CN1802433A - 序列 - Google Patents

Abstract

本发明公开了有关吡喃邻酮醛糖脱水酶的序列信息。本发明还涉及吡喃邻酮醛糖脱水酶在从AF向APP和薄闭壳素转化及从葡糖醛酮向蓝草菌酮转化中的应用。

Description

序列

发明领域

本发明涉及序列。具体而言，本发明涉及吡喃邻酮醛糖(pyranosone)脱水酶的氨基酸序列，及编码它的核酸序列。

技术背景和现有技术

文献中记载过葡萄糖可被吡喃糖2-氧化酶(EC 1.1.3.10，P2O)氧化形成葡糖醛酮(D-arabino-hexos-2-ulose)，然后被吡喃邻酮醛糖脱水酶(PD)转化成蓝草菌酮(cortalcerone)[Koths，K.；Halenbeck，R.；Moreland，M.(1992)，Carbohydr Res.Vol.232 No.1，59-75页；Gabriel，J.；Volc，J.；Sedmera，P.；Daniel，G.；Kubatova，E.(1993)，Arch.Microbi.，160：27-34]。P2O和PD已经在真菌中纯化，P2O已被克隆。PD已经由Koths等(1992)从卵形多孔菌(Polyporus obtusus)纯化，并由Gabriel等(1993)从黄孢原毛平革菌(黄孢原毛平革菌)纯化。然而，迄今为止，还没有描述过PD的氨基酸或核苷酸序列。

现有技术中已经公开了淀粉可被转化成1，5-脱水-D-果糖(AF)[S.Yu和J.Marcussen，Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering；Gilbert，H.J.；Davies，G.J；Henrissat B.；Svensson，B.，Eds.；RoyalSociety of Chemistry(RS.C)Press，1999.242-250]。而且进一步显示很多真菌和红藻提取物都可将AF酶转化成薄闭壳素，但还没有分离，纯化或描述过所涉及的酶[Baute，M-A.；Deffieux，G.；Baute，R.(1986)，Phytochemistry(Oxf)vol.25：1472-1473；Broberg，A.，Kenne，L.，和Pedersén，M.(1996)，Phytochemistry(oxf).41：151-154]。迄今为止，还没有暗示表明PD可在AF向薄闭壳素的转化中起作用。

而且还记载了子囊吡喃酮(ascopyrone)P(APP)可从AF产生[Baute，M-A.；Deffieux，G.；Vercauteren，J.；Baute，R.；Badoc，A.(1993)，Phytochemistry(oxf)vol.33 no.1，41-45]。又，没有证据表明PD涉及该过程。

发明概述

从大方面讲，本发明涉及编码吡喃邻酮醛糖脱水酶的氨基酸序列及核苷酸序列的描述。

本发明另一方面涉及先前未公开的吡喃邻酮醛糖脱水酶的应用，包括AF向薄闭壳素和APP的转化，以及葡糖醛酮向蓝草菌酮的转化。

本发明各方面是在权利要求和下列说明中给出的。

简言之，本发明的一些方面涉及：

1.一种新的氨基酸序列

2.一种新的核苷酸序列

3.制备所述氨基酸序列的方法

4.制备所述核苷酸序列的方法

5.含有所述核苷酸序列的表达系统

6.表达所述核苷酸序列的方法

7.含有所述核苷酸序列的转化宿主/宿主细胞

8.所述氨基酸序列的应用

9.所述核苷酸序列的应用

本发明所用的术语“表达”，“被表达的”和“可表达的”分别与术语“转录”，“被转录的”和“可转录的”同义。

有关本发明核苷酸序列的其它方面包括：含有本发明序列的构建体；含有本发明序列的载体；含有本发明序列的质粒；含有本发明序列的转化细胞；含有本发明序列的转化组织；含有本发明序列的转化器官；含有本发明序列的转化宿主；含有本发明序列的转化生物。本发明还包括使用它们表达核苷酸序列的方法，如在宿主植物细胞中表达；包括转化它们的方法。

为了便于参考，现在适当的标题下面讨论本发明的这些及其它方面。然而，每个部分下面的教导并非必需限制为每个具体的部分。

发明详述

一方面，本发明涉及一种含有选自下列至少一个氨基酸序列的分离多肽，或其变体，同系物或衍生物：

(i)KPHCEPEQPAALPLFQPQLVQGGRPDXYWVEAFPFRSDSSK；

(ii)SDIQMFVNPYATTNNQSSXWTPVSLAKLDFPVAMHYADITK；

(iii)VSWLENPGELR；

(iv)DGVDCLWYDGAR；

(v)PAGSPTGIVRAEWTRHVLDVFGXLXXK；

(vi)HTGSIHQVVCADIDGDGEDEFLYAMMGADPPDFQRTGVWCYK；

(vii)TEMEFLDVAGK；

(viii)KLTLVVLPPFARLDVERNVSGVK；

(ix)SMDELVAHNLFPAYVPDSVR；

(x)NDATDGTPVLALLDLDGGPSPQAWNISHVPPGTDMYEIAHAK；

(xi)TGSLVCARWPPVK；

(xii)NQRVAGTHSPAAMGLTSRWAVTK；

(xiii)GQITFRLPEAPDHGPLFLSVSAIRHQ；

(xiv)KPHXEPEQPAALPLFQPQLVV(Q)GGRPDXY；

其中X是未知的氨基酸残基。

另一方面，本发明涉及一种核苷酸序列，选自：

(a)编码上述氨基酸序列的核苷酸序列；

(b)一种核苷酸序列，它是(a)核苷酸序列的变体，同系物，衍生物或片段；

(c)一种核苷酸序列，它是(a)核苷酸序列的互补序列；

(d)一种核苷酸序列，它是(a)核苷酸序列的变体，同系物，衍生物或片段的互补序列；

(e)能够与(a)核苷酸序列杂交的核苷酸序列；

(f)能与(a)核苷酸序列的变体，同系物，衍生物或片段杂交的核苷酸序列；

(g)一种核苷酸序列，它是能与(a)核苷酸序列杂交的核苷酸序列互补序列；

(h)一种核苷酸序列，它是能够与(a)核苷酸序列的变体，同系物，衍生物或片段杂交的核苷酸序列的互补序列；

(i)一种能够与(a)核苷酸序列的互补序列杂交的核苷酸序列；

(j)一种能够与(a)核苷酸序列的变体，同系物，衍生物或片段的互补序列杂交的核苷酸序列；

(k)含有(a)，(b)，(c)，(d)，(e)，(f)，(g)，(h)，(i)，和/或(j)任何一个的核苷酸序列。

本发明另一方面包括本发明的分离核苷酸序列。

优选方面

在其中一个优选实施方案中，本发明涉及一种含有选自下列(i)-(xiii)中至少一个氨基酸序列的分离多肽，或其变体，同系物或衍生物：

(i)KPHCEPEQPAALPLFQPQLVQGGRPDXYWVEAFPFRSDSSK或KPHXEPEQPAALPLFQPQLVV(Q)GGRPDXY；

(ii)SDIQMFVNPYATTNNQSSXWTPVSLAKLDFPVAMHYADITK；

(iii)VSWLENPGELR；

(iv)DGVDCLWYDGAR；

(v)PAGSPTGIVRAEWTRHVLDVFGXLXXK；

(vi)HTGSIHQVVCADIDGDGEDEFLVAMMGADPPDFQRTGVWCYK；

(vii)TEMEFLDVAGK；

(viii)KLTLVVLPPFARLDVERNVSGVK；

(ix)SMDELVAHN FPAYVPDSVR；

(x)NDATDGTPVLALLDLDGGPSPQAWNISHVPPGTDMYEIAHAK；

(xi)TGSLVCARWPPVK；

(xii)NQRVAGTHSPAAMGLTSRWAVTK；

(xiii)GQITFRLPEAPDHGPLFLSVSAIRHQ；

其中X是未知的氨基酸残基。

在其中一优选实施方案中，所述多肽含有选自上述序列(i)-(xiii)的1个序列。

在其中一优选实施方案中，所述多肽含有选自上述序列(i)-(xiii)的2个序列。

在其中一优选实施方案中，所述多肽含有选自上述序列(i)-(xiii)的3个序列。

在其中一优选实施方案中，所述多肽含有选自上述序列(i)-(xiii)的4个序列。

在其中一优选实施方案中，所述多肽含有选自上述序列(i)-(xiii)的5个序列。

在其中一优选实施方案中，所述多肽含有选自上述序列(i)-(xiii)的6个序列。

在其中一优选实施方案中，所述多肽含有选自上述序列(i)-(xiii)的7个序列。

在其中一优选实施方案中，所述多肽含有选自上述序列(i)-(xiii)的8个序列。

在其中一优选实施方案中，所述多肽含有选自上述序列(i)-(xiii)的9个序列。

在其中一优选实施方案中，所述多肽含选自上述序列(i)-(xiii)的10个序列。

在其中一优选实施方案中，所述多肽含选自上述序列(i)-(xiii)的11个序列。

在其中一优选实施方案中，所述多肽含选自上述序列(i)-(xiii)的12个序列。

在其中一优选实施方案中，所述多肽含选自上述序列(i)-(xiii)的13个序列。

优选，本发明的多肽具有吡喃邻酮醛糖脱水酶活性。

其中一个优选实施方案涉及一种多肽，其可与相对于本发明的纯化氨基酸序列培养的抗体进行免疫反应。

另一方面涉及一种编码本发明多肽，或其变体，同系物，片段或衍生物的分离多核苷酸序列。

优选，所述分离多核苷酸选自：

(i)含有SEQ ID NO.1的核苷酸序列或其互补序列的多核苷酸；

(ii)含有能够与SEQ ID NO.1的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，或其片段的多核苷酸；

(iii)含有能够与SEQ ID NO.1的核苷酸序列的互补序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸；和

(iV)含有由于SEQ ID NO.1多核苷酸的遗传密码简并性而产生的多核苷酸序列的多核苷酸。

优选，所述核苷酸序列可从黄孢原毛平革菌，卵形多孔菌或蓝色伏革菌获得。

在其中一个优选实施方案中，所述核苷酸序列可从盘菌目，更优选从橙黄网孢盘菌(Aleuria aurantia)，疣孢褐盘菌(Peziza badia)，多汁盘菌(P.succosa)，Sarcophaera eximia，尖顶羊肚菌(Morchella conica)，肋纹羊肚菌(M.costata)，弹丝羊肚菌(M.elata)，可食羊肚菌(M.esculenta)，圆形可食羊肚菌(M.esculenta var.rotunda)，M.Hortensis或赭鹿花菌(Gyromitra infula)获得。

在另一优选实施方案中，所述核苷酸序列可从木耳目(Auriculariales)，更优选从肠膜状木耳(Auricularia mesenterica)获得。

在另一优选实施方案中，所述核苷酸序列可从多孔菌目(Aphyllophorales)，更优选从Pulcherricium caeruleum，栎隔孢伏革菌(Peniophora quercina)，Phanerochaete sordida，Vuilleminia comedens，烟色韧革菌(Stereum gausapatum)，血痕韧革菌(S.sanguinolentum)，Lopharia spadicea，柠檬绣球菌(Sparassis laminosa)，Boletopsissubsquamosa，黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)，Trichaptum biformis，Cerrena unicolor，朱红密孔菌(pycnoporus cinnabarinus)，血红密孔菌(P.sanguineus)，Junghunia nitida，黄色枝瑚菌(Ramaria flava)，微黄拟锁瑚菌(Clavulinopsis helvola)，微黄拟锁瑚菌var.Geoglossoides或绚丽拟锁瑚菌(V.pulchra)获得。

在另一优选实施方案中，所述核苷酸序列可从蘑菇目(Agaricales)，更优选从Clitocybe cyathiformis，C.dicolor，C.gibba，C.odora，Lepista caespitosa，L inversa，L luscina，L.nebularis，Mycenaseynii，Pleurocybella porrigens，Marasmius oreales或Inocybe pyriodora获得。

在另一优选实施方案中，所述核苷酸序列可从Gracilariales，更优选从Gracilaria varrucosa，Gracilaria tenuistipitata，Gracilariopsis sp，或Gracilariopsis lemaneiformis获得。

在另一优选实施方案中，所述核苷酸序列可从Melanosporaceae，更优选从Melanospora ornata，Microthecium compressum，Microtheciumsobelii获得。

本发明另一方面涉及一种分离多核苷酸，选自：

(i)含有SEQ ID NO.1的核苷酸序列或其互补序列的多核苷酸；

(ii)含有能够与SEQ ID NO.1的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，或其片段的多核苷酸；

(iii)含有能够与SEQ ID NO.1的核苷酸序列的互补序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸；和

(iv)含有由于SEQ ID NO.1多核苷酸的遗传密码简并性而产生的多核苷酸序列的多核苷酸。

优选，所述核苷酸序列与启动子可操纵连接。

本发明另一方面涉及一种含有上述多核苷酸序列的构建体。

本发明另一方面涉及一种含有上述多核苷酸序列的载体。

本发明另一方面涉及一种宿主细胞，其中已经掺入本发明的多核苷酸序列。

另一方面涉及一种含有本发明多核苷酸序列的表达载体，所述多核苷酸序列与能够指导所述多核苷酸在宿主细胞中表达的调节序列可操纵连接。

另一方面涉及一种由SEQ ID NO.1的多核苷酸序列编码的分离多肽，或其变体，同系物，片段或衍生物。

在优选实施方案中，所述分离多肽具有从N-末端除去的至多7个氨基酸。

更优选，所述分离多肽具有与SEQ ID NO.1编码的多肽序列相比，至少75％的同一性。

另一方面涉及一种能够结合本发明多肽的抗体。

另一方面涉及制备本发明氨基酸序列的方法，其中所述方法包括表达本发明的核苷酸序列，并任选地分离和/或纯化它们。优选，本发明的核苷酸序列是在没有表达酶底物的环境中表达的，例如，在没有1，5-脱水果糖的环境中表达。

另一方面涉及一种使用本发明的氨基酸序列，或本发明核苷酸序列的表达产物制备薄闭壳素的方法。

另一方面涉及一种使用本发明的氨基酸序列，或本发明核苷酸序列的表达产物制备子囊吡喃酮P的方法。

优选，该方法包括使所述氨基酸序列或所述核苷酸序列的表达产物与1，5-脱水-D-果糖反应。

甚至更优选，所述方法还包括使用APP合酶。

在特别优选的实施方案中，所述方法包括使APP合酶及所述氨基酸序列或所述核苷酸序列的表达产物与1，5-脱水-D-果糖反应。

在可选择性的优选实施方案中，所述制备薄闭壳素(microthecin)的方法包括使本发明的多肽与葡聚糖裂合酶及淀粉糊精反应。

本发明另一方面涉及一种使用本发明的氨基酸序列或本发明核苷酸序列的表达产物制备蓝草菌酮(cortalcerone)的方法。

优选，该方法包括使氨基酸序列或核苷酸序列的表达产物与葡糖醛酮反应。

在可选择性的优选实施方案中，所述制备薄闭壳素的方法包括使本发明的多肽与葡萄糖及吡喃糖2-氧化酶反应。

本发明另一方面涉及一种制备薄闭壳素的方法，包括使吡喃邻酮醛糖脱水酶与1，5-脱水-D-果糖反应。

本发明另一方面涉及一种制备子囊吡喃酮P的方法，包括使吡喃邻酮醛糖脱水酶及APP合酶与1，5-脱水-D-果糖反应。

本发明其中一个方面涉及一种制备薄闭壳素的方法，包括使吡喃邻酮醛糖脱水酶与葡萄糖及淀粉糊精反应。

本发明另一方面涉及制备蓝草菌酮的方法，包括使吡喃邻酮醛糖脱水酶与葡糖醛酮反应。

本发明另一方面涉及一种制备蓝草菌酮的方法，包括使吡喃邻酮醛糖脱水酶与葡萄糖及吡喃糖2-氧化酶反应。

本发明另一方面涉及薄闭壳素用于防止和/或抑制微生物在物质中的生长，和/或杀死物质中的微生物的应用。

本发明的可选择性方面涉及蓝草菌酮用于防止和/或抑制微生物在物质中的生长，和/或杀死物质中的微生物的应用。

本发明还涉及一种或多种薄闭壳素，蓝草菌酮，或其衍生物或异构体用于防止和/或抑制微生物在物质中的生长，和/或杀死物质中的微生物的应用。

优选，所述物质是食品。

优选可使用蓝草菌酮和/或薄闭壳素对其发挥作用的微生物是植物真菌病原体。

优选可使用蓝草菌酮和/或薄闭壳素对其发挥作用的微生物选自丝核菌属，腐霉属，丝囊霉属和尾孢属。

优选可使用蓝草菌酮和/或薄闭壳素对其发挥作用的微生物选自茄属丝核菌，终极腐霉，螺壳状丝囊霉和菾菜尾孢。

本发明另一方面涉及薄闭壳素，蓝草菌酮，或其衍生物或异构体在防止和/或抑制病原体丝囊霉的生长，和/或杀死病原体丝囊霉中的用途。

优选，所述病原体是螺壳状丝囊霉。

在优选实施方案中，薄闭壳素的衍生物是2-呋喃基-羟甲基-酮或4-脱氧-甘油-己-2，3-diluose(4-deoxy-glycero-hexo-2，3-diluose)。

