域不是CyaA与CD11b细胞相互作用所必需的

CHO-CD11b与与指定浓度的CyaA、CyaA 1-384或CyaA 373-1706进行预温育。然后将细胞与CyaA-生物素(A)或抗CD11b Mab(B)进行温育。通过FACS测定CyaA-生物素和抗CD11b Mab的结合。结果表示为结合百分比＝(样品结合)/(最大结合)×100，且代表至少2次独立实验的结果。

图6.CyaA片段与CD11b细胞的直接结合

CHO-CD11b细胞(A，C)或CHO细胞(B，D)与指定浓度的CyaA、CyaA 1-384和CyaA 373-1706进行温育。然后以识别催化结构域的抗CyaA 5G12Mab(A，B)或以识别重复结构域的抗CyaA 6D7 Mab(C，D)检测表面结合的CyaA。结果表示为AMFI＝(与CyaA或CyaA片段进行温育的细胞的MFI值)-(未与CyaA或CyaA片段进行温育的细胞的MFI值)，且代表至少2次独立实验的结果。

图7.在存在CyaA-FLAG突变体的情况下CyaA-生物素与CHO-CD11b细胞结合

CHO-CD11b细胞与CyaA或CyaA FLAG突变体(30nM)进行预温育。然后在持续存在CyaA或CyaA-FLAG分子的情况下加入CyaA-生物素。通过以链霉抗生物素-PE通过FACS检测表面结合的CyaA-生物素。结果表示为结合百分比＝(样品结合)/(最大结合)×100，且代表至少2次独立实验的结果。

图8.SDS-Page分析纯化的CyaA制剂及其对红细胞的侵袭活性

(A)根据已有的方法(Karimova等，1998)，通过DEAE-和苯基琼脂糖层析法自尿素提取物中纯化CyaA/FLAG分子与野生型CyaA。将各大约3μg的各种蛋白质在7.5％丙烯酰胺凝胶上电泳并以考马斯兰染色进行分析。(B)CyaA/FLAG分子对绵羊红细胞的侵袭活性。各2μg的各种CyaA蛋白质与5×10⁸洗涤绵羊红细胞温育30分钟，按照已有的方法(Osicka等，2000)测定转移至细胞内的AC活性的量。结果代表3次双份实验的平均值(n＝6)。

图9.在存在选定的CyaA-FLAG突变体的情况下CyaA与CHO-CD11b细胞的结合

CHO-CD11b细胞与不同浓度(自7.5nM至240nM)的CyaA或CyaA FLAG突变体进行预温育。在持续存在CyaA分子的情况下加入CyaA-生物素，并检测表面结合的CyaA-生物素。结果表示为结合百分比＝(样品结合)/(最大结合)×100，且代表至少2次独立实验的结果。

实验部分

A.材料和方法

A.1 CyaA衍生的蛋白质的制备、纯化和修饰

根据标准的方案(Sambrook等，1989)以大肠杆菌菌株XL1-Blue(Stratagene，Amsterdam，Netherlands)作为宿主细胞进行DNA操作。文献中已经描述了编码非酰化的野生型proCyaA(pACT7)、酰化的野生型CyaA(pT7CACT1)和在其催化结构域具有一个独特的半胱氨酸残基和OVA表位的重组去毒化CyaA-E5-CysOVA(pCACT-E5-CysOva)的质粒{Gmira等，2001；Guermonprez等，2001；Osicka等，2000；Sebo等，1991}。编码CyaA 373-1706(pTRCyaAA1-373)的质粒是pTRCAG(Gmira等，2001)的衍生物，其中编码毒素的催化结构域(位于Ndel和BstBI位点之间)的DNA序列被缺失并被替换为一种合适的合成双链寡核苷酸，其编码氨基酸序列：Met-Gly-Cys-Gly-Asn。

制备CyaA的方案已有描述(Karimova等，1998)。所有蛋白质均表达于E.coli BLR菌株(Novagen，Merck KG，Darmstadt，Germany)，并通过如Guermonprez等，2000所述的包括DEAE琼脂糖和苯基琼脂糖层析法的两步程序自内含体使之纯化到超过95％均质(如通过SDS凝胶分析来判断)。根据生产商的说明，以巯基试剂N-(6-(生物素酰胺基)己基)-3′-(2′-吡啶基二硫)丙酰胺(N-(6-(Biotinamido)hexyl)-3′-(2′-pyridyldithio)propiamide，即Biotin-HPDP)(Pierce，Bezons，France)对纯化的CyaA-E5-CysOVA蛋白质进行标记，标记位点是所述的独特的半胱氨酸残基。将生物素酰化的CyaA在DEAE琼脂糖上进行重新纯化，以便除去未反应的Biotin-HPDP试剂。

如Ladant等，1992所述进行CyaA-1-384的表达和纯化。

通过分光光度分析自278nm的吸光度确定毒素的浓度，采用的分子消光系数为：全长CyaA毒素，141mM^-1cm^-1；对于CyaA 373-1706，113mM^-1cm^-1；而对于CyaA 1-384，28mM^-1cm^-1。

