CN1810986A - 一种预测降血压药物钙拮抗剂药效的方法及其应用 - Google Patents

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陈光亮
余运贤
邢厚恂
文育锋
徐希平
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Abstract

本发明涉及一种预测降压药药效的方法，特别用于通过测定功能基因多态性位点基因型，来预测钙拮抗剂类降压药药效的方法及其应用。该方法通过测定受试者的肾上腺素受体基因多态性位点的基因型，预测钙拮抗剂类降压药药效；同时根据ADR多态性对钙拮抗剂类降压药药效的影响，设计出调节ADR功能，以增强钙拮抗剂药效的复方药。本发明可指导医生根据个体差异进行药物选择，提高临床用药安全性和治疗的效率，降低发生药物毒副作用和经济负担的风险。

Description

一种预测降血压药物钙拮抗剂药效的方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种预测降压药药效的方法及其应用，特别用于通过测定功能基因多态性位点基因型，来预测钙拮抗剂类降压药药效的方法及其应用。属于医药领域。
背景技术
高血压病是我国和全球最常见的慢性疾病之一。我国18岁及其以上居民高血压患病率为18.8％，估计全国患病人数为1.6亿多。高血压是引起危及生命的心脑血管病如心肌梗死、脑卒中，以及肾脏功能不全等的主要原因。血压水平与心血管病发病率呈连续性相关。根据流行病学研究标准判断，血压升高是脑卒中和冠心病发病的独立危险因素，因此，有效控制血压对高血压患者机体健康具有重大影响，并具有重要临床意义。临床上用于治疗高血压的药物大致有六类，其中包括：利尿剂、β-受体阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)、血管紧张素II受体(AT1-R)拮抗剂、钙拮抗剂和α肾上腺素受体阻滞剂等。在我国和美国，高血压的血压控制率分别仅为8.1％和34％。这种血压的低控制率不仅与降压药物本身有关，更重要的是与临床上缺乏有效的预测系统有关。
临床上用于预测降压药物疗效的方法主要有两种，一种是医生经验性预测，医生首先会根据患者的一般性临床检查，经验性的选择一种降压药，当一段时期之后，发现疗效不好或副作用大，才会考虑加量或换药或合并用药；这种预测方法具有明显的滞后性及盲目性，患者往往需要事先忍受一段时间的痛苦。另一种预测方法是血压监测，而且已由静态发展为动态血压监测，可以实时有效监测血压，有资料提示动态血压监测反映的血压水平、昼夜节律与心、脑、肾靶器官损害程度之间有较好的相关性；但目前动态血压监测技术本身还有不少局限性，仍不是严格意义上的动态检测，动态血压值尚无统一标准，且检查费价格较贵，因此若在临床上广泛使用这项检查方法仍需积累更多的经验，并且这种监测只能粗略评价，而不能真正预测某一药物的降压作用，更不能给医生选择药物提供准确的个体化信息，医生用药仍然存在一定盲目性。因此，基于目前临床的预测方法，医生在用药时仍不能根据患者个体差异进行药物选择、配伍和剂量的确定，不能有效控制血压和避免毒副作用的发生，不同程度地增加患者的痛苦和经济负担。
药物作用的个体差异与环境因素及遗传因素有关。在家系和双生子研究中发现，约30％～60％的血压变异是由遗传因素造成的[Lancet，1994；344(8916)：169-71]，并且存在小部分的单基因遗传性高血压。药物遗传多态性表现为药物代谢酶的多态性、药物受体的多态性和药物靶标的多态性等，这些多态性的存在可能导致许多药物治疗中药效和不良反应的个体差异[Science，2000；287(5460)：1977-8][J Clin Invest，1994；94(5)：1872-82]。药物基因组学是基于药物反应的遗传多态性提出来的，是从基因水平揭示这些差异的遗传特征，鉴别基因序列中的差异，在基因水平研究药效的差异，并以药物效应及安全性为目标，研究各种基因突变与药效及安全性之间的关系。药物基因组学的研究不同于一般的基因学研究，不是以发现新的基因、探明疾病的发生机制、预见发病风险及诊断疾病为目的，而是研究遗传因素对药物效应的影响，确定药物作用的靶点，研究从表型到基因型的药物反应的个体多样性。
药物基因组学是继人类基因组计划完成之后，新兴的功能基因组研究的一个分支，它是基于基因多态性的DNA检测手段，如对一些疾病相关基因的单核苷酸多态性(SNP)检测，或对特定药物具有敏感性或抵抗性的患病人群进行SNP差异检测，能够预测患者将对某一特定的药物产生怎样的反应(疗效或副作用方面等)，进而优选出最佳的治疗方法，指导医生为患者拟定个体化的给药方案；另外，还有助于减少临床用药不当，提高疗效，降低医疗费用，具有极高的社会效益和卫生经济学意义。
