CN1796557A - 中期因子基因为靶的反义寡核苷酸的结构和用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及一种反义寡核苷酸药物的结构和用途。具体说涉及靶向中期因子(Midkine，MK)基因，抑制人MK表达、新生血管生成及肝癌生长的反义寡核苷酸的结构和用途。本发明采用三种人肝癌细胞系HepG2、SMMC7721和BEL7402的细胞，对10条靶向MK基因的反义寡核苷酸进行了活性筛选和评价，首次发现互补于MK基因特定功能区域的寡核苷酸及其化学修饰物在培养的人肝癌细胞中可有效抑制MK的表达及肝癌细胞的增殖，并抑制人脐静脉内皮细胞的生长。因此，本发明涉及到靶向MKmRNA抗肿瘤及血管生成的反义寡核苷酸的序列与结构及其成为治疗肝癌及与新生血管形成相关疾病的新型药物。

Description

中期因子基因为靶的反义寡核苷酸的结构和用途

发明领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种反义寡核苷酸药物的结构和用途。具体说涉及靶向中期因子(Midkine，MK)基因，抑制人MK表达、新生血管生成及肝癌生长的反义寡核苷酸的结构和用途。

背景技术

肝癌是一种高侵袭性、高转移性的实体恶性肿瘤。尽管目前针对肝癌细胞本身进行的手术切除、化疗和放疗等治疗方案日趋完善，但仍难以取得满意的疗效，因此探索新的有效的治疗途径已成为提高肝癌生存率的关键。

近年研究表明，与其他实体恶性肿瘤一样，肿瘤血管生成(angiogenesis)是肝癌无限制侵袭生长和转移的基础，如果没有新生血管生成，原发肿瘤的生长不会超过1～2mm³。肿瘤组织必须依赖从新生血管中获取营养和排泄代谢产物。因此，以新生血管为靶点，抑制肝癌血管生成，切断肝癌和转移的“命脉”，对肿瘤进行生物基因治疗已成为近几年新的研究热点；它与传统的以肿瘤细胞为靶点的治疗手段相比，具有广谱、放大的抗肿瘤作用，且毒副作用小，不易产生耐药性的特点。中期因子(Midkine，MK)是一个新发现的促血管生成因子，其基因最初是在视黄酸(retinoic acid，RA)诱导分化早期的胚胎瘤细胞中被发现的，定位于染色体11q11.2，由5个外显子和4个内含子组成，故又称视黄酸反应性肝素结合性生长/分化因子。它是一种具有促细胞转化、促有丝分裂作用、促血管生成、抗细胞凋亡和增强纤维蛋白溶解等肿瘤形成相关活性的碱性肝素结合性蛋白质，仅在胚胎中期和成年肾脏表达。已有的研究表明，MK能促进内皮细胞分化，对人脑与脐静脉内皮细胞、PC12细胞、神经外胚层前体细胞和NIH 3T3成纤维细胞具有有丝分裂原活性。在软琼脂培养中，MK能促进SW13细胞克隆形成，而将经MK转染的SW13细胞和NIH 3T3细胞接种无胸腺裸鼠，则能形成富含血管的肿瘤。在肝癌等许多人类恶性肿瘤组织中MKmRNA及蛋白均呈高度表达，而各种正常组织仅有低水平表达或无表达，并与肝癌的发生、浸润转移，血管生成及预后密切相关。因此，MK可能是抗血管生成治疗肝癌的理想靶位。