在优选实施方案中，蓝草菌酮的衍生物是2-呋喃基乙二醛。

在特别优选的实施方案中，所述薄闭壳素，蓝草菌酮，或其衍生物或异构体用于处理植物或植物种子，甚至更优选用于处理甜菜种子，豌豆植株或豌豆种子。

另一方面，本发明涉及薄闭壳素，蓝草菌酮，或其衍生物或异构体作为植物或种子保护剂的应用。

本发明另一方面涉及薄闭壳素，蓝草菌酮，或其衍生物或异构体作为植物生长调节剂的应用。

优点

本发明提供了先前未公开的，有关吡喃邻酮醛糖脱水酶的氨基酸及核苷酸序列的信息。

本发明还涉及吡喃邻酮醛糖脱水酶在从AF向APP及薄闭壳素转化，以及在蓝草菌酮产生中的应用。迄今为止，现有技术中还没有教导或暗示PD涉及，或能够影响这些转化的任一方面。

因此，本发明能够促进薄闭壳素，APP及蓝草菌酮的大量生产。本发明还教导了薄闭壳素及蓝草菌酮可作为抗菌剂使用，特别用于食品中。

测定法

下列测定法可用于描述并鉴定本发明实际和推定的氨基酸序列。

分离的

一方面，优选所述序列为分离的形式。术语“分离的”是指序列不是存在于它的天然环境中(即，在自然中找到)。通常，术语“分离的”是指所述序列至少基本上没有至少一种其它成分，所述其它成分与所述序列天然相关，并且可在自然中找到。这里，所述序列可从与它天然相关的至少一种其它成分中分离出来。

纯化的

一方面，优选所述序列为纯化的形式。术语“纯化的”也指所述序列不是存在于它的天然环境中(即，在自然中找到)。通常，术语“纯化的”是指所述序列至少基本上是从至少一个其它成分中分离出来的，所述其它成分与所述序列天然相关，并且可在自然中找到。

核苷酸序列

本发明包括编码具有此处定义的特殊性质的酶的核苷酸序列。这里所用的术语“核苷酸序列”是指寡核苷酸序列或多核苷酸序列，及其变体，同系物，片段和衍生物(如，它的一部分)。所述核苷酸序列可以是基因组或合成或重组来源的，其可以是双链或单链的，正义或反义链。

本发明中的术语“核苷酸序列”包括基因组DNA，cDNA，合成DNA，及RNA。优选它是指DNA，更优选本发明编码序列的cDNA。

在优选实施方案中，本发明的核苷酸序列本身不包括存在于其天然环境中的本发明的天然核苷酸序列，例如当它与同样存在于其天然环境中的其天然相关序列连接时。为便于对照，我们称该优选实施方案为“非天然的核苷酸序列”。在这点上，术语“天然核苷酸序列”是指存在于其天然环境中的完整核苷酸序列，且当和与其天然相关的完整启动子可操纵连接时，启动子也存在于其天然环境中。然而，本发明的氨基酸序列可在核苷酸序列在其天然生物中表达之后，被分离和/或纯化。然而，优选本发明的氨基酸序列可被其天然生物中的核苷酸序列表达，但其中所述核苷酸序列不受该生物内与其天然相关启动子的控制。

通常，本发明的核苷酸序列是利用重组DNA技术(即，重组DNA)制备的。然而，在本发明可选择性的实施方案中，可利用本领域熟知的化学方法完整或部分合成所述核苷酸序列(见Caruthers MH等，(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 215-23和Horn T等，(1980)Nuc AcidsRes Symp Ser 225-232)。

核苷酸序列的制备

编码具有此处定义的特殊性质的酶或适于修饰的酶的核苷酸序列可从产生所述酶的任何细胞或生物鉴定和/或分离和/或纯化。用于鉴定和/或分离和/或纯化核苷酸序列的各种方法都是本领域熟知的。例如，一旦已经鉴定和/或分离和/或纯化了一个适宜序列，就可利用PCR扩增技术制备不止一个序列。

例如，基因组DNA和/或cDNA库可使用染色体DNA或信使RNA从产生所述酶的生物构造。如果酶的氨基酸序列是已知的，那么可合成标记寡核苷酸探针，并用于鉴定来源于从生物制备的基因组库的编码酶的克隆。可选择性地，含有与其它已知酶基因同源的序列的标记寡核苷酸探针可用于鉴定编码酶的克隆。在后一种情况中，使用较低严格度的杂交和清洗条件。

可选择性地，编码酶的克隆可通过在表达载体，如质粒中插入基因组DNA的片段，用所得基因组DNA库转化酶-阴性菌，然后将转化细菌平板接种在含有酶底物(即，麦芽糖)的琼脂上，由此鉴定表达所述酶的克隆而鉴定。

可选择性地，编码所述酶的核苷酸序列可通过已经确定的标准方法制备，例如由Beucage S.L.等，(1981)Tetrahedron Letters 22，1859-1869页描述的氨基磷酸盐法，或Matthes等，(1984)EMBO J.3，801-805页描述的方法。例如，在氨基磷酸盐法中，在自动DNA合成仪中合成寡核苷酸，纯化，退火，连接并在适宜的载体中克隆。

所述核苷酸序列可以是混合的基因组及合成来源，混合的合成及cDNA来源，或混合的基因组及cDNA来源，它们是按照标准技术，通过连接合成基因组或cDNA来源(适宜)的片段而制备的。每个连接的片段与完整核苷酸序列的各个部分相对应。所述DNA序列还可使用特殊引物，通过聚合酶链反应(PCR)制备，例如在US 4,683,202或Saiki R K等，(Science(1988)239，487-491页)中描述的。

氨基酸序列

本发明还包括此处定义的具有特殊性质的酶的氨基酸序列。

这里所用术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白”同义。在某些例子中，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。在某些例子中，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。

所述氨基酸序列可从适宜的来源制备/纯化，或合成制备它或利用重组DNA技术制备它。

本发明的酶可与其它酶结合使用。因此，本发明还包括酶的组合，其中所述组合含有本发明的酶和其它酶，其可以是本发明的其它酶。此方面在后面的部分中讨论。

优选所述酶不是天然的酶。在这一点上，术语“天然的酶”是指完整的酶，它存在于其天然环境中，且它已经由其天然核苷酸序列表达。

变体/同系物/衍生物

本发明还包括本发明酶的氨基酸序列或编码这种酶的任一核苷酸序列的变体，同系物，和衍生物的应用。这里，术语“同系物”是指与主体氨基酸序列和主体核苷酸序列具有一定同源性的实体。这里，术语“同源性”等同于“同一性”。

在本发明的范围内，同源性序列包括与主体序列至少75，80，85或90％相同，优选至少95，96，97，98或99％相同的氨基酸序列。通常，同系物含有与主体氨基酸序列相同的活性位点等。虽然同源性还可被考虑为相似性(即，具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)，但在本发明的范围内，优选以序列同一性来表示同源性。

在本发明的范围内，同源性序列包括与编码本发明酶的核苷酸序列(主体(subject)序列)至少40，50，60，70，75，80，85或90％相同，优选至少95，96，97，98或99％相同的核苷酸序列。通常，同系物包括编码与主体序列相同的活性位点等的序列。虽然同源性还可被劳率为相似性(即，具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)，但在本发明的范围内，优选以序列同一性表示同源性。

同源性比较可通过肉眼进行，或更通常借助于很容易获得的序列比较程序进行。这些商业可获得的计算机程序可计算两个或多个序列间的同源性％。

可对连续序列计算同源性％，即，将一个序列与另一序列进行排列对比，并将其中一个序列中的每个氨基酸直接与另一序列中的相应氨基酸进行比较，每次比较一个残基。这被称作“无空位”序列对比。通常，这种无空位序列对比只对相对较少数量的残基进行。

虽然这是一种非常简单且可靠的方法，但它不能考虑到，例如，在另一对相同序列中，一次插入或缺失可导致下列核酸残基不能进行序列对比，从而当进行总体序列对比时，可能导致同源性％大大降低。因此，绝大多数序列比较法都被设计成既能产生最佳序列对比，又考虑到了插入和缺失，而不会不适当地罚分总的同源性值。这是通过在序列对比中插入“空位(gaps)”，从而尽力使局部同源性达到最大而实现的。

然而，这些更复杂的方法将“空位罚分(gap penalties)”赋予序列对比中出现的每个空位，这样，对于同样数目的相同氨基酸而言，序列对比具有尽可能少的空位-反映两个比较序列之间更高的相关性-将获得比具有多个空位更高的值。通常使用“亲族空位值”，它给空位的存在注入相对较高的值，而给空位中的每个后续残基赋予较小的罚分。这是最普遍使用的空位评分系统。较高的空位罚分当然可产生具有较少空位的最佳序列对比。绝大多数序列对比程序都可改变空位罚分。然而，当使用这种软件进行序列比较时，优选使用缺省值。例如，当使用GCG Wisconsin Bestfit软件包时，对于空位而言，氨基酸序列的缺省空位罚分是-一个空位12，一次延伸4。

因此，最大同源性％的计算首先要求产生最佳序列对比，同时考虑空位罚分。进行这种序列对比的适宜计算机程序是GCG WisconsinBestfit软件包(Devereux等，1984，Nuc Acids Research 12：387)。可进行序列比较的其它软件的例子包括，但不限制于BLAST软件包(见Ausubel等，1999 Short Protocols in Molecular Biology，4^th Ed-Chapter18)，FASTA(Altschul等，1990，J.Mol.Biol.，403-410)和比较工具的GENEWORKS程序组。BLAST和FASTA可脱机和在线检索(见Ausubel等，1999，7-58-7-60页)。然而，对于某些应用而言，优选使用GCG Bestfit程序。一种被称作BLAST 2 Sequences的新工具也可用于比较蛋白及核苷酸序列(见FEMS Microbiol Lett 1999174(2)：247-50；FEMS Microbiol Lett 1999 177(1)：187-8和tatiana@ncbi.nlm.nih.gov)。

虽然，最终的同源性％可以同一性的形式测量，但通常序列对比过程本身并不是以全有或绝无的成对比较为基础的。相反，通常使用一定的相似性得分矩阵，以化学相似性或进化距离为基础，将值赋予每次成对比较。通常所用这种矩阵的例子是BLOSUM62矩阵-程序的BLAST程序组的缺省矩阵。GCG Wisconsin程序通常使用公共缺省值或自定义符号比较表(见详述部分的用户手册)。对于某些应用而言，优选使用GCG软件包的公共缺省值，或对于其它软件而言，使用缺省矩阵，如BLOSUM62。

可选择性地，同源性百分比可以和CLUSTAL类似的算法为基础，使用多序列对比特征在DNASIS^TM(Hitachi Software)中计算(HigginsDG & Sharp PM(1998)，Gene 73(1)，237-244)。

一旦所述软件产生了最佳序列对比，那么就可计算同源性％，优选计算序列同一性％。通常所述软件是作为序列比较的一部分进行的，并产生数值结果。

所述序列还可具有氨基酸残基的缺失，插入或置换，产生沉默改变及功能等价物质。氨基酸置换可以残基的极性，电荷，溶解性，疏水性，亲水性，和/或两亲性为基础进行，只要能够保留物质的次级结合活性。例如，带负电的氨基酸包括天门冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似亲水性值的不带电的极性端基的氨基酸包括亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，甘氨酸，丙氨酸，天门冬酰胺，谷酰胺，丝氨酸，苏氨酸，苯丙氨酸，和酪氨酸。

保守置换可按照下表进行。第二栏同一区块(block)内的氨基酸，优选第三栏同一行的氨基酸可彼此置换：

脂族	非极性	G  A  P
			I  L  V
		极性-不带电		C  S  T  M
	N  Q
			极性-带电	D  E
	K  R
		芳族			H  F  W  Y

本发明还包括同源性置换(这里所用的置换和替代是指现有氨基酸残基与可选择性残基的交换)，其可进行相似置换，如碱性置换碱性，酸性置换酸性，极性置换极性等。还可进行非同源性置换，即，从一类残基置换成另一类残基，或可选择性地，涉及非天然的氨基酸，如鸟氨酸(此后称作Z)，二氨基丁酸鸟氨酸(此后称作B)，正亮氨酸鸟氨酸(此后称作O)，吡啶基丙氨酸，噻吩基丙氨酸，萘基丙氨酸和苯基甘氨酸。

置换还可用非天然的氨基酸进行，包括：α^*和α-二置换的^*氨基酸，N-烷基氨基酸^*，乳酸^*，天然氨基酸的卤化衍生物，如三氟酪氨酸^*，对-Cl-苯丙氨酸^*，对-Br-苯丙氨酸^*，对-I-苯丙氨酸^*，L-烷基-甘氨酸^*，β-丙氨酸^*，L-α-氨基丁酸^*，L-γ-氨基丁酸^*，L-α-氨基异丁酸^*，L-ε-氨基己酸#，7-氨基庚酸^*，L-甲硫氨酸砜#^*，L-正亮氨酸^*，L-正缬氨酸^*，对-硝基-L-苯丙氨酸^*，L-羟脯氨酸^*，L-硫代脯氨酸^*，苯丙氨酸(Phe)的甲基衍生物，如4-甲基-Phe^*，五甲基-Phe^*，L-Phe(4-氨基)#，L-Tyr(甲基)^*，L-Phe(4-异丙基)^*，L-Tic(1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸)^*，L-二氨基丙酸#和L-Phe(4-苄基)^*。上面为进行讨论所用的符号^*(相对于同源性或非同源性置换)表示衍生物的疏水性，而所用的#表示衍生物的亲水性，#^*表示两亲性。

变体氨基酸序列包括适宜的间隔区，所述间隔区可被插入到序列的任意两个氨基酸残基之间，除了氨基酸间隔区，如甘氨酸或β-丙氨酸残基之外，还包括烷基，如甲基，乙基或丙基。其它变化形式，包括一个或多个氨基酸残基以类胨形式的存在，可由本领域那些技术人员了解。为了避免疑问，“类胨形式”用于指变体氨基酸残基，其中α-碳取代基位于残基的氮原子而不是α-碳上。用于制备类胨形式的肽的方法是本领域已知的，例如Simon RJ等，PNAS(1992)89(20)，9367-9371和Horwell DC，Trends Biotechnol.(1995)13(4)，132-134。

