CN1827777A

CN1827777A - 骨桥蛋白抑制剂在类风湿关节炎中的应用

Info

Publication number: CN1827777A
Application number: CN 200510024203
Authority: CN
Inventors: 李宁丽
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority date: 2005-03-04
Filing date: 2005-03-04
Publication date: 2006-09-06

Abstract

本发明公开了一种在类风湿关节炎(RA)的发病过程中起重要作用的蛋白－骨桥蛋白。本发明还公开了骨桥蛋白及其相关的细胞因子、受体和抑制剂在诊断或治疗RA上的用途。本发明还提供了相应的诊断试剂盒。研究表明，OPN在滑膜浸润T细胞上的过表达与局部炎症环境有非常大的关系。OPN在滑膜浸润T细胞上的过表达与滑膜T细胞OPN受体(整合素αv，β1和CD44)选择性高表达有关。RA患者的SF中IL－10能刺激T细胞使OPN表达增高，抗IL－10抗体能阻断此作用。

Description

骨桥蛋白抑制剂在类风湿关节炎中的应用

技术领域

本发明涉及生物检测和诊断技术领域，具体地说，本发明涉及一种在类风湿关节炎的发病过程中起重要作用的蛋白-骨桥蛋白。本发明还公开了骨桥蛋白及其相关的细胞因子、受体和抑制剂在诊断或治疗类风湿关节炎上的用途。本发明还提供了相应的诊断试剂盒。

背景技术

虽然类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)病因和发病机制尚不清楚，但已公认T细胞介导的炎症在类风关滑膜病变过程中起了很重要的作用。II型胶原和热休克蛋白是类风关发病的自身抗原(1-4)，虽然这些自身抗原在疾病病理过程中的作用并不十分清楚。但是研究已清楚认识到T淋巴细胞，特别是Th1细胞，和炎症有关一系列前炎症细胞因子和趋化因子，和RA组织损伤有关(5，6)。已报道TNF-α拮抗剂和其受体治疗RA有效(7-9)。但类风关滑膜炎症T细胞的激活和存在的分子机制尚不清楚。

已知OPN作为早期T淋巴细胞激活剂近来认为是一潜在的与炎症过程有关的前炎症细胞因子。OPN是一种细胞外基质蛋白，具有多种功能(10，11)。OPN属于Th1细胞因子，因为OPN具有促进巨噬细胞分泌IFN-γ和IL-12的作用(10)。OPN和许多细胞表面受体反应，包括整合素αvβ3，αvβ1，α4β1，α8β1，α9β1和CD44。OPN和这些细胞表面受体结合诱导信号转导从而促进细胞黏附和迁移(12)。

RA和多发性硬化症(MS)损伤部位中OPN高表达已见报道(13-16)。然而，在本发明之前，类风关滑膜浸润T细胞OPN过表达和其在类风关滑膜中的功能关系尚未阐明。

由于类风湿关节炎的发病机理(尤其是类风关滑膜炎症T细胞的激活和存在的分子机制)尚不清楚，因此极大地阻碍了类风湿关节炎的诊断和治疗。因此，本领域长期以来一直迫切希望找到与RA的发病有关的物质，以便开发出针对性诊断或治疗类风湿关节炎的手段。

发明内容

本发明的目的就是提供一种有效的检测(或辅助检测)类风湿关节炎的方法和试剂盒。

本发明的另一目的是提供一种治疗(或辅助治疗)类风湿关节炎的方法和药物组合物。

在本发明的第一方面，提供了一种骨桥蛋白受体的用途，所述的骨桥蛋白受体用于制备检测或辅助检测类风湿关节炎的试剂，其中所述的骨桥蛋白受体选自整合素αv、β1和CD44。

在本发明的第二方面，提供了一种检测类风湿关节炎的试剂盒，它含有容器和位于容器内的检测骨桥蛋白含量的试剂。

在另一优选例中，所述的检测骨桥蛋白含量的试剂是特异性扩增骨桥蛋白的寡核苷酸引物或特异性抗骨桥蛋白的抗体。

在另一优选例中，所述的试剂盒还含有检测骨桥蛋白受体含量的试剂，其中所述的受体选自整合素αv、β1和CD44，而所述的检测骨桥蛋白受体含量的试剂是特异性扩增骨桥蛋白受体的寡核苷酸引物或特异性抗骨桥蛋白受体的抗体。

在另一优选例中，所述的试剂盒还含有检测IL-10含量的试剂。

在另一优选例中，所述的试剂盒还含有检测TNF-α或IFN-γ的试剂。

在本发明的第三方面，提供了一种骨桥蛋白抑制剂的用途，用于制备治疗或辅助治疗类风湿关节炎的药物。

在另一优选例中，所述的骨桥蛋白抑制剂是抗IL-10抗体，或抗整合素αv的抗体、抗整合素β1的抗体或抗整合素CD44的抗体。

在本发明的第四方面，提供了一种筛选治疗类风湿关节炎的药物的方法，包括步骤：

(a)设立实验组和对照组，所述的实验组由2-500个非人哺乳动物类风湿关节炎模型构成，而对照组由1-100个非人哺乳动物类风湿关节炎模型构成，并且对于对照组不施用候选物质；

