CN111220615A - 一种倾斜式三维扫描显微成像系统及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种倾斜式三维扫描显微成像系统，其特征在于：包括面阵相机(1)、筒镜(2)、显微物镜(3)、样品夹具(5)、三维电动平移台(6)、三维电动平移台控制器(8)、计算机(9)、图像处理器(10)；所述三维电动平移台(6)以及所述样品夹具(5)相对平行，样品平面与显微物镜的焦平面不平行、构成一个倾斜夹角θ，所述三维电动平移台(6)带动样品(4)在样品平面上进行倾斜式扫描运动。本发明能够快速的对玻片样品进行三维成像，在保证扫描效率的同时，能够更加完整的获取切片的三维数据，以保证病理切片信息的完整性。

Description

一种倾斜式三维扫描显微成像系统及方法
技术领域
本发明属于扫描显微成像领域，具体涉及一种倾斜式三维扫描显微成像系统及方法。
背景技术
病理扫描仪在病理研究，临床诊断以及教学方面都具有非常大的前景。
相比与镜下阅读病理切片，数字图像在可存储性、共享性以及辅助阅片系统的应用上都具有非常大的优势。但是，由于显微物镜的景深有限，病理玻片扫描仪在扫描成像时只能对样品的某一层进行清晰的成像，这就使得数字病理图像未能够完全将病理玻片的信息进行数字化，会存在信息的丢失。
例如在宫颈细胞筛查的过程中，细胞的涂片往往会存在上下多层的重叠现象，如果使用现有病理扫描仪进行扫描成像，则无法对整个切片的所有细胞都进行清晰的成像，这就可能会导致细胞判读的数量不够，产生假阴性。现有的病理扫描成像仪器大部分仅对样品的单层做扫描成像。少部分仪器能够对玻片样品的多层进行扫描成像，但其成像方法依然是利用单层扫描的方案重复多次来完成多层的扫描，扫描时间与成像层数成比例增加。而且，在单层扫描成像的过程中，由于所使用的显微物镜景深有限，而切片样品存在着不平整性以及样品的堆叠，所以单片扫描成像过程中需要耗费大约80％的时间来进行预对焦，这也极大的限制了切片样品数字化的效率。
所以，在扫描显微成像领域，如何快速的并且完整的获取整个切片样品的数字化图像是当前亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术以上缺陷或改进需求中的至少一种，本发明旨在提供一种能够快速的对玻片样品进行三维成像的系统及方法，在保证扫描效率的同时，能够更加完整的获取切片的三维数据，以保证病理切片信息的完整性。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种倾斜式三维扫描显微成像系统，其特征在于：包括面阵相机、筒镜、显微物镜、样品夹具、三维电动平移台、三维电动平移台控制器、计算机、图像处理器；
所述显微物镜与所述筒镜成共轴关系，所述三维电动平移台控制器与三维电动平移台以及计算机通过网口通讯相连接，所述面阵相机通过所述图像处理器与计算机相连接；
所述三维电动平移台以及所述样品夹具相对平行，样品平面与显微物镜的焦平面不平行、构成一个倾斜夹角θ，所述三维电动平移台带动样品在样品平面上进行倾斜式扫描运动。
优选地，所述三维电动平移台包括三个步进电机与丝杆以及导轨。
优选地，所述三维电动平移台还带有光栅反馈定位装置。
优选地，还包括照明器；所述面阵相机、筒镜、显微物镜以及所述照明器构成同轴的透射式显微成像光路。
优选地，还包括照明器；所述面阵相机、筒镜、显微物镜以及所述照明器构成反射式显微荧光成像光路为实现上述目的，按照本发明的另一方面，还提供了一种倾斜式三维扫描显微成像系统的成像方法，其中
面阵相机所获得的图像的长度为L，样品扫描成像的层数为n，触发间隔距离为l，显微物镜的成像景深为h；样品平面即运动平面内的X轴与显微成像系统的焦平面构成夹角θ，运动平面内的Y轴与显微成像系统的焦平面依然保持平行；
参数的关系为：
L＝l×n；
tanθ＝h/l；
