CN1798996A - 观察工具及使用该工具的观察方法 - Google Patents

Abstract

不使用特殊观察法中需要的特殊调制元件、并且可以简便地对细胞等透明的微小物体进行观察。一种通过具有物镜的光学系统由反射照明光照明、对观察目标进行观察的观察方法中使用的观察目标收存用的观察工具，其具有观察时对反射照明光进行反射的反射面。反射面设置在与物镜对置的面或者对置的面的相反面。观察工具具有保持液体的容器。使用上述观察工具，同时观察细胞等和培养液。

Description

观察工具及使用该工具的观察方法

技术领域

本发明涉及物体的观察技术，特别是涉及细胞等透明的微小物体的观察技术。

背景技术

以前，观察细胞等微小物体时，使用透射观察显微镜。而且，为了以高对比度观察无染色的活细胞的内部结构和形态，需要使用相位差显微镜、无输出相位差显微镜、微分干涉显微镜、偏振光显微镜等，这些显微镜具备有相位差环的特殊聚光器或微分干涉棱镜等，并具有特殊透镜。

具体的，作为显微镜观察培养液中的细胞等透明的微小物体的方法，广泛采用以相位差法、偏斜照明法、微分干涉法等为代表的特殊观察法(参阅特开平7-225341号公报等)。特殊观察法的光学系统的结构如图16所示，一般的透射清晰视场观察的结构由以下构成：光源713，用于产生照明光；瞄准透镜741，用于使由光源713发出的照明光的方向一致；反射镜742，用于使前进方向一致的照明光的前进方向偏向垂直方向；窗口透镜743，用于集聚照明光线；聚光镜头744，用于对含有观察物体的样本708照射已聚集的照明光；物镜706，用于扩大投影样本708；成像透镜746，用于将样本708的像成像于成像面745上；载物台717，用于调整样本708的观察位置。对于该结构，在聚光透镜744的入射孔位置添加照明调制元件747，在物镜706的射出孔位置添加成像调制元件748。在照明调制元件747上使用环形隙缝、在成像调制元件748上使用相位板的是相位差法，在照明调制元件上使用偏心孔径的是偏斜照射法，在照明调制元件747和成像照明元件748上使用偏光板和微分干涉棱镜的是微分干涉法。通过使用特殊观察法，如果和周围的媒质的折射率不同，即使是透明物体也能以明暗的对比度进行观察。这样特殊的观察方法，对本来透明的、以原来状态难以看见的生物体组织以良好的对比度进行观察中特别有效。

发明内容

但是，在这些特殊的观察方法中，必须在上述的聚光透镜744或者物镜706的孔位置配置特殊的调制元件。这些特殊的调制元件价格非常高，并且产生例如物镜706的倍率改变时该调制元件也需要改变的问题等，在使用上有很多不便。

本发明是鉴于上述情况进行的，本发明的目的在于提供一种技术，不使用观察透明微小物体时的特殊观察法需要的特殊调制元件，并且能够简单地进行观察。

本发明的观察工具是具备有反射面的观察目标收存部的观察工具。另外，该观察工具是通过具有物镜的光学系统由反射照明光照明、对观察目标进行观察的观察方法中使用的观察目标收存用的观察工具，设置了观察时反射上述反射照明光的反射面。

上述反射面可以设置在观察时与上述物镜对置的面，也可以设置在与上述物镜对置的面的相反面。

另外，也可以形成上述观察目标经过的流径。另外，收存上述观察目标的收存部也可以具备注入含有观察目标的口和使其流出的口。

另外，本发明的观察方法的特征在于：它是通过具有物镜的光学系统由反射照明光照明对观察目标进行观察的方法，在收存上述观察目标的观察工具中设置观察时反射上述反射照明光的反射面，在上述观察工具中收存观察目标，并对上述观察目标进行观察。