(b)将候选物质施用于实验组，并观察实验组动物中骨桥蛋白的水平，并与对照组的动物中的骨桥蛋白水平进行比较，其中与对照组相比实验组动物中骨桥蛋白水平下降至少30％(较佳地下降至少50％，更佳地下降至少60％，最佳地下降至少70％)，就表示该候选物质是潜在的治疗类风湿关节炎的药物。

在另一优选例中，在步骤(b)中还包括进一步比较实验组动物和对照组蛋白中骨桥蛋白受体或IL-10的表达水平，所述的骨桥蛋白受体选自整合素αv、β1和CD44，其中与对照组相比实验组动物中骨桥蛋白受体或IL-10水平下降至少30％(较佳地下降至少50％，更佳地下降至少60％，最佳地下降至少70％)，就表示该候选物质是潜在的治疗类风湿关节炎的药物。

附图说明

图1显示了外周血、关节液和滑膜组织来源的T细胞OPN mRNA表达。

A.从32例RA患者外周血、关节液和滑膜组织来源的T细胞抽提RNA，定量PCR分析。对照T细胞来自31个健康志愿者。OPN表达量用同一样本GAPDH的表达量标准化。相对量表达用ΔΔCT表示。OPN基因的相对含量用2^-ΔΔCT计算。

B.用磁珠分离关节液CD4+T细胞和CD8+T细胞，定量PCR分析OPN表达量。分离T细胞纯度超过97％。数据来自6个随机抽取的RA患者的平均数。在所有图例中，星号代表在不同组别中比较具有统计学意义(p＜0.05)。

图2显示了RA患者关节液和血清中OPN蛋白浓度的检测结果。

ELISA检测63对RA患者配对关节滑液和血清中OPN浓度。31个健康人血清作为对照。星号表示在不同组别中OPN浓度比较具有统计学意义(p＜0.05)。

图3显示了RA患者血清和关节液中细胞因子浓度检测结果。

ELISA检测RA患者配对关节滑液和血清中IL-18、IL-12、IL-10、TNF-α和IFN-γ浓度，以健康人血清作为对照。单个星表示在RA/SF组或RA血清组与对照组比较有统计学意义(p＜0.05)。双星表示在RA/SF组与RA血清组和对照组比较有统计学意义(p＜0.05)。

图4显示了RA患者外周血、关节液和滑膜组织来源T细胞表达OPN受体。

从32例RA患者外周血、关节液和滑膜组织来源T细胞抽提RNA。31例健康志愿者T细胞RNA作为对照。OPN受体mRNA表达以同一标本内参GAPDH标准化。PBMC和SFMC中T细胞分离纯度大于97％；ST中T细胞分离纯度大于95％。OPN受体相对量表达计算方法与图1相同。星号表示在不同组别间比较具有统计学意义(p＜0.01)。

图5显示了RA滑膜组织T细胞表面CD44，αv和β1的表达。

从RA患者ST制备单细胞悬液。特异性单抗孵育后用流式细胞术检测T细胞表面CD44，αv和β1分子的表达。共用FACS分析了8例RA标本，图5所示为其中之一。

图6显示了用RA关节滑膜液刺激后T细胞OPN mRNA表达的分析结果。

A.1∶5稀释的RA-SF经过滤后分别加到随机选择的10个正常人和10个RA病人(年龄、性别相对应)的PBMC中。48小时后，分离CD2+T细胞(纯度大于97％)，用实时PCR检测OPN的表达情况。图中所示数据代表了用不同病人的RA-SF进行的四个独立实验的结果。B.RA病人的PBMC在不同浓度的RA-SF及相应的血清刺激下OPN表达的剂量曲线。用RA病人和正常人的CD4+T细胞的实验也得到相同的结果。OPN表达的计算方法同图1说明所述。

图7显示了细胞因子对OPN表达的诱导作用和抗IL-10抗体的阻断作用。

A.RA病人的PBMC(n＝10)，分别用25ng/ml浓度的细胞因子(如图所示)刺激培养48小时。磁珠分选出T细胞(纯度大于97％)，用real-time PCR检测OPN的表达。B.相同来源的PBMC用不同浓度的重组IL-10刺激的时间和剂量曲线。按图中所示的时间点收集细胞后，分离T细胞后用real-time PCR检测OPN的表达。C.在一组平行实验中，10个相同来源的PBMC(未处理过的)分别用1∶5稀释过的RA-SF或medium对照培养，相应的孔中，加入5μg/ml的重组IL-10的抗体或对照抗体阻断。分离T细胞(纯度大于97％)，然后用real-time PCR检测OPN的表达。D.CD45RA+和CD45RO+CD45RA-T细胞用磁珠分选出后和总的PBMC一起用做real-time PCR检测OPN表达。OPN表达水平的计算同图1说明。在图中，星号表示组间差异有统计学意义(P＜0.05)。

