CN1786153A - 从无源太空搭载系统中回收微载体上细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及从无源太空搭载系统中回收微载体上细胞的方法，经过太空飞行后，返回地面的微载体上的哺乳类动物细胞的状态较差，因此不能直接进行消化处理，这时应进行消化处理前的细胞孵育，即从无源太空搭载系统中返回的装有微载体和细胞的冻存管中抽出培养液，换上太空完全培养基，然后置于5％左右的CO2、37℃左右孵箱内孵育15－20个小时或在细胞倍增期内孵育，再进行消化处理和单克隆化处理，本发明的方法简便易行，能最大限度地从无源太空搭载系统中的微载体内消化下来太空搭载细胞，尽可能使细胞保持良好的状态，解决了从无源太空搭载系统中返回地面后，从微载体内消化及单克隆细胞的困难。
Description
技术领域
本发明涉及一种处理微载体上细胞的方法，特别是从无源太空搭载系统中回收微载体上细胞的方法。
背景技术
目前，国内利用无源搭载系统对哺乳类动物细胞进行太空搭载试验，试验细胞依附于搭载系统中冻存管的微载体上生长。因为细胞在无源搭载系统中生长的环境相对较差，返回地面时，细胞的生长状态不太好，若直接采用常规的0.25％胰酶和0.2％EDTA的混合液进行消化处理，细胞的成活率较低，而目前尚未具有一套完整地对从无源搭载系统中返回的微载体上细胞进行处理的方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，而提供一种从无源太空搭载系统中回收微载体上细胞的方法，该方法可从经太空飞行返回地面的无源太空搭载系统中消化并单克隆化依附于微载体内的试验细胞。
为了实现上述目的，本发明采用以下方案完成。
本发明的一种从无源太空搭载系统中回收微载体上细胞的方法，其中：包括以下步骤：
(12)从无源太空搭载系统中返回的装有微载体和细胞的冻存管中抽出培养液，换上太空完全培养基，然后置于5％左右的CO2、37℃左右孵箱内孵育15-20个小时或在细胞倍增期内孵育；
(13)吸出冻存管中的太空完全培养基，然后加入2毫升左右无血清培养基清洗微载体；
(14)待微载体完全沉降后吸出冻存管中的无血清培养基；
(15)再向冻存管中加入1毫升左右的0.25％胰酶和0.2％EDTA的混合液，轻摇2-4分钟，来消化微载体上的细胞；
(16)加入2毫升左右的含有20％血清培养基来中和步骤(4)中的混合液；
(17)将冻存管中的溶液颠倒混合，放置冻存管，微载体在管中一边下降，一边从冻存管中吸出上清液，并且将该上清液置于离心管中；
(18)再向冻存管中加入3毫升左右的含有20％血清培养基，颠倒摇动冻存管40-60次，微载体在管中一边下降，一边从冻存管中吸出上清液，并且将该上清液置于步骤(6)所述的离心管中；
(19)重复步骤(2)-(7)2至3次，并且将得到的上清液置于步骤(6)所述的离心管中；
(20)将上述离心管中的上清液进行离心处理5-8分钟，离心速度为1000-1200rpm，然后在室温下收集细胞沉淀；
(21)将收集到的细胞沉淀中加入0.25毫升左右的含有20％血清培养基，混匀，取0.01毫升计数；
(22)根据步骤(10)的计数结果，按照一块96孔板排放20-30个细胞的要求抽取细胞沉淀，并在该细胞沉淀中加入占总体积90％的太空完全培养基和占总体积10％的常规培养该细胞后留存的上清液来稀释后，铺板。
本发明的一种从无源太空搭载系统中回收微载体上细胞的方法，其中：所述的轻摇为以25-40次/分钟的速度进行摇动。
本发明的一种从无源太空搭载系统中回收微载体上细胞的方法，其中：所述的颠倒摇动为以80-120次/分钟的速度进行摇动。
本发明的一种从无源太空搭载系统中回收微载体上细胞的方法，其中：所述的离心管为50毫升的离心管。
本发明的一种从无源太空搭载系统中回收微载体上细胞的方法，其中：该方法还包括：将其余未铺板的细胞中加入3-5毫升太空完全培养基进行常规培养。
本发明的一种从无源太空搭载系统中回收微载体上细胞的方法，其中：该方法还包括：对步骤(11)处理后的微载体进行Gimesa染色，检测其消化情况。
本发明的一种从无源太空搭载系统中回收微载体上细胞的方法，其中：所述的太空完全培养基为每升中含有789.85毫升DMEM、200毫升进口胎牛血清、10毫升每毫升含有0.03克的谷氨酰胺和0.15毫升每毫升含有5毫克的氢化可的松的培养基。
本发明的一种从无源太空搭载系统中回收微载体上细胞的方法，其中：所述的微载体是选自纤维素、甲壳素或胶原的无毒高分子化合物，其上有直径为20-60微米的孔。
本发明的一种从无源太空搭载系统中回收微载体上细胞的方法，其中：所述的微载体本身是球状的，球形直径为100-500微米。
本发明的一种从无源太空搭载系统中回收微载体上细胞的方法，其中：所述的细胞为哺乳类动物细胞。
本发明的方法简便易行，能最大限度地从无源太空搭载系统中的微载体内消化下来太空搭载细胞，尽可能地使细胞保持良好的状态，解决了从无源太空搭载系统中返回地面后，从微载体内消化及单克隆细胞的困难。
具体实施方式
