CN1819839A - 免疫调节化合物和相关方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了免疫调节化合物和一个相关方法。

Description

免疫调节化合物和相关方法
技术领域
本发明涉及免疫调节化合物和一个相关方法，重点涉及具有类似于胸腺素α-1(thymosin α-1)活性的化合物。
发明背景
胸腺是重要的中枢淋巴器官，位于所有哺乳类动物的颈部或上胸部。在生命的早期胸腺最发达。哺乳动物和人类的胸腺在出生时相对重量最大，但绝对重量继续增长，直到青春期开始。此后，在整个人类生命期间胸腺持续变小。通过一系列的有丝分裂，胸腺干细胞产生大量的小淋巴细胞(胸腺细胞)。在分裂和成熟期，分化的胸腺细胞在胸腺内从表层的皮质区移动到髓质核。部分胸腺细胞在胸腺内衰亡，但大部分进入到外周血和淋巴系统。胸腺内少量T淋巴细胞(5-10％)具有抗原识别功能，能识别外源细胞或物质的抗原部位。某些T淋巴细胞可以溶解外源组织细胞，而另外一些T淋巴细胞能够识别抗原的外源性，并协助骨髓介导的淋巴细胞(B淋巴细胞)产生特异性抗体。这两种免疫应答的T淋巴细胞分别被称为杀伤性T淋巴细胞和辅助性T淋巴细胞。它们在组织移植和体液抗体应答中起作用。
胸腺素α-1(thymosinα-1)是由胸腺的上皮网状细胞合成和分泌的多肽激素。胸腺素α-1在几个部位发挥作用：(1)在胸腺中的干细胞前体或未成熟胸腺细胞中。(2)在外周血中的胸腺产生的淋巴细胞和干细胞前体中。胸腺和外周血中的干细胞前体没有免疫活性，被称为T0细胞。而不同的成熟期的T1和T2则具有相应的免疫活性。胸腺素α-1促进和加速T0细胞转变成T1和T2细胞。此外，胸腺素α-1可通过加速分裂成熟和未成熟胸腺细胞而增加淋巴细胞总量。
因为胸腺素α-1具有上述的刺激淋巴细胞生成的作用，它具有明显的治疗功能。例如，已有报导胸腺素α-1在临床上成功的用于预防和治疗一级和二级感染性疾病，降低放疗和化疗的副作用，促进伤口愈合，具有抗衰老和增进医疗效果。此外，在手术和治疗过程中胸腺素α-1作为辅助制剂已被成功地用于抗真菌、细菌和病毒，例如用于治疗乙型肝炎和丙型肝炎。
显然，胸腺素α-1具有可应用的生物学功能。因此，具有与其类似生物学功能的化合物也会有相应的药用价值。
发明内容
该发明包括一项或多项下列特征：
化合物具有氨基酸序列
Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn(序列1)，或氨基酸序列X-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn(序列2)，此处，X为乙酰基或氢，或任一序列与此氨基酸序列至少有70％以上同源性。在序列中，至少一个或多个肽键是由Asp的β-羧基和Ala的α-氨基，Asp的β-羧基和Thr的α-氨基，Asp的β-羧基和Leu的α-氨基，Glu的γ-羧基和Ile的α-氨基，Glu的α-羧基和Lys的ε-氨基，Glu的γ-羧基和Lys的α-氨基，Glu的γ-羧基和Lys的ε-氨基，Glu的γ-羧基和Val的α-氨基，Glu的γ-羧基和Glu的α-氨基，Glu的γ-羧基和Ala的α-氨基，Glu的γ-羧基和Asn的α-氨基，Thr的α-羧基和Lys的ε-氨基，Leu的α-羧基和Lys的ε-氨基，Lys的α-羧基和Lys的ε-氨基，β-Ala的羧基和Ala的α-氨基，β-Ala的羧基和Glu的α-氨基，β-Ala的羧基和Val的α-氨基所构成。化合物可包含在药用载体组份中。化合物具有E-玫瑰花结生成或抑制实验活性，淋巴细胞增殖活性或多重淋巴细胞反应。化合物可被用于重建动物的免疫功能(如哺乳动物)。
附图说明
图1胸腺素α-1(滞留时间27.56分钟)和本发明中的一个化合物(滞留时间26.04分钟)的HPLC图谱。
图2A.胸腺素α-1的LCQ电喷雾质谱。
图2B.本发明中化合物之一胸腺肽β-Asp2，6，15(滞留时间26.04分钟，图1)的LCQ电喷雾质谱。
图3.不同浓度胸腺肽β-Asp2，6，15(滞留时间26.04分钟)和胸腺素α-1的红细胞玫瑰花结生成实验结果比较。
图4.在同一浓度的七个发明物(胸腺肽β-Asp2，6，15，胸腺肽β-Asp2，胸腺肽β-Asp6，胸腺肽β-Asp15，胸腺肽β-Asp2，6，胸腺肽β-Asp2，15和胸腺肽β-Asp6，15)和胸腺素α-1的红细胞玫瑰花结生成结果比较。
图5.本发明化合物之一胸腺肽β-Asp2，6，15图示。
图6.本发明化合物之一胸腺肽β-Asp2图示。
图7.本发明化合物之一胸腺肽β-Asp6图示。
图8.本发明化合物之一胸腺肽β-Asp15图示。
图9.本发明化合物之一胸腺肽β-Asp2，6图示。
图10.本发明化合物之一胸腺肽β-Asp2，15图示。
图11.本发明化合物之一胸腺肽β-Asp6，15图示。
具体实施方式
本发明可以有很多变化，在此我们给出例子并详细讨论。然而，我们不会限定本发明仅此几种化合物，我们将会合理地包括所有的修饰物，衍生物和替换物。本发明的范围将会在权力要求书中说明。
如前所述，胸腺素α-1是由胸腺的上皮网状细胞合成分泌的，具有免疫调节活性的28个氨基酸的多肽激素。胸腺素α-1的氨基酸序列如下：