上述反射面可以设置在观察时与上述物镜对置的面上，也可以设置在与上述物镜对置的面的相反面上。

另外，上述观察目标也可以是微小透明体。

另外，上述观察工具具有能够保持液体的容器，上述容器也可以同时收存含有观察对象的液体。在此，上述观察目标也可以是细胞，上述液体也可以是培养液。

另外，也可以在上述观察工具中收存上述观察目标，以使上述观察目标和上述反射面的距离为上述光学系统的焦点深度的一半以下。

具体的，也可以在上述观察工具中收存上述观察目标，以使上述观察目标和上述反射面的距离d满足以下公式(1)。

       d≤W/(2NA²)…(1)

(式中d表示观察目标和反射面的距离，W表示所用光的波长，NA表示光学系统的数值孔径。)

进而，也可以在上述的观察工具中收纳上述观察目标，以使与上述观察目标相对的照明光的数值孔径比物镜的数值孔径小。

具体的，也可以在上述观察工具中收纳上述观察目标，以使上述观察目标和上述反射面之间的距离d满足以下公式(2)。

        d＞F/(4tan(sin^-1NA))…(2)

(式中d表示观察目标和反射面之间的距离，F表示光学系统的视场直径，NA表示光学系统的数值孔径。)

若按照本发明，不用特殊的光学单元就能够以良好的对比度观察细胞等透明的微小物体。

即，使用本发明的细胞观察工具，利用普通的光学显微镜或者使用普通的透镜和CCD摄像机的监控器，能够对细胞、例如嗜中性白血球、嗜酸性白血球、嗜碱性白血球、单核细胞、巨噬细胞、淋巴球等血液细胞或其它的动物细胞，或者植物的原生质体等甚至含有的颗粒成分的清晰的像，从而对细胞进行观察，不需要使用现有技术的如相位差显微镜的特殊的装置。

附图说明

图1(A)～(C)是涉及第一实施方式的观察工具的剖面图。

图2(A)(B)是具有包含反射面的结构体40的观察工具的剖面图。

图3(A1)～(C)是具有覆盖收存部的盖的观察工具的剖面图。

图4是涉及第一实施方式的观察工具的其它使用的例，(A)是在覆盖玻璃上承载结构体1时的剖面图。(B)是显示设置能让液体通过的孔时的概略图的剖面图。(C)是(B)的观察工具的斜视图。

图5是在收存部刻上刻度的观察工具的一例的上视图。

图6(A)是整体作成管型的观察工具的剖面图。(B)是(A)的虚线AB方向的剖面图。

图7是显示第二实施方式的观察装置的结构的图形。

图8是显示本发明的观察法的光学系统的结构的图形。

图9是显示培养皿和培养细胞的图形。

图10是显示本发明的物体的对比度获取方法的图形。

图11(a)是显示在第二实施方式中的成像模拟的计算模型的图形。图11(b)及(c)是表示成像模拟的计算结果的图形。

图12(a)是表示第二实施方式中的成像模拟计算模型的图形。图12(b)～(f)是显示细胞302和反射镜涂层307的距离为1.0μm、1.2μm、1.4μm、1.6μm以及1.8μm时成像模拟的计算结果的图形。

图13是显示反射面引起的照明光的数值孔径的降低的图形。

图14(a)是显示用于照明光的数值孔径比物镜的数值孔径小时的物体像的模拟例的计算模型的图形。图14(b)～(f)时显示照明光的数值孔径为物镜镜头的数值孔径的100％、80％、60％、40％以及20％时的成像模拟的计算结果的图形。

图15是表示第三实施方式的微小流径观察装置的结构的图形。

图16是显示现有的特殊观察法的光学系统的结构的图形。

图17是显示现有的透射观察显微镜的物体的对比度的获取方法的图形。

图18是使用图3(A2)所示的观察工具观察嗜酸性白血球时所照的照片。

具体实施方式

下面，参照附图说明本发明的一实施方式。首先，说明涉及应用本发明的第一实施方式的观察工具。

本发明的观察工具是用于使用显微镜以反射光观察乃至检测细胞等的工具，具有收存细胞等的部分，即观察目标收存部。并且，至少具有反射该观察工具进行观察的波长区域的光的面，即形成反射面的面。

