CN1821245A - 喜树碱衍生物及其制备 - Google Patents
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Abstract
本发明提供(1)式所代表的喜树碱衍生物及其制备，其中R1代表9，10，11－位上的0－3个相同或不同的取代基，这些取代基包括卤原子、羟基、烷氧基；R2代表C2－C5的直链或支链亚烷基；R3代表氢原子或R4CO－，其中R4代表低级烷基、低级烷氨基烷基或低级烷氧基烷基；Y代表杂环碱基或氢化杂环碱基，本发明还包括制备式(1)各化合物的方法和将它们用于治疗癌症的用途。
Description
技术领域：
本发明涉及一种新的抗肿瘤药物化合物，特别是一种喜树碱的新衍生物，它们的制备及应用。
背景技术：
喜树碱的E内酯环开环的化合物中已发现一些活性与喜树碱相当或更好、毒性比喜树碱小的新衍生物。其中有的可溶于水，因而适于制成注射剂等使用更方便的剂型。例如，日本第一制药公司曾用NH2CH2CH2N(CH3)2对E环进行开环反应，然后再将17-羟基酰基化得到的一系列E环开环的新化合物(参见J.P.A，H1131179；CN1126212A)。意大利的Indena S.P.A.公司通过碱性水解使喜树碱的E环开环生成碱金属羧酸盐，再将17-羟基酰基化，也获得一系列水溶性喜树碱新衍生物(参见US006,121,277A)。但这些喜树碱新衍生物的抗肿瘤活性及低毒型仍然不够理想。
本发明提供了链端含杂环碱基或氢化杂环碱基的新的E环开环化合物，或进一步将这些开环化合物的17-位上的羟基用不同的酰化试剂进行酰化的化合物。这些化合物由于端基上含杂环碱基(咪唑、吡啶、嘧啶、吡嗪等)或氢化杂环碱基(哌啶、哌嗪、吗啉等)且容易与HCl、CF3COOH、RSO3H等形成可溶性盐，制备简单，而且水溶性好、抗癌活性高、毒性小。
发明内容：
本发明提供一种喜树碱的新衍生物，其化学结构如下：
其中
R1代表9、10或11-位上的0-3个相同或不同的取代基，这些取代基选自卤原子、羟基、烷氧基；如：F、Cl、Br、OH、OMe、OEt、-OCH2O-、-OCH2CH2O-等。
R2代表C2-C5的直链或支链亚烷基；如：-CH2CH2-、-CH2CH2CH2-、-CH2(CH2)2CH2-、-CH2CH(CH3)CH2-等。R3代表氢原子或R4CO-，
R4代表低级烷基、低级烷氨基亚烷基或低级烷氧基亚烷基；如：-CH3-CH2CH3、-(CH2)nCH3、-(CH2)nOCH3、-(CH2)nNHCH3、-(CH2)nN(CH3)2等(n＝1-3)
Y代表咪唑、吡啶、嘧啶、吡嗪等杂环碱基或氢化杂环碱基，如哌啶、哌嗪、吗啉。
优选的化合物是：
R1代表H、OH
R2代表-CH2CH2CH2-
R3代表H、R4CO
R4代表-CH3、-CH2CH3、-(CH2)nNR2
Y代表1-咪唑基、1-吗啉基
最优选的化合物是：
R1代表H
R2代表-CH2CH2CH2-
R3代表H、R4CO
R4代表-CH3、-CH2CH3
Y代表1-咪唑基、1-吗啉基
最优选的化合物的化学名称是：
21-N[3-(1-吗啉基)丙基]酰胺-17-羟基E内酯环开环喜树碱(R1＝H，R2＝-CH2CH2CH2-，R3＝H，Y＝1-吗啉基)；21-N[3-(1-吗啉基)丙基]酰胺-17-乙酰氧基E内酯环开环喜树碱(R1＝H，R2＝-CH2CH2CH2-，R3＝R4CO，R4＝-CH3，Y＝1-吗啉基)；21-N[3-(1-吗啉基)丙基]酰胺-17-丙酰氧基E内酯环开环喜树碱(R1＝H，R2＝-CH2CH2CH2-，R3＝R4CO，R4＝-CH2CH3，Y＝1-吗啉基)；21-N[3-(1-咪唑基)丙基]酰胺-17-羟基E内酯环开环喜树碱(R1＝H，R2＝-CH2CH2CH2-，R3＝H，Y＝1-咪唑基)；21-N[3-(1-咪唑基)丙基]酰胺-17-乙酰氧基E内酯环开环喜树碱(R1＝H，R2＝-CH2CH2CH2-，R3＝R4CO，R4＝-CH3，Y＝1-咪唑基)；21-N[3-(1-咪唑基)丙基]酰胺-17-丙酰氧基E内酯环开环喜树碱(R1＝H，R2＝-CH2CH2CH2-，R3＝R4CO，R4＝-CH2CH3，Y＝1-咪唑基)。
本发明的化合物是用一系列含双碱性基团的试剂NH2-(CH2)n-Y(Y代表杂环碱基或氢化杂环碱基)对喜树碱的E环进行开环反应得到的。
制备方法列在以下反应式中：其中，式(1)代表的化合物是由式(2)定义的喜树碱(CPT)、10-羟基CPT、10或11-甲氧基CPT等天然物质或由半合成的9，10，11-位上含有(1)式中定义的取代基的CPT衍生物经式(3)定义的氨解试剂氨解开环，或进一步将17-羟基酯化制备得到，反应式如下：
式中的R1，R2，R3，R4，Y定义同式(1)化合物。
反应式下方的R2和Y代表的化合物是本发明最优选的化合物。