许多与药物作用有关的基因已经被克隆和功能鉴定。目前研究最详细的是药物代谢相关的细胞色素酶P450(CYP)基因，它具有四种多态形式CYP1A1、CYP2C9、CYP2C19和CYP2D6，其对药物的影响各不相同。例如异烟肼治疗结核病患者[BMJ，1960；2：485-91]，具有编码N-乙酰转移酶(NAT1和NAT2)的基因多态性，NAT2等位基因会造成“慢乙酰化”的表型，使药物代谢缓慢，药物分子在体内停留的时间延长，以致发生肢端疼痛、麻痹和虚弱等不良反应；而对N-乙酰转移酶活性较高的“快乙酰化”的患者，因能快速将异烟肼转化，则不会发生这些毒副反应。硫嘌呤甲基转移酶(TPMT)[Clin Pharmacol Ther 1989；46：149-54.]是药物代谢酶中多态性的另一个典型的例子，TPMT影响硫嘌呤类药物的代谢：包括抗白血病药物6-巯基嘌呤，6-巯基鸟嘌呤和免疫抑制剂硝基咪唑硫嘌呤等等。TPMT活性对这些药的代谢十分重要，它决定这些药物的功效和毒性。如果患者遗传性缺乏硫嘌呤甲基转移酶(TPMT)，那么即使是硫嘌呤类药物的标准剂量，也会对他们产生严重的、甚至可危及生命的白细胞毒性。
药物基因组研究已经阐明一些药物靶向的基因多态性与特定药物作用之间的关系。如胆固醇酯酰基转运蛋白(CETP)基因中的一个多态性对冠心病患者服用普伐他汀的临床疗效起着决定性的作用。β-肾上腺素受体基因多态性可以影响哮喘患者对于β-受体激动剂(如舒喘宁)的敏感程度，即携带有甘氨酸-16密码子的哮喘患者与携带精氨酸-16密码子者相比，他们对β-受体激动剂的反应要强；5-羟色胺神经递质受体基因中的多态性与氯氮平的药效相关，即在该受体基因核苷酸序列中，第12位上有胸腺嘧啶-胞嘧啶转化的患者尤其容易对氯氮平产生应答。
第一批DNA水平的检测方法已经进入临床，为新药推广而设计的检测方法，许多医药公司正在开发中。这些检测方法的建立，代表了人类向个体化治疗方案迈进的第一步。在急性淋巴细胞性白血病(ALL)的有效临床治疗方面，基因学试验已经证实，硫嘌呤甲基转移酶(TPMT)的重要作用。把TPMT缺乏者的6-巯基嘌呤的量降至常用量的1/10～1/15以下，其临床疗效与TPMT活性正常者服用常规剂量相近，既安全又有效，极大的减少了这部分患者因服用6-巯基嘌呤造成的毒性反应和伤害。St.Jude儿童研究医院已经开发了此种药物基因组学预测方法，该方法使得医生们能根据患者是否具有与TPMT相关的等位基因遗传性缺陷，预测到该患者TPMT的活性水平。并根据TPMT活性水平的正常、不足和缺乏，将患者进行分类。基因型和表型的一致性接近100％。患者中，大约90％的白种人和黑种人被划为TPMT正常活性者，他们接受传统的治疗剂量；其余10％的患者属于TPMT活性不足和缺乏者。为了避免对他们产生毒性，有针对性地降低了用药剂量。TPMT基因预测方法在St.Jude儿童研究医院已被列为常规性检查项目。
根据药物基因组学研究开发出的乳腺癌相关基因检测试剂盒(Oncotype DXTM)已在美国加利福尼亚州批准上市。该试剂盒由Genomic Health公司生产，用于诊断乳腺癌的复发率和患者对化疗药物的反应性(Science 2004 303：1754-1755)。它是转移性乳腺癌接受化疗药物trastuzumab(Herceptin)治疗前的一个必需检测的项目。此外，人表皮生长因子受体2蛋白(HER2)的过度表达会加速肿瘤的形成与转移，并影响患者对化疗药物的耐药性。通过检测HER2受体基因多态性，也可作为预测某个患者是否会对trastuzumab产生反应的方法。
目前发现原发性高血压涉及到的相关基因已超过70个，不同的基因导致的药物疗效对高血压患者有差别。多数研究集中于观察基因多态性对降压药物治疗引起的心血管反应的影响。例如，携带α-adducin基因460W等位子的高血压患者[Lancet，1997；349(9062)：1353-7]，与应用其他类降压药治疗相比，利尿剂治疗出现心肌梗死和中风的几率降低。在降压作用方面[Drugs，2004；64(16)：1801-1816]，发现一氧化氮合酶(NOE)基因多态性和利尿剂、α-adducin基因多态性和利尿剂、G蛋白α-亚型基因多态性和β肾上腺素受体阻滞剂、ACE基因多态性和血管紧张素II受体(AT1-R)拮抗剂等都存在相互作用。ACE插入缺失的多态性与ACEI存在相互作用，表现为不同基因型在AT1受体蛋白的mRNA表达、左心室肥大、动脉硬化等方面的差异。
一项用于预测ACEI类降压药药效的方法已于2002年申请专利，专利申请号为02123875.8，公开号为CN1465712A。药物基因组学研究发现，携带MS基因919Asp等位子的高血压患者，服用苯那普利后的降压幅度大[J Hum Genet.2004；49_(6)：296-301.Epub 2004 May 18.]；通过测定受试者的MS基因Asp919Gly多态性位点基因型，可以预测ACEI类降压药降压作用。