图1～图6中显示涉及本发明的观察工具结构的一例。并且，在图中，箭头X表示通过物镜由X方向对观察目标进行观察。

图1(A)所示的观察工具中，1是由玻璃、合成树脂、金属、硅等构成的结构体，2是收存细胞等的观察目标的槽。在收存部2的底面3设置反射观察的波长区域的光的反射镜。作为构成反射面的反射镜，例如有对玻璃、合成树脂、金属等进行镀银或者镀铬等的金属电镀，或者粘结金属箔而形成反射镜面。另外，例如有：金属、硅晶片等的、其自身可以加工成镜面的物质来构成结构体1、在设置槽的加工时，底面就直接形成反射镜、设置槽后，对槽的底面进行反射镜加工等。在此，如果至少底面3是反射镜就可以，结构体的表面全部都是反射镜也可以。

以硅晶片构成图1(A)的结构体1时，例如通过机械研磨、化学蚀刻等常用方法加工硅晶片，可以通过形成收存细胞的槽进行制作。例如，图1(A)的情况，反射镜3通过使硅晶片的底面呈镜面状态而形成。进而，通过上述槽的形成工序不能充分呈现镜面状态时，根据需要，也可以进一步进行使槽的底面形成镜面的加工。

尺寸的大小为在普通的显微镜上能使用的尺寸就可以。例如为详细观察细胞的颗粒结构，收存部的深度，最好是细胞大致排列一层的深度。例如，收存部深度为1～100μm、圆形的情况下直径为1～5mm就足够，但是并不限于此，可以按照需要选择适宜的尺寸。

另外，作为结构体1的材质，其自身通过可能的镜面(反射面)加工、电镀等也可以形成反射面。可以使用：例如，玻璃、石英等无机化合物；聚苯乙烯、合成树脂、聚丙烯、聚乙烯、氯乙烯、聚苯基醚、聚苯撑硫等塑胶；不锈钢、铝、青铜等金属或合金；陶瓷等非金属无机材料。

图1(B)所示的观察工具以例如玻璃、塑胶等构成结构体1、设置收存部2。进而，在收存部2的底部4形成表面平滑并且高反射率的材料的反射层。例如，粘结硅晶片的箔或膜、镀银等。

图1(C)所示的观察工具的特征在于：在与物镜对置的面的相反面41上设置反射面。结构体1由透过观察的波长区域的光的材质构成。例如，由玻璃、石英等无机化合物、聚苯乙烯、合成树脂、聚丙烯、聚乙烯、氯乙烯、聚苯基醚、聚苯撑硫等塑胶等构成。按照该观察工具，即使在清洗收存部时等也不能损伤到反射面，反射面的维护容易。

结合结构体1的材质，通过进行电镀加工可以形成反射面41。电镀例如是可使表面平滑并且反射率高的材料、如银等金属的电镀。

图2(A)所示的观察工具在透过光的结构体1和结构体40之间设置反射面。该观察工具通过在结构体1的收存部2的相反面粘上形成反射面的结构体40来制作。该观察工具制作容易，因为是分别对结构体1和结构体40进行加工、最后使其结合制作的。结构体1和结构体40也可以用例如香脂、光硬化型合成树脂粘结剂等的光学粘结剂粘结。另外，不使用粘结剂等，观察时也可以将结构体1和结构体40重叠起来使用。重叠起来使用时，将结构体1和结构体40重叠起来、用夹子等固定工具扶持固定来使用。

图2(B)所示的观察工具与图2(A)所示的观察工具类似，但在以下点上不同：透过光的结构体40的、与物镜对置的面的相反面43上设置反射面。结构体1由透过光的材质构成。根据该观察工具，通过调节结构体40的厚度，能够容易地对观察目标的位置与反射面的距离进行调节。