氨解开环反应虽然也可采用不加溶剂直接用过量的氨解试剂与式(2)定义的CPT衍生物原料反应。但因本发明中使用的氨解试剂沸点较高、不宜用减压蒸馏的方法除去过量的氨解试剂，会给接下来的产品分离纯化带来困难，因此采用稍许过量的氨解试剂与式(2)定义的原料在适当的溶剂中反应。反应后将反应混合物倒入乙醚或石油醚或二者的混合溶剂中，使产物沉淀，滤出的沉淀，进一步用柱层析纯化得产物。
开环产物17-位羟基的酯化，可用相应的酰化剂，如酸酐、酰氯或其它相当的酰化剂在吡啶、DCC或DMAP催化下进行。
例如可将开环产物与酸酐在吡啶存在下加热搅拌过夜，所得反应混合物倒入石油醚中，滤出的黄色固体，经硅胶柱层析分离，得到很纯的酰化产物。
本发明获得的各种CPT新衍生物与等摩尔药用许可的各种酸，如盐酸、甲磺酸或三氟乙酸反应，可得各种可溶性盐。
本发明还包括用本发明的喜树碱衍生物制备的药物制剂，本发明的药物制剂包括药物有效量的本发明的喜树碱衍生物或其生理可接受的盐，必要时还可加入药物可接受的载体，所述制剂采用制剂学常规技术制备，优选的制剂形式为单位剂量的注射用的制剂形式。
以下通过实验数据，说明本发明的有益效果：
一、XY-8对体外培养人肿瘤细胞的抗肿瘤作用
1.XY-8体外抗肿瘤活性筛选
1.1受试物
XY-8(为本发明实施例一制备的化合物)合肥中科大生物技术有限公司提供。阳性药羟基喜树碱注射液(HCPT)，2ml∶2mg，黄石飞云制药有限公司，批号：041001。
1.2受试细胞株
选用人肺癌细胞A549，人低分化胃腺癌细胞BGC-823，人肝癌细胞SMMC-7721，人早幼粒细胞白血病细胞HL-60四个细胞株。
1.3试验方法
取处于指数生长期状态良好的细胞一瓶，加入0.25％胰蛋白酶消化液，消化使贴壁细胞脱落，计数2～4×104个/ml，制成细胞悬液。取细胞悬液接种于96孔板上，180μl/孔，置恒温CO2培养箱中培养24小时。换液，加入受试药物，20μl/孔，培养48小时。将MTT加入96孔板中，20μl/孔，培养箱中反应4小时。吸去上清液，加入DMSO，150μl/孔，平板摇床上振摇5分钟。受试物考察三个浓度(1×10-7，1×10-6，1×10-5mol/L)，用酶联免疫检测仪在波长为570nm处测定每孔的吸光值，分别计算各浓度下的细胞抑制率。
细胞抑制率％＝(阴性对照组OD值-药敏组OD值)/阴性对照组OD值×100％
1.4抗肿瘤活性筛选判断标准
体外抗肿瘤作用筛选中，不同类型受试物的阳性作用判断标准见下表：
| 已知分子量化合物mol/L | 未知化合物μg/ml | 粗提物μg/ml | 细胞抑制率％ | 活性 |
| 1×10-71×10-61×10-5 | 110100 | 220200 | ≥50≥50≥50 | +++强效 |
| 1×10-71×10-61×10-5 | 110100 | 220200 | ＜50≥50≥50 | ++中效 |
| 1×10-71×10-61×10-5 | 110100 | 220200 | ＜50＜50≥50 | +弱效 |
1.5筛选结果
XY-8对体外培养人肿瘤细胞的抗肿瘤作用筛选结果见表1。其中XY-8对人低分化胃腺癌细胞BGC-823有弱效；对人早幼粒细胞白血病细胞HL-60和人肺癌细胞A549有强效。
表1.XY-8对体外培养人肿瘤细胞的抗肿瘤作用筛选结果
| 细胞株 | 受试物 | 终浓度mol/L | 细胞抑制率％ | 活性 |
| A549 | XY-8 | 1×10-71×10-61×10-5 | 53.88a87.3599.59 | +++ |
| 丝裂霉素 | 1×10-71×10-61×10-5 | 18.4241.9389.46 | + | |
| BGC-823 | XY-8 | 1×10-71×10-61×10-5 | 31.2844.7050.66 | + |
| 顺铂 | 1×10-71×10-61×10-5 | 11.0010.9092.94 | + | |
| HL-60 | XY-8 | 1×10-71×10-61×10-5 | 70.4191.8297.32 | +++ |
| 顺铂 | 1×10-71×10-61×10-5 | 24.8246.3796.79 | + | |
| SMMC-7721 | XY-8 | 1×10-71×10-61×10-5 | 27.6317.4033.45 | - |
| 丝裂霉素 | 1×10-71×10-61×10-5 | 5.0349.1461.68 | + |
a：抗肿瘤药物初筛样本数n＝3
2.XY-8对体外培养人肺癌细胞A549抑制作用的IC50值
2.1受试物
XY-8合肥中科大生物技术有限公司提供。阳性药羟基喜树碱注射液(HCPT)，2ml∶2mg，黄石飞云制药有限公司，批号：041001。
2.2受试细胞株
选用人肺癌细胞A549。
2.3试验方法