采用先前描述的CyaA分子中的允许插入位点(Osicka等，2000)构建CyaA-FLAG分子。我们产生了一组17个CyaA构建体，其在各自的允许位点携带用于FLAG表位(Sigma，Saint Quentin Fallavier，France)的合成八肽插入体Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys。为实现这一目的，将三对双链合成寡核苷酸对(分别为5′-GTACTGATTATAAAGATGACGATGACAAATCAC+5′-GTACGTGATTTGTCATCGTCATCTTTATAATCA；5′-GTACTTATCGATTATAAAGATGACGATGACAAA+5′-GTACTTTGTCATCGTCATCTTTATAATCGATAA和5′-GTACGTGGATTATAAAGATGACGATGACAAAGC+5′-GTACGCTTTGTCATCGTCATCTTTATAATCCAC)(SEQ ID NO：5至10)插入此前已经引入cyaA内部的独特的BsrG I位点内(Osicka等，2000)，所述寡核苷酸对在所需读框内编码FLAG表位。通过DNA测序核对正确的插入，在E.coli内表达重组CyaA分子并纯化。如先前所述使用绵羊红细胞作用靶细胞(Osicka等，2000)表征选定的CyaA/FLAG分子的侵袭能力。

A.2 产生抗CyaA单克隆抗体

首先以CyaA毒素(20μg，于明矾中)腹腔内免疫BALB/c小鼠。每隔大约2周，以10μg CyaA(于明矾中)对小鼠进行加强免疫，共3次。在整个免疫接种方案过程中，对小鼠进行放血，并通过ELISA测试它们的血清是否出现抗CyaA抗体。当检测到明显的血清滴度时，给这些小鼠进行最后一次强化，并在3天后将它们的脾细胞与P3X63骨髓瘤细胞(ATCC，Manassas，USA)融合。通过ELISA来筛选所产生的杂交瘤，筛选出产生CyaA特异性单克隆抗体的杂交瘤。然后选择高产杂交瘤并通过单个细胞有限稀释法进行克隆，随后将其用于在BALB/c裸鼠中产生腹水，以产生大量的抗CyaA单克隆抗体。根据生产商的说明，采用T-GeITM纯化试剂盒(Pierce，Bezons，France)自腹水中纯化单克隆抗体。采用Bio-Rad蛋白质分析法(Bio-Rad，Marnes la Coquette，France)测定抗体浓度。这些单克隆抗体中的两种被用于本研究：抗体5G12，其与位于1至190位氨基酸内的表位反应；和抗体6D7，其与位于1006至1706位氨基酸内的表位反应。

A.3 细胞和培养

转染了人CD11b/CD18的中国仓鼠卵巢细胞(CHO-CD11b细胞)、转染了人CD11c/CD18的中国仓鼠卵巢细胞(CHO-CD11c细胞)或仅转染了载体的中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)由D.Golenbock(BostonUniversity School of Medicine，Boston，MA)惠赠，且按照先前所述在有新霉素的调节性进行培养(Ingalls等，1998)。

A.4 抗体

特异于人CD11b的单克隆抗体(ICRF44，小鼠IgG1，κ)和特异于人CD11c的单克隆抗体(B-Ly6，小鼠IgG1，κ)购自BD Pharmingen(LePont de Claix，France)。

A.5 结合分析

分析方法如Guermonprez等，2001所述。简言之，将2×10⁵细胞与指定浓度的CyaA分子在含有4.5mg/ml葡萄糖的无血清的DMEM培养基(Life Technologies，Cergy Pontoise，France)中、在96孔培养板中冰上温育30min。洗涤后，加入25μg/ml的抗CyaA催化结构域Mab(5G12)或抗CyaA重复结构域Mab(6D7)。在一些实验中，将细胞与指定浓度的CyaA分子在冰上预温育30min。然后，在持续存在毒素的情况下分别加入CyaA-生物素(30nM)、抗CD11b Mab(2μg/ml)或抗CD11c Mab(2μg/ml)(BD Pharmingen)。

洗涤并去除上清液后，将细胞以山羊抗小鼠IgG-PE(Caltag，Le Perrayen Yvelines，France)或以链霉抗生物素-PE(BD Pharmingen)的1∶300的稀释液进行染色。末次洗涤后，加入5μg/ml碘化丙啶，将细胞在FACStar^TM(Becton Dickinson，Le Pont de Claix，France)上进行流式细胞仪分析。基于细胞对碘化丙啶的排斥进行门控以减去聚集的细胞或死细胞。自平均荧光强渡(MFI)推算出结合数据，并表示为ΔMFI＝(与CyaA进行温育的细胞的MFI值)-(未与CyaA进行温育的细胞的MFI值)或表示为结合百分比＝(样品结合)/(最大结合)×100。最大结合相应于(与CyaA或抗CD11b在不存在竞争剂的情况下进行温育的细胞的MFI值)-(仅与培养基进行温育的细胞的MFI值)。样品结合相应于(与CyaA或抗CD11b在存在竞争剂的情况下进行温育的细胞的MFI值)-(仅与培养基进行温育的细胞的MFI值)。