为将本实施方式的观察工具用于细胞的观察，将培养液与细胞一同放入收存部，如图3(A1)所示，以覆盖玻璃(图3的5)覆盖，在物镜中使用导入可见光的照明装置，以普通的显微镜观察乃至检测，或者使用与物镜结合的CCD摄像机进行监测。作为导入光的照明装置，可以使用例如作为一般照明装置的市场上出售的日本光学制造“尼康EPI-U”等。

另外，图3(A1)中示出在结构体1的上部设置覆盖玻璃5的情况，但是，如图3(A2)所示，也可以使用使整体上下顺序相反、由下方进行观察的的使用方法。

另外，也可以是如图3(B)(C)的观察工具。图3(B)的观察工具如以下构成：将观察目标放入收存部2的槽中后，以结构体40覆盖收存部2，结构体40在与物镜对置的面44上具有反射面。

另外，图3(C)的细胞观察工具在透过光的结构体40的、与物镜对置的面的相反面45上设置反射面。按照该观察工具，通过调节结构体40的厚度，能够容易地改变观察目标的位置与反射面的距离。

另外，本实施方式的观察工具，如图4(A)所示，可以设置注入观察目标的注入口6、在覆盖玻璃5上承载结构体1来使用。此时由下方进行观察。例如，能够由注入口6同时注入细胞和培养液，观察操作简便。

另外，使用本实施方式的观察工具进行观察时，观察目标、例如细胞，不需要与玻璃面粘结，也能够观察浮游状态、例如在液体中处于流动状态的细胞。即，如图4(B)(C)所示，为使液体能够通过到结构体1，设置孔7、8，由一个孔流入含有细胞的液体，也能够观察流动中的细胞的状态。为此目的，如图6所示，也可以在具有细胞收存部9的透明的管12的内壁11上形成反射面。

上述说明的观察工具根据需要，如图5所示，在收存部上刻上刻度，能够进行细胞等的计算。即使此种情况，根据本实施方式的观察工具能够以好的对比度观察微小透明物体，所以计算容易。

使用本实施方式的细胞观察工具时，使用普通的光学显微镜通过肉眼进行观察时、或者通过使用普通的透镜和CCD摄像机的监控器进行观察时，能够对细胞、例如嗜中性白血球、嗜酸性白血球、嗜碱性白血球、单核细胞、巨噬细胞、淋巴球等血液细胞或其它的动物细胞，或者植物的原生质体等甚至含有的颗粒成分的清晰的像，从而对细胞进行观察，不需要使用现有技术的如相位差显微镜的特殊的装置。

其次，作为应用本发明的第二实施方式，对使用了上述中说明的细胞观察工具的观察方法进行更加详细的说明。

本发明的观察方法的特征在于：能够以良好的对比度对细胞等微小透明物体进行观察。在此，说明涉及本发明的观察方法前，简单地说明关于通过本发明的观察方法能够以良好的对比度观察微小透明物体的原理。

在现有的透射观察显微镜中观察目标像的对比度的获取方法如图17所示。即，照明光入射波阵面103透过媒质101中的观察目标102时，由于媒质101和物体102的折射率不同，射出观察目标的射出波阵面104遭受变形。射出波阵面的微小要素105沿垂直于各自波阵面的方向前进。因此，遭受变形的射出波阵面的微小要素105沿与入射波阵面104前进方向不同的方向前进。物镜106以由数值孔径表示的某一定角度范围的波阵面形成物体的像。通过观察目标102的周边部分等遭受很强变形的射出波阵面的微小要素105的一部分脱离以物镜106的数值孔径表示的角度范围前进时，在像的一部分中产生阴影，观察目标102随对比度而成像。但是，例如培养液中的细胞等，物体102和媒质101的折射率几乎没有差时，遭受变形的射出波阵面的微小要素105也在以物镜106的数值孔径表示的角度范围内前进，所以物体像中几乎没有明暗的对比度。因此，以普通的透射观察显微镜难以观察培养液中细胞的像。