本发明所用的核苷酸序列可包括合成或修饰的核苷酸。对寡核苷酸进行的多种不同类型的修饰是本领域已知的。这些包括甲基膦酸盐和phosphorothioate主链和/或在分子的3’和/或5’末端加入吖啶或聚赖氨酸链。对于本发明而言，应当了解这里所述的核苷酸序列可通过现有技术中任何可获得的方法来修饰。进行这种修饰是为了提高本发明核苷酸序列的体内活性或有效期。

本发明还包括与这里给出的序列互补的核苷酸序列，或其任何衍生物，片段或衍生物的应用。如果序列与其片段互补，那么该序列可用作探针，来鉴定其它生物中的相似编码序列。

并不与本发明序列100％同源，但落在本发明范围内的多核苷酸可以很多方式获得。这里所述序列的其它变体可通过使用从不同个体，例如不同种群的个体制备的DNA库作为探针杂交而获得。此外，还可获得其它病毒/细菌，或细胞同系物，特别是在哺乳动物细胞(例如，大鼠，小鼠，牛和灵长类动物细胞)中发现的细胞同系物，且这种同系物及其片段通常能够选择性地与这里序列表中的序列杂交。这种序列可通过使用从其它动物的基因组DNA库制备的cDNA库作为探针杂交，并在中度到高度严格的条件下，使用所附序列表中任一序列的全部或一部分作为探针与这种库杂交而获得。类似的情况用于获得本发明多肽或核苷酸序列的物种同系物及等位变体。

变体和株系/物种同系物还可利用简并PCR获得，其中使用的引物被设计针对编码本发明序列内保守氨基酸序列的同系物及变体内的序列。通过将来源于若干变体/同系物的氨基酸序列进行排列对比，可预测保守序列。序列对比可使用本领域已知的计算机软件进行。例如，广泛使用的是GCG Wisconsin PileUp程序。

简并PCR中所用的引物包括一个或多个简并位置，而且与克隆序列所用的那些相比，可在较低的严格条件下使用，具有针对已知序列的单一序列引物。

可选择性地，这种多核苷酸可通过特定序列的定点诱变获得。这一点很有用，例如需要进行沉默密码子序列改变来优化其中表达多核苷酸序列的特定宿主细胞的偏爱密码子。还可能需要进行其它序列改变，从而引入限制酶识别位点，或改变由多核苷酸编码的多肽的性质或功能。

本发明还包括经由随机过程，选择诱变或体外重组而进行分子进化的多核苷酸。作为非限制性的实施例，可于体内或体外，在核苷酸序列中产生若干定点或随机突变，随后利用各种方式筛选所编码多肽的改进功能性。此外，多核苷酸序列的突变或天然变体可与野生型或其它突变或天然变体重组，从而产生新的变体。这种新变体还可被筛选所编码多肽的改进功能性。新的优选变体的产生可通过本领域已经确定的各种方法获得，例如Error Threshold Mutagenesis(WO92/18645)，寡核苷酸介导的随机诱变(US 5,723,323)，DNA穿梭(US5,605,793)，外源介导的基因装配WO 00/58517。这些以及类似的随机定向分子进化法可鉴定并选择本发明酶的变体，该变体具有优选的特性而无需有关蛋白结构或功能的任何现有知识，并产生不可预测但有益的突变或变体。在本领域中，用于优化或改变酶活性的分子进化的应用有很多，这种例子包括但不限制于下列的一种或多种：在优选环境条件，例如温度，pH，底物下，宿主细胞中的优化表达和/或活性，或体外酶活性增加，底物和/或产物特异性改变，酶或结构稳定性增加或降低，酶活性/特异性改变。

本发明的多核苷酸(核苷酸序列)可用于产生引物，例如PCR引物，可选择性扩增反应的引物，探针，例如使用放射性或非放射性标记，通过常规方法暴露标记的探针，或将多核苷酸克隆到载体中。这种引物，探针和其它片段的长度为至少15，优选至少20，例如至少25，30或40个核苷酸，而且也包括在本发明所用的术语多核苷酸之内。

本发明的多核苷酸，如DNA多核苷酸及探针可重组，合成，或利用本领域那些技术人员可获得的任何方法产生。还可利用标准技术克隆它们。

通常，引物可通过合成方法产生，包括逐步地，每次制备所需核酸序列的一个核苷酸。使用自动化技术进行的技术在本领域中很容易获得。

较长的多核苷酸通常是利用重组法产生的，例如使用PCR(聚合酶链反应)克隆技术。这包括制备一对引物(例如，大约15-30个核苷酸)，该引物与脂类导向序列区侧面连接，其被克隆，使引物与从动物或人细胞获得的mRNA或cDNA接触，在使所需区扩增的条件下进行聚合酶链反应，分离扩增片段(例如，通过在琼脂凝胶上纯化反应混合物)并回收扩增的DNA。所述引物可被设计含有适宜的限制酶识别位点，从而使扩增的DNA克隆到适宜的克隆载体中。

生物活性

优选，所述变体序列等至少与这里给出的序列具有相同的生物活性。

这里所用的“生物活性”是指该序列具有与天然存在的序列相似的结构功能(但程度无需相同)，和/或相似的调节功能(但程度无需相同)，和/或相似的生化功能(但程度无需相同)。

同功酶

本发明的多肽可以一种或多种不同的同功酶形式存在。这里所用术语“同功酶”包括多肽的变体，其可催化同一反应，但彼此的性质不同，如底物亲和性及酶-底物反应的最大速率不同。由于氨基酸序列的差异，同功酶可由电泳或等电点聚焦技术区分。不同的组织常常具有不同的同功酶。序列差异通常为其中发现特定同功酶的细胞类型的特殊要求带来不同的酶动力学参数，其有时被称作微调。

同种型

本发明还包括这里所述多肽不同的同种型。术语“同种型”是指具有相同功能(即，吡喃邻酮醛糖脱水酶活性)的蛋白，其具有相似或相同的氨基酸序列，但属于不同基因的产物。

杂交

本发明还包括与本发明序列互补的序列或能够与本发明序列或其互补序列杂交的序列。

这里所用的术语“杂交”应包括“通过碱基配对使核酸链与互补链连接的方法”以及在聚合酶链反应(PCR)中进行的扩增过程。

本发明还包括核苷酸序列或其任一衍生物，片段，或衍生物的应用，所述核苷酸序列能够与这里给出序列的互补序列杂交。

术语“变体”还包括能够与这里给出的核苷酸序列杂交的序列的互补序列。

优选，术语“变体”包括在严格条件(例如，50℃和0.2×SSC{1×SSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠pH 7.0})下，能够与这里给出的核苷酸序列杂交的序列的互补序列。

更优选，术语“变体”包括在高度严格条件(例如，65℃和0.1×SSC{1×SSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠pH 7.0})下，能够与这里给出的核苷酸序列杂交的序列的互补序列。

本发明还涉及能够与本发明的核苷酸序列(包括这里所给出那些的互补序列)杂交的核苷酸序列。

本发明还涉及能够与本发明的核苷酸序列(包括这里所给出那些的互补序列)杂交的序列的互补核苷酸序列。

能够在中等至最大程度的严格条件下，与这里给出的核苷酸序列杂交的多核苷酸序列也包括在本发明的范围之内。

在优选方面，本发明包括能够在严格条件(例如，50℃和0.2×SSC)下，与本发明的核苷酸序列，或其互补序列杂交的核苷酸序列。

在更优选方面，本发明包括能够在高度严格条件(例如，65℃和0.1×SSC)下，与本发明的核苷酸序列，或其互补序列杂交的核苷酸序列。

定点诱变

一旦分离出编码酶的核苷酸序列，或鉴定出推定的编码酶的核苷酸序列，就可使序列发生突变，以便制备本发明的酶。

突变可利用合成寡核苷酸引入。这些寡核苷酸含有与所需突变位点侧面连接的核苷酸序列。

适宜的方法在Morinaga等(Biotechnology(1984)2，646-649页)中公开，其中DNA的单链空位，编码酶的序列，是在携带酶基因的载体中创造的。然后使具有所需突变的合成核苷酸退火成单链DNA的同源性部分。然后用DNA聚合酶I(Klenow片段)填补剩余的空位，并用T4连接酶连接该构建体。

US 4,760,025公开了通过对序列盒(cassette)进行较小改变而引入编码多次突变的寡核苷酸。然而，通过上述Morinaga法可在任何时候引入更多突变，这是因为可引入很多不同长度的寡核苷酸。

向编码酶的核苷酸序列中引入突变的其它方法在Nelson and Long(Analytical Biochemistry(1989)，180，147-151页)中描述。该方法包括3-步产生含有所需突变的PCR片段，包括利用化学合成的DNA链作为PCR反应中的一个引物而引入所需突变。通过用限制性内切核酸酶裂解，可从PCR-产生的片段中分离携带突变的DNA片段，并将其重新插入到表达质粒中。

作为举例，Sierks等(Protein Eng(1989)2，621-625和Protein Eng(1990)3，193-198)描述了曲霉葡糖淀粉酶中的定向诱变。

重组的

在本发明其中一个方面中，所述序列是重组序列—即，使用重组DNA技术制备的序列。

合成的

在本发明一个方面中，所述序列是合成序列—即通过体外化学或酶合成制备的序列。它包括但不限制于使用宿主生物，如甲基营养酵母毕赤氏酵母和汉逊氏酵母的最佳偏爱密码子制备的序列。

酶的表达

本发明所用的核苷酸序列可被掺入到重组复制型载体中。该载体可在和/或从适合的宿主细胞复制并表达酶形式的核苷酸序列。预期了同源及异源表达。

对于同源表达而言，优选目标基因或目标核苷酸序列并不存在于其天然存在的基因背景中。在目标基因或目标核苷酸序列存在于其天然存在的基因背景中时，优选表达是由不同于或除了其天然存在的表达机理之外的方式驱动的；例如，通过基因干预过量表达目标基因。

表达可使用控制序列控制，控制序列包括启动子/增强子和其它表达调节信号。原核生物启动子及在真核生物细胞中发挥作用的启动子都可使用。还可使用组织特异或刺激物特异性启动子。还可使用嵌合启动子，其含有来源于上述两种或多种不同启动子的序列元件。

根据所用序列和/或载体的不同，通过表达核苷酸序列而由宿主重组细胞产生的酶可被分泌或胞内含有。编码序列可用信号序列设计，其指导物质编码序列通过特定的原核生物或真核生物细胞膜的分泌。

表达载体

术语“表达载体”是指能够体内或体外表达的构建体。

优选，将所述表达载体掺入到适宜宿主生物的基因组中。术语“掺入的”优选包括稳定掺入到基因组中。

宿主生物可与目标来源生物的基因相同或不同，分别引起同源和异源表达。

优选，本发明的载体含有本发明的构建体。可选择性表达地，优选本发明的核苷酸序列存在于载体中，且其中所述核苷酸序列与调节序列可操纵连接，这样调节序列就可通过适宜的宿主生物提供核苷酸序列的表达，即所述载体是表达载体。

本发明的载体可被转化到下述适宜的宿主细胞中，从而提供本发明多肽的表达。因此，本发明另一方面提供制备随后使用的多肽的方法，包括在一定条件下培养用表达载体转化或转染的宿主细胞，从而通过编码所述多肽的编码序列的载体提供表达，并回收所表达的多肽。

所述载体可以是，例如，用复制源提供的噬菌体载体，病毒或质粒，任选用于所述多核苷酸表达的启动子以及任选的启动子的调节子。载体的选择通常取决于其所被引入的宿主细胞。

本发明的载体可含有一个或多个选择性标记基因。工业用微生物的绝大多数适宜的选择系统是通过选择标记形成的那些，其无需在宿主生物中突变。适宜的选择标记可以是源于枯草芽孢杆菌或地衣型芽孢杆菌的dal基因，或产生抗生素抗性，如氨苄西林，卡那霉素，氯霉素或四环素抗性的基因。可选择的选择标记可以是曲霉选择标记，如amdS，argB，niaD和sC，或产生潮霉素抗性的标记。其它真菌选择标记的例子是ATP合成酶，亚单位9(oliC)，乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶(pvrA)，腐草霉素及苯菌灵抗性(benA)基因。非-真菌选择标记的例子是细菌G418抗性基因(其还可用于酵母中，但不能用于丝状真菌中)，氨苄西林抗性基因(大肠杆菌)，新霉素抗性基因(芽孢杆菌)以及大肠杆菌uidA基因，编码β-葡糖醛酸酶(GUS)。其它适宜的选择标记包括源于枯草芽孢杆菌或地衣型芽孢杆菌的dal基因。可选择性地，选择可通过共同-转化完成(如WO 91/17243所述)。

载体可体外使用，例如产生RNA或用于转染或转化宿主细胞。

因此，本发明所用的核苷酸序列可被掺入到重组载体(通常是复制型载体)，例如克隆或表达载体中。所述载体可用于在适合的宿主细胞中复制核酸。因此在另一实施方案中，本发明提供一种通过将本发明的核苷酸序列引入到复制型载体中，将载体引入到适合的宿主细胞中，并在进行载体复制的条件下使宿主细胞生长而制备本发明核苷酸序列的方法。载体可从宿主细胞回收。适宜的宿主细胞与表达载体一起在下面描述。

用于连接本发明的DNA构建体和调节序列，其中该DNA构造编码具有此处定义的特殊性质的酶，并将它们插入到含有复制所需信息的适宜载体中的过程是本领域技术人员熟知的(例如，见Sambrook等，Molecular Cloning：A laboratory Manual，2nd Ed.(1989))。

所述载体还可含有能够使载体在宿主细胞中复制的核苷酸序列。这种序列的例子是质粒pUC 19，pACYC 177，pUB 110，pE 194，pAMB1和pIJ702复制的来源。

表达载体通常包括克隆载体的成分，如允许载体在所选择的宿主生物中自主复制的元件，和用于选择目的的一个或多个表型可检测的标记。表达载体通常含有编码启动子，操纵子，核糖体结合位点，翻译起始信号，以及任选地，阻抑基因或一个或多个激活基因的控制核苷酸序列。此外，表达载体可含有编码氨基酸序列的序列，其中所述氨基酸序列能够将氨基酸序列对准宿主细胞的细胞器，如过氧物酶体或特定的宿主细胞区室。在本发明中，术语“表达信号”包括上述控制序列，阻抑序列或激活序列中的任何一个。在控制序列的指导下表达时，核苷酸序列以适于表达的方式与控制序列可操纵连接。

调节序列

在某些应用中，本发明所用的核苷酸序列与调节序列可操纵连接，其能够通过所选择的宿主细胞提供核苷酸序列的表达。作为举例，本发明包括的载体含有与调节序列可操纵连接的核苷酸序列，即所述载体是表达载体。

术语“可操纵连接”是指一种邻接，其中所述成分的关系允许它们以其预定的方式发挥作用。调节序列与编码序列“可操纵连接”是指编码序列的表达是在与控制序列适合的条件下获得的。

术语“调节序列”包括启动子和增强子以及其它表达调节信号。

本领域通常意义上的术语“启动子”是，例如，RNA聚合酶结合位点。

编码本发明酶的核苷酸序列的增强表达还可通过异源调节区，例如启动子，分泌前导序列和终止区的选择而获得，其可增加表达且，如果需要，增加目标蛋白自所选择的表达宿主分泌的水平和/或提供本发明酶表达的诱导型控制。在真核生物中，多腺苷酸化序列可与编码该酶的核苷酸序列可操纵连接。