钙拮抗剂用于治疗高血压已经有30年的历史，通过降低血管平滑肌细胞内的游离钙浓度，使血管扩张，血压下降，还能抑制血小板聚集，增强红细胞在缺氧的情况下的变形能力，对脂代谢无不良影响。临床上有效治疗各种程度高血压，尤其是老年高血压或合并心绞痛的患者。常用钙拮抗剂分为二氢吡啶类和非二氢吡啶类，前者包括氨氯地平(amlodipine)、非洛地平(felodipine)、伊拉地平(isradipine)、尼卡地平(nicardipine)、硝苯地平(nifedipine)、尼索地平(nisoldipine)、尼群地平(nitrendipine)、拉西地平(lacidipine)；后者包括地尔硫卓(diltiazem)和维拉帕米(verapamil)。
钙拮抗剂在临床应用上存在一定问题。在对6321例患者为期三年的INSIGHT研究显示，钙拮抗剂拜新同R(硝苯地平控释片)有效率为73％，在心血管病事件死亡率和发病率上拜新同组并不比利尿剂组好；心衰、癌症发病率在拜新同组显著高于利尿剂组。(Hypertension，2003，41(3)：431-6.Epub，2003 Feb 17)。1995年美国Furberg研究认为(Circulation，1995，92(5)：1326-31.)钙拮抗剂尤其是短效的钙拮抗剂可增加冠心病发病甚至死亡的危险，也可增加癌症和消化道出血的危险。钙拮抗剂对糖尿病患者和肾脏保护没有明显益处。2002年Pahor等(Lancet，2000，356(9246)：1949-54)荟萃分析9项试验，以钙拮抗剂与其他一线降压药物对总共27 743例患者达到同样收缩压、舒张压控制水平，认为急性心肌梗死、心力衰竭及主要心血管事件危险，钙拮抗剂明显高于利尿剂、β-受体阻滞剂、ACEI或可乐定。钙拮抗剂常见不良反应为下肢(尤其是踝关节)水肿；由于血管扩张作用，可有颜面潮红；反射性心率加快多见于短效二氢吡啶类钙拮抗剂，在用长效二氢吡啶类钙拮抗剂时少见。另外还出现血压升高，肝功能异常，味觉缺失，齿龈增生，耳鸣，耳痛，阳萎，尿潴留，全身性瘙痒等[张家口医学院学报，2003，04：48～49]。尽管存在上述问题，但钙拮抗剂仍然是临床常用降压药物之一。可见，钙拮抗剂在临床疗效和副作用上存在着不同表现，这可能是由于钙拮抗剂个体差异性大所致；并且由于缺少可预测药物疗效及副作用的指示系统，所以医生在用药时不能根据个体差异进行选择药物、配伍和确定剂量，相对降低了临床用药、治疗的效率和安全性，增加了发生毒副作用和经济负担的风险。
已有药物基因组学研究中，有三项涉及到钙拮抗剂降压药。一项研究发现[Hypertension，1996；28(1)：98～103]ACE基因多态性与钙拮抗剂有相互作用，携带I等位子的患者，AT1受体蛋白的mRNA表达降低。又一项研究发现[Hypertension，1996；28(6)：1081～4]，服用钙拮抗剂后2个月，带有血管紧张素1型受体(AT1R)基因1166A/C多态性中的A等位子的患者，其动脉硬化的发生率降低。另外，没有发现血管紧张素基因M235T多态性与钙拮抗剂在降压作用方面的相互作用[J Hypertens，1996；14(2)：259～62]。
发明内容
由于存在药物反应的个体差异，医生选药时无法量体裁衣的选择配伍和剂量，不能有效控制血压和控制毒副作用的发生，可能延误治疗时机，造成患者经济损失。
本发明克服上述不足，尤其克服在临床选择钙拮抗剂用药时的盲目性，为个体化用药提供一种预测钙拮抗剂类降压药药效的方法，即通过测定受体基因多态性位点基因型来预测钙拮抗剂类降压药的药效。
为实现上述发明目的，采取以下技术方案：
一种预测钙拮抗剂药效的方法，该方法通过采集受试者的生物样本，测定受试者的肾上腺素受体基因多态性，预测钙拮抗剂药效。
所述肾上腺素受体包括α型肾上腺素受体和β型肾上腺素受体；所述α型肾上腺素受体，包括1a亚型(α1a)、1b亚型、1d亚型、2a亚型、2b亚型和2c亚型；所述β型肾上腺素受体，包括β1亚型、β2亚型和β3亚型。
所述肾上腺素受体基因优先为肾上腺素受体α型基因。
所述肾上腺素受体α型基因优先为肾上腺素受体α型1a基因。
一种预测钙拮抗剂药效的方法，其特征在于：该方法通过采集受试者的生物样本，测定受试者的肾上腺素受体α1a基因Arg347Cys多态性，预测钙拮抗剂药效：
a)肾上腺素受体α1a基因型为347Arg/Arg纯合野生型时，预测钙拮抗剂的降压作用差；
b)肾上腺素受体α1a基因型为347Arg/Cys杂合子或347Cys/Cys纯合突变时，预测钙拮抗剂的降压作用好。