与此相对，本发明的观察方法中，观察目标的像的对比度的获取方法如图10所示。即，通过以反射照明观察贴近反射面207的物体202，入射波阵面203透过观察目标202一次后由反射面207反射，进而再一次透过观察目标202。通过入射波阵面203两次透过观察目标202而形成的入射波阵面204遭受到现有的透射观察显微镜情况下的两倍的变形。在现有的透射观察显微镜中，射出波阵面的微小要素205的一部分在以物镜206的数值孔径表示的角度范围内前进，但是如果按照本发明的观察方法，可以脱离该范围前进，所以在观察目标的像上形成阴影。因此，与现有的透射观察显微镜相比容易得到像中明暗的对比度。并且，即使是以普通的透射观察显微镜难以观察的培养液中的细胞，也可能以良好的对比度清晰地进行观察。

以下，参照附图对本发明的第二实施方式进行说明。

图7是应用本发明的一实施方式的观察装置的概略图。如图所示，本实施方式的观察装置具有反射观察显微镜311和在底面使用了反射镜涂层307的培养皿312。

反射观察显微镜311由以下构成：镜筒315、载物台317、光源部313、反射照明管314和物镜306，以及一起支撑这些的镜基座316。载物台317能够在其上面设置培养皿312。载物台317与镜基座316相连接，通过转动对焦柄318可以在上下方向上移动。

图8中，示出反射观察显微镜311的光学系统的结构。如图8所示，光学系统由以下构成：光源813，用于产生照明光；校准透镜841，用于使由光源813发出的照明光的前进方向一致；半透镜842，用于使前进方向一致了的照明光的前进方向偏向垂直方向；物镜806，用于将照明光聚集在含有观察物体的标本808上，同时扩大投影标本808；成像透镜846，用于使标本808的像成在在成像板上；反射镜849，具有反射面807，该反射面反射透过标本808一次的照明光使其返回。

成像透镜846放置在镜筒315中。光源813放置在光源部313中，校准透镜841及半透镜842放置在反射照明管314中。

使用如以上构成的观察装置观察目标时，如以下所示。

如图9所示，将培养液301与观察目标(例如细胞302)同时放入观察工具的收存部。将培养皿设置于载物台317上面。适当调节来自光源313的照明光的亮度。通过转动对焦柄318在上下方向上移动载物台317，对焦并进行观察。

在本实施方式的观察方法中，观察目标和上述反射面的距离d最好满足下述公式(1)。

                 d≤W/(2NA²)…(1)

(式中d表示观察目标和反射面的距离，W表示观察中所用光的波长，NA表示光学系统的数值孔径。)

观察目标和反射面的距离d能够通过调节媒质的密度来调整。例如，如果观察目标比媒质密度高，观察目标通过重力作用自动地沉淀于培养皿312的底部，接近在此处的反射面。

进而，通过满足上述公式，对能够以良好的对比度进行观察的的原理作如下说明。满足上述公式时，在观察的光学系统的焦点深度的约一半以内的距离、接近反射面设置观察目标。并且，透过观察目标一次的入射波阵面，大致不变形，再一次通过观察目标。由此，特别在观察目标的一端射出波阵面清晰地弯折。因此，能够以良好地对比度对观察目标的像进行观察。下面，以模型进行更详细的说明。

图11示出使用以下计算模型时的进行成像模拟的结果：该计算模型将细胞302作为直径4μm、高度2μm的旋转椭圆体，将细胞302的折射率定为1.4，培养液301的折射率定为1.33。另外，图11是成像的略图。在此，521是中心线，522是中心线上的强度分布，523是细胞302的成像。观察中使用的光的波长为550nm。在本模拟中，反射照明光往复两次透过细胞302，因此，能够按照图11(b)所示，以明暗清晰的对比度观察细胞302的轮廓。另一方面，通过现有的透过观察方法对相同条件的细胞302进行观察时，进行成像模拟的结果如图11(c)所示，细胞302的轮廓不清晰。