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn(序列3)。
值得注意的是此处所用的“同源性”是指包括在该序列中的氨基酸，但不包括该序列结构的异构体。例如，氨基酸序列
Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn(序列1)，此处肽键是由Asp的β羧基和Ala的α氨基形成的肽键，直到与氨基酸序列
Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn(序列1)具有100％的序列性。
胸腺素α-1的肽键是由氨基酸的α-氨基和相邻的氨基酸的α-羧基缩和而成。本发明中的肽类化合物具有类似于胸腺素α-1的生物活性，但具有不同的化学结构：至少一个肽键不是由氨基酸的α-氨基和相邻的氨基酸的α-羧基缩和而成。例如，肽化合物与胸腺素α-1至少有70％以上的同源，并且有一个或一个以上的肽键是由Asp的β-羧基和Ala的α-氨基，Asp的β-羧基和Thr的α-氨基，Asp的β-羧基和Leu的α-氨基，Glu的γ-羧基和Ile的α-氨基，Glu的α-羧基和Lys的ε-氨基，Glu的γ-羧基和Lys的α-氨基，Glu的γ-羧基和Lys的ε-氨基，Glu的γ-羧基和Val的α-氨基，Glu的γ-羧基和Glu的α-氨基，Glu的γ-羧基和Ala的α-氨基，Glu的γ-羧基和Asn的α-氨基，Thr的α-羧基和Lys的ε-氨基，Leu的α-羧基和Lys的ε-氨基，Lys的α-羧基和Lys的ε-氨基，β-Ala的羧基和Ala的α-氨基，β-Ala的羧基和Glu的α-氨基，β-Ala的羧基和Val的α-氨基所构成。
值得注意的是此处所用“同源性”是指包括在该序列中的氨基酸，不包括该序列结构的异构体。例如，氨基酸序列
Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn(序列1)，此序列中的一个肽键由Asp的β-羧基和Ala的α-氨基形成的肽键，该序列与
Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn(序列1)(其中一个肽键是Asp的β-羧基与Thr的α-氨基形成)两者具有100％同源性。
此处用“多肽”一词，在广义上来讲是指一个能够被一个细胞基因编码的氨基酸序列，或者是重组核苷酸序列所编码的氨基酸序列，或者是能以化学合成方法得到的氨基酸序列。例如本发明中的多肽是能够被化学合成，其纯化物不含脂类、蛋白质、核酸或其他细胞中的物质(在细胞中通常与多肽共存的物质)。此外，此处所述的多肽可能是大肽的一部分，或是一个完整多肽的一部分。
如上所述，本发明中的肽化合物具有类似于胸腺素α-1的生物活性。氨基酸序列可以是：
X-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn(序列2)，或相应的氨基酸序列衍生物：(1)该序列至少有70％的同源性化合物；(2)有类似于胸腺素α-1的E玫瑰花结形成活性(免疫调节活性)。此处X为乙酰基或氢；(3)并且有一个或一个以上的肽键是由Asp的β-羧基和Ala的α-氨基，Asp的β-羧基和Thr的α-氨基，Asp的β-羧基和Leu的α-氨基，Glu的γ-羧基和Ile的α-氨基，Glu的α-羧基和Lys的ε-氨基，Glu的γ-羧基和Lys的α-氨基，Glu的γ-羧基和Lys的ε-氨基，Glu的γ-羧基和Val的α-氨基，Glu的γ-羧基和Glu的α-氨基，Glu的γ-羧基和Ala的α-氨基，Glu的γ-羧基和Asn的α-氨基，Thr的α-羧基和Lys的ε-氨基，Leu的α-羧基和Lys的ε-氨基，Lys的α-羧基和Lys的ε-氨基，β-Ala的羧基和Ala的α-氨基，β-Ala的羧基和Glu的α-氨基，β-Ala的羧基和Val的α-氨基所构成。
本发明的另一体现形式是肽类化合物氨基酸序列至少75％类似于
X-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn(序列2)。另一种情况是本发明中肽类化合物是氨基酸序列与X-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn(序列2)至少80％以上同源性。同样在不同的形式中本发明中肽类化合物的氨基酸序列至少有85％同源于
X-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn(序列2)。进而本发明中肽类化合物具有90％同源于
X-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn(序列2)。还有，本发明中肽类化合物具有与
X-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn(序列2)至少有95％同源性。
本发明中一种多肽氨基酸序列如下：
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn(序列3)。