成像方法包括如下步骤：
步骤一、三维电动平移台在计算机和三维电动平移台控制器的控制下，沿平行于台面的X轴方向移动样品区域相同长度的距离L，同时每隔距离l给出一个同步触发脉冲到面阵相机上，图像处理器监测到面阵相机产生数字图像后，开始将数据读入到图像处理器的缓存，获得第一个条带的扫描图像；
步骤二、三维电动平移台移动Y轴，并沿X轴负方向运动距离L，同时每隔距离l给出一个同步触发脉冲到面阵相机上，图像处理器监测到面阵相机产生数字图像后，开始将数据读入到图像处理器的缓存，获得第二个条带的扫描图像；
步骤三、重复步骤二，依次获得多个条带的扫描图像，直至扫描成像区域完全覆盖了样品区域；
步骤四、按如下方式进行图像重建：
对每一个条带的扫描图像，图像处理器先将所获取的相同Y轴坐标的图像进行平均分割，其分割的份数为样品扫描成像的层数n；根据X轴的坐标不同，单张图像分别被分割成编号为1至n共计n张图；图像处理器将相同编号的图像拼接为一张条带图像，该条带图像即为扫描成像的单层图像；根据编号的不同，图像处理器一共拼接出n张不同的图像，分别为不同Z向深度的图像，每个条带的图像数据即重建为三维图像。
上述优选技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
面阵图像传感器的不同位置对应着不同深度的样品信息，能够在单次扫描运动的过程中，对不同深度的样品进行同时成像，避免了重复运动，提高了成像效率，能够获取切片样品的三维图像信息。并且该方案成像深度比物镜的景深大，对光学系统的焦面不敏感，也降低了显微成像系统对调焦的高精度要求。同时,该系统不局限于透射式成像,也可以用于反射式成像中三维数据的获取,例如显微荧光成像。
附图说明
图1是本发明实施例的倾斜式三维扫描显微成像系统的结构示意图；
图2是本发明实施例的倾斜式三维扫描显微成像系统的成像方法原理示意图；
图3是本发明实施例的倾斜式三维扫描显微成像系统的成像方法的图像重建示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。下面结合具体实施方式对本发明进一步详细说明。
作为本发明的一种较佳实施方式，如图1-3所示，本发明提供一种倾斜式三维扫描显微成像系统，包括面阵相机1、筒镜2、显微物镜3、样品夹具5、三维电动平移台6、照明器7、三维电动平移台控制器8、计算机9、图像处理器10。
所述三维显微扫描成像系统与传统显微扫描成像系统的安装位置具有显著不同。传统显微扫描成像系统中，要求平移台的样品平面与成像光路系统的光轴应该保证相互垂直成90°夹角，使显微物镜的焦平面与玻片样品的平面平行，避免显微成像的视场中的样品出现局部清晰局部模糊的情况。由于显微物镜的景深有限，且物镜的分辨率越高景深越小，在利用该类成像系统对玻片样品进行高分辨成像时，首先需要对样品进行对焦，让显微成像系统的焦平面与样品平面重合，保证显微成像系统能够对样品进行清晰的成像。在利用高分辨的显微物镜对样品进行成像时，由于物镜的景深较短，对焦系统也必须使用定位精度较高的执行机构才能完成精准对焦，这对整个成像系统的性能提出了较高的要求。同时，在扫描显微成像系统中，样品的移动以及样品本身的高低起伏会导致样品平面与显微系统的焦平面出现不重合的情况，即离焦。这会导致成像系统所拍摄的图像不清晰，分辨率和对比度大大降低。所以，为了拍摄到整个样品清晰度最佳的图像，现有的显微扫描成像系统有两种扫描策略，一种策略是逐个视野进行自动对焦，取最清晰的图像，但这种方法耗时较长。另一种策略是在进行大面积扫描成像前，对样品进行预对焦，然后拟合出样品的焦平面分布后，再进行三轴联动，对样品进行快速扫描成像。
同时，由于高分辨物镜的景深(<2μm)范围一般小于样品的厚度(>3μm)，例如细胞涂片样品的堆叠厚度可能大于10μm。所以在进行扫描成像时，单层扫描成像只能获取到样品的部分信息。如果希望获取样品的完整信息，则需要对样品进行多层的重复运动扫描成像，耗时也会成比例增长。