优选，本发明的核苷酸序列可与至少一个启动子可操纵连接。

除了编码本发明核苷酸序列的基因的天然启动子之外，其它启动子可用于指导本发明多肽的表达。根据指导本发明核苷酸序列在所需表达宿主中表达的效能选择启动子。

在另一实施方案中，可选择组成型启动子来指导本发明所需核苷酸序列的表达。这种表达构建体还可提供其它优点，这是因为它包含了在含有诱导底物的培养基上培养表达宿主的需要。

指导核苷酸序列在细菌宿主中转录的适宜启动子的例子包括大肠杆菌lac操纵子的启动子，天蓝色链霉菌琼脂糖酶基因dagA的启动子，地衣型芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)的启动子，嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽淀粉酶基因(amyM)的启动子，解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)的启动子，枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子，以及源于乳球菌衍生启动子的启动子，包括P170启动子。当核苷酸序列在细菌，如大肠杆菌中表达时，可从噬菌体启动子，包括T7启动子以及噬菌体λ启动子中选择适宜的启动子。

在真菌中转录时，有效启动子的例子是来源于编码米曲霉TAKA淀粉酶，Rhizomucor miehei天门冬氨酸蛋白酶，黑色曲霉中性α-淀粉酶，黑色曲霉酸稳定α-淀粉酶，黑色曲霉葡糖淀粉酶，Rhizomucormiehei脂酶，米曲霉碱性蛋白酶，米曲霉磷酸丙糖异构酶或构巢曲霉乙酰胺酶的基因的那些。

优选用于真菌表达宿主中的强组成型和/或诱导型启动子的例子是从木聚糖酶(xlnA)，肌醇六磷酸酶，ATP-合成酶，亚单位9(oliC)，磷酸丙糖异构酶(tpi)，醇脱氢酶(AdhA)，α-淀粉酶(amy)，淀粉葡糖苷酶(AG-源于glaA基因)，乙酰胺酶(amdS)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gpd)启动子的真菌基因获得的那些。用于在真菌宿主中转录的启动子的其它例子是源于编码米曲霉TAKA淀粉酶，酿酒酵母的TPI(磷酸丙糖异构酶)启动子(Alber等，(1982)J.Mol.Appl.Genet.1，419-434页)，Rhizomucor miehei天门冬氨酸蛋白酶，黑色曲霉中性α-淀粉酶，黑色曲霉酸稳定α-淀粉酶，黑色曲霉葡糖淀粉酶，Rhizomucor miehei脂酶，米曲霉碱性蛋白酶，米曲霉磷酸丙糖异构酶或构巢曲霉乙酰胺酶的基因的那些。

在酵母中表达的适宜启动子的例子包括但不限制于，酿酒酵母的Gal 1和Gal 10启动子，以及巴斯德毕赤氏酵母的AOX1或AOX2启动子。

杂种启动子还可用于改善表达构建体的诱导型调节。

此外，启动子还包括确保或增加在适宜宿主中表达的特征。例如，所述特征可能是保守区，如Pribnow Box或TATA盒。启动子甚至可含有影响(如维持，提高，降低)本发明核苷酸序列表达水平的其它序列。例如，适宜的其它序列包括Shl-内含子或ADH内含子。其它序列包括诱导型元件—如温度，化学品，光或应力诱导型元件。且，可存在提高转录或翻译的适宜元件。后者元件的例子是TMV 5’信号序列(见Sleat 1987 Gene 217，217-225和Dawson 1993 Plant Mol.Biol.23：97)。

构建体

术语“构建体”—其与术语“接合物”、“序列盒”和“杂种”同义—包括直接或间接与启动子连接的本发明核苷酸序列。间接连接的例子是提供适宜的间隔区，如内含子序列，如Shl-内含子或ADH内含子，连接本发明的启动子及核苷酸序列。同样，本发明的术语“融合的”包括直接或间接连接。在某些情况下，该术语不包括编码通常与野生型基因启动子有关的蛋白的核苷酸序列的天然组合，且它们都存在于其天然环境中。

所述构建体甚至可含有或表达标记，从而选择细菌，优选芽孢杆菌属中的，或已经转移到植物中的基因构建体。现有的各种标记都可使用，如编码甘露糖-6-磷酸异构酶的那些(特别对于植物而言)或提供抗生素抗性的那些标记，例如，对G418，潮霉素，博来霉素，卡那霉素和庆大霉素。

对于某些应用而言，优选本发明的构建体至少含有与启动子可操纵连接的本发明核苷酸序列。

宿主细胞

本发明中的术语“宿主细胞”包括含有上述核苷酸序列或表达载体的任何细胞，其可用于重组生产具有此处定义的特殊性质的酶。目标核苷酸与宿主细胞可以是同源或异源的。

因此，本发明另一实施方案提供用表达本发明酶的核苷酸序列转化或转染的宿主细胞。优选所述核苷酸序列携带于复制或表达核苷酸序列的载体中。选择与所述载体适合的细胞，它可以是原核生物(例如细菌)，真菌，酵母或植物细胞。

适宜的细菌宿主生物的例子是革兰氏阳性菌，如芽孢杆菌科，包括枯草芽孢杆菌，地衣型芽孢杆菌，缓慢芽孢杆菌，短芽孢杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌，嗜碱芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，凝结芽孢杆菌，灿烂芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌，链霉菌属，如鼠灰链霉菌，乳酸菌，如乳球菌亚种，如乳酸乳球菌，乳杆菌亚种，包括路氏乳杆菌，明串珠菌亚种，片球菌亚种和链球菌亚种。可选择性地，属于包括大肠杆菌的肠杆菌科，或属于假单胞菌科的革兰氏阴性菌株可被选作宿主生物。

革兰氏阴性菌大肠杆菌被广泛用作异源基因表达的宿主。然而，大量异源蛋白倾向于在细胞内积聚。随后从大量大肠杆菌胞内蛋白纯化所需蛋白时较难。

与大肠杆菌相反，革兰氏阳性菌，如芽孢杆菌属的枯草芽孢杆菌，地衣型芽孢杆菌，缓慢芽孢杆菌，短芽孢杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌，嗜碱芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，凝结芽孢杆菌，环状芽孢杆菌，灿烂芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌，苏云金芽孢杆菌，变青链霉菌或鼠灰链霉菌，可能非常适合作为异源宿主，这是由于它们分泌蛋白到培养基中的能力。适合作为宿主的其它细菌是源于链霉菌属和假单胞菌属的那些。

根据编码本发明酶的核苷酸序列的性质，和/或进一步加工所表达蛋白的需要性，优选真核生物宿主，如酵母或其它真菌。通常，酵母细胞优于真菌细胞，这是因为它们更易于操纵。然而，某些蛋白或者很难从酵母细胞中分泌，或在某些情况下不能适当加工(例如，酵母中的过度糖基化)。在这些例子中，应选择不同的真菌宿主。

典型的真菌表达宿主可选自黑色曲霉，黑色曲霉var.tubigenis，黑色曲霉var.awamori，棘孢曲霉，构巢曲霉，米曲霉，Trichodermareesei，枯草芽孢杆菌，地衣型芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，乳克鲁维氏酵母和酿酒酵母。

适宜的丝状真菌可以是，例如属于曲霉的菌株，如米曲霉或黑色曲霉，或尖孢镰孢菌株，禾谷镰孢菌株(理想状态称为Gribberellazeae，先前的Sphaeria zeae，与玫瑰色赤霉和玫瑰色赤霉f.sp.Cereals同义)，或硫色镰孢(理想状态称为虱状赤霉，Fusariumtrichothercioides，与杆孢状镰孢，接骨木镰孢，玫瑰色镰孢和玫瑰色镰孢var.graminearum同义)，Fusarium cerealis(与Fusariumcrokkwellnse同义)或Fusarium venenatum。

适宜的酵母生物可选自克鲁维氏酵母，糖酵母或裂殖糖酵母，例如，酿酒酵母，或汉逊氏酵母(UK专利申请号第9927801.2)。

适宜宿主细胞—如酵母，真菌和植物宿主细胞的应用—可提供翻译后修饰(例如，十四酰化，糖基化，截短，脂化(lapidation)和酪氨酸，丝氨酸或苏氨酸磷酸化)，这可能是赋予本发明的重组表达产物以最佳生物活性所需的。

所述宿主细胞可以是蛋白酶缺损或蛋白酶不足株。例如，可为蛋白酶缺损株米曲霉，它具有“alp”缺失的碱性蛋白酶基因。该菌株在WO97/35956中描述。

生物(organism)

本发明的术语“生物”包括任何生物，它含有编码本发明酶和/或由此获得的产物的核苷酸序列，和/或当存在于生物中时，其中的启动子可表达本发明的核苷酸序列。

适宜的生物可包括原核生物，真菌，酵母或植物。

本发明的术语“转基因生物”包括任何生物，它含有编码本发明酶和/或由其获得的产物的核苷酸序列，和/或其中的启动子可使本发明的核苷酸序列在生物内表达。优选，所述核苷酸序列被掺入到生物的基因组中。

当受到也存在于其天然环境中的它们天然启动子的控制时，术语“转基因生物”不包括它们天然环境中的天然核苷酸编码序列。

因此，本发明的转基因生物包括的生物含有编码本发明的酶的核苷酸序列的任何一个或组合，含有本发明的构建体，本发明的载体，本发明的质粒，本发明的细胞，本发明的组织，或其产物。例如，转基因生物还可含有在异源启动子的控制下，编码本发明的酶的核苷酸序列。

宿主细胞/生物的转化

如前面所述，宿主生物可以是原核生物或真核生物。适宜的原核生物宿主的例子包括大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。

有关原核生物宿主转化的教导在现有技术中已有记载，例如见Sambrook等(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd edition，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press)和Ausubel等，CurrentProtocols in Molecular Biology(1995)，John Wiley & Sons，Inc。如果使用原核生物宿主，那么需要在转化之前，适当修饰核苷酸序列—如除去内含子。

丝状真菌细胞可通过包括原生质体形成，原生质体转化，及细胞壁再生的过程，按已知方式转化。曲霉作为宿主微生物的应用在EP 0238 023中描述。

其它宿主生物可以是植物。构造遗传修饰植物的基本原理是在植物基因组中插入遗传信息，以便稳定维持所插入的遗传物质。现有插入遗传信息的技术有很多，两个主要的原理是直接引入遗传信息和利用载体系统引入遗传信息。常用技术可在Potrykus(Annu Rev PlantPhysiol Plant Mol Biol[1991]42：205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)的文章中找到。有关植物转化的其它教导可在EP-A-0449375中找到。

有关真菌，酵母和植物转化的一般教导在下列部分中提出。

转化的真菌

宿主生物可以是真菌—如霉菌。这种宿主的适宜例子包括属于Phanerochaete，Thermomyces，支顶孢属，曲霉属，青霉属，毛霉属，链孢霉属，木霉属等—如Thermomyces lanuginosis，Acremoniumchrysogenum，黑色曲霉，米曲霉，泡盛曲霉，产黄青霉，爪哇毛霉，粗糙链孢霉，绿色木霉，黄孢原毛平革菌等的任一成员。

在其中一个实施方案中，所述宿主生物可以是丝状真菌。

几乎一个世纪以来，丝状真菌已经广泛用于很多类型的工业中，用于生产有机化合物和酶。例如，传统的日本酒曲和酱油发酵已经使用了曲霉。且，在本世纪，黑色曲霉已经用于生产有机酸，如柠檬酸，以及工业所用的各种酶。

丝状真菌广泛用于工业中有2个主要原因。第一，丝状真菌可产生大量胞外产物，例如酶和有机化合物，如抗生素或有机酸。第二，丝状真菌可在低成本底物，如谷粒，麸糠，甜菜粕等上生长。同样的原因使得丝状真菌成为进行本发明异源表达的宿主的有吸引力的生物。

为了制备转基因曲霉，表达构建体是通过将本发明的核苷酸序列插入到被设计用于在丝状真菌中表达的构建体中而制备的。

目前，已经研究了几种类型用于异源表达的构建体。这些构建体优选含有一个或多个：指导所分泌氨基酸序列的信号序列，其通常属于真菌来源，以及终止表达系统的终止子(通常在真菌中是活性的)。

其它类型的表达系统已经在真菌中研究出来，在那里，本发明的核苷酸序列可与编码稳定蛋白的真菌基因的较小或较大部分融合。这样可使氨基酸序列稳定。在这种系统中，由特异性蛋白酶识别的裂解位点可被引入到真菌蛋白和氨基酸序列之间，这样所产生的融合蛋白就可在该位点被特异性蛋白酶裂解，由此释放氨基酸序列。作为举例，可引入由至少在某些曲霉中发现的KEX-2样肽酶识别的位点。这种融合导致体内裂解，产生所表达的产物，但不产生较大的融合蛋白。

编码细菌，真菌，脊椎动物和植物蛋白的若干基因已经被报道在曲霉中异源表达。如果本发明的核苷酸序列不与信号序列融合，那么蛋白可胞内沉积。这种蛋白将在胞质中积聚，通常不会糖基化，这对于某些细菌蛋白而言是有利的。如果本发明的核苷酸序列具有信号序列，那么蛋白将胞外积聚。

对于产物稳定性和宿主株的修饰而言，当它们被分泌到真菌的培养液中时，某些异源蛋白并不十分稳定。绝大多数真菌都可产生很多胞外蛋白酶，其可降解异源蛋白。为了避免这种问题，已经使用所减少蛋白酶产生的特殊真菌株作为宿主进行异源产生。

有关转化丝状真菌的教导见US-A-5741665，其中记载了转化丝状真菌和培养真菌的标准技术是本领域熟知的。用于N.Crassa的其它技术参见，例如Davis和de Serres，Methods Enzymol(1971)17A：79-143。标准过程通常用于菌株的维持和分生孢子的制备。Mycelia通常在液体培养物中生长约14小时(25℃)，见Lambowitz等，J Cell Biol(1979)82：17-31。宿主菌株通常在Vogel’s或Fries基本培养基中生长，所述培养基中还补充了适宜的营养物，如his，arg，phe，tyr，trp，对-氨基苯甲酸，和肌醇的任何一种或多种。

有关转化丝状真菌的其它教导见US-A-5674707，其中记载了一旦已经获得了一个构建体，可以线性形式或质粒形式，例如基于pUC或其它载体的形式，将它引入到所选择的丝状真菌宿主中，所使用的技术如DNA-介导的转化，电穿孔，粒子枪轰击，原生质体融合等。此外，Ballance 1991(ibid)记载了用于制备转化真菌的转化方案是以制备原生质体，然后用PEG和Ca²⁺离子将DNA引入到原生质体中为基础的。然后，所转化的原生质体再生，并使用各种选择性标记选择转化真菌。

为了选择所得的转化体，所述转化通常包括可选择的基因标记，其是用表达序列盒而被引入到相同载体上，或通过共同转化，而被引入到其中的基因标记是可选择性的宿主菌株中。各种标记/宿主系统都是可以获得的，包括与构巢曲霉的营养缺陷型菌株使用的pyrG，argB和niaD基因；米曲霉营养缺陷体的pyrG和argB基因；产黄青霉营养缺陷体的pyrG，trpC和niaD基因；和Trichoderma reesei营养缺陷体的argB基因。显性可选择标记包括amdS，oliC，hyg和phleo，现在它们也是可以得到的，并与如下丝状真菌一起使用：黑色曲霉，米曲霉，无花果曲霉，P.chrysogenum，枝顶头孢，异纹旋孢霉，苹果枯腐病霉，Fulvia fulva和Leptosphaeria maculans(见Ward in ModernMicrobial Genetics，1991，Wiley-Liss，Inc.，455-495页)。通常所用的转化标记是构巢曲霉的amdS基因，其以较高的拷贝数使真菌与作为独立氮源的丙烯酰胺一起生长。