取处于指数生长期状态良好的细胞一瓶，加入0.25％胰蛋白酶消化液，消化使贴壁细胞脱落，计数2～4×104个/ml，制成细胞悬液。取细胞悬液接种于96孔板上，180μl/孔，置恒温CO2培养箱中培养24小时。换液，加入受试药物，20μl/孔，培养48小时。将MTT加入96孔板中，20μl/孔，培养箱中反应4小时。吸去上清液，加入DMSO，150μl/孔，平板摇床上振摇5分钟。受试物考察6个浓度(1×10-8～1×10-5mol/L)，用酶联免疫检测仪在波长为570nm处测定每孔的吸光值，分别计算各浓度下细胞抑制率，用IC50计算软件计算受试化合物IC50。
细胞抑制率％＝(阴性对照组OD值-药敏组OD值)/阴性对照组OD值×100％
2.4结果
| 受试物 | 终浓度mol/L | IC50μmol/L | 受试物 | 终浓度mol/L | IC50μmol/L |
| HCPT | 1×10-73×10-71×10-63×10-6 | 13.8±8.6 | XY-8 | 1×10-83×10-81×10-73×10-71×10-6 | 8.1±3.2 |
| 1×10-53×10-5 | 1×10-5 |
注：每个样品IC50复测次数n≥3。
二、XY-8对小鼠移植性肿瘤的实验治疗作用
1.材料与方法
1.1动物
ICR小鼠50只，雌性，18-22g，由中国药科大学动物室提供，合格证号：苏动质SCXK(苏)2002--0011。
1.2瘤种
小鼠S180肉瘤和H22肝癌由中科院上海药物研究所提供。
1.3受试物
XY-8合肥中科大生物技术有限公司提供。阳性药羟基喜树碱注射液(HCPT)，2ml∶2mg，黄石飞云制药有限公司，批号：041001。
2.试验方法
2.1XY-8对小鼠S180肉瘤的实验治疗作用
选用生长良好的7～11天的S180瘤种，接种于小鼠右侧腋部皮下，约4.5～5×106细胞/只，接种24小时后随机分笼，静脉给药，给药容积为0.4ml/只。受试物XY-8设10、5、2.5mg/kg三个剂量组，阳性药HCPT设8mg/kg，各组于接种后第2、5天给药。给药期间每天测定体重，第8天处死动物，称瘤重，计算各组平均瘤重，按下公式求出肿瘤抑制率并进行t检验。
2.2XY-8对小鼠H22肝癌的实验治疗作用
试验方法同S180肉瘤试验，受试物XY-8设10、5、2.5mg/kg三个剂量组，阳性药HCPT设8mg/kg。
3.结果
3.1XY-8对小鼠S180肉瘤的实验治疗作用
结果见表4。与生理盐水对照组相比，XY-8 10、5、2.5mg/kg三个剂量组均能显著抑制肿瘤生长(P＜0.01)，其中XY-8 10mg/kg的作用明显强于HCPT8mg/kg(P＜0.01)。
表4.XY-8对小鼠S180肉瘤的肿瘤生长抑制作用(
x±sd)
| 组别 | 剂量mg/kg | 动物数 | 体重(g) | 瘤重(g) | 肿瘤生长抑制率(％) | ||
| d1 | d7 | d1 | d7 | ||||
| 生理盐水HCPTXY-8XY-8XY-8 | 81052.5 | 1010101010 | 1010101010 | 24.4±1.024.3±1.724.5±1.125.2±1.023.8±1.1 | 29.1±0.728.4±1.928.0±1.328.4±0.928.5±0.7 | 1.09±0.520.31±0.21**0.10±0.08**，##0.18±0.12**0.32±0.10** | 71.390.783.470.4 |
d1、d7：接种后第1、7天；
**P＜0.01，与生理盐水组比较；##P＜0.01，与HCPT组比较。
3.2 XY-8对小鼠H22肝癌的实验治疗作用
结果见表5。与生理盐水对照组相比，XY-8 10、5、2.5mg/kg三个剂量组均能显著抑制肿瘤生长(P＜0.01)，其中XY-8 10、5mg/kg的作用明显强于HCPT8mg/kg(P＜0.01，P＜0.05)。
表5.XY-8对小鼠H22肝癌的肿瘤生长抑制作用(
x±sd)
| 组别 | 剂量mg/kg | 动物数 | 体重(g) | 瘤重(g) | 肿瘤生长抑制率(％) | ||
| d1 | d7 | d1 | d7 | ||||
| 生理盐水HCPTXY-8XY-8XY-8 | 81052.5 | 1010101010 | 1010101010 | 20.2±0.820.1±0.719.7±0.820.1±0.819.6±0.9 | 27.0±2.825.2±1.521.0±1.923.2±1.324.4±1.5 | 1.12±0.45**0.77±0.63**0.18±0.11**，##0.24±0.17**，#0.42±0.23** | 30.783.878.662.3 |
d1、d7：接种第1、7天；
**P＜0.01，与生理盐水组比较；#P＜0.05，##P＜0.01，与HCPT组比较。
三、XY-8对人癌裸小鼠移植瘤的实验治疗作用
1.目的
考察新化合物XY-8对人癌裸小鼠移植瘤有无生长抑制作用及作用强度
2.材料与方法
2.1受试物
新化合物XY-8由合肥中科大生物技术有限公司提供，为淡黄色粉末，易溶于水，给药前用生理盐水配制所需浓度；阳性药羟基喜树碱注射液(HCPT)，2ml∶2mg，黄石飞云制药有限公司，批号：041001，每次给药前用生理盐水稀释至所需浓度。