反义技术是继基因工程以后又一项重大突破。根据核酸杂交原理，与某一些癌基因或生长因子基因互补的反义脱氧寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide，ASODN)，被导入癌细胞后，可与靶基因的mRNA或前体hnmRNA互补结合，阻断mRNA的成熟和翻译，在基因水平调节由基因到蛋白质的遗传信息传导，从而抑制蛋白质表达，达到抗肿瘤的目的。自从1978年Zamecnik和Stephenson首次利用人工合成反义寡核苷酸抑制Rous肉瘤病毒基因获得成功以来，已经有多个针对不同靶基因的反义寡核苷酸逐步从临床前研究走向临床试验研究，这些癌基因包括Bcl-2、c-Raf、H-Ras、P53等。由于反义寡核苷酸具有高度靶特异性，因此靶向肝癌肿瘤血管生成促进因子基因的反义寡核苷酸有望成为理想的抗肝癌血管生成基因治疗的新药。

发明内容

本发明的目的在于寻找特异高效的新型抗肝癌血管生成基因治疗的新药，即对肝癌肿瘤血管生成促进因子MK基因具有较好抑制活性的ASODN及能改善其生物活性的化学修饰衍生物。

本发明的主要内容是，根据GeneBank中的核酸序列数据库，选择NCBI公布的MidkinemRNA参考序列(GeneBank序列号：24475622)，通过对其进行基于多预测RNA二级结构的计算机辅助设计，选择了10个不稳定的茎环结构作为ASODN的作用靶点。通过与GeneBank联机blast序列比对，所选择的靶序列均具有很好的特异性，不会干扰人类其它正常基因的表达。另外，作为评价MK5作用的特异性，设计了其正义序列(SEN)和组成与MK5完全相同而序列不同的错配序列(MIS)(见表1)。在自动DNA合成仪上合成硫代反义寡核苷酸(S-ASODN)。分别采用三种人肝癌细胞系HepG2、SMMC7721和BEL7402对上述ASODNs进行活性筛选和评价。结果显示10条ASODNs中，MK1、MK2、MK3、MK4、MK5、MK6、MK7、MK8在0.4μM时对HepG2、SMMC7721和BEL7402三种人肝癌细胞的增殖具有明显的抑制作用。综合10条S-ASODN三对上述三系细胞的抑制率得出其IC₅₀值，结果表明MK5的抑制活性最强。采用MK5转染人HepG2肝癌细胞和人脐静脉内皮细胞，结果显示MK5能特异性抑制人HepG2肝癌细胞和人脐静脉内皮细胞的增殖及MK的表达；并具明显的剂量依赖效应。

根据本发明，优选的抗肝癌肿瘤血管生成促进因子MK基因的反义寡核苷酸的最佳序列为MK5。

根据本发明，针对MKmRNA编码区的硫代反义寡核苷酸MK5能特异性抑制人HepG2肝癌细胞和人脐静脉内皮细胞的生长及肝癌肿瘤血管生成促进因子基因MK的表达，具有成为用于抑制MK高表达的肝癌细胞生长及与新生血管形成相关疾病的新型生物工程药物的潜力。

根据本发明，反义寡核苷酸的化学修饰物可以是硫代修饰。

根据本发明，包括有效成分的本发明的反义寡核苷酸或其修饰物以及药物学可以接受的载体的药物组合物，本发明的药物组合物能用于抑制高表达MK的肝癌等恶性肿瘤细胞的生长及与新生血管形成相关疾病。

本发明参照附图及下列实施例进行解释，这些实施例的目的只是为了解释而不是为了以任何方式限制本发明。

附图说明：

表1硫代反义寡核苷酸序列及性质

图1a，1b，1c，分别表示10条硫代MK mRNA反义寡核苷酸对HepG2、SMMC7721和BEL7402三种人肝癌细胞增殖的抑制率及剂量依赖效应。图中水平轴上列出的数字1、2、3、4、5、6、7、8、9、10分别代表本发明的反义寡核苷酸MK1、MK2、MK3、MK4、MK5、MK6、MK7、MK8、MK9、MK10.