该序列如图5所示，一个肽键是Asp的β-羧基和Ala的α-氨基；Asp的β-羧基和Thr的α-氨基；Asp的β-羧基和Leu的α-氨基生成(以β-Asp2，6，15表示)。
本发明化合物之二氨基酸序列如下：
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn(序列3)
该序列如图6所示，有一个肽键是由Asp的β-羧基和Ala的α-氨基生成(以β-Asp2表示)。
本发明化合物之三氨基酸序列如下：
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn(序列3)
此处如图7所示，有一个肽键是由Asp的β-羧基和Thr的α-氨基生成(以β-Asp6表示)。
本发明化合物之四氨基酸序列如下：
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn(序列3)
如图8所示，有一个肽键是由Asp的β-羧基和Leu的α-氨基生成(以β-Asp15表示)。本发明化合物之五氨基酸序列如下：
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn(序列3)
此处如图9所示，有二个肽键分别是由Asp的β-羧基和Ala的α-氨基，Asp的β-羧基和Thr的α-氨基生成(以β-Asp2，6表示)。
本发明化合物之六氨基酸序列如下：
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn(序列3)
如图10所示，有二个肽键分别是由Asp的β-羧基和Ala的α-氨基，Asp的β-羧基和Leu的α-氨基生成(以β-Asp2，15表示)。
本发明化合物之七(胸腺肽β-Asp6，15)氨基酸序列如下：
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn(序列3)
如图11所示，有二个肽键分别是由Asp的β-羧基和Thr的α-氨基，Asp的β-羧基和Leu的α-氨基生成(以β-Asp6，15表示)。
本发明中的多肽是以固相化学合成法合成，并采用与之相匹配的保护基团。例如本发明中多肽以固相法在多肽合成仪上自动合成(ABI 431A型，购自Applied Biosystems，FosterCity，California)。本发明采用Fmoc(9-fluorenylmethoxycarbonyl)-t-butyl化学。
每次合成使用0.25毫摩尔Fmoc-Asn(Trityl)Wang树酯(0.40毫摩尔/克，Novabiochem，San Diego，USA)，用FastMoc程序。每个反应瓶装有1.0毫摩尔Fmoc氨基酸。偶联剂为HBTU[2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1，1，3，3-tetramethyluronium hexafluorophosphate]和HOBt(1-Hydroxybenzotriazole)。Fmoc脱保护用20％哌啶/NMP(N-metbylpyrrolidone)进行。当肽链在树酯上连接完毕，最终切割和脱保护用20毫升三氟乙酸，酚，EDT(1，2-ethanedithiol)和水的混合物(20∶1∶0.5∶1)在室温进行2小时。过滤除去树酯，用350毫升冷乙醚沉淀肽。沉淀的肽溶解于100毫升20％乙腈水溶液/1.0摩尔NH4OAc，用水稀释到300毫升然后冻干。粗肽经过C18柱反向HPLC(Vydac 218TP 101550)纯化。合并纯肽馏份(分析HPLC鉴定)并冻干。纯化的肽经质谱鉴定分子量。
每一个肽化合物，胸腺肽β-Asp2，6，15，胸腺肽β-Asp2，胸腺肽β-Asp6，胸腺肽β-Asp15，胸腺肽β-Asp2，6，胸腺肽β-Asp2，15和胸腺肽β-Asp6，15详细合成如下：以合成胸腺肽β-Asp2，6，15为例，装有1.0毫摩尔(4倍过量)的每种Fmoc氨基酸反应瓶被装在ABI 431A自动合成仪上。每个氨基酸的α-氨基由Fmoc基团保护。侧链官能团保护基：10，18，21，24，25，和27位的Glu残基的γ-羧基为t-butyl酯保护；14，17，19和20位的Lys残基的ε-氨基为t-Boc(叔丁氧羰酰基)保护；2，6和15位的Asp残基的α-羧基为t-butyl酯保护，而允许其β-羧基进行偶联；Ser1，8，9和Thr7，12，13的羟基为t-butyl醚保护；剩余的8个残基-Val5，20，23，Leu16，Ile11 and Ala3，24，26的侧链不需要保护。反应瓶中的Fmoc氨基酸衍生物溶解之后，通过氮气送入活化器，然后反应器中。合成从C-端到N-端进行。最终从树酯切割和脱保护如前所述。
胸腺肽β-Asp2，胸腺肽β-Asp6，胸腺肽β-Asp15，胸腺肽β-Asp2，6，胸腺肽β-Asp2，15和胸腺肽β-Asp6，15详细合成方法与胸腺肽β-Asp2，6，15的合成相同，只是Fmoc Asp氨基酸侧链保护的位置不同，如表1所示。
表1
Figure A0382620300161