2.2移植瘤
选用人肺腺癌A-549裸小鼠移植瘤、人胃腺癌BGC-823裸小鼠移植瘤、人胃腺癌SGC-7901裸小鼠移植瘤，分别由人肺腺癌A-549、人胃腺癌BGC-823和人胃腺癌SGC-7901细胞株接种于裸小鼠皮下而建立。细胞接种量为2×106，接种形成移植瘤后再在裸小鼠体内传3代后使用。
2.3动物
雌性BALB/cA裸小鼠，日龄35-40天，体重18-22g，由中国科学院上海实验动物中心提供。合格证编号：沪动合证字122号。每组动物数为阴性对照组10只，给药组5只。
2.4试验方法
取生长旺盛期的瘤组织剪切成1.5mm3左右，在无菌条件下，接种于裸小鼠右侧腋窝皮下。裸小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100～300mm3后将动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量次数为每周3次，每次测量同时还需称鼠重。给药组每周静脉给药3次，阳性对照组每周静脉给药2次，阴性对照组同时给等量生理盐水。
2.5检测指标及计算方法
(1)肿瘤体积(tumor volume，TV)，计算公式为：
TV＝1/2×a×b2
其中a、b分别表示长宽。
(2)相对肿瘤体积(relative tumor volume，RTV)，计算公式为：
RTV＝TVt/TV0。
其中TV0为分笼给药时(即d0)肿瘤体积，TVt为每一次测量时的肿瘤体积。
(3)相对肿瘤增殖率T/C(％)，计算公式为：
TRTV：治疗组RTV；CRTV：阴性对照组RTV。
试验结果以相对肿瘤增殖率T/C(％)作为抗肿瘤活性的评价指标。
3.结果
3.1XY-8对人肺腺癌A-549裸小鼠移植瘤的实验治疗作用
XY-8对人肺腺癌A-549的实验性治疗结果见表6和图1。XY-8对人肺腺癌A-549裸小鼠移植瘤有一定的生长抑制作用。XY-8 2.5、5和10mg/kg剂量组对A-549的T/C(％)分别为为60.7、103.6和53.6，HCPT 8mg/kg剂量组T/C(％)为71.4。实验组无明显毒副反应。
表6.XY-8对人肺腺癌A-549裸小鼠移植瘤的实验治疗作用
| 组别 | 剂量mg/kg | 动物数 | 体重(g) | TV | RTV | T/C(％) | |||
| 开始 | 最后 | 开始 | 最后 | d0 | d17 | ||||
| NSHCPTXY-8XY-8XY-8 | 81052.5 | 105555 | 105555 | 21.4±1.421.3±1.720.7±0.621.5±0.921.3±0.5 | 22.5±1.322.4±1.823.4±2.522.1±1.122.7±1.0 | 128±71131±54132±134126±72120±23 | 390±342258±137211±237407±365200±73 | 2.8±1.02.0±0.51.5±0.4*2.9±1.31.7±0.5* | 71.453.6103.660.7 |
d0：分笼给药时间
3.2XY-8对人胃腺癌BGC-823裸小鼠移植瘤的实验治疗作用
XY-8对人胃腺癌BGC-823的实验性治疗结果见表7和图2。XY-8对人胃腺癌BGC-823裸小鼠移植瘤有一定的生长抑制作用。XY-8 2.5、5和10mg/kg剂量组对A-549的T/C(％)分别为39.8、36.6和27.3，HCPT 8mg/kg剂量组T/C(％)为37.3。实验组无明显毒副反应。
表7.XY-8对人胃腺癌BGC-823裸小鼠移植瘤的实验治疗作用
| 组别 | 剂量mg/kg | 动物数 | 体重(g) | TV | RTV | T/C(％) | |||
| 开始 | 最后 | 开始 | 最后 | d0 | d17 | ||||
| NSHCPTXY-8XY-8 | 8105 | 10555 | 10555 | 20.4±1.320.5±3.620.0±0.820.6±0.8 | 22.9±1.321.8±3.221.0±1.121.6±1.1 | 190±83185±90184±20187±67 | 2793±11171119±327774±1321054±415 | 16.1±5.9**6.0±1.1**4.4±1.0**5.9±2.2** | 37.327.336.6 |
| XY-8 | 2.5 | 5 | 5 | 21.0±1.0 | 22.6±1.3 | 181±61 | 1108±368 | 6.4±2.3** | 39.8 |
d0：分笼给药时间
3.3XY-8对人胃腺癌SGC-7901裸小鼠移植瘤的实验治疗作用
XY-8对人胃腺癌SGC-7901的实验性治疗结果见表8和图3。XY-8对人胃腺癌SGC-7901裸小鼠移植廇有一定的生长抑制作用。XY-8 2.5、5和10mg/kg剂量组对A-549的T/C(％)分别为82.2、62.5和43.3，HCPT 8mg/kg剂量组T/C(％)为54.8。实验组无明显毒副反应。