表2为10条硫代反义寡核苷酸的IC₅₀值

图2a，2b分别表示反义寡核苷酸MK5抑制人HepG2肝癌细胞中MK mRNA表达的序列特异性及相对表达率

图3a，3b分别表示反义寡核苷酸MK5抑制人HepG2肝癌细胞中MK蛋白表达的序列特异性及相对表达率

图4表示反义寡核苷酸MK5抑制人HepG2肝癌细胞增殖的序列特异性

图5a，5b分别表示反义寡核苷酸MK5抑制人HepG2细胞MK mRNA表达的剂量依赖效应

图6a，6b分别表示反义寡核苷酸MK5抑制人HepG2肝癌细胞中MK蛋白表达的剂量依赖效应

图7.表示反义寡核苷酸MK5对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的抑制作用及剂量依赖效应

具体实施方式：

实施例一：靶向MK基因硫代反义寡核苷酸的设计和筛选

材料和方法

1、靶向MK基因硫代反义寡核苷酸的设计与合成

检索GeneBank中的核酸序列数据库，选择NCBI公布的Midkine mRNA参考序列(GeneBank序列号：24475622)，通过对其进行基于多预测RNA二级结构的计算机辅助设计，选择了10个不稳定的茎环结构作为ASODN的作用靶点。通过与GeneBan联机blast序列比对，所选择的靶序列均具有很好的特异性，不会干扰人类其它正常基因的表达。作为评价MK5作用的特异性，设计了其正义序列(SEN)和组成与MK5完全相同而序列不同的错配序列(MIS)(见表1)。所有寡核苷酸均采用ABI8909型自动DNA合成仪合成并在合成时进行硫代修饰，过程如下：将硫代试剂(Beaucage regent，Transgenomic)溶于无水乙腈中使其终浓度为1g/100ml，置于DNA合成仪AUX位置处，采用合成仪上提供的DNA硫化程序进行自动合成硫代寡核苷酸。合成完毕浓氨水55℃切割并脱保护15小时后，经Micro Pure II反相纯化柱(Oligo Prep OP120，SAVANT)纯化，紫外定量后真空干燥，一20℃保存备用。

2.细胞培养

实验所用的细胞系有：人肝癌细胞系HepG2、SMMC7721，BEL7402由军事科学院放射研究所提供。实验所用细胞用含10％小牛血清及100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素的DMEM培养基，置37℃，5％CO₂孵箱培养。

3.S-ASODN转染、MTT法测细胞生长抑制率

待细胞出现50％-60％融合后，在无血清状态下，采用Lipofection(Gibco，1mg/mL)试剂，并参照说明书操作进行硫代反义寡核苷酸转染，每条反义寡核苷酸设置四个浓度，分别为0.1μM、0.2μM、0.4μM、0.8μM。每个浓度三孔，每孔总体积100uL，并设置细胞和脂质体对照。转染5小时后，换含10％小牛血清的DMEM培养基培养19小时，然后每孔加20uLMTs(Promega)，37℃孵育90min，测定490nm光吸收(A₄₉₀)，计算以抑制率＝(A_对照-A_用药)/A_对照，通过细胞生长倍增数量评价反义寡核苷酸对细胞生长得影响，计算细胞增殖的抑制率。所用反义寡核苷酸为MK1、MK2、MK3、MK4、MK5、MK6、MK7、MK8、MK9、MK10，并均为硫代修饰。

结果

1、靶向MK基因硫代反义寡核苷酸的设计与合成

共选择了10作用靶点的ASODN，分别为MK1、MK2、MK3、MK4、MK5、MK6、MK7、MK8、MK9、MK10，并均为硫代修饰。作为评价MK5作用的特异性，设计了其正义序列(SEN)和组成与MK5完全相同而序列不同的错配序列(MIS)(见表1)。