A.6 cAMP分析

基本上按照如Guermonprez等，2001所述测定聚集在暴露于CyaA毒素的细胞内的环AMP。简言之，5×10⁵细胞与指定浓度的CyaA在DMEM+葡萄糖中在37℃温育20min。洗涤后，以0.1N HCl裂解并在120℃煮沸5min使得聚集在细胞浆中的cAMP释放。以0.1N NaOH进行中和后，将样品加入到预先以cAMP-BSA缀合物包被的微量滴定板中，然后与经过适当稀释的抗cAMP兔抗血清进行温育。洗涤后，以偶联了碱性磷酸酶的抗兔抗体检测抗cAMP抗体。通过与用已知浓度的cAMP得到的标准曲线进行比较而确定各个样品的cAMP含量。

A.7 CyaA侵袭活性

通过如Osicka等，2000在先前所述测定CyaA分子的侵袭活性。简言之，将绵羊红细胞与毒素温育30min，将侵袭活性测定为转移至红细胞内、并可抵抗通过在细胞外加入胰蛋白酶进行消化的AC活性。

B.结果

B.1 CyaA特异性结合CD11b+细胞并抑制CyaA-生物素和抗CD11b与CD11b+细胞的结合

为了研究CyaA在其与CD11b的相互作用中的生物学特征和结构特征的作用，设计了两种互补的分析：一种结合分析以及一种竞争分析。结合分析包括将CyaA分子与转染的表达人CD11b/CD18的CHO细胞(CHO-CD11b细胞)进行温育，或与模拟转染的CHO细胞进行温育，随后以一种特异于催化结构域的抗CyaA单克隆抗体(5G12)来检测与细胞结合的毒素。如图1A所示，采用这种分析，在CD11b+细胞上特异性检测到CyaA结合。在竞争分析中，可测试不同CyaA分子(突变体或片段)与CyaA-生物素或抗CD11b单克隆抗体(Mab)竞争结合CD11b+细胞的能力。在此，将CHO-CD11b细胞与不同浓度的CyaA在冰上温育30min。然后，在持续存在CyaA的情况下，加入CyaA-生物素(30nM)或抗CD11b Mab(2μg/ml)，并通过FACS评价其与细胞的结合。如图1B所示，CyaA以剂量依赖性方式有效地抑制了CyaA-生物素和抗CD11b两者与CHO-CD11b细胞的结合。这种抑制作用对CD11b具有特异性，这是因为CyaA完全不能与另一种配体(抗CD11c Mab)竞争由CHO细胞表达的其特异性受体(CD11c)(图1C)。

B.2 缺乏CyaA酰化影响其与CD11b+细胞的结合

由于已知CyaA需要在转录后进行棕榈酰化才能行使其侵袭活性并形成溶血性膜通道，因此我们测试了缺乏酰化是否影响CyaA与CD11b+细胞的相互作用。在一种结合分析中，将CHO细胞或CHO-CD11b细胞与CyaA或非酰化的proCyaA进行温育。使用抗CyaA催化结构域Mab(5G12)对结合进行评价。如图2A所示，在低浓度，CyaA和proCyaA这两种分子与CD11b+细胞的结合是相当接近的，酰化的CyaA的结合效率略微更高一些。这可能是由于其与细胞膜具有增强的相互作用、CyaA具有更适合于结合的构象和/或CyaA具有与CD11b受体更高的亲和力。的确，与CyaA的结合相比，proCyaA的结合在明显更高的前毒素浓度达到饱和。对这一现象的最简单的解释可以是proCyaA结合CD11b+细胞的亲和力低于CyaA。在高前毒素浓度，proCyaA的聚集和/或寡聚体可能结合细胞，随后，更多的proCyaA被发现与抗体检测系统发生结合。与此不同，检测到CyaA或proCyaA与对照CHO细胞的结合极低(图2B)。

B.3 酰化稳定了CyaA与CD11b+的相互作用

为了进一步研究CyaA酰化在该毒素与CD11b+细胞相互作用中的作用，我们测试了非酰化的proCyaA与CyaA竞争结合CHO-CD11b细胞的能力。如图3A所示，与酰化的CyaA相比，非酰化的proCyaA与生物素酰化的CyaA竞争结合CD11b+细胞的能力是明显降低的。为了确定缺乏抑制是否是由于不能与CD11b相互作用，我们评价了proCyaA阻断抗CD11b与CHO-CD11b细胞结合的能力。的确，与CyaA相比，proCyaA不能抑制抗CD11b与CHO-CD11b细胞的结合(图3B)。

由于超过生理学水平产生cAMP和细胞毒性是CyaA与CD11b+细胞相互作用的结果，因此，我们随后使用CHO-CD11b细胞分析这些毒素的功能是否依赖于CyaA的酰化。正如所预期的，与酰化的毒素不同，proCyaA没有在CHO-CD11b细胞中诱导任何cAMP的升高(图4A)，且对这些细胞没有明显的细胞毒作用(图4B)。总之，这些结果清楚地证实，CyaA的酰化对于毒素与CD11b+细胞的功能性相互作用是必需的，而且proCyaA与CD11b的结合不足以在表达CD11b的细胞中引发细胞毒作用。