图8显示了OPN对一些与自身免疫病和炎症相关基因表达的影响。

A.用一张含有与自身免疫病和炎症相关基因的cDNA芯片检测OPN对这些基因表达的影响。图中显示了其中的一个实验结果，图中的每个点显示了相应的促炎症细胞因子或趋化因子的表达情况。详细的基因列表可见网站(www.supperarray.com)。PBMC用1μg/ml的OPN刺激3个小时。基因的表达情况与相同实验条件下未用OPN处理的PBMC比较。在和样品的cDNA杂交后，膜的化学发光用自显影技术检测，然后用Bio-Rad Quantity One软件分析。分析的结果用OPN处理组的与非处理组的亮度的比值来表示(见表2)。

B.RA的PBMC按相同的方法用OPN处理后，用实时PCR检测一些趋化因子和细胞因子的表达情况。基因的相对表达情况同图1说明所述。OPN处理组和非处理组中趋化因子的表达存在极其显著差异(P＜0.01)。

图9显示了OPN激活了转录因子NF-κB。

用EMSA分析了OPN对RA病人PBMC中的NF-κB的激活作用。细胞用1μg/ml的OPN刺激30分钟后，提取核蛋白做EMSA分析。第1、2道为OPN处理过的PBMC。第3、4道为非处理组对照。第5道为TNF-α(40ng/ml)处理40分钟的PBMC。在2和4道中，加入了100倍的非标记的NFκB探针作为竞争剂。这些实验结果代表了用不同的PBMC进行的三次独立实验的结果。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次阐明了OPN在RA炎症过程和其他自身免疫条件中的作用机制。研究表明，类风关滑膜浸润T细胞的OPN表达能被炎症关节中占主要地位的细胞因子所诱导。OPN表达增高提供了一种在类风关滑膜起永久放大炎症的功能机制。在此基础上完成了本发明。

具体而言，在本发明中，首次发现OPN在滑膜浸润T细胞上的过表达与局部炎症环境有非常大的关系，OPN作为一种重要介质在类风湿关节炎患者滑膜组织中起了非常重要的作用。研究表明，OPN mRNA在RA患者滑膜浸润CD4+T细胞上高表达，与关节液(SF)中OPN浓度增高相关联。OPN在滑膜浸润T细胞上的过表达与滑膜T细胞OPN受体(整合素αv，β1和CD44)选择性高表达有关。RA患者的SF中IL-10能刺激T细胞使OPN表达增高，抗IL-10抗体能阻断此作用。在300多个自身免疫和炎症应答基因中，OPN能选择性诱导前炎症细胞因子和趋化因子的表达，这些前炎症细胞因子和趋化因子能促进炎症细胞迁移和募集，并能活化转录因子NFκB。

基于上述研究，在本发明提供了一种骨桥蛋白受体的用途，所述的骨桥蛋白受体用于制备检测或辅助检测类风湿关节炎的试剂，其中所述的骨桥蛋白受体选自整合素αv、β1和CD44。

本发明还提供了一种检测类风湿关节炎的试剂盒，它含有容器和位于容器内的检测骨桥蛋白含量的试剂(如特异性扩增骨桥蛋白的寡核苷酸引物或特异性抗骨桥蛋白的抗体)。

此外，所述的检测试剂盒还含有检测骨桥蛋白受体、IL-10、TNF-α或IFN-γ含量的试剂，其中所述的受体选自整合素αv、β1和CD44，而所述的试剂是特异性扩增这些物质的寡核苷酸引物或特异性的抗体。

在本发明的试剂盒中，还可含有相应的特异性探针和/或PCR缓冲液等。

本发明还提供了用骨桥蛋白抑制剂治疗或辅助治疗类风湿关节炎的方法。较佳地，所述的骨桥蛋白抑制剂是抗IL-10抗体，或抗整合素αv的抗体、抗整合素β1的抗体或抗整合素CD44的抗体。

如本文所用，“骨桥蛋白抑制剂”指抑制骨桥蛋白表达或功能的物质，包括抗骨桥蛋白抗体、骨桥蛋白编码序列的反义序列、抗IL-10抗体、可溶性的骨桥蛋白受体等。

另一方面，本发明还涉及对骨桥蛋白及其相关受体(即整合素αv、β1和CD44)或IL-10具有特异性的抗体，尤其是单克隆抗体。本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体。

以骨桥蛋白为例，“特异性”是指抗体能结合于人骨桥蛋白或片段。较佳地，指那些能与骨桥蛋白或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。

抗人骨桥蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测血清标本中的人骨桥蛋白。

一种检测样品中是否存在骨桥蛋白的方法是利用骨桥蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将血清样品与骨桥蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在骨桥蛋白。根据抗体复合物的数量，可以定量确定骨桥蛋白的数量。