2、靶向MK基因硫代反义寡核苷酸的筛选

图1a，b，c中可见10条S-ASODN对HepG2、SMMC7721和BEL7402三种人肝癌细胞均有不同程度的抑制作用。MK1、MK2、MK3、MK4、MK5、MK6、MK7、MK8在0.4μM时对HepG2、SMMC7721和BEL7402三种人肝癌细胞的增殖具有明显的抑制作用。在0.1-0.8μM浓度范围内，MK1、MK2、MK3、MK4、MK5、MK6、MK7、MK8对HepG2、SMMC7721和BEL7402三种人肝癌细胞的增殖具有明显的剂量依赖性抑制活性。结果表明，MK1、MK2、MK3、MK4、MK5、MK6、MK7、MK8可以有效地抑制HepG2、SMMC7721和BEL7402三种人肝癌细胞的生长。

3、通过S-ASODN对HepG2、SMMC7721、和BEL7402三种人肝癌细胞增殖的抑制率得出其IC₅₀值(表2)，结果MK5的IC₅₀值最小，表明MK5对HepG2、SMMC7721和BEL7402三种肝癌细胞增殖的抑制效果最好。

结论

1、靶向MK的10条ASODNs对HepG2、SMMC7721和BEL7402三种人肝癌细胞的增殖具有不同程度的抑制活性。

2、在0.1-0.8μM浓度范围内，MK1、MK2、MK3、MK4、MK5、MK6、MK7、MK8对HepG2、SMMC7721和BEL7402三种人肝癌细胞的增殖均有明显的剂量依赖效应。

3、根据S-ASODN对三种人肝癌细胞的抑制率得出的IC₅₀值表明MK5对人肝癌细胞生长的抑制效果最好。

实施例二：反义寡核苷酸MK5抑制人HepG2肝癌细胞生长及MK表达的序列特异性

材料和方法

1、细胞培养：人HepG2肝癌细胞系由军事科学院放射研究所提供，细胞用含10％小牛血清及100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素的DMEM培养基，置37℃，5％CO₂孵箱培养。

2、实验分组：根据在人HepG2肝癌细胞中加药的不同，分为反义寡核苷酸MK5组、正义序列组和错配序列组，并设不加药组作为对照。

3、MK5抑制人HepG2肝癌细胞中MKmRNA表达的序列特异性

各组以0.4μM加药处理人HepG2肝癌细胞，24小时后，吸去培养液，用PBS清洗2遍后，按TRIzol试剂盒(Invitrogen)说明书提取总RNA，紫外分光光度计定量，OD 260/280在1.8-2.0之间，RNA甲醛变性电泳显示无降解。然后进行逆转录，具体方法如下：各取RNA1μl，OligodT(15)0.5μg，RNA酶抑制剂(40U)0.1μl，共10.3μl，混匀，70℃温育10min，立即冰上冷却。加入第一链反应缓冲液5μl，DTT 2.5μl，RNA酶抑制剂0.7μl，dNTP(A、G、C、T10mM)1.0μl，混匀，42℃反应2min，加入逆转录酶superscript II 0.5μl，42℃反应1min，最后70℃变性15min。反转录产物1.5μl作为PCR扩增的模板，以看家基因三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内源对照，进行双重PCR。靶基因MK上游引物为5’GAAAGGGAAGGGAAAGGA 3’，下游引物为5’AAAGCG GGC TCT GGG ACT 3’，扩增片段为307bp。GAPDH的上游引物为5’ACCACAAGTCCATGCCATCAC3’，下游引物为5’TCCACCACCCTGTTGCTGTA3’，扩增片段499bp。PCR反应体系总体积20μl，上下游引物终浓度为1μM，Mg²⁺浓度1.5mM，加入反转录产物0.5μl，Taq酶1U。PCR循环参数为94℃预变性2min，94℃ 20s，61℃ 30s，72℃ 20s，循环22次，最后72℃延伸2min。2％琼脂糖凝胶(Sigma)电泳检测。BIO-RAD图像分析系统检测。

