CN1793860A - 激光共焦扫描结合图像拼接的生物芯片成像方法及其装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了激光共焦扫描结合图像拼接的生物芯片成像方法及其装置。整个生物芯片区域分成多个子区域，每个子区域的一维扫描由振镜与平场物镜组成的光学扫描实现，另一维由电机与导轨组成的机械扫描实现，荧光信号由光电探测器转换为电信号，经计算机采集并重建当前子区域的荧光图像。完成第一个子区域扫描成像后，生物芯片沿光学扫描方向平移一段距离，使下一子区域进入光学扫描范围，实现该子区域的扫描成像，依此类推，在完成最后一个子区域的扫描成像后，计算机对每个子区域的荧光图像拼接，合成完整的生物芯片荧光图像。本发明以分区扫描、图像拼接的方法克服了光学扫描装置中平场物镜焦距长、数值孔径小的缺点，提高了光学分辨率和荧光探测灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及生物芯片荧光成像方法及其装置，尤其是激光共焦扫描结合图像拼接的生物芯片成像方法及其装置。
背景技术
基于激光共焦扫描的生物芯片荧光成像方法按照扫描方式可分为两大类：第一类是将反射镜和小视场物镜固定在一个扫描头内，扫描头沿某一方向快速扫描生物芯片；第二类是采用大视场物镜，激光束以不同角度入射至物镜，由物镜将激光束的角度扫描转换为沿生物芯片某一方向的线性扫描。美国专利5,459,325和6,407,858均描述了第一类扫描装置，前者将反射镜与显微物镜固定在一个扫描头内，该扫描头由直线电机驱动，沿一个直线导轨快速往复运动，从而实现对生物芯片一个方向的直线扫描；后者将扫描头设计成弧线扫描运动，反射镜和物镜固定在一个以一定频率作摆动的振荡臂上，绕其轴线作旋转运动，因此获得的原始荧光图像为球坐标图像。第一类扫描装置的优点在于物镜的焦距短、数值孔径大，因此光学分辨率和荧光收集效率高，同时扫描视场始终沿着光轴方向，物镜只要保证轴上点的成像质量即可，对轴外点的像差没有要求，光学系统设计简单；其缺点为扫描头的重量较大，因此扫描惯性大、震动大，扫描速度仅20Hz左右，不仅降低了系统可靠性，而且生物芯片的分析时间较长。为克服上述缺点，美国专利5,381,224和5,646,411描述了第二类扫描装置，前者将两个振镜按照一定的摆动方式组合，使入射的激光束经振镜反射后，由大视场物镜实现激光束对生物芯片的二维扫描；后者采用一个振镜，使振镜在快速摆动的同时再旋转运动，将入射的激光束以不同角度反射至大视场物镜，实现生物芯片的二维扫描。中国专利02112040.4描述了振镜与大视场物镜共同实现生物芯片的一维高速扫描，步进电机驱动精密导轨实现生物芯片的另一维低速扫描，也属于第二类扫描装置。第二类装置的主要优点是振镜的转动惯量小、噪声小、扫描速度可达50Hz以上；缺点主要是大视场物镜必须同时保证轴上点和轴外点的成像质量，光学设计复杂，焦距长，数值孔径小，很难获得很高的光学分辨率和荧光收集效率。
发明内容
本发明的目的是提供一种扫描速度快、噪声小、光学分辨率高、荧光收集效率高的激光共焦扫描结合图像拼接的生物芯片成像方法及其装置。
为达上述目的，本发明的激光共焦扫描结合图像拼接的生物芯片成像方法，采用平场物镜分区域扫描和图像拼接实现整个生物芯片的荧光成像。
步骤如下：
1)将生物芯片放在由两台电机带动作二维移动的平台上；
2)将激光器发出的激光经扩束镜扩束，依次经过反射镜反射和二色镜透射后到达绕轴摆动的振镜，使激光束以不同角度反射至平场物镜，平场物镜将不同入射角度的激光束横向聚焦在生物芯片的下表面，对生物芯片横向扫描，同时，第一台电机带动平台纵向运动，对生物芯片纵向扫描，形成生物芯片的二维扫描子区域；
3)生物芯片发出的荧光由平场物镜收集，依次经过振镜、二色镜反射，荧光滤色片透射后，到达会聚镜，在会聚镜的焦面上放置开有小孔的共焦光阑，使生物芯片下表面的荧光穿过小孔到达光电探测器，光电探测器的输出信号经过前置信号处理单元放大处理，由计算机采集并重建该子区域的荧光图像；
4)第二台电机带动平台横向平移，对生物芯片下一子区域重复步骤2)和3)，获得各个子区域图像，由计算机拼接平场物镜视场内获得的各个子区域图像，得到完整的生物芯片荧光图像。
用于上述生物芯片成像方法的装置，包括激光器、扩束镜、反射镜、二色镜、振镜、平场物镜、荧光滤色片、会聚镜，开有小孔的共焦光阑、光电探测器和用于放置生物芯片的平台，在平台底部设置有导轨和导轨、导轨的丝杆与第一电机轴相连、导轨的丝杆与第二电机轴相连；激光器、扩束镜、反射镜、二色镜、振镜、平场物镜依次排列，形成生物芯片的激光扫描光路，振镜位于平场物镜的前焦面，生物芯片位于平场物镜的后焦面；在二色镜的反射光路上，沿光反射方向依次放置滤色片、会聚镜、共焦光阑和光电探测器，共焦光阑位于会聚镜的后焦面。