B.4 催化结构域对于CyaA与CD11b的相互作用是非必需的

在功能上，CyaA由两种具有独立活性的主要结构域组成。N末端结构域具有腺苷酸环化酶活性(氨基酸1-400)，而羧基末端的溶血素部分(氨基酸400-1706)负责将AC结构域输送至靶细胞内以及百日咳博德特氏菌的溶血活性。为确定CyaA的这两种功能性结构域在结合CD11b+细胞中的作用，我们测试了由残基1至384编码的催化结构域CyaA 1-384以及由残基373至1706编码的溶血性部分CyaA 373-1706与CyaA-生物素竞争结合CHO-CD11b细胞的能力。如图5A所示，催化结构域不能抑制CyaA-生物素结合CHO-CD11b细胞，而CyaA 373-1706显示出与全长CyaA相同的结合抑制作用。相似地，催化结构域也不能抑制抗CD11bMab与CHO-CD11b细胞的结合(图5B)。此外，以特异于催化结构域的抗CyaA Mab(5G12)进行的直接结合分析没有发现CyaA 1-384与CHO-CD11b细胞的表面发生任何明显的结合，而CyaA的结合则很容易被检测到(图6A)。CyaA 373-1706与CHO-CD11b细胞的直接结合不能被识别位于CyaA的前200个氨基酸内的表位的5G12Mab检测到，单却清楚地被特异于重复结构域的另一种抗CyaA Mab(6D7)清楚地证实(图6C)。同样，以6D7 Mab检测到在缺乏CD11b的CHO细胞上仅有极弱的CyaA或CyaA 373-1706的结合(图6B和D)。总之，这些结果清楚地证实，催化结构域对于CyaA与CD11b的相互作用是非必需的，且CyaA/CD11b相互作用结构域位于CyaA 373-1706片段内。

B.5 与CD11b相互作用的CyaA结构域位于CyaA重复区域内

为了鉴定CyaA的与CD11b相互作用的区域，我们表达并纯化了C末端区域CyaA 373-1706的不同亚片段(包括残基373-1490、或700-1706、或700-1490、或1006-1706)，对这些亚片段在竞争性分析中进行了测试。不过，这些多肽无一能够对CyaA-生物素与CHO-CD11b细胞的结合构成显著的竞争。这可能是由于这些分离的片段的构象发生了改变。因此，我们采用了突变方法来定位CyaA的CD11b结合结构域。通过在如材料和方法中所详细说明的毒素多肽中的各种所述位点插入FLAG表位(氨基酸序列：DYKDDDDK)而构建了17种经不同修饰的CyaA分子。我们认为，在CD11b结合结构域的特定位置插入异源性的且高度带电的肽有可能破坏其与CD11b相互作用的能力。这17种FLAG标记的CyaA分子被表达并被纯化至均质，并测试其抑制CyaA-生物素与CHO-CD11b细胞结合的能力(注意在CyaAA510-515/FLAG和CyaAd1245-1273/FLAG这两种情况中，CyaA的氨基酸510至515或1245至1273分别被缺失并被插入的FLAG表位所替代)。如图7所示，在位于残基1166-1281之间的3个不同位点插入FLAG表位完全消除了与CD11b的相互作用。当以30nM的浓度进行测试时，相应的修饰的CyaA基本上不能与CyaA-生物素竞争结合CD11b。相反，所有其他的以FLAG标记的重组CyaA均能够与CyaA-生物素竞争结合CD11b+细胞，但具有不同的效率。引人注目地，这3种在靠近蛋白质的羧基末端(即1416位、1623位和1648位)插入FLAG表位的重组CyaA构建体与CyaA-生物素竞争结合CD11b的能力也部分受损。

为了进一步表征与CD11b相互作用的CyaA结构域，除了被发现能够与完整的CyaA同样有效地结合CD11+细胞的4种CyaA/FLAG分子以外，我们集中研究了这3种不能抑制CyaA-生物素与CD11b+细胞的结合的CyaA/FLAG分子。这些CyaA分子同样被表达并纯化至接近均质(图8A)，并通过分析其穿透绵羊红细胞膜(RBC)的能力以及将催化结构域输送至细胞外加入的胰蛋白酶所无法达到的区室的能力而测定其细胞侵袭活性。如图8B所示，除了CyaA1387/FLAG，所有其他经测试的CyaA/FLAG分子的侵袭活性均在一定程度上受到插入FLAG肽的影响。CyaA524/FLAG的侵袭活性反映了CyaA将催化结构域转移至红细胞内的能力，在残基524处插入FLAG肽完全消除了CyaA524/FLAG的侵袭活性。而CyaA424/FLAG、CyaA722/FLAG和CyaA1166/FLAG等其他蛋白质以及(在较小程度上)CyaAA1245-1273/FLAG和CyaA1281/FLAG蛋白质的穿透进入RBC的能力则是相当的。

如图9所示，以剂量依赖性方式测试了这些分子与CyaA-生物素竞争结合CHO-CD11b细胞的能力。如预期的，CyaA1166/FLAG、CyaAA1245-1273/FLAG、和CyaA1281/FLAG蛋白质不能抑制CyaA-生物素与CD11b+细胞的结合，甚至在浓度高达240nM仍是如此。相反，所有其他CyaA/FLAG构建体均以剂量依赖性方式抑制了CyaA-生物素的结合，与完整的CyaA相似。因此，CyaA1166/FLAG、CyaAA1245-1273/FLAG和CyaA1281/FLAG对结合缺乏抑制作用的原因不能归结于由FLAG插入所引起的一般性的构象破坏，这是因为这些构建体对RBC的侵袭活性与CyaA424/FLAG蛋白相当，而后者可非常高效地与CD11b+细胞相互作用。