表8.XY-8对人胃腺癌SGC-7901裸小鼠移植瘤的实验治疗作用
| 组别 | 剂量mg/kg | 动物数 | 体重(g) | TV | RTV | T/C(％) | |||
| 开始 | 最后 | 开始 | 最后 | d0 | d17 | ||||
| NSHCPTXY-8XY-8XY-8 | 81052.5 | 105555 | 105555 | 19.7±1.119.5±0.719.7±1.219.7±0.720.0±0.6 | 23.5±1.622.2±1.320.5±1.720.2±2.823.4±1.1 | 263±98283±140272±56273±146251±42 | 5671±17013009±14192382±5893241±12034510±727 | 20.8±5.711.4±2.9**9.0±2.3**13.0±3.8**17.1±1.6 | 54.843.362.582.2 |
d0：分笼给药时间
其他新喜树碱衍生物的抗肿瘤活性实验
1实验结果
| 样品编号 | 终浓度(mol/L) | 人低分化胃腺癌细胞BGC-823 | 人早幼粒白血病细胞HL-60 | 人肺癌细胞A549 | 人肝癌细胞SMMC-7721 |
| 抑制率(％) | 抑制率(％) | 抑制率(％) | 抑制率(％) | ||
| Aa | 1×10-71×10-61×10-5 | 31.2844.7050.66 | 70.4191.8297.32 | 53.8887.3599.59 | 27.6317.4033.45 |
| Bam | 1×10-71×10-61×10-5 | 19.7825.5324.72 | 1.4149.8889.68 | 12.2431.6387.35 | 19.0319.7417.26 |
| Ban | 1×10-71×10-6 | 12.5129.16 | 28.9180.54 | 41.8485.71 | 23.0722.94 |
| 1×10-5 | 53.48 | 95.86 | 95.71 | 55.33 | |
| Ab | 1×10-71×10-61×10-5 | 33.2035.7263.57 | 55.7285.5094.01 | 17.1485.5196.94 | 29.6233.8853.91 |
| Bbm | 1×10-71×10-61×10-5 | 26.9419.2726.84 | 5.35.26.2874.21 | 5.7112.2463.27 | 13.1414.7017.26 |
| Bbn | 1×10-71×10-61×10-5 | 19.7811.8117.76 | 0.0058.3591.48 | 6.3728.3790.20 | 14.9121.384.05 |
其中Aa代表21-N[3-(1-吗啉基)丙基]酰胺-17-羟基E内酯环开环喜树碱(R1＝H，R2＝-CH2CH2CH2-，R3＝H，Y＝1-吗啉基)，Bam代表21-N[3-(1-吗啉基)丙基]酰胺-17-乙酰氧基E内酯环开环喜树碱(R1＝H，R2＝-CH2CH2CH2-，R3＝R4CO，R4＝-CH3，Y＝1-吗啉基)，Ban代表21-N[3-(1-吗啉基)丙基]酰胺-17-丙酰氧基E内酯环开环喜树碱(R1＝H，R2＝-CH2CH2CH2-，R3＝R4CO，R4＝-CH2CH3，Y＝1-吗啉基)，Ab代表21-N[3-(1-咪唑基)丙基]酰胺-17-羟基E内酯环开环喜树碱(R1＝H，R2＝-CH2CH2CH2-，R3＝H，Y＝1-咪唑基)，Bbm代表21-N[3-(1-咪唑基)丙基]酰胺-17-乙酰氧基E内酯环开环喜树碱(R1＝H，R2＝-CH2CH2CH2-，R3＝R4CO，R4＝-CH3，Y＝1-咪唑基)，Bbn代表21-N[3-(1-咪唑基)丙基]酰胺-17-丙酰氧基E内酯环开环喜树碱(R1＝H，R2＝-CH2CH2CH2-，R3＝R4CO，R4＝-CH2CH3，Y＝1-咪唑基)。
2实验方法：MTT法
1.取处于指数生长期状态良好的细胞一瓶，加入0.25％胰蛋白酶消化液，消化使贴壁细胞脱落，计数2～4×10-4个/mL，制成细胞悬液。
2.取细胞悬液接种于96孔板上，180μl/孔，置恒温CO2培养箱中培养24小时。
3.换液，加入受试药物，20μl/孔，培养48小时。
4.将MTT加入96孔板中，20μl/孔，培养箱中反应4小时。
5.吸去上清夜，加入DMSO，150μl/孔，平板摇床上振摇5分钟。
6.用酶联免疫检测仪在波长为570nm处测定每孔的吸光值，并计算细胞抑制。
XY-8静脉给药对小鼠的急性毒性试验
XY-8的急性毒性试验结果表明：小鼠静脉注射(iv)给药的LD50值为269.7mg/kg。小鼠的中毒症状表现为摄食减少，自发活动明显下降，腹卧，眼睑下垂，对外界刺激反应迟钝，动物安静而亡。最高剂量组给药3h后即出现动物死亡，各剂量组动物死亡均发生在48h内，约48小时后，小鼠活动开始增加并恢复正常。死亡小鼠肉眼尸检，脏器未见明显病变。