正如前述，以电喷雾质谱法鉴定β-Asp2，6，15，β-Asp2，β-Asp6，β-Asp15，β-Asp2，6，β-Asp2， 15。每个肽β-Asp2，6，15，β-Asp2，β-Asp6，β-Asp15，β-Asp2，6，β-Asp2，15，的合成产率和质谱分析(MW)如下：胸腺肽β-Asp2，6，15的产率为26.0％，MH+＝3108.9(计算分子量为3108.1)；胸腺肽β-Asp2的产率为10.3％，MH+＝3108.6(计算分子量为3108.1)；胸腺肽β-Asp6的产率为8.0％，MH+＝3108.9(计算分子量为3108.1)；胸腺肽β-Asp15的产率为4.8％，MH+＝3108.4(计算分子量为3108.1)；胸腺肽β-Asp2，6的产率为15.8％，MH+＝3107.9(计算分子量为3108.1)；胸腺肽β-Asp2，15的产率为5.5％，MH+＝3107.2(计算分子量为3107.5)；胸腺肽β-Asp6，15的产率为10.1％，MH+＝3108.6(计算分子量为3108.1)。
图1为胸腺肽β-Asp2，6，15和胸腺素α-1的HPLC图谱比较。胸腺肽β-Asp2，6，15的滞留时间(26.04分钟)比胸腺素α-1的滞留时间(27.56分钟)短，表明了比较好的水溶性。分析HPLC条件如下：A液：0.1％TFA水溶液；B液：70％乙腈/水，0.09％TFA；层析柱：Vydac C184.6×250mm；洗脱条件：0-20％B，1.0ml/min，洗脱30分钟。此处注意到多肽β-Asp2，6， 15的产率为26％，比胸腺素α-1的产率19％要高。图2B是β-Asp2，6，15的质谱。图2A是胸腺α-1的质谱。MH+，MH2 ++，MH3 +++和MH4 ++++分别为3107.5，1554.3，1036.5和777.6。
本发明中的多肽化合物的生物活性和药用治疗效果可通过多种体外实验(in vitro)方法检测，但不限于这些方法。在此，我们选用红细胞玫瑰花结(E-Rosette)生成实验来评估胸腺肽β-Asp2，6，15，胸腺肽β-Asp2，胸腺肽β-Asp6，胸腺肽β-Asp15，胸腺肽β-Asp2，6，胸腺肽β-Asp2，15和胸腺肽β-Asp6，15的生物活性。
红细胞玫瑰花结(E-Rosette)实验试剂和材料：
肝素溶液：200单位肝素/毫升生理盐水。
Alserver′s溶液：将氯化钠(0.42克)，葡萄糖(2.00克)，柠檬酸(0.055克)，柠檬酸二氢钠(0.766克)溶于100毫升水中，煮沸1小时灭菌。
固定液：25％戊二醛，3.5％NaHCO3和Hanks溶液(1∶1∶38)。
Hanks溶液：磷酸二氢钾(KH2PO4，0.06克)，磷酸氢二钠(Na2HPO4，0.06克)，氯化钾0.42克，氯化钠8.00克和葡萄糖1.00克溶于1000毫升水中。用4％Na2HCO3调pH至7.2-7.3后，灭菌。
染色液：将2毫升Gimesa染色液与6毫升Hanks溶液混合，1500rpm/分钟离心10分钟，取上清。
Gimesa染色液：加33毫升甘油到0.50克Gimesa染料中，加热到55-60℃使染料溶解。在室温加入33毫升甲醇，室温放置24小时。
猪胸腺：猪胸腺取自健康的猪。
羊血：收集羊静脉血，并用抗凝剂肝素处理。加入等体积的Alserver′s溶液，储存于4℃。
制备T-淋巴细胞溶液：将剔除脂肪后新鲜猪胸腺切成小块，加入适量的Hanks溶液。用100目分子筛过滤悬浮液。将上清液转移到装有三分之一体积淋巴细胞分离液的离心管中，在2000rpm离心20分钟。收集细胞，悬浮在适量的Hanks溶液中，1500rpm离心3分钟。此程序重复3次。淋巴细胞溶液的终浓度配制成4×106细胞/毫升Hanks。
制备羊红细胞溶液：
与制备T-淋巴细胞相同，羊红细胞被洗涤3次后，配制成4×107细胞/毫升Hanks的溶液。
肽样品溶液：用Hanks溶液溶解胸腺肽β-Asp2，6，15或胸腺素α-1，配制成200微克/毫升，20微克/毫升，2.0微克/毫升，0.2微克/毫升和0.02微克/毫升的系列溶液。胸腺肽β-Asp2，胸腺肽β-Asp6，胸腺肽β-Asp15，胸腺肽β-Asp2，6，胸腺肽β-Asp2，15和胸腺肽β-Asp6，15被配制成200微克/毫升的溶液。
方法：
在试管中加入0.1毫升肽样品溶液，对照管中加入0.1毫升Hanks溶液。在样品管和对照管中分别加入0.2毫升4×106细胞/毫升Hanks的T-淋巴细胞溶液，37℃保温1小时。然后加入0.2毫升4×107细胞/毫升Hanks的羊红细胞溶液，温和混合。500rpm离心3分钟，4℃放置过夜。去掉上清液，轻微振摇悬浮细胞，用Gimesa染色液染色。在玻片上数200个T-细胞来计算玫瑰花结细胞生成比率(RFC％)。
结果：
胸腺肽β-Asp2，6，15和胸腺素α-1的红细胞玫瑰花结生成实验结果如图3所示。当加入0.1毫升系列稀释的(从0.02微克/毫升到200微克/毫升)的胸腺肽β-Asp2，6，15或胸腺素α1时，玫瑰花结细胞生成比率明显地增加了16％到35％。在胸腺肽β-Asp2，6，15和胸腺素α1的活性之间，没有明显差别。