综上所述，这些结果提供的证据是引人注目的，其说明由残基1166和1281所划定的、并包含位于两个保守性RTX重复模块(Osicka等，2000)之间的一个推定的环(残基1208-1243)的CyaA RTX重复结构域部分对于CyaA与CD11b+细胞的相互作用是至关重要的，且其最有可能代表CyaA的主要整联蛋白结合结构域。

C.讨论

腺苷酸环化酶毒素(ACT或CyaA)的生物学活性完全依赖于共价性的翻译后脂肪酰化作用。在保守性Lys-983残基没有酰化的情况下，CyaA不能将其催化结构域输送至红细胞内，因此不能形成溶血通道(Barry等，1991；Basar等，2001；Hackett等，1994)。已经发现CyaA能够以可检测到的功效穿透许多种真核细胞。但是，已经证实其主要的靶细胞是髓性细胞例如中性粒细胞和肺巨噬细胞，这些细胞对CyaA特别敏感，暴露于CyaA后会失去功能并发生凋亡(Confer and Eaton，1982；Khelefand Guiso，1995；Khelef等，1993)。最近，我们确实发现该毒素具有特异性细胞受体，一种α_Mβ₂整联蛋白(CD11b/CD18)，其仅表达于免疫细胞例如中性粒细胞、巨噬细胞或树突状细胞，且这些细胞对CyaA高度敏感的原因最有可能是其表达CD11b(Guermonprez等，2001)。在本研究中，本发明人发现CyaA酰化在其与CD11b+细胞的相互作用中具有主要的作用。的确，尽管非酰化的proCyaA能够与CyaA同样有效地结合CD11b+细胞，但其不能有效地与酰化的CyaA竞争结合CHO-CD11b+细胞，且完全不能阻断抗CD11b Mab与这些细胞的结合。这提示，尽管其仍然能够与CD11b相互作用，但相互作用的性质且特别是proCyaA-CD11b复合体的亲和力和/或稳定性显著不同于成熟CyaA与CD11b的相互作用。此外，尽管proCyaA仍然能够结合CD11b受体，但这种相互作用无法使得该前毒素穿透膜。因此，可能需要进行酰化以获得能够进行转移的CyaA构象，而这是将催化结构域输送至细胞浆并在其中催化ATP转换为cAMP所必需的。

在功能上，CyaA可分为两个主要结构域：一个具有腺苷酸环化酶活性结构域，位于残基1至400之间，另一个负责溶血活性，位于残基400至1706内(Ladant and Ullmann，1999)。毒素与靶细胞发生相互作用后，催化结构域可被直接转移通过红细胞的浆膜。本发明的数据说明，尽管催化结构域通过催化将ATP转换为cAMP而在CyaA的细胞毒活性中发挥关键作用，但该结构域并不是CyaA与其受体相结合所必需的。这些结果进一步说明，CyaA/CD11b相互作用结构域位于溶血素部分，且更确切地位于包括1166至1281位残基的富含甘氨酸和天冬氨酸的RTX重复区域的部分，正如在对与CD11b+细胞的结合具有显著影响的构建体中FLAG表位的插入位点所描绘的。具体而言，插入两个RTX重复模块之间的并包括残基1208至1243的一个推定的环结构(Osicka等，2000)，可能在CyaA与CD11b+细胞的相互作用至具有关键的作用。CyaA1166/FLAG、CyaAΔ1245-1273和CyaA1281/FLAG构建体分别缺乏与CD11b的相互作用，可能是由于一些结构上的改变，所述结构上的改变选择性地影响了特异性参与CyaA蛋白与CD11b的相互作用的、一种在功能上至关重要的节段。这是十分合理的，因为所有3种不能结合CD11b的构建体在红细胞上的替代分析系统中仍然显示出明显的细胞侵袭活性(相当于完整CyaA的20％至50％)，其中毒素活性不依赖于与CD11b的相互作用。这提示FLAG插入位置1166、1245和1281并没有损害CyaA的总体结构，但相当选择性地消除了这些构建体与CD11b+细胞相互作用的能力。总之，这些结果提示CyaA的残基1166至1281描绘了参与毒素与α_Mβ₂整联蛋白(CD11b/CD18)的相互作用的整联蛋白结合结构域的关键部分。

这一结论能够得到如下结果的支持，即所有在CyaA的前800个残基内插入FLAG肽的CyaA变体可与生物素酰化的完整的CyaA充分竞争结合CD11b。相反，蛋白质CyaA1416/FLAG、CyaA/FLAG1623和CyaA/FLAG1648的CD11b结合能力也有所降低，这提示在毒素的RTX重复部分羧基末端可能存在CyaA的一种辅助CD11b相互作用结构域。