对于丝状真菌的转化而言，已经相对于很多丝状真菌研究出了若干转化方案。在用于转化的标记之中，有很多营养缺陷型标记，如argB，trpC，niaD和pyrG，抗生素抗性标记，如苯菌灵抗性，潮霉素抗性以及腐草霉素抗性。

一方面，所述宿主生物可以是曲霉属，如黑色曲霉。

本发明的转基因曲霉还可通过下列教导制备，见Rambosek，J.和Leach，J.1987(丝状真菌中的重组DNA：发展和展望CRC Crit Rev.Biotechnol.6：357-393)，Davis R.W.1994(曲霉中的异源基因表达和蛋白分泌Martinelli S.D.，Kinghorn J.R.(编辑)曲霉：工业微生物学的50年发展vol 29.Elsevier Amsterdam 1994.525-560页)，Ballance，D.J.1991(丝状真菌的转化系统和真菌基因构建体的概述Leong，S.A.，Berka R.M.(编辑)Molecular Industrial Mycology.丝状真菌的系统和应用Marcel Dekker Inc.New York 1991.1-29页)和Turner G.1994(基因操纵的载体Martinelli S.D.，Kinghorn J.R.(编辑)曲霉：工业微生物学的50年发展vol 29.Elsevier Amsterdam 1994.641-666页)。

转化酵母

在另一实施方案中，所述转基因生物可以是酵母。

在这点上，酵母也已经被广泛用作异源基因表达的载体。

作为举例，酿酒酵母具有很长的工业使用历史，包括用于异源基因表达。异源基因在酿酒酵母中的表达已经由Goodey等，(1987，YeastBiotechnology，D R Berry等，编辑，401-429页，Allen and Unwin，London)和King等，(1989，Molecular and Cell Biology of Yeasts，E FWalton和G TYarrontoh，编辑，107-133页，Blackie，Glasgow)描述。

酿酒酵母适于异源基因表达的原因有几个。第一，它对于人是非致病性的，且不会产生某些内毒素。第二，它具有很长的安全使用历史，几个世纪以来，已经被用于各种不同目的。它还具有广泛的公众可接受性。第三，广泛的商业应用和对该生物投入的研究产生了有关遗传学和生理学的知识资源以及酿酒酵母的大规模发酵特性描述。

在酿酒酵母中进行异源基因表达的原理以及基因产物分泌的原理由E Hinchcliffe E Kenny(1993，“酵母作为异源基因表达的载体”，Yeasts，Vol 5，Anthony H Rose和J Stuart Harrison，编辑，第2nd版，Academic Press Ltd.)给出。

很多类型的酵母载体都是可以获得的，包括整合载体，其需要与维持它们的宿主基因组，和自主复制型质粒载体重组。

为了制备转基因糖酵母，通过将本发明的核苷酸序列插入到被设计用于在酵母中表达的构建体中来制备表达构建体。已经研究出了若干类型用于异源表达的构建体。所述构建体可含有在酵母中发挥活性的启动子，如酵母来源的启动子，如GAL1启动子。通常使用酵母来源的信号序列，如编码SUC2信号肽的序列。在酵母中发挥活性的终止子可终止表达系统。

相对于酵母的转化而言，已经研究出了若干转化方案。例如，本发明的转基因糖酵母可通过下列教导制备，见Hinnen等，(1978，Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75，1929)；Beggs，J D(1978，Nature，London，275，104)；和Ito，H等，(1983，J Bacteriology 153，163-168)。

转化酵母细胞可用各种选择标记选择。在用于转化的标记之中，有很多是营养缺陷型标记，如LEU2，HIS4和TRP1，以及显性抗生素抗性标记，如氨基苷类抗生素标记，例如G418。

转化植物/植物细胞

适于本发明的优选宿主生物是植物。

在这点上，构造遗传修饰植物的基本原理是将遗传信息插入到植物基因组中，以便稳定维持所插入的基因物质。

插入遗传信息的技术有几个，两个主要的原理是直接引入遗传信息和利用载体系统引入遗传信息。一般技术可见Potrykus(Annu RevPlant Physiol Plant Mol Biol[1991]42：205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)。

虽然本发明的启动子没有在EP-B-0470145和CA-A-2006454中公开，但那两篇文献都提供了某些关于技术类型的有用的背景说明，从而用于制备本发明的转基因植物。这些背景教导中的一些现包括在下列说明中。

构造遗传修饰植物的基本原理是将遗传信息插入到植物基因组中，从而稳定维持所插入的遗传物质。

因此，一方面，本发明涉及一种载体系统，其携带有本发明的核苷酸序列或构建体，而且能够将所述核苷酸序列或构建体引入到生物，如植物的基因组中。

所述载体系统可含有一个载体，但也可含有2个载体。在两个载体的情况下，所述载体系统通常被称作组合载体系统。组合载体系统在Gynheung An等(1980)，Binary Vectors，Plant Molecular BiologyManualA3，1-19中详细描述。

用于转化具有已知启动子或核苷酸序列或构建体的植物细胞的一个广泛使用的系统是以使用源于根癌土壤杆菌的Ti质粒或源于发根病土壤杆菌的Ri质粒为基础的，见An等(1986)，Plant Physiol.81，301-305和Butcher D.N.等(1980)，Tissue Culture Methods for PlantPathologists，编辑：D.S.Ingrams和J.P.Helgeson，203-208。

若干不同的Ti和Ri质粒已经构造出来，其适于构造上述植物或植物细胞构建体。这种Ti质粒的非限制性粒子是pGV3850。

本发明的核苷酸序列或构建体应优选插入到T-DNA的末端序列或相邻T-DNA序列之间的Ti-质粒中，从而避免围绕在T-DNA边缘的序列立即断裂，因为这些区中的至少一个似乎是将修饰T-DNA插入到植物基因组中所必需的。

从上述说明应当可以了解，如果生物是植物，那么本发明的载体系统优选含有感染植物所需的序列(例如，vir区)和T-DNA序列的至少一个边缘部分，所述边缘部分位于与基因构建体相同的载体上。优选所述载体系统是根癌土壤杆菌Ti-质粒或发根病土壤杆菌Ri-质粒或其衍生物，因为这些质粒是熟知的，且广泛用于构造转基因植物，现有的很多载体系统都是以这些质粒或其衍生物为基础的。

在构造转基因植物时，本发明的核苷酸序列或构建体首先是在微生物中构造的，载体可在其中复制，而且在插入到植物中前，易于操纵。有效微生物的例子是大肠杆菌，但也可使用具有上述性质的其它微生物。当已经在大肠杆菌中构造上述载体系统的载体时，如果需要，可将它转化到适宜的土壤杆菌，例如根癌土壤杆菌中。因此，优选将隐匿本发明核苷酸序列或构建体的Ti-质粒转化到适宜的土壤杆菌，如根癌土壤杆菌中，从而获得隐匿本发明核苷酸序列或构建体的土壤杆菌细胞，随后将DNA转移到所要修饰的植物细胞中。

如CA-A-2006454所报道的，大量克隆载体都是可以获得的，其含有大肠杆菌中的复制系统和选择转化细胞的标记。所述载体包括，例如，pBR 322，pUC系列，M13mp系列，pACYC 184等。

这样，本发明的核苷酸或构建体可被引入到载体的适当限制性位置中。所含的质粒用于在大肠杆菌中转化。大肠杆菌细胞是在适宜的营养培养基中培养的，然后采集并溶解。之后回收质粒。作为分析方法，通常使用序列分析，限制分析，电泳和其它生化-分子生物学方法。每次操作后，所用的DNA序列可被限制并与下一个DNA序列连接。每个序列可被克隆到相同或不同的质粒中。

每次将本发明所需的启动子或构建体或核苷酸序列引入到植物中后，其它DNA序列的存在和/或插入可能是必需的。如果，例如，进行转化时，使用植物细胞的Ti-或Ri-质粒，作为所引入基因的侧翼区，至少Ti-和Ri-质粒T-DNA的右边界，然而常常是右边界和左边界可被连接。T-DNA用于转化植物细胞的应用已经被集中研究，且在EP-A-120516；Hoekema，The Binary Plant Vector System Offset-drukkerij Kanters B.B.，Alblasserdam，1985，Chapter V；Fraley等，Crit.Rev.Plant Sci.，4：1-46；和An等，EMBO J.(1985)4：277-284中描述。

用土壤杆菌直接感染植物组织是一种简单的技术，已经广泛使用，并在Butcher D.N.等(1980)，植物病理学家的组织培养法，编辑：D.S.Ingrams和J.P.Helgeson，203-208。有关这个论题的其它教导见Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol[1991]42：205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)中描述。使用这种技术，可在植物的特定部分或组织，即叶，根，茎或植物其它部分上进行植物的感染。

通常，用携带启动子和/或GOI的土壤杆菌直接感染植物组织时，所感染的植物是受过损伤的，即用剃刀切割植物或用针刺穿植物或用磨料研磨植物。然后在伤口中接种土壤杆菌。接着，使所接种的植物或植物的一部分在适宜的培养基上生长，并发育为成熟的植物。

当植物细胞被构造时，这些细胞可按照熟知的组织培养方法生长并维持，例如在适宜的培养基中培养细胞，所述培养基中补充了必需的生长因子，如氨基酸，植物激素，维生素等。转化细胞在基因修饰植物中的再生可使用从细胞或组织培养物中再生植物的已知方法完成，例如使用抗生素选择转化的芽，在含有适宜营养物，植物激素等的培养基上再次培养该芽。

转化植物的其它技术包括冲击(ballistic)转化，碳化硅晶须(siliconwhisker carbide)技术(见Frame BR，Drayton PR，Bagnaall SV，LewnauCJ，Bullock WP，Wilson HM，Dunwell JM，Thompson JA & Wang K(1994)利用碳化硅晶须-介导的转化产生可繁殖的转基因玉蜀黍，ThePlant Journal 6：941-948)和病毒转化技术(例如，见Meyer P，HeidmannI & Niedenhof I(1992)木薯花斑病病毒作为植物载体系统的应用，Gene 110：213-217)。有关冲击转化的教导在下面的部分中提出。

有关植物转化的其它教导可在EP-A-0449375中找到。

植物和植物组织的冲击转化

正如所述，产生转基因植物的技术是本领域熟知的。通常，完整的植物，细胞或原生质体可用编码锌指分子或靶DNA的适宜核酸构建体转化(见上面核酸构建体的例子)。将转化DNA构建体引入到细胞中的方法有很多，但并不都适于把DNA送递给植物细胞。适宜的方法包括土壤杆菌感染(见，Turpen等，1993，J.Virol.Methods，42：227-239)或直接送递DNA，例如，通过PEG-介导的转化，电穿孔或DNA涂覆粒子的加速。加速法通常是优选的，包括如，微粒轰击。

最初研究产生的植物稳定转化体可抗根癌土壤杆菌所致的转化，植物组织的冲击转化可将DNA引入到金属粒子表面上的细胞中，现在已经用于检测瞬时表达过程中，基因构建体的性能。这样，基因表达可在瞬时转化的细胞中研究，没有基因在目标中的稳定整合，并由此没有稳定转化体的耗时产生。

更具体而言，冲击转化技术(也被称作粒子轰击技术)首先由Klein等[1987]，Sanford等[1987]和Klein等[1988]描述并普及，这是由于易于操纵，且无需在目标中进行细胞或组织的预处理。

粒子轰击技术的原理是通过驱动力(例如放电或压缩空气)直接将DNA-涂覆的微粒送递到完整的植物细胞中。微粒刺穿细胞壁和细胞膜，仅具有微小的损伤，然后转化细胞表达启动子构建体。

可进行的其中一个粒子轰击技术使用Particle Inflow Gun(PIG)，它是由Finer等[1992]和Vain等[1993]研制并描述的。PIG使流动氦流中的微粒加速，通过不完全真空，进入到植物细胞中。

PIG的其中一个优点是微粒的加速可通过计时器中继螺线管以及通过调节所提供的氦压来控制。加压氦作为驱动力的使用具有惰性，没有残留物和产生可再现性加速的优点。真空可降低对粒子的拖拉，在冲击之前，减少氦气分散对组织的损害[Finer等，1992]。

在某些情况下，PIG系统的有效性和简便性使它成为产生瞬时转化的瓜儿豆组织的良好选择，并测试了启动子/报道基因融合体的瞬时表达。

下面所述产生转基因植物的典型方案(特别是单子叶植物)见美国专利号第5,874,265。

用于将转化DNA片段送递给植物细胞的方法的实施例是微粒轰击。在该方法中，非生物粒子可用核酸涂覆，并通过推进力送递到细胞中。举例的粒子包括由钨、金、铂等组成的那些。

微粒轰击的特殊优点，除了可再现地稳定转化双子叶植物和单子叶植物外，还有就是既不需要分离原生质体，又不需要对土壤杆菌感染敏感。通过加速将DNA送递到植物细胞中的方法的举例实施方案是Biolistics Particle Delivery System，其可用于通过屏幕，如不锈钢或Nytex屏幕，将用DNA涂覆的粒子推进到用在混悬液中培养的植物细胞涂覆的滤器表面上。屏幕可将钨-DNA粒子分散，这样它们就不能被送递给较大聚集体中的受体细胞。据信在发射设备与所要轰击的细胞，发射聚集体之间没有屏幕干扰，且可能对于获得较高的转化频率而言太大。这可能是由于通过发射施加在受体细胞上的损害太大。

进行轰击时，优选在滤器上浓缩细胞的混悬液。含有所要轰击细胞的滤器位于macroprojectile终止平板下的适当距离。如果需要，一个或多个屏幕还可位于枪和所要轰击的细胞之间。通过上述技术的使用，可在轰击滤器上获得瞬时表达基因标记的1000或更多簇细胞(“集落”)。轰击48小时后，表达外源基因产物的集落中的细胞数为1-10，平均为2-3。

通过上述任何一种方法将外源DNA送递给受体细胞之后，优选的步骤是鉴定转化细胞，用于进一步培养和植物再生。该步骤可包括根据可筛选特征直接测定培养物，或使受到轰击的培养物与选择剂接触。

可筛选标记特征的例子是在玉蜀黍中R-座位的控制下产生的红色。该颜色可通过在含有营养培养基的固体支持物上培养细胞而检测，其中所述培养基能够在该阶段支持生长，在18℃和大于180μEm-2s-1的条件下培养细胞，并从已经着色的克隆中选择细胞(细胞的可见聚集体)。这些细胞可在混悬液中或固体培养基上进一步培养。

鉴定转化细胞的举例性方法包括使受轰击的培养物与选择剂，如代谢抑制剂，抗生素，除草剂等接触。已经转化并稳定整合的细胞，赋予所用选择剂抗性的标记基因在培养物中生长并分化。敏感细胞不能进一步培养。

为了使用bar-bialaphos选择系统，将滤器上的轰击细胞重悬浮在非选择性液体培养基中，培养(例如1-2周)并转移到覆盖了含有1-3mg/l bialaphos的固体培养基的滤器上。通常优选1-3mg/l，建议在本发明中使用0.1-50mg/l。轰击所用滤器的类型并不特别重要，可包括任何固体，多孔，惰性支持物。

与选择剂接触存活的细胞可在支持植物再生的培养基中培养。将组织维持在含有激素的基础培养基上约2-4周，然后转移到没有激素的培养基中。2-4周后，芽的发育预示了转移到其它培养基中的时间。