图4显示了胸腺肽β-Asp2，6，15(χ坐标样品8)，胸腺肽β-Asp2(χ坐标样品1)，胸腺肽β-Asp6(χ坐标样品2)，胸腺肽β-Asp15(χ坐标样品3)，胸腺肽β-Asp2，6(χ坐标样品4)，胸腺肽β-Asp2，15(χ坐标样品5)，胸腺肽β-Asp6，15(χ坐标样品6)和胸腺素α-1(χ坐标样品7)的玫瑰花结细胞生成比率。当加入0.1毫升200微克/毫升的胸腺肽β-Asp2，6，15，胸腺肽β-Asp2，胸腺肽β-Asp6，胸腺肽β-Asp15，胸腺肽β-Asp2，6，胸腺肽β-Asp2，15和胸腺肽β-Asp6，15和胸腺素α-1时，它们之间没有明显差别。
因此，由于其免疫调节功能，本发明中这些胸腺肽衍生物具有明显的治疗用途。例如，它们可被用于预防和治疗一级和二级感染，降低放疗和化疗的副作用，促进伤口愈合，抗衰老和增加医药疗效。此外，它们还可用于手术和临床中的抗真菌、细菌和病毒的辅助治剂(例如，用于治疗乙型肝炎和丙型肝炎)。
值得强调的是基于体外实验结果(例如E玫瑰花结实验)本发明中的多肽单独或与其他免疫调节因子结合使用，可以推测其在体内具有免疫增强的医用效果。预计通过已有的诊断和处理原则本发明中的主体物质在处理疾病或增进免疫功能方面的临床前和临床上治疗方面的应用将会被很好的解决。
因此，本发明中的化合物或多肽将会应用于免疫调节组份中，如重建生物功能免疫制剂中。举例来说，重建哺乳动物免疫调节功能的一种方法包括给予哺乳动物下列具有免疫调节效果的一种化合物或肽，其氨基酸序列如下：
X-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn(序列2)，或任一序列(1)与此氨基酸序列至少有70％以上(例如，75％，80％，85％，90％，或95％)同源性，(2)有免疫调节活性，例如，红细胞玫瑰花结生成活性。在序列中，X为乙酰基或氢，至少一个或多个肽键是由Asp的β-羧基和Ala的α-氨基，Asp的β-羧基和Thr的α-氨基，Asp的β-羧基和Leu的α-氨基，Glu的γ-羧基和Ile的α-氨基，Glu的α-羧基和Lys的ε-氨基，Glu的γ-羧基和Lys的α-氨基，Glu的γ-羧基和Lys的ε-氨基，Glu的γ-羧基和Val的α-氨基，Glu的γ-羧基和Glu的α-氨基，Glu的γ-羧基和Ala的α-氨基，Glu的γ-羧基和Asn的α-氨基，Thr的α-羧基和Lys的ε-氨基，Leu的α-羧基和Lys的ε-氨基，Lys的α-羧基和Lys的ε-氨基。
本发明中化合物也可用于药物组份。本发明的药物组份可以用于任何经过实验证明本发明化合物有效的动物，最重要的是用于人，但本发明不限于此。本发明的药用组份可以是多肽的中性制剂或盐类，可作为药物的盐类包括游离的氨基和盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等生成的盐类，或游离的羧基和钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸等生成的盐类。
本发明中这些胸腺肽衍生物可通过各种方法或途径达到药用的目的，例如，给药可以是肠道的，皮下，静脉，肌肉，腹腔或口腔，也可以是口服给药。药物剂量将依据受试者年龄、健康状况和体重、并行处理的种类、处理频率和所需效果的性质而定。
在此，“药用”这一术语是指国家药品管理局批准，或列入美国药典，或其它用于动物，特别是用于人的被公认的药典中。所谓载体即稀释剂，佐剂，药物赋形剂。该药用载体可能是无菌的液体，如水或油，包括来自石油，动物，植物或合成品，如花生油，大豆油，矿物油，芝麻油等，以及聚乙二醇，甘油，乙二醇或其他合成溶剂。当药物组份以静脉给药时，水可以作载体。生理盐水，水溶性葡聚糖和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用作注射液。适当的药品赋形剂包括淀粉、葡萄糖、半乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面、硅胶、天然碳酸钙、硬脂酸钠，单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油丙二醇、水和乙醇等。该组份(如果需要的话)，也可以含有微量润湿剂或乳化剂，或PH缓冲液，如乙酸、柠檬酸、或磷酸。抗菌剂如苄基乙醇、或甲基parabens。抗氧化剂，如抗坏血酸，或二硫化物。鳌合剂如乙二胺四乙酸。辅助剂，如氯化钠或葡聚糖也在视野之内。此外，安瓶，一次性注射器或多次使用的玻璃和塑料制品也应包括在内。
药用组份可以采用不同的形式，如溶液，悬浮液，乳浊液、片剂、丸剂、胶囊、粉剂缓释配方等。该组份也可以制成栓剂，用传统的结合剂和载体，如甘油三酯，微晶纤维素，面黄著胶或明胶。口服剂型通常含有标准的载体，如药物级别的甘露醇、半乳糖、淀粉、硬脂酸锰、糖精钠，纤维素，碳酸锰等。药物组份的载体在E.W.Marti所著Remington’sPharmaceutical Science”中有详细描述。该药物组份将含有有效量的本发明中的多肽，最好是纯化物，与适当量的载体配合，提供一个剂型以便适合于患者用药。