本研究结果鉴定出区域1166-1287是CyaA的主要CD11b结合基序，这为此前观察到的CyaA与CD11b的结合是严格钙依赖性的现象(Guermonprez等，2001)提供了一种有吸引力的解释。由于RTX结构域参与钙结合并在结合钙后发生显著结构的重排(Rose等，1995)，因此可以推测位于1166-1287这一区域的CD11b结合基序可能仅在RTX结构域处于钙结合构象时才得以暴露。在此鉴定的位于CyaA的1166-1287位氨基酸区域中的CD11b结合基序准确位于第二和第三个RTX重复模块之间。可以推测，该节段的α-螺旋结构参与形成了CD11b的停靠位点(docking site)。

CyaA已经在小鼠百日咳模型中被用于若干被动或主动的保护方案。以抗CyaA特异性抗体或以纯化的CyaA进行免疫降低了百日咳博德特氏菌在呼吸道建群的时间并保护小鼠免于致死性鼻内感染(Guiso等，1989；Guiso等，1991)。此外，在感染百日咳博德特氏菌的人类婴儿的血清中检测到特异于CyaA的抗体(Arciniega等，1991；Guiso等，1993)。本研究的结果提示，缺乏CyaA/CD11b相互作用结构域的CyaA分子可被设计为用于制备安全的细胞疫苗以抵抗百日咳博德特氏菌感染。通过在位于CyaA的188和189残基之间的ATP结合位点(Fayolle等，1996)插入二肽可容易地灭活这种分子的催化活性，而CD11b相互作用结构域内的缺失可保护免疫细胞抵抗潜在的不良反应，例如通过类毒素与整联蛋白结合引起的信号转导和/或一些由于与CyaA类毒素竞争结合CD11b而产生的功能性干扰，CyaA类毒素也可作为补体受体CR3。

总之，本发明的结果为百日咳博德特氏菌腺苷酸环化酶的酰化和不同结构域在其与CD11b+细胞相互作用中的作用以及在由这种相互作用随后所引起的生物学活性中的作用提供了重要的新的认识。