对于抗整合素αv、β1和CD44抗体，抗IL-10的抗体以及抗TNF-α或IFN-γ的抗体，也都是本领域中已知的，可用常规方法制备，可从在市场上购得。

在本发明中，还可以通过常规的核酸定量检测技术(如荧光实时PCR技术)，来检测样品中骨桥蛋白及其相关受体(即整合素αv、β1和CD44)或IL-10的水平。

以骨桥蛋白为例，骨桥蛋白的多核苷酸也可用于类风湿关节炎的早期的诊断和治疗。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用骨桥蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测骨桥蛋白的转录产物。

根据本发明，还提供了治疗类风湿关节炎的药物组合物，它含有安全有效量的骨桥蛋白的抑制剂(包括抗骨桥蛋白抗体、骨桥蛋白编码序列的反义序列、抗IL-10抗体，尤其是抗IL-10抗体)以及药学上可接受的载体或赋形剂。

所述的药学上可接受的载体或赋形剂包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。以抗IL-10的抗体为例，本发明的药物组合物可用常规方法制成针剂、片剂和胶囊。骨桥蛋白的抑制剂的给药量是常规的治疗有效量，例如每天约1微克抑制剂/千克体重-约5毫克抑制剂/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

本发明的主要优点在于：

(a)为类风湿关节炎的诊断或辅助诊断提供准确、高效的检测方法。

(b)提供了针对性地治疗类风湿关节炎的手段。

(c)提供了有效筛选类风湿关节炎治疗药物的新方法。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

方法：

患者和实验材料

本研究共收集95例RA患者。所有患者均符合美国风湿病学会的诊断标准。RA患者性别比为：女68人，男27人；疾病年限为15±12年。患者年龄为54±19岁。完整配对样本有32例，每位患者有外周血、关节液和关节滑膜组织。另外一组63例配对样本有关节液和血清(不含细胞)，ELISA分析OPN和细胞因子的浓度。对照T细胞和血清来自31个健康志愿者，性别和年龄与RA组相似。在样本采集前2月，患者没有用过免疫抑制剂和免疫调节剂。在样本收集前患者均签署知情同意书。研究流程符合研究公约。

滑膜组织来自滑膜切除术或关节镜手术。关节液3000rpm离心3分钟收集上清立刻-80℃保存。Ficoll分离RA患者关节液和外周血得单个核细胞，立即进行细胞培养。组织切成小块，立即匀浆抽提RNA。

RNA抽提和定量PCR

用Qiagen公司Rneasy Mini试剂盒抽提总RNA。在纯化RNA过程中用DNA酶消化基因组DNA。RNA-80℃保存。用Qiagen公司Sensiscript RT试剂盒逆转录RNA样本。在cDNA合成中用随机引物。

用定量PCR SYBR方法检测OPN、OPN受体和趋化因子的mRNA表达，OPN和OPN受体特异性引物序列见表1。

表1.用于实时PCR分析的特异性引物

名称	引物	序列(5’→3’)	SEQ ID NO：	产物长度
名称	引物	序列(5’→3’)	SEQ ID NO：	产物长度	GAPDHOPNαvα4α8α9β1β3β5CD44	FWRVFWRVFWRVFWRVFWRVFWRVFWRVFWRVFWRVFWRV	GAAGGTGAAGGTCGGAGTCGAAGATGGTGATGGGATTTCGCCGACCAAGGAAAACTCACTTGCCTAGGAGGCAAAAGCAACTTCTTGGTGGTCCTGGTAGGCAGTCCGAGTTGCTAATTGCTGGTGGTTGCTATGGAGTGAAGAGAGCCAGTCCAGTAAGATGTTGAAGCTGTCGGCTAGACCCACACCACCATCCTGGTTACTTAAGTGCCGTGTTCACACCGATGTTCTTCCAGCGATGAGCAGGAAGGAATGCCTACTTCTGCAACTGCTGTGGTTGGATCTGACGTGCTGACGCTAACTGACATGAGTCTTGGCATCAGTGGTCACCTCTCGGTGTGATCTGGCTCCGGATATTGTCCAAGTCAATGGTCGCTACAGCATCTCTGCTGCACAGATGGAGTTG	1234567891011121314151617181920	18760131190226193194190298182

热循环条件包括起始50℃ 2分钟，随后95℃ 10分钟，2步PCR循环包括95℃15秒，60℃ 60秒，40个循环。数据收集，ABI 7900对数据作定量分析。GAPDH基因作为内参使不同标本总RNA量得以标准化。标本定量以GAPDH表达倍数表示。每个标本复孔平均值以阈值计算和表达(CT，每个PCR反应达到预定荧光阈值的循环数)。基因表达量用样本CT值和内参GAPDH CT值的差值来表示。相对量表达以ΔΔCT计算。基因相对表达量为2^-ΔΔCT。

