CN1799343A - 一种创造草地早熟禾抗草甘膦新种质的方法 - Google Patents

Abstract

一种创造草地早熟禾抗草甘膦新种质的方法，涉及农作物组织培养方法技术领域。主要步骤包括：取草地早熟禾的幼嫩花序切段为外植体，在诱导培养基上诱导愈伤组织发生，然后对愈伤组织进行继代培养增殖；选取已分化出绿点的愈伤组织，在附加草甘膦的筛选培养基上筛选，对筛选存活的愈伤组织进行恢复培养和扩增，然后转入分化培养基上分化成苗；小苗生根长大后移栽，检测其抗草甘膦的效能。本发明为草地早熟禾抗除草剂育种创造了优异材料。

Description

一种创造草地早熟禾抗草甘膦新种质的方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养方法技术领域，是一种创造草地早熟禾种质的方法。

背景技术

草地早熟禾被称为“草坪草之王”，原产欧洲、亚洲北部及非洲北部，后引到北美洲，现遍及全球温带地区。草地早熟禾属多年生草本植物，须根系，具有根状茎，繁殖迅速，再生力强，耐修剪。叶色诱人，质地细软，颜色光亮鲜绿，绿期长，具有较好的耐践踏性，广泛利用于家庭、公园、医院、学校等公共绿地、观赏性草坪以及高尔夫球场、运动场草坪，还可应用于堤坝护坡等设施草坪。

杂草是草坪的大敌。尤其是稗草、马唐、藜、苋、空心莲子草、打碗花、牛筋草、一年篷、马齿苋等危害十分严重的恶性杂草，防除不及时就会影响草坪的生长并降低草坪的观赏性，严重者使整个草坪荒废。因此，能否有效地防除杂草就成为草坪建植成败的关键之一。目前，我国大多采用人工方式防除杂草。这不仅花费成本高、效率低，而且防除不容易彻底，并且在剔除杂草的过程中常会造成草坪的机械损伤。应用除草剂除草不仅除草效率高、防除彻底，而且大大减轻了劳动强度并降低了除草成本，据有关的报告调查，化学除草所花费用为人工除草的1/30到1/20。因此，随着草坪种植面积的不断扩大，杂草的化学防除已成为提高草坪经济效益、观赏效益和社会效益的重要技术措施之一。

除草剂的种类很多，根据其防除对象分，可以分为广谱性和选择性除草剂。使用广谱性除草剂效率高，但因其杀伤面太大而在草坪管理上常局限用于草坪建坪前的除草。而目前常用的选择性除草剂尽管对杂草防除有一定的选择性，但这种选择性常会因草坪草与杂草的组合不同，除草剂使用的浓度不同而对草坪草造成伤害。因此限制了除草剂在草坪管理上的应用。草甘膦是一种广谱性除草剂，通过体细胞无性系变异筛选，获得新型的抗草甘膦草坪草，将对于除草剂在草坪管理上的推广应用起到很大的促进作用。

发明内容：

本发明要解决的技术问题是公开一种通过体细胞无性系变异筛选创造草地早熟禾抗草甘膦新种质的方法。

本发明解决技术问题的方案是取草地早熟禾的幼嫩花序切段为外植体，在诱导培养基上诱导愈伤组织发生，然后对愈伤组织进行继代培养增殖，选取已分化出绿点的愈伤组织，在附加草甘膦的筛选培养基上筛选，对筛选存活的愈伤组织进行恢复培养和扩增，然后转入分化培养基上分化成苗，小苗生根长大后移栽，检测其抗草甘膦的效能。

具体由以下步骤完成：

1、取草坪或温室盆栽生长1～3个月的早熟禾植株主茎，用70～75％乙醇棉球擦拭外层包叶2～4遍后，在无菌工作台上剥去1～3层外包叶，剩余部分切成8～12cm的切段，置于0.05％～0.1％的氯化汞溶液中，浸泡4～10分钟消毒，然后用无菌水冲洗3～5次，放在无菌滤纸上吸干切段表面水分，接种在MS0培养基上，放在温度为24±2℃的培养室，黑暗条件下培养。

2、培养在MS0培养基上的早熟禾主茎切段，2～5周后一部分即有幼穗伸出包叶，将这些幼穗切成2～4cm的切段，接种于诱导培养基(MS+2，4-D 2～5mg/L+蔗糖2％～6％+琼脂0.6％～0.8％，pH5.6～6.5)上诱导愈伤组织，培养条件同上。3～8周可获得愈伤组织，诱导率为70％～100％。

3、取诱导出的鲜黄、松脆、颗粒状的愈伤组织，用新鲜的诱导培养基继代培养，每隔1～3周继代一次，直到部分愈伤组织上出现绿点。培养温度为24±2℃，光照强度1000～3000lx，每天16h光照。

4、将有绿点的愈伤组织转移到附加100mg/L～350mg/L草甘膦的新鲜诱导培养基上筛选，3～8周后愈伤组织存活率为1％～8％。

5、将存活的愈伤组织转移到去掉草甘膦的新鲜诱导培养基上恢复培养，每隔1～3周继代培养一次扩增愈伤组织，连续扩增数次。

6、将扩增的愈伤组织转移到MS0分化培养基上，2～4周即可分化出小苗，1～2周小苗生出3～5条白色根系。

7、取8～12cm高的试管苗，在培养室内去掉瓶塞，覆盖3～5层纱布，保持纱布湿润5～7天。然后从试管中取出小苗，洗净根部的琼脂，移栽到营养钵中生长。移栽成活率为80％～100％。