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序列表

<110>巴斯德研究院

<120>包含或缺乏CD11b/CD18相互作用结构域的修饰的博德特氏菌腺苷酸环化酶及其用途

<130>B5699A-PCT-AD/DBO/MNH

<140>XXXXXXX

<141>2004-06-18

<150>EP 03291486.3

<151>2003-06-18

<160>10

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1706

<212>PRT

<213>Bordetella pertussis

<400>1

Met Gln Gln Ser His Gln Ala Gly Tyr Ala Asn Ala Ala Asp Arg Glu

1 5 10 15

Ser Gly Ile Pro Ala Ala Val Leu Asp Gly Ile Lys Ala Val Ala Lys

20 25 30

Glu Lys Asn Ala Thr Leu Met Phe Arg Leu Val Asn Pro His Ser Thr

35 40 45

Ser Leu Ile Ala Glu Gly Val Ala Thr Lys Gly Leu Gly Val His Ala

50 55 60

Lys Ser Ser Asp Trp Gly Leu Gln Ala Gly Tyr Ile Pro Val Asn Pro

65 70 75 80

Asn Leu Ser Lys Leu Phe Gly Arg Ala Pro Glu Val Ile Ala Arg Ala

85 90 95

Asp Asn Asp Val Asn Ser Ser Leu Ala His Gly His Thr Ala Val Asp

100 105 110

Leu Thr Leu Ser Lys Glu Arg Leu Asp Tyr Leu Arg Gln Ala Gly Leu

115 120 125

Val Thr Gly Met Ala Asp Gly Val Val Ala Ser Asn His Ala Gly Tyr

130 135 140

Glu Gln Phe Glu Phe Arg Val Lys Glu Thr Ser Asp Gly Arg Tyr Ala

145 150 155 160

Val Gln Tyr Arg Arg Lys Gly Gly Asp Asp Phe Glu Ala Val Lys Val

165 170 175

Ile Gly Asn Ala Ala Gly Ile Pro Leu Thr Ala Asp Ile Asp Met Phe

180 185 190

Ala Ile Met Pro His Leu Ser Asn Phe Arg Asp Ser Ala Arg Ser Ser

195 200 205

Val Thr Ser Gly Asp Ser Val Thr Asp Tyr Leu Ala Arg Thr Arg Arg

210 215 220

Ala Ala Ser Glu Ala Thr Gly Gly Leu Asp Arg Glu Arg Ile Asp Leu

225 230 235 240

Leu Trp Lys Ile Ala Arg Ala Gly Ala Arg Ser Ala Val Gly Thr Glu

245 250 255

Ala Arg Arg Gln Phe Arg Tyr Asp Gly Asp Met Asn Ile Gly Val Ile

260 265 270

Thr Asp Phe Glu Leu Glu Val Arg Asn Ala Leu Asn Arg Arg Ala His

275 280 285

Ala Val Gly Ala Gln Asp Val Val Gln His Gly Thr Glu Gln Asn Asn

290 295 300

Pro Phe Pro Glu Ala Asp Glu Lys Ile Phe Val Val Ser Ala Thr Gly

305 310 315 320

Glu Ser Gln Met Leu Thr Arg Gly Gln Leu Lys Glu Tyr Ile Gly Gln

325 330 335

Gln Arg Gly Glu Gly Tyr Val Phe Tyr Glu Asn Arg Ala Tyr Gly Val

340 345 350

Ala Gly Lys Ser Leu Phe Asp Asp Gly Leu Gly Ala Ala Pro Gly Val

355 360 365

Pro Ser Gly Arg Ser Lys Phe Ser Pro Asp Val Leu Glu Thr Val Pro

370 375 380

Ala Ser Pro Gly Leu Arg Arg Pro Ser Leu Gly Ala Val Glu Arg Gln

385 390 395 400

Asp Ser Gly Tyr Asp Ser Leu Asp Gly Val Gly Ser Arg Ser Phe Ser

405 410 415

Leu Gly Glu Val Ser Asp Met Ala Ala Val Glu Ala Ala Glu Leu Glu

420 425 430

Met Thr Arg Gln Val Leu His Ala Gly Ala Arg Gln Asp Asp Ala Glu

435 440 445

Pro Gly Val Ser Gly Ala Ser Ala His Trp Gly Gln Arg Ala Leu Gln

450 455 460

Gly Ala Gln Ala Val Ala Ala Ala Gln Arg Leu Val His Ala Ile Ala

465 470 475 480

Leu Met Thr Gln Phe Gly Arg Ala Gly Ser Thr Asn Thr Pro Gln Glu

485 490 495

Ala Ala Ser Leu Ser Ala Ala Val Phe Gly Leu Gly Glu Ala Ser Ser

500 505 510

Ala Val Ala Glu Thr Val Ser Gly Phe Phe Arg Gly Ser Ser Arg Trp

515 520 525

Ala Gly Gly Phe Gly Val Ala Gly Gly Ala Met Ala Leu Gly Gly Gly

530 535 540

Ile Ala Ala Ala Val Gly Ala Gly Met Ser Leu Thr Asp Asp Ala Pro

545 550 555 560

Ala Gly Gln Lys Ala Ala Ala Gly Ala Glu Ile Ala Leu Gln Leu Thr

565 570 575

Gly Gly Thr Val Glu Leu Ala Ser Ser Ile Ala Leu Ala Leu Ala Ala

580 585 590

Ala Arg Gly Val Thr Ser Gly Leu Gln Val Ala Gly Ala Ser Ala Gly

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<212>PRT

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<212>PRT

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<211>33

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Claims

1.由博德特氏菌腺苷酸环化酶组成的蛋白质，所述博德特氏菌腺苷酸环化酶的CD11b/CD18相互作用结构域通过一或多个氨基酸的缺失、取代或插入而被修饰，其中所述蛋白质在结合CD11b/CD18方面具有缺陷，但与识别野生型博德特氏菌腺苷酸环化酶的抗血清具有特异性反应性。

2.权利要求1的蛋白质，其中所述博德特氏菌腺苷酸环化酶通过完全缺失CD11b/CD18相互作用结构域而被修饰。

3.权利要求1或2的蛋白质，其中所述CD11b/CD18相互作用结构域通过在其中插入一种肽而被修饰。

4.权利要求1至3中任一项的蛋白质，其中所述博德特氏菌腺苷酸环化酶通过在N末端催化结构域中具有一或多个氨基酸的插入、缺失或取代而进一步被修饰，其中所述修饰的博德特氏菌腺苷酸环化酶具有的催化活性与野生型博德特氏菌腺苷酸环化酶活性相比是降低的。

5.权利要求4的蛋白质，其中所述博德特氏菌腺苷酸环化酶通过缺失N末端催化结构域的至少第1至300位氨基酸残基而被修饰，且优选地通过缺失N末端催化结构域的第1至373位氨基酸残基而被修饰。

6.权利要求4的蛋白质，其中所述博德特氏菌腺苷酸环化酶中被修饰的是发生翻译后酰化的氨基酸，这些氨基酸对应于百日咳博德特氏菌腺苷酸环化酶的Lys 983和Lys 860。

7.权利要求1至6中任一项的蛋白质，其中所述博德特氏菌腺苷酸环化酶是百日咳博德特氏菌腺苷酸环化酶。

8.药物组合物，其包含权利要求1至7中任一项的蛋白质和药学可接受的载体。

9.用作疫苗的权利要求8的组合物，其包含免疫保护和非毒性量的权利要求1至7中任一项的蛋白质。

10.权利要求9的组合物，其中所述组合物还包含一或多种合适的引发佐剂。

11.权利要求1至7中任一项的蛋白质在制备用于预防或治疗人或动物的与百日咳相关的疾病症状和/或用于保护人或动物抵抗与博德特氏菌感染相关的疾病症状的药物中的用途。

12.能够结合CD11b/CD18的多肽，所述多肽是

a.具有30至500个氨基酸、优选地50至300个氨基酸、且更优选地50至150个氨基酸的博德特氏菌腺苷酸环化酶的片段，所述片段包含所述博德特氏菌腺苷酸环化酶的野生型CD11b/CD18相互作用结构域，或包含所述野生型CD11b/CD18相互作用结构域的足以保留结合CD11b/CD18的能力的片段，或者

b.与所述片段具有至少70％相同性、优选地至少80％相同性、且更优选地至少90％相同性的所述片段的变体，其中所述变体保留结合CD11b/CD18的能力。

13.权利要求12的多肽，其中所述多肽能够增加特异性识别博德特氏菌腺苷酸环化酶的抗体，优选地特异性识别百日咳博德特氏菌腺苷酸环化酶的抗体。

14.权利要求12或13的多肽，其中所述多肽是百日咳博德特氏菌腺苷酸环化酶的片段，优选地是百日咳博德特氏菌腺苷酸环化酶的自1166位氨基酸至1281位氨基酸的片段，且更加优选地是包含百日咳博德特氏菌腺苷酸环化酶的自1208位氨基酸至1243位氨基酸这一区域的片段。