一种预测钙拮抗剂药效的方法，其特征在于：该方法通过采集受试者的生物样本，测定受试者的肾上腺素受体β1基因Arg389Gly多态性，预测钙拮抗剂药效：
a)肾上腺素受体β1基因型为389Arg/Arg纯合野生型时，预测钙拮抗剂的降压作用差；
b)肾上腺素受体β1基因型为389Arg/Gly杂合子或389Gly/Gly纯合突变时，预测钙拮抗剂的降压作用好。
一种预测钙拮抗剂药效的方法，其特征在于：该方法通过采集受试者的生物样本，测定受试者的肾上腺素受体β2基因Gln27Glu多态性，预测钙拮抗剂药效：
a)肾上腺素受体β2基因型为27Gln/Gln纯合野生型时，预测钙拮抗剂的降压作用好；
b)肾上腺素受体β2基因型为27Gln/Glu杂合子或27Glu/Glu纯合突变时，预测钙拮抗剂的降压作用差。
上述测定肾上腺素受体基因多态位点基因型所采用的方法选自PCR、基因芯片、基因测序、基因扫描、Taqman等生物检测方法，或制成试剂盒、试纸等快速检测载体中的一种。PCR、基因芯片、基因测序、基因扫描基因型检测方法是本领域技术人员常规使用的方法，Taqman技术是一种运用荧光技术实时定量PCR的方法，具体操作过程见本发明实施例1。其中优选的检测方法为PCR或Taqman技术。
所述受试者的生物样本为血液样本、口腔粘膜试子、唾液样本和尿液样本中的一种。其中，优选的生物样本为血液样本。
所述的钙拮抗剂类降压药为氨氯地平、非洛地平、伊拉地平、尼卡地平、硝苯地平、尼索地平、尼群地平、拉西地平、地尔硫卓、维拉帕米及其活性代谢产物或盐类中的一种。其中硝苯地平和氨氯地平是钙拮抗剂类降压药中常用的、具有代表性的药物。
上述预测钙拮抗剂药效的方法可以进一步在药物研发中应用。可以根据肾上腺素受体多态性基因型对钙拮抗剂类降压药药效的影响，设计出调节肾上腺素受体功能可增强钙拮抗剂药效的复方药，所述复方药由选择性或非选择性的肾上腺素受体阻滞剂和钙拮抗剂组成。
本发明的是基于多年的药物基因组学研究。研究时，给高血压患者服用拜新同进行治疗。拜新同是硝苯地平控释片，硝苯地平为二氢吡啶类L型电压依赖性钙拮抗剂，它可阻止钙离子流入血管的平滑肌细胞，使细胞内钙降低，血管扩张，临床用于降压治疗。拜新同可在24小时内恒速释放硝苯地平(持续释放)，因此适用于每日服药一次，常用剂量为30-60mg，临床广泛用于治疗轻、中度高血压病。
本发明中研究的基因多态性是α1a肾上腺素受体基因多态性。α1a肾上腺素受体是α肾上腺素受体的三个亚型之一，ADRα1a是动物和人体内参与周围血管阻力和体循环动脉压调节的主要亚型[Proc Natl Acad Sci USA.2002；99(14)：9474-9.Epub 2002 Jul 01]。ADRα1a基因的一个多态性表现是第1441个核苷酸C到T的突变，导致多肽链第347位精氨酸(Arg)被半胱氨酸(Cys)替代，该多态位点在ADRα1a羧基末端与G蛋白偶联是氨基酸的酰化位点，对细胞的定位和功能具有重要的作用[Br J Pharmacol.1996；118(6)：1403-8.]。α1a肾上腺素受体广泛的分布在人类的动静脉血管系统中。在不同种族的人群中α1a肾上腺素受体347Cys等位子的分布频率存在差异，其中白人是53.8％、黑人29.5％、日本人10％。
本发明涉及的研究发现：
在已知ADRα1a基因的Arg347Cys多态性情况下，高血压病人经钙拮抗剂类药治疗后，在服药后第16天，347Cys等位子携带的个体的降压作用显著好于347Arg/Arg野生纯合型等位基因携带者。提示ADRα1a基因Arg347Cys多态性和钙拮抗剂类的降压作用有关；ADRα1a基因的基因型，作为预测钙拮抗剂类抗高血压药物的指示系统之一，可以指示并定性和定量地预测钙拮抗剂类降压药的药效，指导临床医生个体化用药。
ADRα1a基因的基因型，作为预测钙离子拮抗剂类抗高血压药物的指示系统之一：可以指示ADRα1a基因多态性对应的代谢(酶)活性/功能状态，作为新药的功能靶点，指导复方降压药物的研发；并可以指示结合研制的复方降压药物，更合理选择钙离子拮抗剂类药物的个体最适剂量和最适复合药物的配伍。
人类β肾上腺素受体(βARs)属Gs蛋白耦联受体超家族成员，在心血管的功能和疾病中起重要作用，通过神经激素去甲肾上腺素和肾上腺素发挥作用。β1AR和β2AR的激活导致心肌的正性肌力和正性变时作用。β1AR主要分布于心脏，代表了80％的心肌细胞βAR。肾脏的β1AR和β2AR激活肾素的释放，从而活化肾素—血管紧张素—醛固酮系统。β2AR还存在于动脉，激活后导致血管舒张。β3AR最近被报道，认为本质上主要与代谢有关，也可能与catecholamines对心脏的负性肌力作用有关[Can J.Physiol.Pharmacol.2000；78：681-690.]。