ELISA检测关节液OPN和细胞因子蛋白含量

根据操作手册用ELISA Kit定量检测血清和关节液中的OPN和细胞因子浓度。OPN ELISA Kit购自Assay公司，特异性检测全长OPN。细胞因子检测试剂盒购自Bender MedSystems公司和BD Biosciences公司。首先用纯化的抗细胞因子小鼠抗体或抗OPN的小鼠抗体包板，洗涤后用含10％胎牛血清的PBS封闭非特异性结合位点1小时，随后洗涤。关节液或血清和标准品一起用PBS稀释后加入，每份标本均作双复孔。板孵育2小时，随后用PBS-T洗涤。加入生物素结合的检测抗体孵育2小时。洗涤后，加入Avidin结合的辣根过氧化物酶和3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(3，3’，5，5’-tetramethylbenzidine)显色。合适波长检测，用计算机软件定量分析细胞因子浓度。

滑膜组织单细胞悬液制备

手术取下的滑膜组织立即放入含有10％胎牛血清和1％青链霉素的完全RPMI介质中，剪成小块。用Teflon Resin棒撵磨，用含有10％胎牛血清和1％青链霉素的完全RPMI介质反复冲洗，用70μm尼龙网过滤得到单细胞悬液。

流式细胞术分析

用含1％BSA和0.1％叠氮钠的PBS重悬细胞，用FITC和PE结合的单抗或同型对照共同孵育30分钟。抗CD2，CD4和CD8的单抗购自BD公司，抗CD44和整合素的单抗购自Immunotech公司。

CD4+和CD8+T细胞的分离和纯化

将收集的细胞用含2％FCS(胎牛血清)的PBS洗涤一次，并按1×10⁷cell/ml的浓度重悬在含2％FCS的PBS中。然后用Dynal beads阳选出CD2+，CD4+和CD8+T细胞。分离后，用流式分析阴性细胞，检测这些细胞中含CD2+，CD4+和CD8+T细胞的比例。阳选出的细胞一部分用来作纯度分析，其余的用来抽提RNA并做实时PCR检测。在所有实验中，阳选效率都在97％以上。CD2+，CD4+和CD8+T细胞的纯度也在97％以上。这里提到的T细胞都是从IL-10或OPN刺激过的PBMC中分离出来的。

T细胞刺激

RA和正常人的PBMC按每孔1×10⁶个的数量放在24孔板上培养，用含20％的FBS和100μg/ml青霉素和链霉素的RPMI 1640进行培养。在用RA-SF的刺激实验中，在培养液中加入RA-SF(1∶5稀释)。使用时，所有的RA-SF都要用Millex过滤器(Millipore公司)除菌。细胞在37℃，5％ CO₂的培养箱中培养48小时后收集。细胞收集后分离T细胞做实时PCR分析。在阻断实验中，抗人IL-10的单克隆抗体和同型对照抗体以5μg/ml的浓度加到用SF刺激的PBMC的培养液中。然后按照上面所述的过程处理。在研究氨甲蝶呤(methotrexate)和强的松龙(prednisolone)对T细胞中OPN表达的作用时，也采用相同的操作流程。

为检测细胞因子对OPN的作用，正常人的PBMC用分别含有25ng/ml的IL-10，IL-12，IFN-γ或TNF-α的RPMI 1640(含20％的FBS和100μg/ml青霉素和链霉素)，在24孔板上，以每孔1×10⁶个的数量进行培养。为研究OPN对炎症因子表达的作用，正常人的PBMC用含有OPN(终溶度为1μg/ml)RPMI 1640(含20％的FBS和100μg/ml青霉素和链霉素)，在24孔板上，以每孔1×106个的数量进行培养。细胞在37℃，5％ CO₂的培养箱中培养24小时后收集。然后分离T细胞做real-time PCR检测。

CDNA阵列分析

细胞因子和趋化因子的表达情况通过一个商品化的cDNA阵列(GEArray SSeries human autoimmune and inflammatory response gene array，SuperArray，Bethesda，MD)系统来检测。这个cDNA阵列上含有与自身免疫和炎症反应相关的364个基因和20个阳性及阴性对照基因。所有基因的列表见公司的网站(www.supperarray.com)。所有的流程按照操作手册进行，PBMC用OPN(1μg/ml)处理3小时后，用Tri-reagent(Molecular Research Center Inc.，Cincinnati，OH)提取总RNA。用莫洛尼氏白血病毒(Moloney murine leukemiavirus)逆转录酶将3mg的总RNA逆转录成生物素-16-脱氧-UTP-标记的单链cDNA。在预杂交后，将膜与生物素标记的样品cDNA进行杂交并和连有碱性磷酸酶的链亲和素进行孵育。膜上的化学发光通过自显影技术来检测。实验结果用Bio-Rad定量分析软件(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)进行分析。不同基因的相对表达水平通过比较其发光强度与内对照基因的平均信号强度来评估。在OPN处理组和非处理组之间信号强度之比大于2.0视为有明显变化。实验结果显示的是三次分别用不同的PBMC进行的实验结果。