在另一实体中，依据通用程序该组份被制备成适用于给动物静脉用药(例如人)的药用制剂。典型例子是把适用于静脉的组份制成无菌的等渗水缓冲溶液。如果必要的话，该组份也包括溶解剂和一个局部麻醉剂，如利多卡因减轻注射部位的疼痛。一般而言，配料被分别或以单位剂量形式混合在一起提供，例如在气密封容器中(如安瓶，或标示出活性试剂量的包装物)的冻干粉剂或无水浓缩物。当组份以输注方式用药时，可用含有药用级别的水或生理盐水的输注瓶。当组份以注射方式用药时，采用注射的无菌水或(生理盐水)的安瓶，以便在施药前配料能被充分混合。本发明中的多肽用量将依据处理具体疾病的有效性，或疾病的性质和状况而定。
此外，在体外实验中(如上述讨论中所述内容)的结果可被选择的应用于确立合理剂量范围。本发明中组份的用药剂量范围是足以产生药效的大剂量，如达到免疫调节的有效剂量。然而，剂量不能大到引起不利的副反应，如不希望发生的交叉副反应等。一般而言，正如前文所述，其剂量是随年龄、身体状况、患者性别和疾病状况而变化。还有，免疫耐受和其它可变因素也将影响用药剂量。此外，在制剂中精确的使用剂量也依赖于用药途径，疾病的严重程度而变，而且也应取决于从业医生的对具体情况的判断。
在此，虽然我们已对本发明做了图解和详细说明，但这些图解和说明可被认为是特殊例子。所有与此发明中肽化合物相关的修饰物和衍生物都将受到相应的保护。
                 序列表
<110>李惟，郭莉莉，罗斯克.罗杰
<120>免疫调节化合物和相关方法
<130>29920-71479
<150>PCT/US2003/002627
<151>2003-01-29
<160>3
<170>专利说明3.2
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<212>PRT
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Lys Glu Lys Lys Glu Val Val Glu Glu Ala Glu Asn
            20                  25

Claims (55)

1.化合物结构组成(氨基酸序列)中包括：
X-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn(序列1)，或任一序列与此氨基酸序列至少有70％以上同源性的化合物。在序列中，至少一个肽键是由Asp的β-羧基和Ala的α-氨基，Asp的β-羧基和Thr的α-氨基，Asp的β-羧基和Leu的α-氨基，Glu的γ-羧基和Ile的α-氨基，Glu的α-羧基和Lys的ε-氨基，Glu的γ-羧基和Lys的α-氨基，Glu的γ-羧基和Lys的ε-氨基，Glu的γ-羧基和Val的α-氨基，Glu的γ-羧基和Glu的α-氨基，Glu的γ-羧基和Ala的α-氨基，Glu的γ-羧基和Asn的α-氨基，Thr的α-羧基和Lys的ε-氨基，Leu的α-羧基和Lys的ε-氨基，Lys的α-羧基和Lys的ε-氨基，β-Ala的羧基和Ala的α-氨基，β-Ala的羧基和Glu的α-氨基，β-Ala的羧基和Val的α-氨基所构成。
2.权利要求1的结构组成中：
该氨基酸序列或变体中至少一个肽键是由Asp的β-羧基和Ala的α-氨基构成。
3.权利要求1的结构组成中：
该氨基酸序列或变体中至少一个肽键是由Asp的β-羧基和Thr的α-氨基形成。
4.权利要求1的结构组成中：
该氨基酸序列或变体中至少一个肽键是由Asp的β-羧基和Leu的α-氨基构成。
5.权利要求1的结构组成中：
该氨基酸序列或变体中至少一个肽键是由Glu的γ-羧基和Ile的α-氨基构成。
6.权利要求1的结构组成中：
该氨基酸序列或变体中至少一个肽键是由Glu的γ-羧基和Lys的ε-氨基构成。
7.权利要求1的结构组成中：
该氨基酸序列或变体中至少一个肽键是由Glu的γ-羧基和Lys的α-氨基构成。
8.权利要求1的结构组成中：
该氨基酸序列或变体中至少一个肽键是由Glu的γ-羧基和Lys的ε-氨基构成。
9.权利要求1的结构组成中：
该氨基酸序列或变体中至少一个肽键是由Glu的γ-羧基和Val的α-氨基构成。
10.权利要求1的结构组成中：
该氨基酸序列或变体中至少一个肽键是由Glu的γ-羧基和Glu的α-氨基构成。
11.权利要求1的结构组成中：
该氨基酸序列或变体中至少一个肽键是由Glu的γ-羧基和Ala的α-氨基构成。
12.权利要求1的结构组成中：
该氨基酸序列或变体中至少一个肽键是由Glu的γ-羧基和Asn的α-氨基所构成。
13.权利要求1的结构组成中：
该氨基酸序列或变体中至少一个肽键是由Thr的α-羧基和Lys的ε-氨基构成。
14.权利要求1的结构组成中：
该氨基酸序列或变体中至少一个肽键是由Leu的α-羧基和Lys的ε-氨基构成。
15.权利要求1的结构组成中：
该氨基酸序列或变体中至少一个肽键是由Lys的α-羧基和Lys的ε-氨基所构成。
16.权利要求1的结构组成中：
该氨基酸序列或变体中至少一个肽键是由β-Ala的羧基和Ala的α-氨基构成。
17.权利要求1的结构组成中：
该氨基酸序列或变体中至少一个肽键是由β-Ala的羧基和Glu的α-氨基构成。
18.权利要求1的结构组成中：
该氨基酸序列或变体中至少一个肽键是由β-Ala的羧基和Val的α-氨基所构成。