再生通常要求培养基的发展，其中所述培养基的组成已经被改变，从而在从转化的愈合组织向更成熟植物连续发育的阶段，提供适宜的营养物和激素信号。将正在发育的幼苗(plantlet)转移到土壤中，使之变硬，例如，在大约85％相对适度的环境可控室中，600ppmCO₂，和250μE m^-2s^-1的光。植物优选在生长室或温室中成熟。再生通常需要大约3-12周的时间。再生过程中，细胞在组织培养容器中的固体培养基上生长。这种容器的例子是陪替氏培养皿。再生植物优选在大约19-28℃下生长。再生植物已经发芽并生根后，可把它们转移到温室中进一步生长并检测。

基因组DNA可从愈伤组织细胞系及植物中分离，从而通过本领域那些技术人员熟知的技术，如PCR和/或DNA印迹来确定外源基因的存在。

很多技术都可用于插入遗传信息，两个主要原理是直接引入遗传信息，以及利用载体系统引入遗传信息。一般性技术见Potrykus(AnnuRev Plant Physiol Plant Mol Biol[1991]42：205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)的文章。

培养和产生

用核苷酸序列转化的宿主细胞可在有助于产生编码酶并促进酶从细胞和/或培养基中回收的条件下培养。

用于培养细胞的培养基可以是适于使宿主细胞生长并获得酶表达的任何常规培养基。适宜的培养基可从供应商处获得或按照公开的方法制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中所述)。

由重组细胞产生的蛋白可在细胞表面上展示(display)。如果需要，且正如本领域那些技术人员所了解的，含有编码序列的表达载体可用信号序列来设计，其指导编码序列通过特定原核生物或真核生物细胞膜的分泌。其它重组构建体可将编码序列与编码多肽结构域的核苷酸序列连接起来，其可促进可溶性蛋白的纯化(Kroll DJ等(1993)DNACell Biol 12：441-53)。

所述酶可从宿主细胞分泌，而且可通过熟知的过程，很方便地从培养基中回收，包括利用离心或过滤分离培养基中的细胞，利用盐，如硫酸铵使培养基中的蛋白成分沉淀，接着使用色谱过程，如离子交换色谱，亲和色谱等。

分泌

常常希望由表达宿主分泌的酶进入到培养基中，这样更容易回收该酶。根据本发明，分泌前导序列可根据所需的表达宿主来选择。杂种信号序列也可在本发明的范围内使用。

异源分泌前导序列的典型例子是源于真菌淀粉葡糖苷酶(AG)基因(glaA-18和24个氨基酸译本，例如来源于曲霉)，a-因子基因(酵母，例如糖酵母，克鲁维氏酵母和汉逊氏酵母)或α-淀粉酶基因(杆菌)的那些。

检测

检测及测量氨基酸序列表达的各种方法都是本领域已知的。例子包括酶联免疫吸附测定法(ELISA)，放射免疫测定法(RIA)和荧光活化细胞分选法(FACS)。利用对POI上两个非-干扰抗原决定部位反应的单克隆抗体进行的双位点、基于单克隆的免疫测定法也可使用，或使用竞争结合测定法。这些以及其它测定法都已经被描述，见Hampton R等，(1990，Serological Methods，A Laboratory Manual，APS Press，St Paul MN)和Maddox DE等(1983，J Exp Med 15 8：121 1)。

多种标记和接合技术都是本领域那些技术人员已知的，可用于各种核酸及氨基酸测定法中。产生标记杂交或PRC探针，用于检测氨基酸序列的方法包括寡标记，切口翻译，末端标记或使用标记核苷酸的PCR扩增。可选择性地，NOI，或它的任一部分，可被克隆到载体中，用于产生mRNA探针。这种载体是本领域已知的，可商业获得，并可通过加入适当的RNA聚合酶，如T7，T3或SP6以及标记核苷酸而用于体外合成RNA探针。

很多公司，如Pharmacia Biotech(Piscataway，NJ)，Promega(Madison，WI)，和US Biochemical Corp(Cleveland，OH)都可提供商业试剂盒以及这些过程的方案。适宜的报道分子或标记包括那些放射性核素，酶，荧光，化学发光，或显色剂以及底物，辅因子，抑制剂，磁性粒子等。教导使用这种标记的专利包括US-A-3,817,837；US-A-3,850,752；US-A-3,939,350；US-A-3,996,345；US-A-4,277,437；US-A-4,275,149和US-A-4,366,241。而且，重组免疫球蛋白可按照US-A-4,816,567所述生产。

测量氨基酸序列表达的其它方法包括放射性标记(Melby PC等，1993 J Immunol Methods 159：235-44)或生物素化(Duplaa C等，1993Anal Biochem 229-36)核苷酸，控制核酸的共同扩增，插入实验结果的标准曲线。多个样品的量化可通过运行ELISA测定而加速，其中目标低聚物以各种稀释度给出，且分光光度或量热反应可快速量化。

虽然标记基因表达存在与否都可表示核苷酸序列的存在，但它的存在和表达都应被证实。例如，如果核苷酸序列被插入到标记基因序列中，那么可通过标记基因功能的缺失鉴定含有核苷酸序列的重组细胞。可选择性地，在本发明启动子或可选择性启动子(优选本发明的同一启动子)的控制下，可将标记基因与核苷酸序列一前一后放置。应答诱导或选择时，标记基因的表达通常也表示氨基酸序列的表达。

可选择性地，含有核苷酸序列的宿主细胞可利用本领域那些技术人员已知的各种过程来鉴定。这些过程包括，但不限制于，DNA-DNA或DNA-RNA杂交和蛋白生物测定或免疫测定技术，其包括基于膜，基于溶液，基于芯片的技术，从而检测和/或量化核酸或蛋白。

融合蛋白

本发明的氨基酸序列可作为融合蛋白产生，例如，有助于提取和纯化。融合蛋白配偶体的例子包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，6xHis，GAL4(DNA结合和/或转录活化结构域)及(β-半乳糖苷酶)。它还可在融合蛋白配偶体与目标蛋白序列之间包括蛋白裂解位点，从而除去融合蛋白序列。优选，融合蛋白不阻碍蛋白序列的活性。

融合蛋白可含有与本发明物质融合的抗原或抗原决定子。在该实施方案中，所述融合蛋白可以是非天然存在的融合蛋白，其含有在提供免疫系统全身刺激时作为助剂发挥作用的物质。所述抗原或抗原决定子可与物质的氨基或羧基末端连接。

在本发明另一实施方案中，所述氨基酸序列可与异源序列连接，从而编码融合蛋白。例如，筛选能够影响物质活性的肽库时，它可用于编码表达异源抗原决定部位的嵌合物质，所述异源抗原决定部位可由商业获得的抗体识别。

其它POI

本发明的序列可与一个或多个其它目标蛋白(POI)或目标核苷酸序列(NOI)结合使用。

POI的非限制性例子包括：涉及淀粉代谢的蛋白或酶，涉及糖原代谢的蛋白或酶，乙酰基酯酶，氨肽酶，淀粉酶，阿拉伯聚糖酶，阿拉伯呋喃糖苷酶(arabinofuranosidases)，羧肽酶，过氧化氢酶，纤维素酶，壳多糖酶，凝乳酶，cutinase，脱氧核糖核酸酶，差向异构酶，酯酶，α-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶，α-葡聚糖酶，葡聚糖裂合酶，内切-β-葡聚糖酶，葡糖淀粉酶，葡糖氧化酶，α-葡糖苷酶，β-葡糖苷酶，葡糖醛酸糖苷酶，半纤维素酶，己糖氧化酶，水解酶，转化酶，异构酶，漆酶，脂酶，裂合酶，甘露糖苷酶，氧化酶，氧化还原酶，果胶酸酯裂合酶，果胶乙酰基酯酶，果胶解聚酶，果胶甲酯酶，pectinolytic enzymes，过氧化物酶，酚氧化酶，肌醇六磷酸酶，聚半乳糖醛酸酶，蛋白酶，鼠李-galacturonases，核糖核酸酶，祝马丁，转移酶，转运蛋白，转谷氨酰胺酶，木聚糖酶，己糖氧化酶(D-己糖：O₂-氧化还原酶，EC 1.1.3.5)或其组合。POI甚至可以是那些序列任何一个的反义序列。

POI甚至可以是融合蛋白，例如帮助提取和纯化。

融合蛋白配偶体的例子包括麦芽糖结合蛋白，谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，6xHis，GAL4(DNA结合和/或转录活化结构域)及β-半乳糖苷酶。它还可在融合组份之间包括蛋白裂解位点。

POI甚至可与分泌序列融合。分泌前导序列的例子是来源于淀粉葡糖苷酶基因，α-因子基因，α-淀粉酶基因，脂酶A基因，木聚糖酶A基因的那些。

其它序列还可促进分泌或增加分泌POI的产率。这种序列可编码伴侣蛋白，例如，在UK专利申请9821198.0中描述的黑色曲霉cyp基因的产物。

对NOI进行工程改造从而改变它们活性的原因有很多，包括但不限制于，改变其表达产物的加工和/或表达。例如，可使用本领域熟知的技术，例如，定点诱变引入突变，从而插入新的限制性位点，改变糖基化模式或偏爱密码子。作为举例，还可对NOI进行修饰，从而优化在特定宿主细胞中的表达。还可进行其它序列改变，从而引入限制性酶识别位点。

NOI内可包括合成或修饰的核苷酸。对寡核苷酸进行的各种不同类型的修饰是本领域已知的。这些包括甲基膦酸盐或硫代磷酸盐主链，在分子的3’和/或5’末端加入吖啶或聚赖氨酸链。对于本发明而言，应当理解NOI可被本领域的任何方法修饰。进行这种修饰可提高NOI的体内活性或使用期限。

NOI可被修饰增加胞内稳定性及半衰期。可能的修饰包括，但不限制于，加入分子5’和/或3’末端的侧翼序列，或使用硫代磷酸盐或2’O-甲基，而不是分子主链内的磷酸二酯酶。

抗体

本发明一方面涉及与权利要求1的一个或多个氨基酸序列进行免疫反应的氨基酸序列。

抗体可通过标准技术，如用本发明的物质免疫，或使用噬菌体展示库产生。

对于本发明而言，除非另有说明，术语“抗体”包括但不限制于，多克隆，单克隆，嵌合，单链，Fab片段，由Fab表达库产生的片段，及其模拟物。这种片段包括整个抗体的片段，其保留了它们对靶物质的结合活性，FV，F(ab’)和F(ab’)₂片段，以及单链抗体(scFv)，融合蛋白和其它合成蛋白，其含有抗体的抗原-结合位点。此外，抗体及其片段还可以是人源化抗体。中和抗体，即抑制物质多肽生物活性的那些，对于诊断和治疗是特别优选的。

如果需要多克隆抗体，用本发明的序列(或含有其免疫抗原决定部位的序列)使所选择的哺乳动物(例如，小鼠，兔子，山羊，马等)免疫。根据宿主种类的不同，可使用各种助剂来增加免疫应答。这种助剂包括，但不限制于Freund’s，矿物质凝胶，如氢氧化铝，和表面活性物质，如溶血卵磷脂，pluronic polyols，聚阴离子，肽，油乳胶，匙孔戚血蓝蛋白，和二硝基酚。BCG(Bacilli Calmette-Guerin)和Corynebacterium parvum是潜在有效的人类助剂，如果将纯化物质的多肽给予无免疫应答的个体来刺激系统防御，那么可使用它。

采集免疫动物的血清，并按照已知的过程处理。如果含有本发明序列(或含有其免疫抗原决定部位的序列)的多克隆抗体的血清含有其它抗原的抗体，那么所述多克隆抗体可利用免疫亲和色谱纯化。生产并加工多克隆抗血清的技术是本领域已知的。为了制备这种抗体，本发明还提供相对于其它多肽haptensied本发明多肽或其片段作为动物或人的免疫原。

针对本发明序列的单克隆抗体(或含有其免疫抗原决定部位的序列)可由本领域的技术人员很容易地生产出来。利用杂交瘤制备单克隆抗体的一般性方法是熟知的。产生无限增殖抗体的细胞系可通过细胞融合创造，还可利用其它技术，如用致癌基因DNA直接转化B淋巴细胞，或用Epstein-Barr病毒转染而创造。筛选相对于轨道抗原决定部位产生的单克隆抗体组的各种性质，即同型和抗原决定部位的亲和性。

本发明序列(或含有其免疫抗原决定部位的序列)的单克隆抗体可使用任何技术制备，其利用培养物中的连续细胞系生产抗体分子。这些包括，但不限制于，最初由Koehler和Milstein(1975 Nature256：495-497)描述的杂交瘤技术，人B-细胞杂交瘤技术(Kosbor等，(1983)Immunol Today 4：72；Cote等，(1983)Proc Natl Acad Sci80：2026-2030)和EBV-杂交瘤技术(Cole等，(1985)MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy，Alan R Liss Inc，77-96页)。此外，为生产“嵌合抗体”而研究的技术，可使用从小鼠抗体基因向人抗体基因剪接，从而获得具有适宜抗原特异性和生物活性分子的方法(Morrison等，(1984)Proc Natl Acad Sci 81：6851-6855；Neuberger等，(1984)Nature 312：604-608；Takeda等，(1985)Nature 314：452-454)。可选择性地，生产单链抗体的技术(美国专利号第4,946,779)适于生产物质特异性单链抗体。

抗体还可通过在淋巴细胞群中诱导体内产生或筛选重组免疫球蛋白库或高度特异性结合试剂组而生产，见Orlandi等，(1989，Proc NatlAcad Sci 86：3833-3837)，和Winter G和Milstein C(1991；Nature349：293-299)。

还可产生含有物质特异性结合位点的抗体片段。例如，这种片段包括，但不限制于，F(ab’)₂片段，其可通过抗体分子的胃蛋白酶消化产生，和Fab片段，其可通过还原F(ab’)₂片段的二硫键产生。可选择性地，可构造Fab表达库，从而快速并简单地鉴定具有所需特异性的单克隆Fab片段(Huse WD等，(1989)Science 256：1275-1281)。

大规模应用

在本发明其中一个优选实施方案中，大规模应用所述氨基酸序列。

优选，培养宿主生物后，所述氨基酸序列以1g/升-约2g/升总细胞培养物体积的量生产。

优选，培养宿主生物后，所述氨基酸序列以100mg/升-约900mg/升总细胞培养物体积的量生产。

优选，培养宿主生物后，所述氨基酸序列以250mg/升-约500mg/升总细胞培养物体积的量生产。

概述

总之，本发明涉及氨基酸序列及核苷酸序列，还涉及含有它们的构建体。本发明还涉及已知酶的新用途。

参考附图，在下列非限制性实施例中进一步举例说明本发明，其中：

图1表示在8-25％梯度的凝胶上，对PD1(吡喃邻酮醛糖脱水酶同种型1)进行电泳。更具体而言，图1A表示SDS-PAGE：(左数)第1和2道分别是源于Novex和Pharmacia的蛋白标记，第3，4和5道是纯化的PD1。图1B，表示Native PAGE：第1，2和3道是纯化的PD1，第4道是源于Pharmacia的蛋白标记，第5道是部分纯化的。凝胶用源于Pharmacia的PhastGel Blue R染色。

图2表示吡喃邻酮醛糖脱水酶的部分氨基酸序列。

图3A举例说明1，5-脱水-D-果糖和PD用于生产薄闭壳素的应用。反应混合物含有1，5-脱水-D-果糖5μl(3.0％)，PD制剂5μl，65μl磷酸钠缓冲液(pH 6.0)和补足至0.7ml终体积的水。反应可通过在350-190nm之间扫描来监测。将第0分钟的反应时间用作空白。约230nm处的吸光度峰值表示薄闭壳素的形成。265nm处的吸光度表示在转化成薄闭壳素之前，从AF首先形成中间体。