β1AR无内含子，定位于10q24-26。属于G蛋白偶联受体超家族成员，包括胞外氨基端，7个跨膜区和胞内羧基端。β1AR的基因多态性存在多位点，已经报道14种多态性，其中5种属于无意突变。其中，肾上腺素受体β1基因，第389位氨基酸由精氨酸突变为甘氨酸(Arg389Gly)，携带Arg389个体的腺苷酸环化酶的活性轻度升高；对激动剂的结合能力强；最大异丙肾上腺素刺激水平高。
人类β2肾上腺素受体属G蛋白耦联受体超家族成员，分子量为6400D，是第一个被克隆的腺苷环化酶连接受体，由413个氨基酸，组成7簇疏水基团。为跨膜螺旋区，每个跨膜螺旋区由20～30个氨基酸组成，N-端在胞外，含有两个糖基化的天冬酰胺，C-端在胞内，为3个环状结构。其基因序列已被克隆、测序，定位于5q31-32。[Kobilka BK，et al.ProcNatl Acad Sci USA，1987，84：46-50.]，并具有两个显著的特点：无内含子的基因和有两个高效的启动子[Kobilka BK etal.J Biol Chem，1987，262(15)：7321-7327.]。β2-AR与β2激动剂结合发挥作用，松弛支气管平滑肌细胞。
人类β2AR基因与野生型比较含有9个位点突变，其中4个属非退化性位点突变，并产生了氨基酸的改变(Arg-Gly 16，Gln-Glu 27，Val-Met 34，Thr-Ile 164)。其中三个突变位点(16、27、164)可致受体功能变化，Ile 164表现为与腺甘环化酶偶联功能下降，Gly 16可增强激动剂诱导的受体反应性下降，Gln 27则显示对激动剂诱导的受体反应性下降有抵抗性。β2AR基因启动子区也发现存在多态性改变，它们位于β2AR编码区5’端的1470bp内，共有8种多态性(-20T～C，-47T～C，-367T～C，-468C～G，-654G～A，-1023G～A，-1343A～G，-1429T～A)，并且发现某些突变可改变下游区β2AR编码区的基因表达。
本发明涉及的研究发现：
在已知ADRβ1基因的Arg389Gly和ADRβ2基因的Gln27Glu多态性情况下，高血压病人经钙拮抗剂类药治疗后，在服药后第16天，389Gly等位子携带的个体的降压作用较389Arg/Arg野生纯合型等位基因携带者有增强趋势，27Gln/Gln野生纯合型等位基因携带的个体的降压作用较27Glu等位子携带者有增强趋势。提示ADRβ1基因Arg389Gly、ADRβ2基因Gln27Glu多态性分别和钙拮抗剂类的降压作用有关；ADRβ基因的基因型，作为预测钙拮抗剂类抗高血压药物的指示系统之一，可以指示并定性和定量地预测钙拮抗剂类降压药的药效，指导临床医生个体化用药。
ADRβ基因的基因型，作为预测钙离子拮抗剂类抗高血压药物的指示系统之一：可以指示ADRβ基因多态性对应的代谢(酶)活性/功能状态，作为新药的功能靶点，指导复方降压药物的研发；并可以指示结合研制的复方降压药物，更合理选择钙离子拮抗剂类药物的个体最适剂量和最适复合药物的配伍。
本发明提供了利用功能基因预测钙拮抗剂类抗高血压药物疗效的一种方法，可作为钙拮抗剂类降压药药效的指示系统，通过测定ADR功能基因多态位点基因型，预测钙拮抗剂类降压药疗效。根据ADR多态性基因型，设计出通过调节ADR功能，明显增强钙离子拮抗剂药效的复方药。便于医生在用药时根据个体差异进行选择，提高了临床用药和治疗的效率与安全性，降低了发生毒副作用的风险和经济负担。本发明通过测定基因型，指导新药研发形成一组钙离子拮抗剂类复合新药，特别对于目前治疗效果不佳的患者，提供了更好的选择。应用这类功能基因多态性的发明成果，对今后更加经济有效地指导抗高血压药物的临床选药、预测用药疗效和指导新药研制具有产业与服务的应用价值。
具体实施方式
实施例1：测定ADRα1a基因Arg347Cys多态性位点并预测钙拮抗剂类降压药硝苯地平的降压作用
(一)测定ADRα1a基因的Arg347Cys多态位点基因型：
(1)提取宿主细胞的基因组DNA：
(a)在全血中加入30ml红细胞裂解液，缓慢摇匀，室温静置10分钟，期间，摇动数次，彻底裂解红细胞；
(b)于4℃、2000转离心/分，10分钟，去上清，将沉淀之白细胞在旋转震荡器上打散，加蛋白酶40ul、RNA酶50ul，摇匀，加白细胞裂解液置15ml，混匀37℃水浴20分钟后取出，置冷水中；
(c)加冷的蛋白沉淀液4ml，混匀后放在-20℃冰箱5分钟，取出于4℃、3000转/分离心10分钟。将上清液倒入已加好15ml异丙醇的50ml离心管中缓慢摇动数次，至DNA絮状物析出；
(d)将析出的DNA絮状物移至另一1.5ml已装入75％乙醇的滤纸上，使液体挥发干。
(e)加DNA水化液1.5ml，置摇床，摇动过夜，备用；
(f)DNA浓度的测定采用紫外分光光度法，分别测定260nm及280nm两个波长下的OD值，以OD260nm×50所得值为DNA浓度。并以OD260nm/OD280nm比值估计DNA纯度；