19.肽类化合物结构组成的氨基酸序列为：
X-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn(序列2)或序列至少有70％类似于该序列的变体，且具有E-玫瑰花活性。在序列中，①X为乙酰基或H。②该序列或变体中至少一个肽键是由Asp的β-羧基和Ala的α-氨基，一个肽键是由Asp的β-羧基和Thr的α氨基，一个肽键是由Asp的β-羧基和Leu的α-氨基构成，Glu的γ-羧基和Ile的α-氨基，Glu的α-羧基和Lys的ε-氨基，Glu的γ-羧基和Lys的α-氨基，Glu的γ-羧基和Lys的ε-氨基，Glu的γ-羧基和Val的α-氨基，Glu的γ-羧基和Glu的α-氨基，Glu的γ-羧基和Ala的α-氨基，Glu的γ-羧基和Asn的α-氨基，Thr的α-羧基和Lys的ε-氨基，Leu的α-羧基和Lys的ε-氨基，Lys的α-羧基和Lys的ε-氨基，β-Ala的羧基和Ala的α-氨基，β-Ala的羧基和Glu的α-氨基，β-Ala的羧基和Val的α-氨基所构成。
20.权利要求19的结构组成中：
在该序列或变体中，至少一个肽键是由Asp的β-羧基和Ala的α-氨基构成，Asp的β-羧基和Thr的α-氨基，和Aspβ-羧基与Leu的α-氨基构成。
21.权利要求19的结构组成中：
该氨基酸序列或变体中至少一个肽键是由Glu的γ-羧基与Ile的α-氨基，Glu的γ-羧基和Lys的α-氨基，Glu的γ-羧基和Lys的ε-氨基，Glu的γ-羧基与Val的α-氨基，Glu的γ-羧基与Glu的α-氨基，Glu的γ-羧基与Ala的α-氨基，Glu的γ-羧基与Asn的α-氨基形成肽键。
22.权利要求19的结构组成中：
该氨基酸序列或变体中至少一个肽键是由Glu的α-羧基与Lys的ε-氨基，Thr的α-羧基与Lys的ε-氨基，Leu的α-羧基与Lys的ε-氨基，Lys的α-羧基与Lys的ε-氨基形成肽键。
23.具有氨基酸序列如下的多肽：
Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn(序列1)，或①具有至少与该序列有70％以上类似性②具有E-玫瑰花结活性的变体。在序列中，至少一个肽键是由Asp的β-羧基和Ala的α-氨基，一个肽键是由Asp的β-羧基和Thr的α氨基，一个肽键是由Asp的β-羧基和Leu的α-氨基构成，Glu的γ-羧基和Ile的α-氨基，Glu的α-羧基和Lys的ε-氨基，Glu的γ-羧基和Lys的α-氨基，Glu的γ-羧基和Lys的ε-氨基，Glu的γ-羧基和Val的α-氨基，Glu的γ-羧基和Glu的α-氨基，Glu的γ-羧基和Ala的α-氨基，Glu的γ-羧基和Asn的α-氨基，Thr的α-羧基和Lys的ε-氨基，Leu的α-羧基和Lys的ε-氨基，Lys的α-羧基和Lys的ε-氨基，β-Ala的羧基和Ala的α-氨基，β-Ala的羧基和Glu的α-氨基，β-Ala的羧基和Val的α-氨基所构成。
24.权利要求23中：
该氨基酸序列或变体中至少一个肽键是由Asp的β-羧基和Ala的α-氨基构成。
25.权利要求23中：
该氨基酸序列或变体中至少一个肽键是由Asp的β-羧基和Thr的α-氨基构成。
26权利要求23中：
该氨基酸序列或变体中至少一个肽键是由Asp的β-羧基和Leu的α-氨基构成。
27.权利要求23中：
该氨基酸序列或变体中至少一个肽键是由Glu的γ-羧基和Ile的α-氨基构成。
28.：权利要求23中：
该氨基酸序列或变体中至少一个肽键是由Glu的α-羧基和Lys的ε-氨基构成。
29.权利要求23中：
该氨基酸序列或变体中至少一个肽键是由Glu的γ-羧基和Lys的α-氨基构成。
30.权利要求23中：
该氨基酸序列或变体中至少一个肽键是由Glu的γ-羧基和Lys的ε-氨基构成。
31.权利要求23中：
该氨基酸序列或变体中至少一个肽键是由Glu的γ-羧基和Val的α-氨基构成。
32.权利要求23中：
该氨基酸序列或变体中至少一个肽键是由Glu的γ-羧基和Glu的α-氨基构成。
33.权利要求23中：
该氨基酸序列或变体中至少一个肽键是由Glu的γ-羧基和Ala的α-氨基构成。
34.权利要求23中：
该氨基酸序列或变体中至少一个肽键是由Glu的γ-羧基和Asn的α-氨基构成。
35.权利要求23中：
该氨基酸序列或变体中至少一个肽键是由Thr的α-羧基和Lys的ε-氨基构成。
36.权利要求23中：
该氨基酸序列或变体中至少一个肽键是由Leu的α-羧基和Lys的ε-氨基构成。
37.权利要求23中：
该氨基酸序列或变体中至少一个肽键是由Lys的α-羧基和Lys的ε-氨基构成。
38.权利要求23中：
该氨基酸序列或变体中至少一个肽键是由β-Ala的羧基和Ala的α-氨基构成。
39.权利要求23中：
该氨基酸序列或变体中至少一个肽键是由β-Ala的羧基和Glu的α-氨基构成。
40.权利要求23中：
该氨基酸序列或变体中至少一个肽键是由β-Ala的羧基和Val的α-氨基构成。
41.构成多肽的氨基酸序列如下：
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn(序列3)