但是，细胞302和反射镜涂层307的距离拉大时，细胞像的对比度下降。在本实施例中的观察光学系统的焦点深度Δ由以下的公式求得。

     Δ＝W/NA²＝0.55μm/0.452＝2.7μm

(式中W表示使用光的波长，NA表示反射观察显微镜311中安装的物镜306的数值孔径。)

即，焦点深度Δ的一半约为1.4μm。图12(b)～(f)中示出使用以下计算模型的成像模拟的结果：该计算模型如图12(a)所示，改变细胞302和反射镜涂层307之间的距离。距离d分别为(b)1μm、(c)1.2μm、(d)1.4μm、(e)1.6μm、(f)1.8μm。如图所示，随着距离d由1μm开始增加，细胞302的轮廓的对比度降低，距离d超过1.4μm时几乎就不能看见。

由上述可知细胞302与反射镜涂层307的间隔最好为焦点深度Δ的约一半以下。

另外，在本实施方式的一例中，观察目标与反射面的距离d最好满足以下的公式(2)。

          d＞F/(4tan(sin^-1NA))…(2)

(式中d表示观察目标与反射面的距离，F表示对观察目标进行观察的光学系统的视场直径，NA表示对观察目标进行观察的光学系统的数值孔径。)

使用图3(A2)所示的观察工具时，由于重力观察目标位于覆盖玻璃5上，因此通过加工调节收存部2的槽的深度a，能够调节观察目标和反射面的距离d。

另外，图1(c)的观察工具等情况，通过加工调节收存部槽的深度，从而调节槽的底面与反射面的距离，所以能够调节观察目标与反射面的距离。图2(B)的观察工具等的情况，通过调节结构体40的厚度能够调节观察目标和反射面的距离。

另外，观察目标和反射面的距离d可以通过调节媒质的密度进行调整。例如，如果观察目标比媒质密度小，观察目标自动地由培养皿312的底部离开，与在该处的反射面相距一定的距离。

另外，由于满足上述计算公式2，对能够以良好的对比度进行观察的原理进行如下说明。满足上述计算公式2时，反射面在某种程度上远离观察目标。实际上照明光的数值孔径降低。所以，能够以良好的对比度观察物体。

更具体的，考虑以下情况：如图13所示，在物镜1006的焦点位置处配置物体1002，与物体1002相距d的位置上配置具有反射面1007的反射镜1049，以反射照明观察物体1002。由物镜1006直接照射物体1002附近的照射区域1009通过物镜1006或者含由物镜的光学系统的规格被直径F限制。由物镜1006射出、透过物体1002近旁一次、由反射面1007反射，再次照射物体的照明光通过反射面1007的镜像作用，犹如照射区域1009的镜像1009′成为光源面对物体1002进行照射。此时，由物体1002来看的照射光的最大角度θi_max由下式给出。

          tanθi_max＝F/(4d)…(3)

因此，对于物体1002实质的照射光的数值孔径sinθi_max由公式

          sinθi_max＝sin(tan^-1F/(4d))…(4)

给出。这如果是比物镜1006的数值孔径NA小的条件

          NA＞sinθi_max…算式5

即

          d＞F/(4tan(sin^-1NA))…(2)，实质照明光的数值孔径就比物镜的数值孔径小，物体1002的观察像的对比度得到提高。

照明光的数值孔径比物镜的数值孔径小时，通过图14对计算物体的观察像对比度提高的状况的模拟例进行说明。图14(a)示出在培养液1101中的细胞1102的计算模型，细胞1102作为直径5μm、厚度2μm的旋转椭圆体。细胞的折射率定为1.4，培养液的折射率定为1.33。照明光的波长定为550nm。物镜的数值孔径定为0.45。图14(b)～(f)示出以下计算例：照明光的数值孔径为物镜的数值孔径的(b)100％、(c)80％、(d)60％、(e)40％、(f)20％。可知随着照明光的数值孔径变得比物镜的数值孔径小，物体像的对比度提高。