经过太空飞行后，返回地面的微载体上的哺乳类动物细胞的状态较差，因此不能直接进行消化处理，这时应进行消化处理前的细胞孵育，即从无源太空搭载系统中返回的装有微载体和细胞的冻存管中抽出培养液，换上太空完全培养基，然后置于5％左右的CO2、37℃左右孵箱内孵育18个小时后，吸出冻存管中的太空完全培养基，再加入2毫升左右无血清培养基清洗微载体，待微载体完全沉降后，吸出冻存管中的无血清培养基，再向冻存管中加入1毫升左右的0.25％胰酶和0.2％EDTA的混合液，并以35次/分钟的速度进行轻轻摇动3分钟，来消化微载体上的细胞，然后加入2毫升左右的含有20％血清培养基来中和0.25％胰酶和0.2％EDTA的混合液，将冻存管中的溶液颠倒混合，放置冻存管，微载体在管中一边下降，一边从冻存管中吸出上清液，上清液中含有从微载体中消化下来的细胞，将上清液置于50毫升离心管中，再向冻存管中加入3毫升左右的含有20％血清培养基，并以100次/分钟的速度颠倒摇动冻存管50次，微载体在管中一边下降，一边从冻存管中吸出上清液，并且将该上清液置于上述的50毫升离心管中，重复上述除孵育步骤外的所有步骤3次，并且将得到的上清液置于上述的50毫升离心管中。对上述50毫升离心管中的上清液进行离心处理7分钟，离心速度为1200rpm，然后在室温下收集细胞沉淀，将收集到的细胞沉淀中加入0.25毫升左右的含有20％血清培养基，混匀，取0.01毫升计数，根据计数结果，按照一块96孔板排放20-30个细胞的要求抽取细胞沉淀，并在该细胞沉淀中加入占总体积90％的太空完全培养基和占总体积10％的常规培养该细胞后留存的上清液来稀释后，铺板，进行后续的单克隆化处理。其余未铺板的细胞中加入4毫升太空完全培养基进行常规培养。并且对处理后的微载体进行Gimesa染色，检测其消化情况，若发现微载体内的搭载细胞没有完全消化，将重复上述除孵育步骤外的所有步骤。
本发明的太空完全培养基是每升中含有789.85毫升DMEM、200毫升进口胎牛血清、10毫升每毫升含有0.03克的谷氨酰胺和0.15毫升每毫升含有5毫克的氢化可的松的培养基。
本发明微载体是选自纤维素、甲壳素或胶原的无毒高分子化合物，其上有直径为20-60微米的孔，微载体本身是球状的，球形直径为100-500微米。
Claims (10)
1.一种从无源太空搭载系统中回收微载体上细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)从无源太空搭载系统中返回的装有微载体和细胞的冻存管中抽出培养液，换上太空完全培养基，然后置于5％左右CO2、37℃左右孵箱内孵育15-20个小时或在细胞倍增期内孵育；
(2)吸出冻存管中的太空完全培养基，然后加入2毫升左右无血清培养基清洗微载体；
(3)待微载体完全沉降后吸出冻存管中的无血清培养基；
(4)再向冻存管中加入1毫升左右的0.25％胰酶和0.2％EDTA的混合液，轻摇2-4分钟，来消化微载体上的细胞；
(5)加入2毫升左右的含有20％血清培养基来中和步骤(4)中的混合液；
(6)将冻存管中的溶液颠倒混合，放置冻存管，微载体在管中一边下降，一边从冻存管中吸出上清液，并且将该上清液置于离心管中；
(7)再向冻存管中加入3毫升左右的含有20％血清培养基，颠倒摇动冻存管40-60次，微载体在管中一边下降，一边从冻存管中吸出上清液，并且将该上清液置于步骤(6)所述的离心管中；
(8)重复步骤(2)-(7)2至3次，并且将得到的上清液置于步骤(6)所述的离心管中；
(9)将上述离心管中的上清液进行离心处理5-8分钟，离心速度为1000-1200rpm，然后在室温下收集细胞沉淀；
(10)将收集到的细胞沉淀中加入0.25毫升左右的含有20％血清培养基，混匀，取0.01毫升计数；
(11)根据步骤(10)的计数结果，按照一块96孔板排放20-30个细胞的要求抽取细胞沉淀，并在该细胞沉淀中加入占总体积90％的太空完全培养基和占总体积10％的常规培养该细胞后留存的上清液来稀释后，铺板。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的轻摇为以25-40次/分钟的速度进行摇动。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的颠倒摇动为以80-120次/分钟的速度进行摇动。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的离心管为50毫升的离心管。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于：该方法还包括：将其余未铺板的细胞中加入3-5毫升太空完全培养基进行常规培养。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于：该方法还包括：对步骤(11)处理后的微载体进行Gimesa染色，检测其消化情况。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的太空完全培养基为每升中含有789.85毫升DMEM、200毫升进口胎牛血清、10毫升每毫升含有0.03克的谷氨酰胺和0.15毫升每毫升含有5毫克的氢化可的松的培养基。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的微载体是选自纤维素、甲壳素或胶原的无毒高分子化合物，其上有直径为20-60微米的孔。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述的微载体本身是球状的，球形直径为100-500微米。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述的细胞为哺乳类动物细胞。
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