试验结果按Bliss法计算，测得小鼠iv XY-8的LD50值为269.7mg/kg，其95％的置信限为257.7～280.2mg/kg。
附图说明：
图1.XY-8对人肺癌A-549裸小鼠移植瘤生长抑制作用
图2.XY-8对人胃腺癌BGC-823裸小鼠移植瘤生长抑制作用
图3.XY-8对人胃腺癌SGC-7901裸小鼠移植瘤生长抑制作用
具体实施方式：
以下通过实施例进一步说明本发明：
实施例一：N-(3-氨基丙基)吗啉对CPT的氨解开环产物(1)Aa的制备105mg(0.3mmol)CPT溶于15ml甲醇，加入1.2当量的氨解试剂N-(3-氨基丙基)吗啉(3)a，于75℃下反应14小时后，体系变澄清，将反应混合物倒入乙醚中，析出黄色沉淀，滤出沉淀，用冷乙醚洗涤。由TLC可看出，产物中含有未反应的CPT。将产物溶于少量CHCl3，用氧化铝柱层析分离(洗脱剂∶乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1→4∶1)得纯的开环产物(1)Aa 106mg，产率88％。
IR(KBr)ν：1620.61cm-1(-CONH-)。
1HNMR(CDCl3，300MHz)δppm：1.07(t，J＝7.20Hz，3H，18-CH3)，1.76(m，2H，19-CH2)，2.25(m，1H，22-CH2)，2.43(m，1H，22-CH2)，2.44(m，6H，22-CH2，and 2x24-CH2)，3.41(m，2H，21-CH2)，3.75(m，4H，2x25-CH2)，4.88(q，JAB＝12.70Hz，2H，17-CH2)，5.04(s，2H，5-CH2)，7.47(t，J＝8.4Hz，1H，10-H)，7.48(s，1H，14-H)，7.56(d，J＝7.20Hz，1H，9-H)，7.67(t，J＝5.20Hz，2H，11-H)，7.87(s，1H，7-H)，7.97(d，J＝8.46Hz，1H，12-H)，8.20(s，1H，NH)。
实施例二、CPT的氨解开环产物(1)Aa的17-羟基乙酰化产物(1)Bam的制备
126mg N-(3-氨基丙基)吗啉的CPT开环产物(1)Aa(0.25mmol)溶于2mL(24.8mmol)吡啶中，加入1mL(10.6mmol)乙酸酐，加热使温度维持在40℃左右，搅拌过夜。减压蒸去溶剂。残留物用少量的CHCl3溶解，倒入20mL石油醚乙醚等体积比的混合液中，析出沉淀，过滤，冷乙醚洗涤。再用CHCl3溶解，硅胶柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯∶石油醚＝2∶1→纯乙酸乙酯)，得黄色的固体粉末(1)Bam 112mg。产率81.9％。
IR(KBr)ν：1733.69cm-1(-CO-CH3)，1620.61cm-1(-CONH-)。
1HNMR(CDCl3，300MHz)δppm：1.10(t，J＝7.17Hz，3H，18-CH3)，1.77(m，2H，19-CH2)，2.06(s，3H，-CO-CH3)，2.30(m，1H，22-CH2)，2.52～2.54(m，7H，23-CH2，2x24-CH2，1/2x22-CH2)，3.31～3.42(m，2H，21-CH2)，3.78(d，J＝4.38Hz，4H，25-CH2)，5.15(q，J＝19.41Hz，2H，5-CH2)，5.47(dd，JAB＝11.58Hz，2H，17-CH2)，7.43(t，J＝7.42Hz，1H，10-H)，7.58(s，1H，14-H)，7.63(d，J＝8.11Hz，1H，9-H)，7.69(t，J＝7.23Hz，1H，11-H)，8.04(d，J＝8.34Hz，1H，12-H)，8.14(s，1H，7-H)，8.17(s，1H，NH)
实施例三、CPT的氨解开环产物(1)Aa的17-羟基丙酰化产物(1)Ban的制备
150mg(0.30mmol)N-(3-氨基丙基)吗啉的CPT开环产物(1)Aa，1.5mL吡啶(18.6mmol)和1mL丙酸酐(7.7mmol)混合加热至40℃，搅拌过夜，蒸去低沸点溶剂，剩余物倒入50mL乙醚，析出淡黄色固体，经硅胶柱层析进一步纯化(洗脱剂∶乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1→3∶1)得(1)Bam纯产品111mg，产率66.4％。
IR(KBr)ν：1729.83cm-1(-COCH2CH3)，1654.52cm-1(-CONH-)