为了实现快速的对玻片样品进行三维的快速成像，本发明提供了一种倾斜式的的扫描成像方式。所述显微物镜3与所述筒镜2成共轴关系，并与所述面阵相机1以及照明器7构成同轴的透射式显微成像光路；该系统不局限于透射式成像，面阵相机1、筒镜2、显微物镜3以及照明器7还可以构成反射式显微荧光成像光路；所述三维电动平移台控制器8与三维电动平移台6以及计算机9通过网口通讯相连接，所述面阵相机1通过所述图像处理器10与计算机9相连接；所述三维电动平移台6以及所述样品夹具5相对平行，并和显微物镜3构成的显微成像光路的同心轴、与扫描运动方向成夹角θ，即样品平面与显微物镜的焦平面不平行，沿某一个二维坐标方向构成一个倾斜角度；所述三维电动平移台6带动样品4在样品平面上进行倾斜式扫描运动。优选地，所述三维电动平移台6包括三个步进电机与丝杆以及导轨，还带有光栅反馈定位装置。
面阵相机所获得的图像的长度为L，样品扫描成像的层数为n，触发间隔距离为l，显微物镜的成像景深为h；样品平面即运动平面内的X轴与显微成像系统的焦平面构成夹角θ，运动平面内的Y轴与显微成像系统的焦平面依然保持平行；
参数的关系为：
L＝l×n；
tanθ＝h/l。
该扫描成像系统的原理如下：
显微扫描成像系统的焦平面与样品平面(运动平面)在沿X轴上构成一定的夹角，Y轴依然保持平行。由于显微物镜存在一定的景深，当夹角存在时，可以将显微成像系统的焦平面沿X轴方向分成多个不同的成像区域，每个成像区域对应着沿Z轴不同的深度的图像，当平移台沿X轴进行扫描成像时，图像传感器会进行连续等间隔曝光，所获取的图像长度为L，所拍摄的层数为n，则触发间隔距离l等于L\n。根据触发间隔的长度，图像处理器将图像按照L/n的长度分成n份。没一份对应着不同Z轴深度的图像。则该成像系统在沿X轴扫描成像时，可以同时对不同深度的样品进行扫描成像，即三维扫描成像，随着X轴的平移，图像传感器会输出一系列的图像，图像处理单元会将该序列的每一张图像按照L/n的大小按顺序裁成n份并编号1至n。然后将每张图像中编号相同的图像拼接到一起组成一张新图像，则该序列的图像在裁剪重组后构成了n张独立的图像，且每一张对应着样品不同深度的图像信息。
本发明选用了20X数值孔径为0.75的物镜，其景深范围根据公式计算约为1.24μm，成像系统的相机采用了3000×3000分辨率的彩色CMOS相机，其像元大小5.5μm。假定成像系统同时拍摄的层数为10层，则单次成像的触发距离为82.5μm，可以计算出θ＝0.9°。
如图2-3所示，本发明的倾斜式三维扫描显微成像系统的成像方法，包括如下步骤：
步骤一、三维电动平移台6在计算机9和三维电动平移台控制器8的控制下，沿平行于台面的X轴方向移动样品区域相同长度的距离L，同时每隔82.5μm给出一个同步触发脉冲到面阵相机1上，图像处理器10监测到面阵相机1产生数字图像后，开始将数据读入到图像处理器10的缓存，获得第一个条带的扫描图像；
步骤二、三维电动平移台6移动Y轴，并沿X轴负方向运动距离L，同时每隔82.5μm给出一个同步触发脉冲到面阵相机1上，图像处理器10监测到面阵相机1产生数字图像后，开始将数据读入到图像处理器10的缓存，获得第二个条带的扫描图像；
步骤三、重复步骤二，依次获得多个条带的扫描图像，直至扫描成像区域完全覆盖了样品区域；
步骤四、如图3所示，按如下方式进行图像重建：
对每一个条带的扫描图像，图像处理器10先将所获取的相同Y轴坐标的图像进行平均分割，其分割的份数为样品扫描成像的层数n，以10层为例，此时分割长度应取300个像素；根据X轴的坐标不同，单张图像分别被分割成编号为0-9共计10张图；图像处理器10将相同编号的图像拼接为一张条带图像，该条带图像即为扫描成像的单层图像；根据编号的不同，图像处理器一共拼接出10张不同的图像，分别为不同Z向深度的图像，每个条带的图像数据即重建为三维图像。