图3B举例说明薄闭壳素的产生及其中间体。反应混合物含有10μl部分纯化的PD(源于黄孢原毛平革菌、没有细胞的提取物的25-50％饱和度之间的硫酸铵部分)，25μl AF(3.0％，w/v)，100μl磷酸钠缓冲液(0.1M，pH6.5)和0.84ml水。反应是通过加入底物AF而开始的。反应在22℃进行。薄闭壳素及其中间体的形成分别在230nm和263nm处监测。可见到首先形成中间体，且水平在大约20分钟后稳定。薄闭壳素的形成延迟，但它的形成一直持续到反应混合物中的所有AF几乎都被消耗。

图4表示SEQ ID NO.1，编码源于真菌Phaherochaete chrysosporium的吡喃邻酮醛糖脱水酶(PD)的基因，其包括上游调节区(-1--288)，编码区(1-3146)和下游区(3147-3444)。推定的起始密码子是ATG(粗体)，终止密码子是TGA TAG(粗体)。如果假设翻译从粗体密码子ATG开始，那么纯化的功能性PD对应于从PD N-末端截短的7-氨基酸。

图5表示源于真菌黄孢原毛平革菌的吡喃邻酮醛糖脱水酶(PD)基因的上游区，编码区和下游区。理论上，所述DNA序列可编码具有不同氨基酸序列的3种蛋白。粗体氨基酸是通过对纯化功能性PD进行氨基酸测序而找到的那些。鉴定的内含子是下面划线的那些。

图6表示按照实施例3处理过的甜菜种子的最终萌发(emergence)。

图7表示相对于引起甜菜根腐烂的病原体螺壳状丝囊霉，筛选不同浓度薄闭壳素的作用。图8和9分别表示相对于引起甜菜根腐烂的病原体终极腐霉和茄属丝核菌，筛选不同浓度薄闭壳素的作用。

实施例

从真菌Phanerochaete chrysosporium纯化的吡喃邻酮醛糖脱水酶

黄孢原毛平革菌(白腐真菌)是生物技术上很重要的真菌，这是由于它较高的生长最佳温度(40℃)及其产生各种胞外氧化酶的能力。因此，这种真菌已经用于处理各种垃圾，包括爆炸污染物，农药，和有毒垃圾。此外，黄孢原毛平革菌是被测序的第一个担子菌基因组(University of California and Department of Energy，USA)。

在寻找代谢脱水果糖(AF)的酶时，纯化的热稳定性吡喃邻酮醛糖脱水酶(PD)是从P.chrysosporium获得的。研究显示，这种纯化PD不仅使用AF作为底物，而且它较之天然底物葡糖醛酮更有效。此外，产物为薄闭壳素，一种用于植物保护的抗真菌剂。

用两种蛋白酶水解后，阐明PD的N-末端序列，和PD的内切-N-末端序列。以它具有97kDa的Mr的假设为基础，这些加在一起为332个氨基酸或占PD蛋白全长的37％。

通过使用上述部分氨基酸序列在真菌基因组上进行数据库检索，在Scaffold 62中鉴定了全长PD基因(图4)。鉴定了转录起始和终止密码子及3个内含子(图4)。似乎纯化PD是从N-末端截下来的7个氨基酸，但仍然是功能性的。因为在培养基中没有发现酶PD，因此它可能没有信号肽。

测定法

测量PD活性

反应混合物含有25μl脱水果糖溶液(3.0％)，10μl PD制剂，93μl0.1M磷酸钠(pH 6.5)，和补足至1ml终体积的水。混合反应，每5分钟于室温(22℃)在190-320nm之间扫描，或30分钟后在Perkin ElmerLambda 18 uv/vis分光光度计上扫描。记录260和230nm处的吸光度值。将PD的一个活性单位定义为22℃、230nm下，每分钟吸光度单位增加0.01。

蛋白测定法是用Bio-Rad法(Bradford method)进行的，其中使用了源于Bio-Rad实验室的试剂和规程[Peterson，GL：总蛋白的测定，Methods Enzymol.91，95-119(1983)]。

分离葡糖醛酮，AF和薄闭壳素的TLC是在使用乙酸乙酯，醋酸，甲醇和水(12∶3∶3∶2)的溶剂系统之前，按照所述进行的[Yu S，AhmadT，Pedersén M，Kenne L：α-1，4-葡聚糖裂合酶，一类新的淀粉/糖原降解酶.III.底物特异性，作用模式，和裂解机理，Biochim Biophys Acta1244：1-9(1995)]。使用厚度为0.15mm的Merck硅胶60(20×20cm)平板。1，5-脱水-D-果糖是利用DNS法测定的[Yu S，Olsen CE，MarcussenJ：1，5-脱水-D-果糖和α-1，4-葡聚糖裂合酶的测定法，Carbohydr.Res.305：73-82(1998)]。

PD的纯化

所用的纯化过程基本上与Gabriel等，(1993)描述的相同，区别在于所用菌株不同。此外，还包括了额外的硫酸铵分级分离步骤。本次使用的菌株是源于美国典型培养物保藏中心的黄孢原毛平革菌(ATCC 32629)和(ATCC 24725)，而Gabriel等，(1993)所用的菌株是从Czechish保藏中心获得的黄孢原毛平革菌k-3。

将Phanerochaete crysosporium没有细胞的提取物培养至55％硫酸铵饱和。然后轻轻混合2小时，4℃、10000xg离心20分钟。将具有PD活性的沉淀物溶解在相同体积的提取缓冲液中，再次离心，通过Gabriel等(1993)描述的过程，从上清液中纯化PD。

PD纯化后，进行SDS-PAGE，并按照制造商的说明，使用8-25％梯度凝胶的PhastSystem(Pharmacia)进行天然-PAGE。凝胶上的蛋白带是用考马斯亮蓝(PhastGel Blue R)染色观察的。从图1A可看出，PD1具有97kDa的分子量，以及与蛋白标记磷酸化酶b(97.4kDa)相似的迁移速率。

氨基酸测序

对纯化PD进行氨基酸测序。PD的氨基酸测序是按照先前所述进行的[Yu.S.；Christensen TMIE，Kragh KM，Bojsen K，Marcussen J：源于真菌的2个α-1，4-葡聚糖裂合酶的有效纯化，特性描述，和部分氨基酸测序Biochim Biophys Acta 1339：311-320(1997)]。首先用蛋白酶部分水解PD。在HPLC上分离所产生的肽片段。收集每个单个的多肽，通过质谱测定分子量，并使用脉冲-液体快速循环在AppliedBiosystems 476A测序仪上测序。进一步描述PD的pH和最佳温度，活性，稳定性，及其它动力学性质的离子要求。

从真菌黄孢原毛平革菌纯化的吡喃邻酮醛糖脱水酶获得的氨基酸序列

下列氨基酸序列是通过胰蛋白酶或内切蛋白酶LysC消化而获得的。利用反相HPLC进行肽的纯化，并利用MALDI-TOF质谱仪产生分子量的信息。然后将所获得的序列与由加利福尼亚大学进行的White Rot Genome(黄孢原毛平革菌)工程中的DNA序列进行比较。序列相似性对比是用BLAST算法进行的。

产生显著序列对比的所有肽都是在Scaffold 62中找到的。

LysC肽

肽27.3(N末端)

KPHCEPEQPAALPLFQPQLVQGGRPDXYWVEAFPFRSDSSKV

可能的异质性

该肽是从碱基对38620-38742找到的。在碱基对38599和38317处有一个起始密码子，表示可能的信号肽。通过对蛋白PD2，一种同功酶进行测序证实了这是蛋白的N末端。

残基27上的X是数据库中的G，这与MS数据匹配。

MSc+＝4669.10  MSo+＝4668.01-0.023％

N-末端

吡喃邻酮醛糖脱水酶的同功酶I(PDI)的N-末端是：KPHXEPEQPAALPLFQPQLVV(Q)GGRPDXY

X未知。V(Q)是指它可以是V或Q或两者皆可(由于异质性)。

上述N-末端序列(肽27.3)是同功酶II(PDII)。PDI和PDII的N-末端非常相似或相同。

肽31.4b

SDIQMFVNPYATTNNQSSXWTPVSLAKLDFPVAMHYADITKD

可能的异质性

这个肽是从碱基对38788-38963发现的。数据库序列被源于碱基对38836-38889的内含子中断。残基28-41的序列是利用胰蛋白酶肽8.4证实的。

残基19上的X是数据库序列中的S，与MS数据匹配。

MSc+＝4591.22  MSo+＝4591.55+0.007％

胰蛋白酶肽

肽6a

VSWLENPGELR

该肽是从碱基对39096-39128发现的。

MSc+＝1300.44  MSo+＝1300.45+0.001％

肽5

DGVDCLWYDGAR

该肽是从碱基对39426-39461发现的。

MSc+＝1427.48  MSo+＝1427.48

LysC肽

肽27.4a

PAGSPTGIVRAEWTRHVLDVFGXLXXK

该肽是从碱基对39673-39753发现的。

3个X’是数据库中的PNG，与MS数据匹配。

MSc+＝2876.27  MSo+＝2876.80+0.021％

肽29.4.8

HTGSIHQVVCADIDGDGEDEFLVAMMGADPPDFQRTGVWCYK

该肽是从碱基对39754-39879发现的。

MSc+＝4727.13  MSo+＝4727.70+0.012％

肽13.11

TEMEFLDVAGK

该肽是从碱基对40244-40276发现的。

MSc+＝1240.42  MSo+＝1240.53+0.009％

肽14.2

KLTLVVLPPFARLDVERNVSGVK

该肽是从碱基对40277-40345发现的。

MSc+＝2552.08  MSo+＝25551.35-0.029％

胰蛋白酶肽

肽10.5

SMDELVAHNLFPAYVPDSVR

该肽是从碱基对40526-40585发现的。

MSc+＝2259.55  MSo+＝2259.77+0.009％

LysC肽

肽31.4a

NDATDGTPVLALLDLDGGPSPQAWNISHVPPGTDMYEIAHAK

该肽是从碱基对41293-41469发现的，并含有源于碱基对41362-41416的内含子。

MSc+＝4289.73  MSo+＝4289.45-0.007％

肽2b

TGSLVCARWPPVK

该肽是从碱基对41470-41508发现的。

MSc+＝1471.71  MSo+＝1472.62+0.062％

肽2a

NQRVAGTHSPAAMGLTSRWAVTK

该肽是从碱基对41509-41577发现的。

MSc+＝2440.71  MSo+＝2441.58+0.036％

肽11.3

GQITFRLPEAPDHGPLFLSVSAIRHQ

该肽是从碱基对41641-41718发现的。

MSc+＝2888.34  MSo+＝2888.25-0.031％

该肽不用K终止，其表示C末端。该序列后面还接有终止密码子。

该蛋白的分子量约为97KD。基于氨基酸的平均分子量为110的假设，残基数应为880，可产生总数为2640的碱基对。

根据数据库序列计算的碱基对数为3100。两个已知的内含子含有53和54个碱基对，如果假设该数字是标准的，那么预期数据库序列含有约8个内含子。

这里测序的残基总数为332个氨基酸，占蛋白的37％。

实施例1：1，5-脱水-D-果糖和PD在生产薄闭壳素中的应用

反应混合物含有1，5-脱水-D-果糖5μl(3.0％)，PD制剂5μl，65μl磷酸钠缓冲液(pH 6.0)和补足至0.7ml体积的水。反应是通过在350-190nm之间扫描而监测的。将第0分钟的反应时间用作空白。230nm附近的吸光度峰值表示薄闭壳素的形成。265nm处的吸光度表示在转化成薄闭壳素之前，首先从AF形成中间体。

所形成的薄闭壳素可通过TLC上的相对迁移速率被进一步证实，2-呋喃羟甲基酮的转化在275nm处显示出典型的吸光度峰值[BauteM.-A.等，1986]。

在大规模生产薄闭壳素时，使用0.4％-20％的AF。反应之后，使用DNS法除去反应混合物中的AF[Yu.S.；Christensen TMIE，KraghKM，Bojsen K，Marcussen J，Biochim Biophys Acta 1339：311-320(1997)]。薄闭壳素的形成是在265nm处监测的，然后移至230nm处，并利用TLC法进一步监测。

较之天然底物葡糖醛酮，1，5-脱水-D-果糖是吡喃邻酮醛糖脱水酶(PD)的更好底物。使用AF获得的Vmax比使用葡糖醛酮获得的要高约4.7倍(表1)。

表1

终底物浓度(μg/ml反应混合物)	用AF作为底物的OD226nm	用葡糖醛酮作为底物的OD226nm
			13.7	0.308	0.069
27.4	0.534	0.104
			41.1	0.76	0.141

68.4	1.246	0.238
			95.8	1.764	0.323
137	2.43	0.484
			205	2.943	0.634

反应系统含有AF或葡糖醛酮1-15μl，25μl磷酸钠缓冲液(6.5.0.1M)，水，1.4μl PD，终体积200μl。反应在22℃进行5.5小时。在226nm处监测薄闭壳素自AF的形成，和蓝草菌酮自葡糖醛酮的形成。

实施例2：蓝草菌酮的产生

蓝草菌酮可一步产生，如通过将淀粉型底物，如含蜡淀粉，糊精，与淀粉水解酶，如淀粉葡糖苷酶和脱支酶或环糊精转移酶，吡喃糖2-氧化酶，和PD一起培养。培养后，通过使用300-30,000，优选10,000的截止膜超滤而分离出反应混合物中的蓝草菌酮。

实施例3：1，5-脱水-D-果糖，PD及子囊吡喃酮P合酶生产APP的应用

反应混合物含有1，5-脱水-D-果糖50μl(3.0％)，PD制剂5μl，子囊吡喃酮P合酶5μl，0.1ml磷酸钠缓冲液(pH 6.0)和补足至0.8ml的水。通过289nm处APP的形成而分光光度监测该反应。反应温度为22℃，反应时间为24小时。最后，有90％的AF转化成了APP。APP的结构是用先前所述的NMR证实的[WO 00/56838，于16/3/00提交，要求19/3/99提交的GB9906457.8的优先权]。

PD基因的表达

利用本领域熟知的技术和此前说明书中提到的参考文献，可在生物，如巴斯德毕赤氏酵母，黑色曲霉，和多形汉逊氏酵母中表达PD基因。

抗体产生

用纯化酶给兔子注射，并分离抗血清中的免疫球蛋白，可培养本发明氨基酸的抗体，见N Harboe和A Ingild(“免疫，免疫球蛋白的分离，抗体滴定度的评估”，A Manual of QuantitativeImmunoelectrophoresis，Methods and Applications，N H Axelsen等，(编辑)，Universitetsforlaget，Oslo，1973)和T G Cooper(“The Tools ofBiochemistry”，John Wiley & Sons，New York，1977)。

薄闭壳素抗真菌

真菌在植物中生长可引起巨大的经济损失。例子是它们对甜菜幼苗和它们叶子的损害。只要甜菜种子在土壤中发芽，它就会立即与真菌如茄属丝核菌，终极腐霉，螺壳状丝囊霉接触，受到攻击。在本发明中，人们发现薄闭壳素能够抑制引起这些疾病的真菌的生长。因此，用含有50-2000ppm薄闭壳素的糊状物涂覆经济作物的种子，如甜菜种子，并在种植前干燥。可选择性地，可将薄闭壳素的水溶液直接喷在植物及其叶子上。

实验

基础薄闭壳素溶液：24mg/ml Batch no.Mic20011016

所用稀释度：

稀释倍数	浓度
		5	4.8mg/ml
10	2.4mg/ml
		20	1.2mg/ml
50	0.48mg/ml
		100	0.24mg/ml

所有溶液都是通过用于灭菌的0.22μm过滤器过滤的。

相对于下列真菌测试该溶液：

真菌	甜菜的病
		茄属丝核菌	根腐烂

终极腐霉	根腐烂
		螺壳状丝囊霉	根腐烂
菾菜尾孢	叶生斑

将新鲜菌丝体的环状孢塞(直径10mm)放在含有PDA培养基的陪替氏培养皿(直径9cm)的中央。(PDA＝马铃薯葡萄糖琼脂Difcono.213400)。沿着琼脂平板的周围切割一个直径5mm的孔。在每个孔中放50μl试验溶液。可选择性地，将20μl各试验溶液沿着平板周围直接放在琼脂上。并且，将50μl各试验溶液直接放在真菌菌丝体的孢塞上。