(2)使用Taqman方法检测Arg347Cys多态位点基因型
(a)用PCR仪扩增ADRα1a功能基因多态位点及其侧翼序列，在5ul PCR反应体系中含有基因组DNA 10ng，2.5ul的Taqman_2X Universal PCR Master Mix No AmpEraseUNG(组成成份包括：AmpliTaq Gold DNA Polymerase，dNTPs with Dutp，PassiveReference，以优化的缓冲液)，及0.72uM的正向引物，0.72uM的反向引物及两段带荧光报告集团的等位基因特异性探针各0.16uM。
引物序列为
正向引物：5’GGTGTAGCCCAGGGCATGTT 3’
反向引物：5’CCATGCTCCAGCCAAGAGTTC 3’
等位基因特异性探针的序列为：
VIC-5’TGCTTTCTGCAGAGACA3’-NFQ，
对应于“A(或Cys)”等位基因，携带VIC荧光报告集团。
FAM-5’TCTGCGGAGACACTG3’-NFQ
对应于“G(或Arg)”等位基因，携带FAM荧光报告集团。
PCR反应条件：
95℃10min，1个循环；
92℃15s，
60℃1min，
50个循环
(b)在7900型荧光定量PCR仪上检测荧光信息
将完成PCR反应的PCR板放入7900型荧光定量PCR仪上，选用“AllelicDiscrimination”程序，进行扫描与结果的判断：
发出FAM荧光者的基因型为Arg/Arg纯合子；
发出VIC荧光者的基因型为Cys/Cys纯合子；
发出两种荧光者的基因型为Arg/Cys杂合子。
(二)、预测药效：
基因型为347Arg/Arg纯合野生型时，钙拮抗剂类降压药药效的降压作用较小；
基因型为347Arg/Cys杂合子或347Cys/Cys纯合突变时，钙拮抗剂类降压药药效的降压作用较大。
以上方法通过临床验证，先将高血压病人分为三组：纯合野生型组、杂合子型组、纯合突变型组，分别给予拜新同16天，观察其降压作用，结果如下：
在高血压病人服用拜新同后第16天的收缩压(SBP)和舒张压(DBP)降压效果在Arg347等位子携带个体中显著高于347Arg/Arg纯合子(P＜0.05)，提示ADRα1a基因Arg347Cys多态性和拜新同的降压作用有关(见表1)。
表1拜新同的降压作用与ADRα1a基因Arg347Cys多态位点的关系
Genotype Number Mean±SD           adjusted
  β*   SE   P
  SBP Reduction   CC   348   27.5±15.5
  CT+TT   89   32.5±14.0   4.3   1.5   0.004
  DBP Reduction   CC   348   10.6±7.5
  CT+TT   89   12.5±7.8   1.4   0.8   0.057
注：调整了性别、年龄、BMI、吸烟、饮酒、血药浓度和基线血压等因素。CC，代表347Arg/Arg纯合野生型；CT+TT，代表347Arg/Cys杂合子和347Cys/Cys纯合突变型。
实施例2.测定ADRβ1基因Arg389Gly多态性位点并预测钙拮抗剂类降压药硝苯地平的降压作用
(一)测定ADRβ1基因的Arg389Gly多态位点基因型：
(1)提取宿主细胞的基因组DNA：
在标准的操作规程的基础上，用盐沉淀法，抽提唾液细胞中基因组DNA。DNA放-20℃保存。
(2)使用PCR和限制性酶切片断长度多态性分析方法(PCR-RFLP)检测多态位点。
根据ADRA1B基因序列设计PCR特异性引物，包括PCR正向引物和PCR反向引物，按如下条件进行常规PCR扩增。
引物序列：
Sense：5’-GTCTTCTTCAACTTGCTGGG-3’
Antisense：5’-CCTGCGCGCGCAGCAGAGCGGTC-3’
PCR反应体系：
Genomic DNA 45ng，上下游引物10pmol(20umol/L)，dNTPs 2.0mmol/l，10×buffer(without Mg2+)1.0ul，Gold Taq DNA polymerase 3U，ddH2O补足总体积至10ul。
PCR反应条件(Touchdown程序)：
95℃预变性10min后，第一阶段：94℃变性30sec，61℃退火30sec，72℃延伸30sec，每循环退火温度下降0.5℃，10循环后，退火温度降至56℃；第二阶段：完成35个恒定循环程序，即94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸30sec，最后72℃延伸7min。最后得到111bp的片断。