本发明的倾斜式三维扫描显微成像系统能够快速的对玻片样品进行三维成像，在保证扫描效率的同时，能够更加完整的获取切片的三维数据，以保证病理切片信息的完整性。面阵图像传感器的不同位置对应着不同深度的样品信息，能够在单次扫描运动的过程中，对不同深度的样品进行同时成像，避免了重复运动，提高了成像效率，能够获取切片样品的三维图像信息。并且该方案成像深度比物镜的景深大，对光学系统的焦面不敏感，也降低了显微成像系统对调焦的高精度要求。同时,该系统不局限于透射式成像,也可以用于反射式成像中三维数据的获取,例如显微荧光成像。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种倾斜式三维扫描显微成像系统，其特征在于：包括面阵相机(1)、筒镜(2)、显微物镜(3)、样品夹具(5)、三维电动平移台(6)、三维电动平移台控制器(8)、计算机(9)、图像处理器(10)；
所述显微物镜(3)与所述筒镜(2)成共轴关系，所述三维电动平移台控制器(8)与三维电动平移台(6)以及计算机(9)通过网口通讯相连接，所述面阵相机(1)通过所述图像处理器(10)与计算机(9)相连接；
所述三维电动平移台(6)以及所述样品夹具(5)相对平行，样品平面与显微物镜的焦平面不平行、构成一个倾斜夹角θ，所述三维电动平移台(6)带动样品(4)在样品平面上进行倾斜式扫描运动。
2.如权利要求1所述的倾斜式三维扫描显微成像系统，其特征在于：
所述三维电动平移台(6)包括三个步进电机与丝杆以及导轨。
3.如权利要求2所述的倾斜式三维扫描显微成像系统，其特征在于：
所述三维电动平移台(6)还带有光栅反馈定位装置。
4.如权利要求1所述的倾斜式三维扫描显微成像系统，其特征在于：
还包括照明器(7)；所述面阵相机(1)、筒镜(2)、显微物镜(3)以及所述照明器(7)构成同轴的透射式显微成像光路。
5.如权利要求1所述的倾斜式三维扫描显微成像系统，其特征在于：
还包括照明器(7)；所述面阵相机(1)、筒镜(2)、显微物镜(3)以及所述照明器(7)构成反射式显微荧光成像光路。
6.一种如权利要求1-5任一项所述的倾斜式三维扫描显微成像系统的成像方法，其特征在于：
面阵相机所获得的图像的长度为L，样品扫描成像的层数为n，触发间隔距离为l，显微物镜的成像景深为h；样品平面即运动平面内的X轴与显微成像系统的焦平面构成夹角θ，运动平面内的Y轴与显微成像系统的焦平面依然保持平行；
参数的关系为：
L＝l×n；
tanθ＝h/l；
成像方法包括如下步骤：
步骤一、三维电动平移台(6)在计算机(9)和三维电动平移台控制器(8)的控制下，沿平行于台面的X轴方向移动样品区域相同长度的距离L，同时每隔距离l给出一个同步触发脉冲到面阵相机(1)上，图像处理器(10)监测到面阵相机(1)产生数字图像后，开始将数据读入到图像处理器(10)的缓存，获得第一个条带的扫描图像；
步骤二、三维电动平移台(6)移动Y轴，并沿X轴负方向运动距离L，同时每隔距离l给出一个同步触发脉冲到面阵相机(1)上，图像处理器(10)监测到面阵相机(1)产生数字图像后，开始将数据读入到图像处理器(10)的缓存，获得第二个条带的扫描图像；
步骤三、重复步骤二，依次获得多个条带的扫描图像，直至扫描成像区域完全覆盖了样品区域；
步骤四、按如下方式进行图像重建：
对每一个条带的扫描图像，图像处理器(10)先将所获取的相同Y轴坐标的图像进行平均分割，其分割的份数为样品扫描成像的层数n；根据X轴的坐标不同，单张图像分别被分割成编号为1至n共计n张图；图像处理器(10)将相同编号的图像拼接为一张条带图像，该条带图像即为扫描成像的单层图像；根据编号的不同，图像处理器一共拼接出n张不同的图像，分别为不同Z向深度的图像，每个条带的图像数据即重建为三维图像。
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