15.权利要求12至14中任一项的多肽，其还包含腺苷酸环化酶的酰化结构域和/或疏水性结构域。

16.权利要求12至15中任一项的多肽，其中所述多肽被施用于哺乳动物体内时是无毒的。

17.权利要求12至16中任一项的多肽在制备用于预防或治疗人或动物的与百日咳相关的疾病症状和/或用于保护人或动物抵抗与博德特氏菌感染相关的的疾病症状的药物中用途。

18.权利要求12至16中任一项的多肽在制备一种用于将感兴趣的分子特异性导向表达CD11b的细胞的载体中的用途。

19.用于将感兴趣的分子导向表达CD11b/CD18的细胞的载体，其特征在于所述载体包含权利要求12至16中任一项的能够结合CD11b/CD18的多肽，所述多肽偶联于一种感兴趣的分子。

20.权利要求19的载体，其中所述感兴趣的分子选自：肽、糖肽、脂肽、多糖、寡糖、核酸、脂质和化合物。

21.权利要求19或20的载体，其中所述感兴趣的分子是药物的有效成分。

22.权利要求19至21中任一项的载体，其中所述感兴趣的分子通过化学连接进行偶联。

23.权利要求19至22中任一项的载体，其中所述感兴趣的分子包含抗原或表位。

24.权利要求23的载体，其中所述感兴趣的分子是包含抗原或表位的肽或多肽。

25.一种核酸，其编码以下多肽之一：

a.权利要求1至7中任一项的蛋白质；

b.权利要求12至16中任一项的多肽；

c.权利要求24的载体。

26.通过将权利要求25的核酸克隆入一种表达载体中而构建的重组核酸，所述表达载体适合于在宿主细胞中表达所编码的多肽。

27.权利要求26的重组核酸，其中所述表达载体是质粒、粘粒、噬菌粒或病毒DNA。

28.一种宿主细胞，其包含权利要求25的核酸或权利要求26或27的重组核酸。

29.一种药物组合物，其包含与药学上可接受的载体组合的权利要求12至16中任一项的多肽或权利要求19至24中任一项的载体。

30.药物组合物，其包含权利要求23或24的载体，其中所述感兴趣的分子是药物的有效成分。

31.权利要求30的药物组合物，其中所述组合物是疫苗。

32.通过以权利要求12至16中任一项的多肽或以权利要求29至31中任一项的组合物免疫动物或人而获得的多克隆血清。

33.特异性抗权利要求12至16的多肽的单克隆抗体。

34.权利要求32的多克隆血清或权利要求33的单克隆抗体，其中所述多克隆血清或所述单克隆抗体能够阻断腺苷酸环化酶与CD11b/CD18的结合。

35.一种药物组合物，其包含与药学上可接受的载体组合的权利要求32的多克隆血清或权利要求33的单克隆抗体。

36.权利要求35的多克隆血清或单克隆抗体在制备一种用于预防或治疗人或动物的与百日咳相关的疾病症状和/或用于保护人或动物抵抗与博德特氏菌感染相关的的疾病症状的药物中用途。

37.用于在体外将感兴趣的分子导向表达CD11b的细胞的方法，所述方法包含

a.提供取自活生物体的表达CD11b的细胞，

b.将所述表达CD11b的细胞与权利要求19至24中任一项的载体在适合于将所述载体导向所述表达CD11b的细胞的条件下进行培养。

38.权利要求37的方法，其中所述感兴趣的分子包含抗原或表位。

39.权利要求37或38的方法，其中所述表达CD11b的细胞是髓性树突状细胞。

40.通过权利要求37至39中任一项的方法获得的包含感兴趣的分子的表达CD11b的细胞。

41.通过权利要求38的方法获得的包含抗原或表位的表达CD11b的细胞。

42.用于针对一种抗原而免疫人或动物的细胞治疗产品，其特征在于包含与药学可接受的载体组合的有效量的权利要求41的表达CD11b的细胞。

43.权利要求41的表达CD11b的细胞在制备用于针对一种抗原而免疫人或动物的细胞治疗产品中的用途。

44.用于针对一种抗原而免疫患者的方法，所述方法包含，

a.自所述患者提取表达CD11b的细胞，

b.在体外将所述表达CD11b的细胞与权利要求23或24的载体在适合于将所述载体导向所述细胞的条件下进行培养，

c.将有效量的包含所述载体的所述细胞重新施用至所述患者以引发CD4+和/或CD8+应答，

由此针对所述抗原而免疫所述患者。

45.权利要求44的方法，其中所述表达CD11b的细胞是髓性树突状细胞。