酶切条件及体系(15ul)：
PCR产物10ul，10×NEBuffer#4 1.5ul，Ave II内切酶4U(0.4ul)，和3.1ul ddH2O，37℃过夜。
基因型分析：
将DNA酶切后的产物点样在3.5％琼脂糖胶上，200V电压下电泳1小时后，在紫外灯下读取胶图并进行基因型分析。个体基因型鉴定如下：
酶切片断为111bp，ADRβ1基因型为Arg/Arg；
酶切片断为111+87+24bp，ADRβ1基因型为Arg/Gly；
酶切片断为87+24bp，ADRβ1基因型为Gly/Gly。
(二)、预测药效：
肾上腺素受体β1基因型为389Arg/Arg纯合野生型时，预测钙拮抗剂的降压作用差；
肾上腺素受体β1基因型为389Arg/Gly杂合子或389Gly/Gly纯合突变时，预测钙拮抗剂的降压作用好。
以上方法通过临床验证，先将高血压病人分为三组：纯合野生型组、杂合子型组、纯合突变型组，分别给予拜新同16天，观察其降压作用，结果如下：
在高血压病人服用拜新同后第16天的收缩压(SBP)和舒张压(DBP)降压效果389Gly等位子携带的个体的降压作用较389Arg/Arg野生纯合型等位基因携带者有增强趋势，提示ADRB1基因Arg389Gly多态性和拜新同的降压作用有关(见表2)。
           表2拜新同的降压作用与ADRβ1基因Arg389Gly多态位点的关系
Genotype Number Mean±SD             adjusted
  β*   SE   P
  SBP Reduction   CC   244   27.6±15.3
  CG   163   29.4±16.1   1.8   1.2   0.140
  GG   31   30.3±10.5   2.6   2.3   0.262
  DBP Reduction   CC   244   10.4±7.6
  CG   163   11.5±8.0   0.5   0.6   0.469
  GG   31   11.3±5.8   0.2   1.2   0.897
注：调整了性别、年龄、BMI、吸烟、饮酒、血药浓度和基线血压等因素。CC，代表389Arg/Arg纯合野生型；CG，代表389Arg/Gly杂合子；GG，代表389Gly/Gly纯合突变型。
实施例3测定ADRβ2基因Gln27Glu多态性位点并预测钙拮抗剂类降压药硝苯地平的降压作用
(一)DNA提取和多态位点基因型测定方法同实施例1，其中
引物序列为
正向引物：5’-CGGCAGCGCCTTCTTG-3’
反向引物：5’-AGGACGATGAGAGACATGACGAT-3’
等位基因特异性探针的序列为：
VIC-5’TCGTCCCTTTGCTGCGTG 3’-NFQ，
对应于“Gln”等位基因，携带VIC荧光报告集团。
FAM-5’TCGTCCCTTTCCTGCGTG 3’-NFQ
对应于“Glu”等位基因，携带FAM荧光报告集团。
(二)、预测药效：
基因型为27Gln/Gln野生纯合型时，钙拮抗剂类降压药药效的降压作用较好；
基因型为27Gln/Glu杂合子或27Glu/Glu纯合突变时，钙拮抗剂类降压药药效的降压作用较小。
以上方法通过临床验证，先将高血压病人分为三组：纯合野生型组、杂合子型组、纯合突变型组，分别给予拜新同16天，观察其降压作用，结果如下：
在高血压病人服用拜新同后第16天的收缩压(SBP)和舒张压(DBP)降压效果在27Gln/Gln野生纯合型等位基因携带的个体的降压作用较27Glu等位子携带者有增强趋势，提示ADRβ1基因Arg389G1y多态性和拜新同的降压作用有关。(见表3)。
          表3拜新同的降压作用与ADRβ2基因Gln27Glu多态位点的关系
Genotype Number Mean±SD           adjusted
  β*   SE   P
  SBP Reduction   CC   358   28.9±15.3
  CG±GG   84   26.4±15.1   -1.3   1.5   0.402
  DBP Reduction   CC   358   11.2±7.8
  CG±GG   84   9.7±6.8   -0.8   0.8   0.313
注：调整了性别、年龄、BMI、吸烟、饮酒、血药浓度和基线血压等因素。CC，代表27Gln/Gln纯合野生型；CG+GG，代表27Gln/Glu杂合子和27Glu/Glu纯合突变型。
实施例4.硝本地平联用多沙唑嗪的协同降压作用