电泳迁移率实验(EMSA)

用EMSA来检测OPN处理后细胞中NFκB向核内的迁移情况。PBMC用OPN(1μg/ml)处理40min，TNF-α用做阳性对照。细胞核提取物用NE-PER Nuclear andCytoplasmic Extraction Reagents(Pierce，Rockford，IL)试剂盒提取。5’-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3’(SEQ ID NO：21)和它的互补链用作探针。实验中用的是非放射性标记的方法，将探针的3’端用生物素标记(Biotin 3’EndDNA Labeling Kit；Pierce，Rockford，IL)。生物素标记的寡核苷酸用LightShift Chemiluminescent EMSA试剂盒(Pierce，Rockford，IL)检测。样品在5％的非变性胶上分离后，转移到带正电的尼龙膜上。尼龙膜经紫外交联后，末端用生物素标记的探针用在发光氨显色液中用链亲和素-HRP检测。

统计分析

各组之间基因表达的差异情况采用曼-惠特尼U检验(The Mann-Whitney UTest)分析。P值小于0.05表示有显著性差异。

结果：

结果如图1-9和表2所示。

(a)类风关滑膜中OPN mRNA和蛋白水平的表达及滑膜组织浸润T细胞上OPN受体表达

外周血单个核细胞(PBMC)，滑膜液单个核细胞(SFMC)和滑膜组织来自临床RA患者，同时以健康人PBMC为对照。如图1A所示，定量PCR检测SFMC中T细胞和同一RA患者滑膜组织T细胞OPN的表达与其自身PBMC和健康对照PBMC中T细胞上OPN的表达，前者OPN的表达明显升高(p＜0.05)。如图1B所示，SFMC中T细胞OPN的表达以CD4+T细胞为主。

如图2所示，检测63例RA患者的关节液，OPN蛋白含量为16.8±4.3μg/ml，比自身配对血清和正常对照血清高出10倍。结果提示OPN表达在RA患者滑膜T细胞mRNA和蛋白水平均明显增高。分布格局提示OPN在类风关滑膜过表达。同时，用ELISA方法检测5种细胞因子浓度，在RA患者关节液和自身配对血清及正常对照血清中检测IL-18、IL-10、IL-12、TNF-α和IFN-γ。RA关节液和血清中IL-18和IL-12浓度比正常对照血清明显增高(p＜0.01)，RA关节液中IL-10、TNF-α和IFN-γ分布格局与OPN很相似，即主要在RA关节液中高表达，提示这些细胞因子主要来自类风关滑膜(图3)。

OPN和许多细胞表面受体结合，包括整合素αvβ3，αvβ5，αvβ1，α4β1，α8β1，α9β1以及CD44。OPN和这些表面受体结合介导OPN在靶细胞发挥作用，包括T细胞。定量PCR分析发现外周血和滑膜T细胞协同表达这些受体(特异性引物序列见表1)。如图4，一些OPN受体(如：αv，β1和CD44)选择性表达在RA滑膜组织的T细胞上，而RA患者SFMC和PBMC及健康对照PBMC表达很低(p＜0.01)。用流式细胞术检测发现RA组织来源的单细胞悬液中T细胞确实表达这些受体。图5显示RA组织来源的单细胞悬液中T细胞表达αv，β1和CD44。

(b)关节滑液和细胞因子能诱导OPN表达

为了阐述T细胞上OPN的表达能否被含有不同细胞因子的关节液所诱导，随机抽取RA患者和健康志愿者外周血分离PBMC用于功能实验。首先体外分离PBMC，然后加入不同稀释倍数的关节液，随后分离T细胞，用定量PCR方法分析OPN mRNA的表达。如图6A所示，用RA患者关节液刺激RA患者PBMC，分离T细胞发现OPN的表达明显增高。但RA患者关节液刺激作用是非特异性的，对正常人PBMC同样有效。实验是用4个不同RA患者关节液混合刺激的。图6B是RA患者关节液刺激OPN表达的剂量依赖曲线。与图1相似，OPN表达增高主要在CD4+T细胞亚群。相反，配对RA血清没有相似的刺激效果(图6B)。RA患者关节液刺激T细胞OPN表达能被氨甲蝶呤和强的松龙抑制。抑制率分别为37±7％(氨甲蝶呤，剂量为0.5μg/ml)和76±13％(强的松龙，剂量为2μg/ml)。

结果还阐明了OPN的过表达是否和类风关滑膜组织的炎症环境和细胞因子的关系。如图3所示，RA患者关节液中4种细胞因子的表达格局和RA患者T细胞OPN刺激表达格局相似。但只有IL-10能刺激OPN的表达(图7A)。IL-10刺激OPN的表达也主要在CD4+T细胞而不是CD8+T细胞。IL-10刺激CD4+T细胞，ELISA检测培养上清中OPN浓度为27.6±1.1ng/ml，而阴性对照上清OPN浓度＜0.05ng/ml。IL-10刺激OPN表达的剂量和动力曲线如图7B所示。SF刺激OPN表达能部分被抗IL-10抗体所阻断(图7C)，说明关节液中的IL-10的确或至少部分能诱导OPN的表达。另外，IL-10亦能刺激CD45RA+T细胞和CD45RO+T细胞亚群OPN的表达。