其次说明作为应用本发明的第三实施方式的微小流径观察装置。第三实施方式的微小流径观察装置以观察目标收存部为特征，适用于细胞的移动的观察。

观察目标收存部如图15所示，具有微小流径612。微小流径612构建在硅衬底631上。在本实施方式中，通过未图示的倒立型反射照射显微镜由下方对观察目标进行观察。图15中的606表示物镜。

微小流径612中设置一个入口632、3个出口633。入口632和出口633在微小流径612内部相连接。微小流径612以如下方法制造：使用半导体制造技术，在硅衬底上进行由氧化硅634的图形的形成，以玻璃板635作为盖子来覆盖该模型。

另外，氧化硅634的膜厚形成与细胞602大致相同的厚度。因此，细胞602通过微小流径612时，细胞602处于几乎与硅衬底表面607相接触的状态，所以能以良好的对比度观察细胞602的轮廓。

进而，形成与该微小流径612的入口632连接、细胞滞留的部分，可以使微小流径612中流动的细胞602作暂时停留。此时，细胞滞留部分的硅衬底开一个深孔，由此，以该部分作为反射面进行作用的硅衬底的表面远离玻璃板635。如上所作，在该细胞滞留部分中，实质的照明光的数值孔径降低，所以能够以良好的对比度观察位于细胞滞留部分中的细胞602。

另外，如图所示，微小流径612中安装由电压控制装置650、可变电压发生装置660以及两个电极665构成的电场发生装置。两个电极665安装在微小流径612的侧面，对微小流径612侧面施加电连接的可变电压装置660产生的电压，因此使微小流径内部产生电场。可变电压发生装置660与电压控制装置电连接，基于利用未图示的倒立型反射显微镜的细胞602的观察方法，控制可变电压发生装置660产生的电压，来分配细胞602的前进方向向三个出口663中的哪一个方向去。多个细胞602由入口632顺次流入微小流径612内，通过物镜606进行反射观察。硅衬底的表面607作为反射面而使用，能够以良好的对比度观察微小流径612内的细胞602。基于该观察的信息，电场发生装置变换微小流径612内的电场强度。由内部的电场强度控制前进方向，使微小流径612内的细胞602区分三个出口633放出。

这样，如果使用本实施方式的微小流径观察装置，作为细胞602的观察单元使用了反射照明显微镜，能够在硅衬底631上构建微小流径612。硅衬底631上的微小流径由于能够使用半导体制造技术，所以与现有的玻璃衬底上构建微小流径的情况相比，能够以低价大量地生产。进而，与现有的使用特殊显微镜的观察方法相比，不需透射照明装置，使保持微小流径612的载物台简化等，使观察装置整体小型化，同时低价构建成为可能。

另外，在上述第三实施方式中，同第二实施方式中说明的一样，观察目标和反射面(镜面)的距离满足公式(1)及公式(2)为好。

以上对本发明的实施方式进行了说明。

在上述实施方式中，能够以良好的对比度对现有的非常难以观察的微小透明物体进行观察。

另外，若按照上述实施方式，因为不需要用于透射照明的光学系统，所以具有可能谋求观察装置整体的小型化的优点。另外，具有以下优点：即使物体移动困难的情况，通过观察装置整体的移动，能够容易地调整物体观察部位。

若按照上述实施方式，通过在容器内设置反射面，能够容易地实现物体接近反射面的状态。另外，在玻璃器皿的底面设置反射镜，在该玻璃器皿中注入含有观察的物体的媒质时，物质如果比媒质密度大，由于重力作用物质自动地沉淀到玻璃器皿地底部，接近于在该处的反射面。

另外，本发明并不限定于上述的实施方式，在该要点的范围内的各种变形都是可能的。

(实施例)