此处一个肽键是由Asp的β-羧基和Ala的α-氨基，一个肽键是由Asp的β-羧基和Thr的α-氨基，一个肽键是由Asp的β-羧基和Leu的α-氨基构成。
42.构成多肽的氨基酸序列如下：
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn(序列3)此处一个肽键是由Asp的β-羧基和Ala的α-氨基形成。
43.构成多肽的氨基酸序列如下：
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn(序列3)此处一个肽键是由Asp的β-羧基和Thr的α-氨基形成。
44.构成多肽的氨基酸序列如下：
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn(序列3)
此处一个肽键是由Asp的β-羧基和Leu的α-氨基形成。
45.构成多肽的氨基酸序列如下：
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn(序列3)此处一个肽键是由Asp的β-羧基和Ala的α-氨基，一个肽键是由Asp的β-羧基和Thr的α-氨基形成。
46.构成多肽的氨基酸序列如下：
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn(序列3)
此处一个肽键是由Asp的β-羧基和Leu的α-氨基形成。
47.构成多肽的氨基酸序列如下：
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn(序列3)
此处一个肽键是由Asp的β-羧基和Thr的α-氨基，一个肽键是由Asp的β-羧基和Leu的α-氨基形成。
48.在哺乳动物中重组免疫功能的一种方法，该方法包括：施药给动物有效剂量产生免疫促进活性的化合物，该化合物的氨基酸序列如下：
X-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn(序列2)，或①至少有70％以上类似于该序列。②具有E玫瑰花结形成活性的氨基酸序列变体。
此处①X为乙酰基或氢，②在该氨基酸序列或变体中一个肽键是由Asp的β-羧基和Ala的α-氨基，Asp的β-羧基和Thr的α-氨基，Asp的β-羧基和Leu的α-氨基，Glu的γ-羧基和Ile的α-氨基，Glu的α-羧基和Lys的ε-氨基，Glu的γ-羧基和Lys的α-氨基，Glu的γ-羧基和Lys的ε-氨基，Glu的γ-羧基和Val的α-氨基，Glu的γ-羧基和Glu的α-氨基，Glu的γ-羧基和Ala的α-氨基，Glu的γ-羧基和Asn的α-氨基，Thr的α-羧基和Lys的ε-氨基，Leu的α-羧基和Lys的ε-氨基，Lys的α-羧基和Lys的ε-氨基，β-Ala的羧基和Ala的α-氨基，β-Ala的羧基和Glu的α-氨基，β-Ala的羧基和Val的α-氨基所构成。
49.具有下列结构式的一种化合物：
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn(序列3)
此处一个肽键是由Asp的β-羧基和Ala的α-氨基，一个肽键是由Asp的β-羧基和Thr的α-氨基，一个肽键是由Asp的β-羧基和Leu的α-氨基形成。
50.具有下列结构式的一种化合物：
Ac-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn(序列3)
此处一个肽键是由Asp的β-羧基和Ala的α-氨基形成。
51.具有下列结构式的一种化合物：
Ac-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn(序列3)
此处一个肽键是Asp的β-羧基和Thr的α-氨基形成。
52.具有下列结构式的一种化合物：
Ac-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn(序列3)
此处一个肽键是Asp的β-羧基和Leu的α-氨基形成。
53.具有下列结构式的一种化合物：
Ac-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn(序列3)
此处一个肽键是由Asp的β-羧基和Ala的α-氨基，一个肽键是由Asp的β-羧基和Thr的α-氨基形成。
54.具有下列结构式的一种化合物：
Ac-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn(序列3)
此处一个肽键是由Asp的β-羧基和Ala的α-氨基，一个肽键是由Asp的β-羧基和Leu的α-氨基形成。
55.具有下列结构式的一种化合物：
Ac-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn(序列3)
此处一个肽键是由Asp的β-羧基和Thr的α-氨基，一个肽键是由Asp的β-羧基和Leu的α-氨基形成。
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