(c)前炎症趋化因子和细胞因子的诱导及OPN活化转录因子NFκB

结果还表明，滑膜单核细胞OPN过表达能诱导滑膜组织中前炎症趋化因子和细胞因子的表达。实验中，首先用重组OPN(1μg/ml)刺激PBMC，用cDNA阵列的方法检测与自身免疫和炎症应答有关的364个基因的表达。结果提示OPN刺激PBMC能诱导前炎症趋化因子的表达，至少前炎症细胞因子(IL-1和IL-8)表达和NFκB转录途径相关的基因编码分子以及TNF受体家族表达增高(图8A和表2)。一些趋化因子和细胞因子在cDNA阵列中的表达格局用定量PCR鉴定(图8B)。实验结果被不同PBMC所重复。转录因子NFκB在活化前炎症趋化因子和细胞因子的相关基因中的潜在作用正在研究，NFκB途径可能和许多前炎症趋化因子和细胞因子的诱导有关。图9所示，Gel Shift实验证实OPN对活化NFκB有潜在作用。随后，在用商业化的NFκBp60和p65 ELISA检测试剂盒进行了的实验中也得到了证实。

表2.在体外用OPN处理后PBMC的基因表达情况

基因分组	改变的基因	比率	位置
基因分组	改变的基因	比率	位置	表达上升
化学因子(Chemokines)细胞因子NFκB信号传导分子(NFκB signaling molecules)	CCL2(MCP-1/SCYA2)CCL3(MIP-1α/SCYA3)CCL4(MIP-1β)CCL15(MIP-1δ/MIP-5)CCL18(PARC)CXCL1(GROa/MGSA)CXCL2(MIP-2α/GROb)CXCL3(GRO3)CXCL5(ENA-78/SCYA5)CXCL6(GCP-2/SCYB6)IL-1αIL-1βIL-8NFKB1NFKB2NFKBIA	12.94.54.02.03.15.22.72.64.22.03.44.32.02.02.02.0	36434431348691929394164165184253254255	表达上升
化学因子(Chemokines)细胞因子NFκB信号传导分子(NFκB signaling molecules)		12.94.54.02.03.15.22.72.64.22.03.44.32.02.02.02.0	36434431348691929394164165184253254255	表达下降
化学因子/受体细胞因子TNF受体家族及其他	CCR2(MCP-1)XCL1(SCYC1)XCL2(SCYC2)XCR1(CCXCR1)IL-11TGFβ1TNFRSF8(CD30)TRAF5TRAF6XPO5ZFPM2NFAT5(TONEBP)	5.02.55.02.52.53.33.35.03.33.33.33.3	49358359360145310337348349361363248	表达下降

讨论

到目前为止，RA的病原和发病机制仍然不完全清楚。除了T细胞、B细胞和补体等因素的参与之外，在RA关节滑膜液中还存在许多促炎症因子，它们相互作用形成一个复杂的调控网络，在RA的形成和发展中起重要作用。针对TNF-α的治疗在临床所取得的疗效已经充分证实了炎症因子的重要性(17)。在RA关节滑膜液中找出一个维持这种调控网络的关键性的炎症因子对于认识RA的发病过程和开发新的治疗手段是有重要意义的。本研究首次对OPN在RA病人的表达情况作了系统研究，并对OPN与其它细胞因子间的作用作了深入研究。这些发现既有助于认识OPN在RA中的作用，也有助于认识它在其它炎症反应中的作用。

本发明中，首先设计实验来估计OPN过表达在大量RA患者滑膜组织中的分布格局，以及和细胞因子及T细胞上OPN受体表达的关系。然后阐明在类风关滑膜中诱导OPN过表达的细胞因子和OPN在诱导T细胞前炎症因子和趋化因子中的作用。

研究结果表明OPN在RA病人滑膜中的T细胞的表达显著升高，并CD4+T细胞的表达较CD8+T细胞高。在RA滑膜液中检测到OPN蛋白的浓度大于15μg/ml，比相应的RA病人血清中的OPN蛋白水平高出十倍以上。更有意义的是，OPN在滑膜中的高表达主要集中在T细胞上。IL-10，TNF-α和IFN-γ在滑膜和血清中的表达分布情况与OPN相似，而IL-18和IL-12在相应组织中的表达情况则没有明显的变化。另外，第一次发现在滑膜液T细胞中一些OPN受体(如α_v，β₁和CD44)与OPN的共表达情况有差异。已经知道，OPN通过一系列的细胞表面受体起作用，包括整合素α_vβ₃，α_vβ₅，α_vβ₁，α₄β₁，α₈β₁，α₉β₁和CD44(14)。OPN和这些整合素的作用促进细胞的黏附、迁移和细胞的一些信号转导。以前仅有少数关于整合素在滑膜组织中的表达情况的报道(18-20)，本发明第一次在滑膜的T细胞上发现了一些OPN受体和OPN之间的共表达。这种共表达关系提示，OPN在滑膜液中的作用机制可能主要是通过这些受体起作用的。