室温时，将琼脂平板放在日光下，但避免直接日晒。

真菌对试验物质的反应(抑制区)如下判断：

茄属丝核菌：      生长2-3天后

终极腐霉：        生长1-2天后

螺壳状丝囊霉：    生长3-4天后

菾菜尾孢：        生长3-4周后

结果

作为真菌生长调节剂的薄闭壳素可抑制，终极腐霉，螺壳状丝囊霉和菾菜尾孢。薄闭壳素对真菌的最小抑制浓度(mic)分别为240，480，1200和2400ppm。

实施例4：薄闭壳素对颗粒状(pelleted)甜菜种子的作用

薄闭壳素对植物病原性真菌终极腐霉，茄属丝核菌和螺壳状丝囊霉的体外作用是通过筛选琼脂平板上病原体的生长抑制而研究的(图6，7，8)。

图7表示不同浓度薄闭壳素对螺壳状丝囊霉的筛选作用，而图8和9分别表示对终极腐霉和茄属丝核菌的筛选作用。在各种情况下，都是将薄闭壳素溶解在水中，放在周围的孔中。将含有病原体的琼脂块放在中央。使病原体在PDA-琼脂平板上生长3-5天。这些研究结果显示，极低浓度的薄闭壳素能够减少丝囊霉的生长。

使用其它微生物进行的类似试验表明，薄闭壳素对尾孢没有作用。对假单胞菌(荧光假单胞菌DS96.578，门多茜娜假单胞菌DS98.124)的影响较小，而对芽孢杆菌的生长没有影响(短小芽孢杆菌DS96.734，巨大芽孢杆菌DS98.124)。

以这些发现为基础，在田间试验中进一步研究薄闭壳素的作用。该试验的播种时间相对较晚，这样病原体丝囊霉在试验田中存在的机会更高。

材料和方法

                                        Pellet TKW

1.Manhattan CAC-7-2306 kb5，3,0-4,25mm，19,2(7)19,1(1)

2.Tower     MIT-1-0290 kb5，3,0-4,25mm，17,3(8)17,8(2)

使用具有(1，2)或没有(7，8)Thiram的标准P1造粒使种子成颗粒状。

标准种子涂覆：

内层涂覆：0.3gai/U薄闭壳素，0.5％水溶液或

14.7gai/U Hymexazol

60gai/U Imidacloprid

标准金属绿的种子覆盖薄膜

试验包括下列组合：

R FO       没有杀真菌剂

R FT       Thiram(颗粒状)

R FH       Hymexazol

R FM       薄闭壳素

R P1 STD   Thiram(颗粒状)+Hymexazol

R FTM      Thiram(颗粒状)+薄闭壳素

试验位置   Bukkehave，DK.(4reps，200个种子/块地)

试验播种   21.05.2002

1.Count    28.05.2002(速度)

2.Count    29.05.2002(速度)

3.Count    24.06.2002(最终)

结果

实验室和田间的数字在表2中给出(试验性FEHCP034丝囊霉)。最终数字在图6中表示。

表2

											TSV						相对FE
																				登录FE名	FEn o	Variety	类型	3d	4d	4d＞15	7d	MM	Tvil	Abn	7d	14d	21d	FE1	FE2	FE3	1	2	3
丝囊霉PLACE：Buk
																				1 R FO1 R FO1 R FO	700701	1 Manhattan2 Tower	PP		839287,5	94125,0	9910099,5	10099100	0,310,7	0,300,2				36,333,334,8	96,598,797,6	183,0191,7187,3	100	100	99
2 R FT2 R FT2 R FT	702703	1 Manhattan2 Tower	PP		829488,0	104025,0	999999,0	10099100	0,30,50,4	000,0				38,038,638,3	100,8108,5104,6	176,3188,0182,1	110	108	97
																				3 R FH3 R FH3 R FH	704705	1 Manhattan2 Tower	PP		888787,5	62415,0	1009999,5	999999	0,50,80,7	00,30,2				23,828,326,0	77,894,386,0	186,5191,3188,9	75	88	100
4 R FM4 R FM4 R FM	706707	1 Manhattan2 Tower	PP		687672,0	153726,0	969796,5	10099100	00,50,3	0,300,2				37,038,337,6	101,3103,5102,4	188,5195,8192,1	108	105	102
																				5 STD P15 STD P15 STD P1	12	1 Manhattan2 Tower	PP		828885,0	3159,0	999999,0	100100100	000,0	000,0	95116105,	888486,0	908185,5	30,035,032,5	82,894,386,5	188,5193,3190,9	94	91	101
6 R FTM6 R FTM6 R FTM	708709	1 Manhattan2 Tower	PP		647167,5	134529,0	1009999,5	10099100	00,50,3	000,0				39,339,539,4	98,5110,8104,6	185,0194,3189,6	113	108	101
																				Opsummering for‘Place’＝Buk(12 detaljeposter)Gnsnt				3d	4d81,3	4d＞1521,5	7d98,8	MM100	Tvil0,4	Abn0,1	7d105,	14d86,0	21d85,5	FE134,8	FE297,3	FE3188,5

实验室研究的结果表明，薄闭壳素可降低实验室发芽的速度(4天)，但在4天＞15mm的图中没有反映。这与hymexazol的作用相反，其具有较低的4天＞15mm发芽。

有关发芽速度，田间试验表明，单独含有hymexazol，或者同时含有hymexazol及Thiram的颗粒发芽相对较慢(正如根据4天＞15mm的实验室发芽预期的)。含有薄闭壳素的颗粒的发芽速度可与仅含Thiram的颗粒相比较。

与含有Thiram颗粒的快速发芽相反，含有薄闭壳素的颗粒显示较高的最终发芽(可与含Hymexazol的颗粒相比较)。

虽然引起根腐烂的病原体的试剂攻击十分有限，但FT-区中的(约)4％幼苗的缺失是由病原体对幼苗的攻击所引起，所述病原体(大概绝大多数丝囊霉)可由Hymexazol控制。FT-区中的最终幼苗数低于FO(没有杀真菌剂)区中的幼苗数。这可由Thiram的作用来解释，其可控制其它微生物，但不能控制丝囊霉，由此使得丝囊霉很容易进入幼苗中。

含薄闭壳素的颗粒是限制快速发芽和较高的最终发芽的唯一颗粒。因此，据信薄闭壳素可成为昂贵的化学品hymexazol的替代品。

上面说明书中的提到的所有公开出版物都引入此处作为参考。在不背离本发明范围和精神的前提下，本发明所述方法和系统的各种改进和变化对于本领域那些技术人员而言是显而易见的。虽然已经联系具体优选的实施方案对本发明进行了描述，但应当理解，本发明的保护范围不应被限制在这种具体的实施方案。事实上，进行本发明的所述模式的各种改进对于分子生物学或相关领域的那些技术人员而言是显而易见的，被认为包括在下列权利要求的范围之内。

Claims (46)

1.一种含有选自下列至少一个氨基酸序列的分离多肽，或其变体、同系物或衍生物：

(i)KPHCEPEQPAALPLFQPQLVQGGRPDXYWVEAFPFRSDSSK或KPHXEPEQPAALPLFQPQLVV(Q)GGRPDXY；

(ii)SDIQMFVNPYATTNNQSSXWTPVSLAKLDFPVAMHYADITK；

(iii)VSWLENPGELR；

(iv)DGVDCLWYDGAR；

(v)PAGSPTGIVRAEWTRHVLDVFGXLXXK；

(vi)HTGSIHQVVCADIDGDGEDEFLVAMMGADPPDFQRTGVWCYK；

(vii)TEMEFLDVAGK；

(viii)KLTLVVLPPFARLDVERNVSGVK；

(ix)SMDELVAHNLFPAYVPDSVR；

(x)NDATDGTPVLALLDLDGGPSPQAWNISHVPPGTDMYEIAHAK；

(xi)TGSLVCARWPPVK；

(xii)NQRVAGTHSPAAMGLTSRWAVTK；

(xiii)GQITFRLPEAPDHGPLFLSVSAIRHQ；

其中X是未知的氨基酸残基。

2.根据权利要求1所述的多肽，其含有选自权利要求1的至少一个序列。

3.根据权利要求1或2所述的多肽，其具有吡喃邻酮醛糖脱水酶活性。

4.一种多肽，其可与针对纯化的权利要求1-3任何一项所述的多肽产生的抗体进行免疫反应。

5.一种分离多核苷酸，它编码权利要求1-4任何一项所述的多肽或其变体、同系物、片段或衍生物。

6.根据权利要求5所述的分离多核苷酸，其选自：

(i)含有SEQ ID NO.1的核苷酸序列或其互补序列的多核苷酸；

(ii)含有能够与SEQ ID NO.1的核苷酸序列杂交的核苷酸序列或其片段的多核苷酸；

(iii)含有能够与SEQ ID NO.1的核苷酸序列的互补序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸；和

(iv)含有由于SEQ ID NO.1多核苷酸的遗传密码简并性而产生的多核苷酸序列的多核苷酸。

7.根据权利要求5，6或7任何一项所述的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列可从黄孢原毛平革菌，卵形多孔菌或蓝色伏革菌获得。

8.根据权利要求5，6或7任何一项所述的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列可从盘菌目，木耳目，多孔菌目，蘑菇目或Gracilariales获得。

9.根据权利要求5，6或7任何一项所述的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列可从橙黄网孢盘菌，疣孢褐盘菌，多汁盘菌，Sarcophaeraexinaia，尖顶羊肚菌，肋纹羊肚菌，弹丝羊肚菌，可食羊肚菌，圆形可食羊肚菌，M.hortensis，赭鹿花菌，肠膜状木耳，Pulcherriciumcaeruleum，栎隔孢伏革菌，Phanerochaete sordida，Vuilleminiacomedens，烟色纫革菌，血痕韧革菌，Lopharia spadicea，柠檬绣球菌，Boletopsis subsquamosa，黑刺烟管菌，Trichaptum biformis，Cerrenaunicolor，朱红密孔菌，血红密孔菌，Junghunia nitida，黄色枝瑚菌，微黄拟锁瑚菌，微黄拟锁瑚菌var.geoglossoides，绚丽拟锁瑚菌，Clitocybe cyathiformis，C.dicolor，C.gibba，C.odora，Lepistacaespitosa，L inversa，L.luscina，L.nebularis，Mycena seynii，Pleurocybella porrigens，Marasmius oreales，Inocybe pyriodora，Gracilaria varrucosa，Gracilaria tenuistipitata，Gracilariopsis sp，或Gracilariopsis lemaneiformis获得。

10.一种分离多核苷酸，其选自：

(i)含有SEQ ID NO.1的核苷酸序列或其互补序列的多核苷酸；

(ii)含有能够与SEQ ID NO.1的核苷酸序列杂交的核苷酸序列或其片段的多核苷酸；

(iii)含有能够与SEQ ID NO.1的核苷酸序列的互补序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸；和

(iv)含有由于SEQ ID NO.1多核苷酸的遗传密码简并性而产生的多核苷酸序列的多核苷酸。

11.一种含有权利要求5-10任何一项所述的核苷酸序列的构建体。

12.一种含有权利要求5-10任何一项所述的核苷酸序列的载体。

13.一种含有权利要求5-10任何一项所述的多核苷酸序列的表达载体，所述多核苷酸序列与能够指导所述多核苷酸在宿主细胞中表达的调节序列可操纵连接。

14.一种宿主细胞，其中已经掺入权利要求5-10任何一项所述的核苷酸序列。

15.一种由SEQ ID NO.1的多核苷酸序列编码的分离多肽，或其变体、同系物、片段或衍生物。

16.一种根据权利要求15所述的分离多肽，其从N-末端除去至多7个氨基酸。

17.一种根据权利要求15或16所述的分离多肽，它具有与SEQID NO.1编码的多肽序列相比至少75％的同一性。

18.一种能够结合权利要求1-4或15-17任何一项所述多肽的抗体。

19.一种制备权利要求1-4或15-17任何一项所述多肽的方法，其中所述方法包括表达权利要求5-10任何一项所述的核苷酸序列，并任选地分离和/或纯化它们。

20.一种使用权利要求1-4或15-17任何一项所述多肽制备薄闭壳素的方法。

21.一种使用权利要求1-4或15-17任何一项所述多肽制备子囊吡喃酮P的方法。

22.根据权利要求20或21所述的方法，包括使所述多肽与1，5-脱水-D-果糖反应。

23.根据权利要求21所述的方法，其中所述方法还包括在制备子囊吡喃酮P中使用APP合酶。

24.根据权利要求23所述的方法，包括使APP合酶及所述多肽与1，5-脱水-D-果糖反应。

25.根据权利要求20所述的方法，包括使所述多肽与葡聚糖裂合酶及淀粉糊精接触。

26.一种使用权利要求1-4或15-17任何一项所述多肽制备蓝草菌酮的方法。

27.根据权利要求26所述的方法，包括使所述多肽与葡糖醛酮反应。

28.根据权利要求26所述的方法，包括使所述多肽与葡萄糖及吡喃糖2-氧化酶反应。

29.一种制备薄闭壳素的方法，包括使吡喃邻酮醛糖脱水酶与1，5-脱水-D-果糖反应。

30.一种制备薄闭壳素的方法，包括使吡喃邻酮醛糖脱水酶与葡萄糖及淀粉糊精反应。

31.一种制备子囊吡喃酮P的方法，包括使吡喃邻酮醛糖脱水酶及APP合酶与1，5-脱水-D-果糖反应。

32.一种制备蓝草菌酮的方法，包括使吡喃邻酮醛糖脱水酶与葡糖醛酮反应。

33.一种制备蓝草菌酮的方法，包括使吡喃邻酮醛糖脱水酶与葡萄糖及吡喃糖2-氧化酶反应。

34.薄闭壳素、蓝草菌酮或其衍生物或异构体在防止和/或抑制病原体丝囊霉的生长，和/或杀死病原体丝囊霉中的应用。

35.根据权利要求34所述的应用，其中所述病原体是螺壳状丝囊霉。

36.根据权利要求34或35所述的应用，其中所述薄闭壳素的衍生物是2-呋喃基-羟甲基-酮或4-脱氧-甘油-己-2，3-diluose。

37.根据权利要求34或35所述的应用，其中所述蓝草菌酮的衍生物是2-呋喃基乙二醛。

38.根据权利要求34-37任何一项所述的应用，其用于处理植物或植物种子。

39.薄闭壳素、蓝草菌酮或其衍生物或异构体作为植物或种子保护剂的应用。

40.根据权利要求34-39任何一项所述的应用，其用于处理甜菜种子。

41.一种具有基本上根据本文并参考实施例所述的吡喃邻酮醛糖脱水酶活性的酶。

42.一种编码酶的核苷酸序列，所述酶具有基本上根据本文并参照实施例所述的吡喃邻酮醛糖脱水酶活性。

43.一种基本上根据本文并参照实施例所述的制备子囊吡喃酮P的方法。

44.一种基本上根据本文并参照实施例所述的制备薄闭壳素的方法。

45.一种基本上根据本文并参照实施例所述制备蓝草菌酮的方法。

46.一种基本上根据本文并参照实施例所述防止和/或抑制病原体丝囊霉的生长，和/或杀死病原体丝囊霉的方法。

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