图18示出使用图3(2A)所示的观察工具、由下方观察摄影细胞情况的照片。使用的观察工具为：结构体1由硅晶片构成，覆盖玻璃5和反射面的距离a为5μm。另外，摄影条件如下。

摄影机器：CCD数字影像摄像机CL-211H(Watec America Co.，Las Vegas，Nev)

照射装置：EPI-U(Nikon Kawasaki，Japan)

物镜：×20

培养液：使用RPMI1640缓冲液中加入20mM HEPES以及0.1％牛血清蛋白质的培养液。

细胞：嗜酸性白血球

对于人血液中的颗粒白血球划分，使用通过由抗CD16抗体结合的磁性块的阴极选择精选的嗜酸性白血球。另外，磁性块中使用动力学磁性粒子集中器(Dynal A.S.，Oslo，Norway)，按照产品所附的使用方法操作。

如图18所示，可知，能够以良好的对比度对微小透明物体、即酸性白血球以及细胞内的颗粒进行观察。

Claims (16)

1.一种观察工具，具备有反射镜的观察目标收存部。

2.一种观察工具，该观察工具是通过具有物镜的光学系统以反射照明光照明、对观察目标进行观察的观察方法中使用的观察目标收存部用的观察工具，其特征在于：

设置一反射面，该反射面观察时反射上述反射照明光。

3.如权利要求2中的观察工具，其特征在于：

上述反射面设置在观察时与物镜对置的面。

4.如权利要求2中的观察工具，其特征在于：

上述反射面设置在观察时与物镜对置的面的相反面。

5.如权利要求2～4中任意一项中的观察工具，其特征在于：

设置上述观察目标通过的流径。

6.如权利要求2～5中任意一项中的观察工具，其特征在于：

收纳上述观察目标的收存部具有注入含有观察目标的液体的口和流出含有观察目标的液体的口。

7.一种观察方法，该观察方法通过具有物镜的光学系统由反射照明光照明、对观察目标进行观察，其特征在于：

在收纳上述观察目标的观察工具上设置观察时反射上述反射照明光的反射面，

上述观察工具收纳观察目标，并对上述观察目标进行观察。

8.如权利要求7中的观察方法，其特征在于：

上述反射面设置于观察时与物镜对置的面。

9.如权利要求7中的观察方法，其特征在于：

上述反射面设置在观察时与物镜对置的面的相反面。

10.如权利要求7～9中的任意一项中的观察方法，其特征在于：

上述观察目标是微小透明体。

11.如权利要求7～10中任意一项中的观察方法，其特征在于：

上述观察工具具有能够保持液体的容器，

上述容器同时收存观察目标与包含它的液体。

12.如权利要求11中的观察方法，其特征在于：

上述对象物体是细胞，

上述液体是培养液。

13.如权利要求7～12任意一项中的观察方法，其特征在于：

在上述观察工具中收存上述观察目标，以使上述观察目标与上述反射面的距离为上述光学系统的焦点深度的一半以下。

14.如权利要求7～13中任意一项中的观察方法，其特征在于：

上述观察工具中收存上述观察目标，以使上述观察目标和上述反射面的距离d满足以下公式(1)

             d≤W/(2NA²)          …(1)

(式中d表示观察目标和反射面的距离，W表示观察中使用的光的波长，NA表示光学系统的数值孔径。)

15.如权利要求7～14中任意一项中的观察方法，其特征在于：

在上述观察工具中收存上述观察目标，以使与上述观察目标相对的照明光数值孔径比物镜的数值孔径小。

16.如权利要求7～15中任意一项中的观察方法，其特征在于：

在上述观察工具中收存上述观察目标，以使上述观察目标与上述反射面的距离d满足以下公式(2)

        d＞F/(4tan(sin^-1NA))           …(2)

(式中d表示观察目标与反射面的距离，F表示光学系统的视场直径，NA表示光学系统的数值孔径。)

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