本发明表明，OPN在RA中的高表达是(至少部分是)由IL-10引起的。在实验中发现，IL-10能够刺激OPN的表达，而且这种刺激作用能够被抗IL-10的抗体阻断。长期以来，IL-10被认为是一个抗炎性细胞因子，而OPN具有促炎症的作用，因此，IL-10刺激OPN的表达看来有些出乎意外。但是，这种诱导作用和前面所述和其他研究组发现的IL-10在RA滑膜液中的高表达是一致的(21，22)。同时，IL-10在RA滑液中的高表达和OPN的表达情况也是一致的。从这点上看，它具有对OPN的刺激作用也就不意外了。IL-10是一个具有多面性的细胞因子，它在免疫反应，特别是在人体免疫反应中的作用很复杂。它一般被认为是抗炎症细胞因子并且在动物模型中发现它对诱导型的关节炎有保护作用。在迄今为止的RA临床实验中，IL-10的疗效并不理想(23)。并且，有研究表明IL-10与RA病人自身抗体的产生和B细胞的激活相关，而后者与RA疾病的进程有关(24)。本研究提示，IL-10可能不直接促进T细胞表达促炎症的趋化因子，但它可能通过上调OPN的表达而间接作用于炎症反应。在实验中发现，SF对OPN的刺激作用只能被IL-10部分抑制，所以不能排除有其他细胞因子对OPN的激活有促进作用。

更进一步，研究发现OPN可促进PBMC中促炎症细胞因子的表达。用与自身免疫病和炎症相关的364个基因的cDNA阵列分析发现，OPN可以选择性地促进一些趋化因子和细胞因子(如IL-1，IL-8，CXCL1等)的表达。有趣的是，OPN也能调控NFκB转录通路和TNF家族中的一些分子的表达。进一步研究确认OPN能够激活NFκB这个在许多炎症因子的分泌中起重要调控作用的转录因子(25-27)。因为OPN的这些作用和机制，本发明人认为OPN在滑膜炎症反应的维持和放大中起重要作用。就是说，炎症性T细胞和巨噬细胞分泌的细胞因子环境使得IL-10在类风湿性关节滑膜液中富集，IL-10分泌的增多促进了OPN的高表达，而OPN的高表达又进一步促进促炎性趋化因子和细胞因子的表达。从而通过促进炎症细胞迁移和聚集到炎症性滑膜液中。这种通过OPN来联系的调节机制在类风湿性关节炎中可能起重要作用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

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Claims

1.一种骨桥蛋白受体的用途，其特征在于，所述的骨桥蛋白受体用于制备检测或辅助检测类风湿关节炎的试剂，其中所述的骨桥蛋白受体选自整合素αv、β1和CD44。

2.一种检测类风湿关节炎的试剂盒，其特征在于，它含有容器和位于容器内的检测骨桥蛋白含量的试剂。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的检测骨桥蛋白含量的试剂是特异性扩增骨桥蛋白的寡核苷酸引物或特异性抗骨桥蛋白的抗体。

4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还含有检测骨桥蛋白受体含量的试剂，其中所述的受体选自整合素αv、β1和CD44，而所述的检测骨桥蛋白受体含量的试剂是特异性扩增骨桥蛋白受体的寡核苷酸引物或特异性抗骨桥蛋白受体的抗体。

5.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还含有检测IL-10含量的试剂。

6.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还含有检测TNF-α或IFN-γ的试剂。

7.一种骨桥蛋白抑制剂的用途，其特征在于，用于制备治疗或辅助治疗类风湿关节炎的药物。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的骨桥蛋白抑制剂是抗IL-10抗体、或抗整合素αv的抗体、抗整合素β1的抗体或抗整合素CD44的抗体。

9.一种筛选治疗类风湿关节炎的药物的方法，其特征在于，包括步骤：

(b)将候选物质施用于实验组，并观察实验组动物中骨桥蛋白的水平，并与对照组的动物中的骨桥蛋白水平进行比较，其中与对照组相比实验组动物中骨桥蛋白水平下降至少30％，就表示该候选物质是潜在的治疗类风湿关节炎的药物。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中还包括进一步比较实验组动物和对照组蛋白中骨桥蛋白受体或IL-10的表达水平，所述的骨桥蛋白受体选自整合素αv、β1和CD44，其中与对照组相比实验组动物中骨桥蛋白受体或IL-10水平下降至少30％，就表示该候选物质是潜在的治疗类风湿关节炎的药物。