4、MK5抑制人HepG2肝癌细胞中MK蛋白的序列特异性

各组采用脂质体介导的方法以0.4μM给药浓度转染人HepG2肝癌细胞，用RIPA-PICT(Pharmacia)提取细胞总蛋白，蛋白定量后将各提取物调至相同浓度。每孔50μg总蛋白，10％聚丙烯酰胺凝胶电泳后，采用半干转印法将蛋白转至硝酸纤维素膜(PROTRAN^_BA-S83Reinforced NC，Schleicher & Schuell)上，以β-actin(43KD)作为对照。4℃封闭过夜，封闭液组成：10％脱脂奶粉，1×TBST。然后与羊抗人MK抗体(Santa cruz)或鼠抗人β-actin抗体(Sigma)结合1h，TBST洗膜3次，每次10min，再与辣根过氧化酶标记的抗羊或抗鼠二抗(中山)结合1h，TBST洗膜3次，每次10min，ECL(Pharmacia)显色系统显色，X光片曝光。

5、MK5抑制HepG2肝癌细胞增殖的特异性分析

各组人HepG2肝癌细胞接种至6孔板，3×10³/每孔，37℃，5％CO₂条件下孵育24小时，待80-90％细胞融合后，在无血清状态下，采用Lipofection(Invitrogen，1mg/mL)试剂，并参照说明书操作，以0.4μM给药浓度进行寡核苷酸转染，孵育5小时后，换含10％新鲜小牛血清的DMEM培养基培养48小时，然后每孔加20μl MTs(Promega)，37℃，5％CO₂孵箱孵育90min，测定490nm光吸收(A490)，通过细胞生长倍增数量评价反义寡核苷酸MK5对肝癌HepG2细胞生长的影响，计算细胞增殖抑制率。

结果

1、MK5抑制人HepG2肝癌细胞中MK mRNA表达的序列特异性

反义寡核苷酸MK5组对人HepG2肝癌细胞中MKmRNA表达的抑制作用，与正义序列组、错配序列组和不加药组比较有显著性差异(P＜0.01)，其正义序列组、错配序列组与不加药组比较没有显著性差异(P＞0.05)(见图2a)。另外，采用Quantity One图像系统分析结果显示，以对照组MK与内标产物的灰度比值为标准(灰度比值定为100％)，其他几组与之比较，MK5组、正义序列组和错配序列组MKmRNA的相对表达率分别是对照组的96％、92.79％和35.48％(见图2b)。

2、MK5抑制人HepG2肝癌细胞中MK蛋白的序列特异性

反义寡核苷酸MK5组人HepG2肝癌细胞中MK蛋白的抑制作用，与其正义、错配序列和不加药组比较有显著性差异(P＜0.01)。正义序列组、错配序列组与不加药组比较没有显著性差异(P＞0.05)(见图3a)。采用Quantity One图像系统分析结果显示，以对照组MK与内标产物的灰度比值为标准(灰度比值定为100％)，其他几组与之比较，MK5组、正义序列组和错配序列组MK蛋白的相对表达率分别是对照组的96.79％、99.59％和6.3％(见图3b)。

3、MK5对HepG2肝癌细胞生长抑制特异性的分析

反义寡核苷酸MK5对HepG2肝癌细胞的增殖具有明显的抑制作用，与其正义、错配序列和不加药组比较有显著性差异(P＜0.01)。正义序列组和错义序列与不加药组比较没有显著性差异(P＞0.05)。(见图4)

结论

1、MK5能特异性抑制人HepG2肝癌细胞中MK mRNA的表达，具有明显的序列特异性

2、MK5能特异性抑制人HepG2肝癌细胞中MK蛋白的表达，具有明显的序列特异性

3、MK5能特异性抑制人HepG2肝癌细胞的生长，具有明显的序列特异性

实施例三：反义寡核苷酸MK5抑制人HepG2肝癌细胞生长及MK表达的的剂量依赖效应材料和方法

1、细胞培养。HepG2肝癌细胞系由军事科学院放射研究所提供，细胞用含10％小牛血清及100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素的DMEM培养基，置37℃，5％CO₂孵箱培养。