8、当移栽成活的小苗生长至20～30cm高时，喷洒稀释50～200倍(原液浓度为41％)的草甘膦溶液，3～8天后一部分植株干枯死亡，存活率为20％～50％，存活的植株生长正常。

本发明方法为草地早熟禾抗除草剂育种创造了优异材料，所获得的草地早熟禾生长状态良好，不受草甘膦影响。

具体实施方式：

获得抗300mg/L草甘膦的草地早熟禾新材料，首先，由草坪或温室盆栽1个月的早熟禾植株主茎，用75％乙醇棉球擦拭外层包叶4遍后，在无菌工作台上剥离3层外包叶，将剩余部分切成10cm的切段，置于0.1％的氯化汞溶液中，浸泡6分钟消毒，然后用无菌水冲洗3次，放在无菌滤纸上吸干切段表面水分，接种在MS0培养基上。放在温度为24±2℃的培养室，黑暗条件下培养。将培养在MS0培养基上的早熟禾主茎切段，3周后一部分即有幼穗伸出包叶，将这些幼穗切成4cm的切段，接种于诱导培养基(MS+2，4-D 2mg/L+蔗糖3％+琼脂0.8％，pH5.8)上诱导愈伤组织，培养条件同上。4周可获得愈伤组织，诱导率为80％。再取诱导出的鲜黄、松脆、颗粒状的愈伤组织，用新鲜的诱导培养基继代培养，每隔2周继代一次，直到部分愈伤组织上出现绿点。培养温度为24±2℃，光照强度1000～3000lx，每天16h光照。将有绿点的愈伤组织转移到附加300mg/L草甘膦的新鲜诱导培养基上筛选，6周后愈伤组织存活率为1.7％。将存活的愈伤组织转移到去掉草甘膦的新鲜诱导培养基上恢复培养，每隔2周继代培养一次扩增愈伤组织，共扩增4次。将扩增的愈伤组织转移到MS0分化培养基上，2周即可分化出小苗，1周小苗生出3～5条白色根系。取8～12cm高的试管苗，在培养室内去掉瓶塞，覆盖3层纱布，保持纱布湿润5天。然后从试管中取出小苗，洗净根部的琼脂，移栽到营养钵中生长。移栽成活率为80％。当移栽成活的小苗生长至30cm高时，喷洒稀释100倍(原液浓度为41％)的草甘膦溶液，7天后一部分植株干枯死亡，存活率为40％，存活的植株生长正常。

Claims (2)

1、一种创造草地早熟禾抗草甘膦新种质的方法，其特征由以下步骤完成，取草地早熟禾的幼嫩花序切段为外植体，在诱导培养基上诱导愈伤组织发生，然后对愈伤组织进行继代培养增殖，选取已分化出绿点的愈伤组织，在附加草甘膦的筛选培养基上筛选，对筛选存活的愈伤组织进行恢复培养和扩增，然后转入分化培养基上分化成苗，小苗生根长大后移栽，检测其抗草甘膦的效能。

2、根据权利要求1所述的创造草地早熟禾抗草甘膦新种质的方法，由以下步骤完成：

(1)、取草坪或温室盆栽生长1～3个月的早熟禾植株主茎，用70～75％乙醇棉球擦拭外层包叶2～4遍后，在无菌工作台上剥去1～3层外包叶，剩余部分切成8～12cm的切段，置于0.05％～0.1％的氯化汞溶液中，浸泡4～10分钟消毒，然后用无菌水冲洗3～5次，放在无菌滤纸上吸干切段表面水分，接种在MS0培养基上，放在温度为24±2℃的培养室，黑暗条件下培养；

(2)、培养在MS0培养基上的早熟禾主茎切段，2～5周后一部分即有幼穗伸出包叶，将这些幼穗切成2～4cm的切段，接种于诱导培养基(MS+2，4-D 2～5mg/L+蔗糖2％～6％+琼脂0.6％～0.8％，pH5.6～6.5)上诱导愈伤组织，培养条件同步骤1，3～8周可获得愈伤组织，诱导率为70％～100％，诱导培养基为MS+2，4-D 2～5mg/L+蔗糖2％～6％+琼脂0.6％～0.8％，pH5.6～6.5；

(3)取诱导出的鲜黄、松脆、颗粒状的愈伤组织，用新鲜的诱导培养基继代培养，每隔1～3周继代一次，直到部分愈伤组织上出现绿点。培养温度为24±2℃，光照强度1000～3000lx，每天16h光照；

(4)将有绿点的愈伤组织转移到附加100mg/L～350mg/L草甘膦的新鲜诱导培养基上筛选，3～8周后愈伤组织存活率为1％～8％。

(5)将存活的愈伤组织转移到去掉草甘膦的新鲜诱导培养基上恢复培养，每隔1～3周继代培养一次扩增愈伤组织，连续扩增数次；

(6)将扩增的愈伤组织转移到MS0分化培养基上，2～4周即可分化出小苗，1～2周小苗生出3～5条白色根系；

(7)取8～12cm高的试管苗，在培养室内去掉瓶塞，覆盖3～5层纱布，保持纱布湿润5～7天。然后从试管中取出小苗，洗净根部的琼脂，移栽到营养钵中生长。移栽成活率为80％～100％；

(8)当移栽成活的小苗生长至20～30cm高时，喷洒稀释50～200倍的草甘膦溶液，3～8天后一部分植株干枯死亡，存活率为20％～50％，存活的植株生长正常，草甘膦溶液原浓度为41％。