用0.2mm银夹狭窄Wistar大鼠左肾动脉，8～10周后大鼠血压升高超过150mmHg以上为高血压动脉模型。将高血压大鼠随机分组，分别为模型组(给溶媒)、硝苯地平组(2.0mg/kg)、硝苯地平+多沙唑嗪组(2.0+0.3)mg/kg、多沙唑嗪组(0.3mg/kg)，另设正常对照组。灌胃给药，连续2周。分别测定给药前和给药后第14天大鼠血压，计算降压百分率：(SBP给药前—SBP给药后)/SBP给药前×100，结果见表4。
结果表明：多沙唑嗪单独应用对二肾一夹型高血压大鼠有轻度降压作用，降压率为10.5±6.4％，硝苯地平2.0mg/kg灌胃给药，对二肾一夹型高血压大鼠有显著降压作用，降压率为18.2±5.6％；与多沙唑嗪合用后，降压率为32.3±7.4％。
结论：多沙唑嗪与硝苯地平合用，可以增强硝苯地平的降压作用。
表4硝苯地平+多沙唑嗪灌胃给药连续2周，对二肾一夹型高血压
          大鼠的降压作用(x±s，n＝12)
组别   剂量(mg/kg)   给药前血压(mmHg)   第14天降压百分率(％)
  正常组   -   110.0±10.5   2.6±1.8
  模型组   -   188.0±33.5   -2.0±6.2
  硝苯地平   2.0   185.4±35.2   18.2±5.6**
  多沙唑嗪   0.3   178.5±24.3   10.5±6.4**
  硝苯地平+多沙唑嗪   2.0+0.3   183.2±33.9   32.3±7.4**▲▲
与模型组比较，**P＜0.01；与硝苯地平组比较▲▲P＜0.01

Claims (14)

1.一种预测钙拮抗剂药效的方法，该方法通过采集受试者的生物样本，测定受试者的肾上腺素受体基因多态性，预测钙拮抗剂药效。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述肾上腺素受体基因为肾上腺素受体α型基因。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述肾上腺素受体α型基因为肾上腺素受体α1a亚型基因。
4.一种预测钙拮抗剂药效的方法，其特征在于：该方法通过采集受试者的生物样本，测定受试者的肾上腺素受体α1a基因Arg347Cys多态性，预测钙拮抗剂药效：
a)肾上腺素受体α1a基因型为347Arg/Arg纯合野生型时，预测钙拮抗剂的降压作用差；
b)肾上腺素受体α1a基因型为347Arg/Cys杂合子或347Cys/Cys纯合突变时，预测钙拮抗剂的降压作用好。
5.一种预测钙拮抗剂药效的方法，其特征在于：该方法通过采集受试者的生物样本，测定受试者的肾上腺素受体β1基因Arg389Gly多态性，预测钙拮抗剂药效：
a)肾上腺素受体β1基因型为389Arg/Arg纯合野生型时，预测钙拮抗剂的降压作用差；
b)肾上腺素受体β1基因型为389Arg/Gly杂合子或389Gly/Gly纯合突变时，预测钙拮抗剂的降压作用好。
6.一种预测钙拮抗剂药效的方法，其特征在于：该方法通过采集受试者的生物样本，测定受试者的肾上腺素受体β2基因Gln27Glu多态性，预测钙拮抗剂药效：
a)肾上腺素受体β2基因型为27Gln/Gln纯合野生型时，预测钙拮抗剂的降压作用好；
b)肾上腺素受体β2基因型为27Gln/Glu杂合子或27Glu/Glu纯合突变时，预测钙拮抗剂的降压作用差。
7.如权利要求1～6中任一所述的方法，其特征在于：所述测定肾上腺素受体基因多态位点基因型，采用的方法选自PCR、基因芯片、基因测序、基因扫描、Taqman等生物检测方法，或制成试剂盒、试纸等快速检测载体中的一种。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述的方法为PCR或Taqman生物检测方法。
9.如权利要求1～6中任一所述的方法，其特征在于：所述受试者的生物样本为血样、口腔粘膜试子、唾液样本和尿样中的一种。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述的生物样本为血样。
11.如权利要求1～6中任一所述的方法，其特征在于：所述的钙拮抗剂类降压药选自氨氯地平、非洛地平、伊拉地平、尼卡地平、硝苯地平、尼索地平、尼群地平、拉西地平、地尔硫卓、维拉帕米及其活性代谢产物或盐类中的一种。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于：所述的钙拮抗剂类降压药为氨氯地平或硝苯地平。
13.权利要求1～6中所述的方法在药物研发中的应用。
14.如权利要求13所述的应用，其特征在于：所述的应用是指根据肾上腺素受体多态性基因型对钙拮抗剂类降压药药效的影响，设计出调节肾上腺素受体功能可增强钙拮抗剂药效的复方药，所述复方药由选择性或非选择性的肾上腺素受体阻滞剂和钙拮抗剂组成。
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