2、实验分组：根据在人HepG2肝癌细胞中加入反义寡核苷酸MK5药量的不同，分为0.2μM、0.4μM和0.8μM组，并设不加药组作为对照。

3、反义寡核苷酸MK5抑制人HepG2细胞中MK mRNA表达的剂量依赖效应各组以不同的给药浓度处理人HepG2肝癌细胞，其余操作同实施例二的3。

4、反义寡核苷酸MK5抑制人HepG2肝癌细胞中MK蛋白表达的剂量依赖效应各组采用脂质体介导的方法以不同的给药浓度转染人HepG2肝癌细胞，其余操作同实施例二的4。

5、反义寡核苷酸MK5抑制人HepG2肝癌细胞生长的剂量依赖效应

各组人HepG2肝癌细胞接种至6孔板，3×10³/每孔，37℃，5％CO₂条件下孵育24小时，待细胞出现50％-60％融合后，在无血清状态下，采用Lipofection(Gibco，1mg/mL)试剂，并参照说明书操作进行各组硫代反义寡核苷酸转染，每个浓度三孔，每孔总体积100uL，并设置细胞和脂质体对照。转染5小时后，换含10％小牛血清的DMEM培养基培养19小时，然后每孔加20uLMTs(Promega)，37℃孵育90min，测定490nm光吸收(A₄₉₀)，计算以抑制率＝(A_对照-A_{用 药})/A_对照，通过细胞生长倍增数量评价反义寡核苷酸对细胞生长得影响，计算细胞增殖的抑制率。

结果

1、反义寡核苷酸MK5的3个浓度组0.2、0.4、0.8μM处理48小时后，MK mRNA的表达均受到抑制，采用Quantity One图像系统分析结果显示，以对照组MK与内标产物的灰度比值为标准(灰度比值定为100％)，其他几组与之比较，0.2μM、0.4μM和0.8μM组的MKmRNA的相对表达率分别是对照组的65.06％、40.88％和22.96％。故反义寡核苷酸MK5对人HepG2肝癌细胞MK mRNA的表达具有浓度依赖性抑制作用(P＜0.05)(图5a，5b)。

2、反义寡核苷酸MK5的3个浓度组0.2、0.4、0.8μM处理48小时后，MK蛋白的表达均受到抑制，采用Quantity One图像系统分析结果显示，以对照组MK与内标产物的灰度比值为标准(灰度比值定为100％)，其他几组与之比较，0.2μM、0.4μM和0.8μM组的MK蛋白的相对表达率分别是对照组的54.16％、17.16％和3.6％。故反义寡核苷酸MK5对人HepG2肝癌细胞MK蛋白的表达具有明显的浓度依赖性抑制作用(P＜0.05)(图6a，6b)。

3、反义寡核苷酸MK5的3个浓度组0.2、0.4、0.8μM处理48小时后，细胞增殖受到明显抑制，MTT法测得其抑制率分别为67.4％、74.7％和80.5％。故反义寡核苷酸MK5对人HepG2肝癌细胞的增殖具有明显的浓度依赖性抑制作用(P＜0.05)(图1a)

结论

1、反义寡核苷酸MK5能明显抑制人HepG2细胞中MK mRNA的表达，并具有明显的剂量依赖效应。

2、反义寡核苷酸MK5能明显抑制人HepG2肝癌细胞中MK蛋白的表达，并具有明显的剂量依赖效应。

3、反义寡核苷酸MK5能明显抑制人HepG2肝癌细胞的生长，并具有明显的剂量依赖效应。

实施例四：反义寡核苷酸MK5对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的特异性抑制作用及剂量依赖效应

材料和方法

1、细胞培养人脐静脉内皮细胞系(HUVER)购自美国Cascade Biolgics公司。细胞用含10％小牛血清及100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素的DMEM培养基，置37℃，5％CO₂孵箱培养。