本发明的有益效果是：小视场平场物镜的焦距短、数值孔径大、体积小，在提高生物芯片扫描成像的光学分辨率和荧光收集效率的同时，减小了成像装置的尺寸，降低了系统成本。
举例来说，若平场物镜的扫描视场减小至原来的1/4，则其焦距可减小1倍以上，数值孔径可增大1倍，因此光学分辨率和荧光收集效率可提高2倍以上。整个成像装置可选择更小的振镜尺寸，振镜的扫描速度更快，可达到200Hz，虽然此时需分4次扫描整个生物芯片，但总体扫描速度仍然可保证50Hz。
本发明克服了背景技术中第一类装置和第二类装置的缺点，集成了各自的优点，可广泛应用于各类荧光显微成像系统中。
附图说明
图1是本发明构成示意图。
具体实施方式
参照图1，激光共焦扫描结合图像拼接的生物芯片成像方法的装置，包括激光器1、扩束镜2、反射镜3、二色镜4、振镜5、平场物镜6、荧光滤色片13、会聚镜14，开有小孔的共焦光阑15、光电探测器16和用于放置生物芯片7的平台8，在平台8底部设置有导轨9和导轨10、导轨9的丝杆与第一电机11轴相连、导轨10的丝杆与第二电机12轴相连；激光器1、扩束镜2、反射镜3、二色镜4、振镜5、平场物镜6依次排列，形成生物芯片7的激光扫描光路，振镜5位于平场物镜6的前焦面，生物芯片7位于平场物镜6的后焦面；在二色镜4的反射光路上，沿光反射方向依次放置滤色片13、会聚镜14、共焦光阑15和光电探测器16，共焦光阑15位于会聚镜14的后焦面。
使用时，将装置的光电探测器16与连接计算机18的前置信号处理单元17相连，前置信号处理单元17可以是OPA27芯片。发明装置工作如下：由激光器1发出的激光首先经扩束镜2扩束，依次经过反射镜3反射和二色镜4透射后到达振镜5，振镜5绕其轴5-1快速摆动，将激光束以不同角度反射至平场物镜6，平场物镜6将不同入射角度的激光束沿Y方向聚焦在生物芯片7下表面的不同位置，激发相应位置的荧光标记物，实现生物芯片7的横向扫描。第一电机11推动导轨9沿X方向运动，实现生物芯片7的纵向扫描。平场物镜6的视场大小仅为生物芯片宽度的一部分，因此仅扫描生物芯片7一个子区域7-1。子区域7-1扫描点发出的荧光由平场物镜6收集，依次经过振镜5反射、二色镜4反射、荧光滤色片13透射后，到达会聚镜14，在会聚镜14的焦面上放置开有小孔的共焦光阑15，仅生物芯片下表面的荧光能穿过小孔到达光电探测器16，光电探测器16的输出信号经过前置信号处理单元17放大处理，由计算机18采集并重建子区域7-1的荧光图像。第二电机12通过导轨10带动平台8沿Y方向平移，使生物芯片7的下一子区域7-2到达平场物镜6的视场之内。重复上述对子区域的扫描过程，获得子区域7-2、7-3、7-4的荧光图像。完整的生物芯片荧光图像由计算机18拼接平场物镜6视场内获得的各个子区域7-1、7-2、7-3、7-4的荧光图像得到。
Claims (2)
1.激光共焦扫描结合图像拼接的生物芯片成像方法，步骤如下：
1)将生物芯片放在由两台电机带动作二维移动的平台上；
2)将激光器发出的激光经扩束镜扩束，依次经过反射镜反射和二色镜透射后到达绕轴摆动的振镜，使激光束以不同角度反射至平场物镜，平场物镜将不同入射角度的激光束横向聚焦在生物芯片的下表面，对生物芯片横向扫描，同时，第一台电机带动平台纵向运动，对生物芯片纵向扫描，形成生物芯片的二维扫描子区域；
3)生物芯片发出的荧光由平场物镜收集，依次经过振镜、二色镜反射，荧光滤色片透射后，到达会聚镜，在会聚镜的焦面上放置开有小孔的共焦光阑，使生物芯片下表面的荧光穿过小孔到达光电探测器，光电探测器的输出信号经过前置信号处理单元放大处理，由计算机采集并重建该子区域的荧光图像；
4)第二台电机带动平台横向平移，对生物芯片下一子区域重复步骤2)和3)，获得各个子区域图像，由计算机拼接平场物镜视场内获得的各个子区域图像，得到完整的生物芯片荧光图像。
2.根据权利要求1所述的生物芯片成像方法的装置，其特征在于包括激光器(1)、扩束镜(2)、反射镜(3)、二色镜(4)、振镜(5)、平场物镜(6)、荧光滤色片(13)、会聚镜(14)，开有小孔的共焦光阑(15)、光电探测器(16)和用于放置生物芯片(7)的平台(8)，在平台(8)底部设置有导轨(9)和导轨(10)，导轨(9)的丝杆与第一电机(11)轴相连、导轨(10)的丝杆与第二电机(12)轴相连；激光器(1)、扩束镜(2)、反射镜(3)、二色镜(4)、振镜(5)、平场物镜(6)依次排列，形成生物芯片(7)的激光扫描光路，振镜(5)位于平场物镜(6)的前焦面，生物芯片(7)位于平场物镜(6)的后焦面；在二色镜(4)的反射光路上，沿光反射方向依次放置滤色片(13)、会聚镜(14)、共焦光阑(15)和光电探测器(16)，共焦光阑(15)位于会聚镜(14)的后焦面。
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