1HNMR.(CDCl3，300MHz)δppm：1.11(t，J＝7.23Hz，3H，18-CH3)，1.21(t，J＝7.05Hz，3H，-CO-C-CH3)，1.77(m，2H，19-CH2)，2.31(m，1H，1/2x22-CH2)，2.40～2.15(m，1H，1/2x22-CH2)，2.55～2.56(m，6H，23-CH2 and 2x24-CH2)，3.32(m，1H，1/2x21-CH2)，3.44(m，1H，1/2x21-CH2)，3.48(q，J＝6.99Hz，2H，-CO-CH2-)，3.79(t，J＝4.50Hz，4H，2x25-CH2)，5.13(q，J＝19.17Hz，2H，5-CH2)，5.47(q，J＝AB＝11.58Hz，2H，17-CH2)，7.45(t，J＝7.41，1H，10-H)，7.57(s，1H，14-H)，7.60(d，J＝8.10，1H，9-H)，7.68(t，J＝7.51，1H，11-H)，8.03(d，J＝8.46，1H，12-H)，8.12(s，1H，7-H)，8.21(s，1H，NH)。
实施例四、1-(3-氨基丙基)咪唑对CPT的氨解开环产物(1)Ab的制备：
639mg CPT(1.84mmol)与约1.2当量的1-(3-氨基丙基)咪唑和1mLCHCl3，搅拌，加热(约60℃)至变为澄清，蒸去CHCl3，残留液倒入40mL的NHCl4饱和溶液，用5×40mL的CHCl3萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析提纯(洗脱剂：乙酸乙酯∶石油醚＝2∶1→纯乙酸乙酯)，最终得到黄色粉末状固体(1)Ab 815mg。产率93.7％。
IR(KBr)ν：1651.08cm-1(-CONH-)
1HNMR.(CDCl3，300MHz)δppm：1.06(t，J＝6.44Hz，3H，18-CH3)，2.05(m，2H，19-CH2)，2.30～2.39(m，2H，22-CH2)，3.33(m，2H，21-CH2)，4.01(t，J＝6.97Hz，2H，23-CH2)，4.92(dd，JAB＝12.64Hz，2H，17-CH2)，5.04(s，2H，5-CH2)，6.94(s，1H，)，7.01(s，1H，)，7.45(t，J＝7.23Hz，1H，10-H)，7.51(d，J＝7.10Hz，1H，9-H)，7.56(s，1H，14-H)，7.65(d，J＝9.11Hz，1H，12-H)，7.70(t，J＝7.42Hz，1H，11-H)，8.03(s，1H，)，8.05(s，1H，7-H)。
实施例五、CPT的氨解开环产物(1)Ab的17-羟基乙酰化产物(1)Bbm的制备
153mg(0.32mmol)(1)Ab溶于1.8mL(22.3mmol)的吡啶，加入1.2mL(12.7mmol)的乙酸酐。加热使温度在50℃左右，过夜。冷却，旋转蒸去部分溶剂，然后用乙醚沉淀，过滤。固体在通过硅胶柱层析提纯(洗脱剂：乙酸乙酯∶石油醚＝2∶1→纯乙酸乙酯)，最终得到干燥黄色固体粉末产物(1)Bbm 123mg。产率：88.4％。
IR(KBr)ν：1722.12cm-1(-CO-CH3)，1651.08cm-1(-CONH-)
1HNMR.(CDCl3，300MHz)δppm：1.07(t，J＝7.20Hz，3H，18-CH3)，2.06(s，3H，-CO-CH3)，2.10(m，2H，19-CH2)，2.32～2.46(m，2H，22-CH2)，3.33(m，2H，21-CH2)，4.07(t，J＝7.02Hz，2H，23-CH2)，5.20(m，2H，5-CH2)5.52(dd，JAB＝11.49Hz，2H，17-CH2)，7.01(s，1H，)，7.10(s，1H，)，7.54(t，J＝7.23Hz，1H，10-H)，7.61(s，1H，14-H)，7.76(d，1H，J＝7.13，9-H)，7.79(t，J＝7.42Hz，1H，11-H)，7.82(s，1H，)，8.12(d，J＝9.11Hz，1H，12-H)，8.23(s，1H，7-H)。
实施例六、CPT的氨解开环产物(1)Ab的17-羟基丙酰化产物(1)Bbn的制备
127mg(0.27mmol)(1)Ab溶于1.5mL(18.6mmol)吡啶，加入1.0mL(7.7mmol)丙酸酐。加热至50℃左右，搅拌过夜。减压蒸去部分溶剂，然后用石油醚-乙醚沉淀，过滤。固体经硅胶柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯∶石油醚＝2∶1→纯乙酸乙酯)，得黄色固体粉末(1)Bbn 103mg。产率：72.4％。
IR(KBr)ν：1726.12cm-1(-CO-C2H5)，1652.23cm-1(-CONH-)
1HNMR.(CDCl3，300MHz)δppm：1.01(t，J＝7.13Hz，3H，18-CH3)，1.23(t，J＝7.11，3H，-CO-C-CH3)，2.04(m，2H，19-CH2)，2.30～2.47(m，4H，-CO-CH2-and22-CH2)，3.31(m，2H，21-CH2)，4.04(t，J＝6.99Hz，2H，23-CH2)，5.16(m，2H，5-CH2)5.52(dd，JAB＝11.61Hz，2H，17-CH2)，6.98(s，1H，)，7.06(s，1H，)，7.51(t，J＝7.18Hz，1H，10-H)，7.59(s，1H，14-H)，7.60(s，1H，)，7.67(d，1H，J＝7.07，9-H)，7.73(t，J＝7.42Hz，1H，11-H)，8.01(d，J＝9.02Hz，1H，12-H)，8.18(s，1H，7-H)。