2、反义寡核苷酸MK5对人脐静脉内皮细胞生长的特异性抑制及剂量依赖效应

人脐静脉内皮细胞接种至6孔板，3×10³/每孔，37℃，5％CO₂条件下孵育24小时，待80-90％细胞融合后，在无血清状态下，采用Lipofection(Invitrogen，1mg/mL)试剂，并参照说明书操作进行寡核苷酸转染，反义寡核苷酸MK5及其正义和错配序列各设置三个浓度组，分别为0.2、0.4、0.8μM，并设置一个空白对照。孵育5小时后，换含10％新鲜小牛血清的DMEM培养基培养48小时，然后每孔加20μl MTs(Promega)，37℃，5％CO₂孵箱孵育90min，测定490nm光吸收(A₄₉₀)，通过细胞生长倍增数量评价反义寡核苷酸MK5对人脐静脉内皮细胞生长的影响，计算细胞增殖抑制率。

结果

1、反义寡核苷酸MK5抑制人脐静脉内皮细胞增殖的序列特异性

加反义寡核苷酸MK5组与其正义组、错配序列组和不加药空白对照组比较有显著性差异(均P＜0.05)，其正义组和错配序列与不加药组比较没有显著性差异(均P＞0.05)。表明反义寡核苷酸MK5能明显抑制人脐静脉内皮细胞的增殖，并具有明显的序列特异性(见图7)。

2、人脐静脉内皮细胞经反义寡核苷酸MK5的3个浓度组0.2、0.4、0.8μM处理48小时后，细胞增殖受到明显抑制，MTT法测得其抑制率分别为36.48％、51.65％和68.5％。故反义寡核苷酸MK5对人脐静脉内皮细胞的增殖具有浓度依赖性抑制作用(P＜0.05)(见图7)。

结论

1、反义寡核苷酸MK5能特异性抑制人HepG2肝癌细胞的生长，具有明显的序列特异性。

2、反义寡核苷酸MK5能有效抑制人脐静脉内皮细胞的增殖，并具有明显的剂量依赖效应。

Claims (6)

1.一种抑制人中期因子(Midkine，MK)表达的反义寡核苷酸，其长度为20个核苷酸，其特征是：与MK GeneBank(GeneBank序列号：24475622)转录部分的MK mRNA的一部分互补。

2.根据权利要求1中的寡核苷酸，其包括序列如下表。   SEQ IDNO.   名称   MK mRNA靶位(nt)   长度(nt)   特性   寡核苷酸序列(5’-3’)   12345678910   MK1MK2MK3MK4MK5MK6MK7MK8MK9MK10   629-648178-1971-20428-447108-127296-315435-454636-65561-80511-530   20202020202020202020   AAAAAAAAAA   ATC CCT TGT CCC TCC CCA CTCGC GGA AAC CCA CGC CGC AATGC CCG CGC TGC TTG GCC CGCCC TTC CCT TTC TTG GCT TTCCC CGG GCC GCC CTT CTT CACCC CAT CAC ACG CAC CCC AGGTC CTT TCC CTT CCC TTT CTTCC CAG AAT CCC TTG TCC CTAGG AGG GTG AGG AGG AGG AACGG GCC TGG GAG AGG GAG GG

A：反义

3.根据权利要求1中的寡核苷酸，其最佳序列是：MK5

4.根据权利要求1中的寡核苷酸，经过不同化学修饰后，可以用于治疗肝癌等MK高表达的恶性肿瘤及与新生血管形成相关的疾病。

5.权利要求4中的寡核苷酸的化学修饰物可以是硫代修饰。

6.权利要求5中经化学修饰后的寡核苷酸可以制成各种不同的剂型，通过不同的给药途径用于高表达MK的肝癌等恶性肿瘤及与新生血管形成相关的疾病治疗的组合物。

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