Claims (10)
1.一种结构如下式的喜树碱衍生物
其中：
R1代表9、10或11-位上的0-3个相同或不同的取代基，这些取代基选自卤原子、羟基、烷氧基；
R2代表C2-C5的直链或支链亚烷基；
R3代表氢原子或R4CO-；R4代表低级烷基、低级烷氨基亚烷基或低级烷氧基亚烷基；
Y代表杂环碱基或氢化杂环碱基。
2.权利要求1的喜树碱衍生物，其中Y代表杂环碱基选自：咪唑、吡啶、嘧啶、吡嗪，氢化杂环碱基选自：哌啶、哌嗪、吗啉等。
3.权利要求1的喜树碱衍生物，
其中：
R1代表H、OH
R2代表-CH2CH2CH2-
R3代表H、R4CO
R4代表-CH3、-CH2CH3、-(CH2)nNR2
Y代表1-咪唑基、1-吗啉基
4.权利要求1的喜树碱衍生物，
其中：
R1代表H
R2代表-CH2CH2CH2-
R3代表H、R4CO
R4代表-CH3、-CH2CH3
Y代表1-咪唑基、1-吗啉基
5.权利要求1的喜树碱衍生物，是如下化合物：
21-N[3-(1-吗啉基)丙基]酰胺-17-羟基E内酯环开环喜树碱，
21-N[3-(1-吗啉基)丙基]酰胺-17-乙酰氧基E内酯环开环喜树碱，
21-N[3-(1-吗啉基)丙基]酰胺-17-丙酰氧基E内酯环开环喜树碱，
21-N[3-(1-咪唑基)丙基]酰胺-17-羟基E内酯环开环喜树碱，
21-N[3-(1-咪唑基)丙基]酰胺-17-乙酰氧基E内酯环开环喜树碱，
21-N[3-(1-咪唑基)丙基]酰胺-17-丙酰氧基E内酯环开环喜树碱。
6.权利要求1的喜树碱衍生物的制备方法，其特征在于，经过以下步骤制备：含双碱性基团的试剂NH2-(CH2)n-Y对喜树碱的E环进行开环反应得到，其中Y代表杂环碱基或氢化杂环碱基。
7.权利要求6的制备方法，其特征在于，经过以下步骤制备：
将通式(2)代表的喜树碱或其衍生物原料与过量的NH2-(CH2)n-Y化合物反应以打开内酯环，生成相应的开环化合物，根据需要，进一步的将开环后的化合物用相应的酰化剂将17-羟基酰基化。
式中R1的定义同通式(1)。
8.权利要求7的制备方法，其特征在于，其中Y代表杂环碱基或氢化杂环碱基。
9.权利要求7的制备方法，其特征在于，其中酰化剂选自：乙酰氯，丙酰氯，乙酸酐，丙酸酐等。
10.权利要求7的制备方法，其特征在于，开环产物以及开环后17-羟基进一步酰基化产物是：
21-N[3-(1-吗啉基)丙基]酰胺-17-羟基E内酯环开环喜树碱，
21-N[3-(1-吗啉基)丙基]酰胺-17-乙酰氧基E内酯环开环喜树碱，
21-N[3-(1-吗啉基)丙基]酰胺-17-丙酰氧基E内酯环开环喜树碱，
21-N[3-(1-咪唑基)丙基]酰胺-17-羟基E内酯环开环喜树碱，
21-N[3-(1-咪唑基)丙基]酰胺-17-乙酰氧基E内酯环开环喜树碱，
21-N[3-(1-咪唑基)丙基]酰胺-17-丙酰氧基E内酯环开环喜树碱。
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| C56 | Change in the name or address of the patentee |
Owner name: HEFEI USTC BIOTECHNOLOGY CO., LTD. Free format text: FORMER NAME: HEFEI ZHONGKEDA BIO-TECHNOLOGY CO., LTD. |
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| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: 230088, Anhui province high tech Zone, 425 innovation Avenue, Anhui province science and technology achievement demonstration base D, Hefei Patentee after: Hefei Keda Biological Technology Co., Ltd. Address before: 230027 No. 96, Jinzhai Road, Anhui, Hefei Patentee before: Hefei Zhongkeda Bio-technology Co., Ltd. |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20070926 Termination date: 20160905 |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |